專利名稱：一種定標(biāo)測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物樣本中測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的技術(shù)方案以及有此方案制造的試劑。特別是涉及一種將定量測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的FAPGG速率法標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)方案。
背景技術(shù)：
Buttery(1993)應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)酶解苯丙氨酰雙甘氨肽類化合物(furylacryloylphenylalanylglycylglycine，F(xiàn)APGG)生成苯丙氨酰類化合物(furylacryloylphenylalanine，F(xiàn)AP)及雙甘氨肽(glycylglycine，GG)。FAPGG最大吸收峰在340nm，酶促反應(yīng)造成340nm處吸光度下降。通過連續(xù)監(jiān)測(cè)測(cè)定FAPGG在340nm處吸光度下降的速度可計(jì)算出ACE的活性。
一個(gè)單位ACE活性定義為在Buttery氏法條件下37℃每分鐘消耗一個(gè)微摩爾(μmol)底物FAPGG所需ACE酶量。其原理反應(yīng)方程式如下 Buttery JE，Stuart S.評(píng)估和優(yōu)化血漿測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的動(dòng)力學(xué)方法。臨床化學(xué)雜志。1993年2月；39(2)312-6。[Buttery JE，Stuart S.Assessment and optimization of kineticmethods for angiotensin-converting enzyme in plasma.Clin Chem.1993Feb；39(2)312-6.]Buttery氏法缺點(diǎn)在于沒能使用一種公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)法定標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品，從而造成測(cè)試精確度下降，不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用不同生化分析儀引起的儀器誤差，這是ACE正常參考范圍數(shù)據(jù)混亂、不可比性的主要原因。
Hurst(1981)應(yīng)用ACE酶解馬尿組氨酰亮氨酸(N-hippuryl-l-histidyl-l-leucine，HHL)生成馬尿酸(hippuric acid)和二肽組氨酰亮氨酸(histidyl-leucine)。馬尿酸和氰尿酸氯化物(2，4，6-trichloro-s-triazine，Cyanuric Chloride)/1，4-二惡烷(1，4-dioxane)反應(yīng)生成有色終點(diǎn)產(chǎn)物，該產(chǎn)物可在382nm處定量測(cè)定。通過制定馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，可定量ACE活性。ACE活性(單位/升，U/L)定義為在Hurst氏法條件下37℃每分鐘產(chǎn)生一個(gè)μmol馬尿酸所需ACE酶量。
Paul L.Hurst和Chris J.Lovell-Smith.優(yōu)化血清血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的測(cè)定。臨床化學(xué)雜志。27/12，2048-2052(1981)[Paul L.Hurst and Chris J.Lovell-Smith.Optimized Assayfor Serum Angiotensin-Converting Enzyme Activity.Clin.Chem.27/12，2048-2052(1981)]盡管Hurst氏法可定量測(cè)定ACE活性，但實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，不適于臨床生化檢驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在Buttery氏法中加入ACE標(biāo)準(zhǔn)品。用Hurst氏法確定ACE標(biāo)準(zhǔn)品的活性。再應(yīng)用Buttery氏法以ACE標(biāo)準(zhǔn)品的活性為參照，定量測(cè)定生物樣本中的ACE活性。本發(fā)明解決了Buttery氏法的缺陷，提高了測(cè)試精確度、減少了儀器誤差和增強(qiáng)了ACE正常參考范圍數(shù)據(jù)的可比性。
以本發(fā)明的定標(biāo)測(cè)定ACE的方法配制了測(cè)定ACE的試劑盒。
具體實(shí)施例方式
1.ACE標(biāo)準(zhǔn)品和其活性的確定1)ACE標(biāo)準(zhǔn)品成分0-200U/L人源基因重組ACE2)ACE標(biāo)準(zhǔn)品活性的確定參照Hurst氏法，在含0.2ml孵育緩沖液(200mM硼酸，2M氯化納pH 8.3)試管中加入0.1ml蒸餾水和0.1ml ACE標(biāo)準(zhǔn)品(0-200U/L)，37℃孵育5分鐘。加入0.1ml 20mM HHL底物溶液啟動(dòng)反應(yīng)15分鐘。加入0.5ml 1M鹽酸(HCl)溶液終止反應(yīng)，30秒后加入0.5ml 1M氫氧化鈉(NaOH)中和反應(yīng)。加入2ml 200mM磷酸鉀稀釋液pH 8.3，隨后1.5ml顯色液(3％氰尿酸氯化物溶于1，4-二惡烷)，混勻，靜止5分鐘，再混勻，每分3000轉(zhuǎn)離心10分鐘。取上清液在382nm處定量測(cè)定吸光度。用不同濃度馬尿酸(μmol/L)代替底物HHL，按上述方法同樣測(cè)取上清液在382nm處吸光度，以此畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。有ACE標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出對(duì)應(yīng)的馬尿酸濃度(μmol/L)，將其除以反應(yīng)時(shí)間15分鐘即得出ACE標(biāo)準(zhǔn)品活性(U/L)。ACE活性(U/L)定義為在Hurst氏法條件下37℃每分鐘產(chǎn)生一個(gè)μmol馬尿酸所需ACE酶量。
2.樣本ACE活性的測(cè)定參照Buttery氏法用ACE標(biāo)準(zhǔn)品的活性為參照，定量測(cè)定生物樣本中的ACE活性。
1)試劑組成ACE底物溶液含F(xiàn)APGG的硼酸鹽緩沖液pH 8.22)生物樣本0-200U/L人源基因重組ACE。
3)試驗(yàn)參數(shù)與操作步驟溫度37℃波長340nm比色杯光徑 1.0cm測(cè)試方法定時(shí)速率法反應(yīng)方向負(fù)反應(yīng)時(shí)間10分鐘樣本/試劑 1∶10水調(diào)零(340nm)予孵育 ACE底物溶液和樣本預(yù)溫至37℃啟動(dòng)反應(yīng)0.25ml ACE底物溶液+0.025ml樣本讀吸光值A(chǔ)0(340nm)孵育時(shí)間10分鐘終止反應(yīng)讀吸光值A(chǔ)10(340nm)測(cè)試儀 Shimadzu UV-160
4)計(jì)算計(jì)算測(cè)試時(shí)間段每分鐘平均吸光度的變化(ΔA/min)。
ΔA/min=(A10-A0)10]]>樣本ACE(U/L)＝(ΔAx/ΔAc)×Ec其中ΔAx＝樣本ΔA/minΔAc＝標(biāo)準(zhǔn)品ΔA/minEc＝ACE標(biāo)準(zhǔn)品的活性(U/L)5)結(jié)果ACE線性范圍0-200(U/L)3.ACE測(cè)定試劑盒產(chǎn)品名稱血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)檢測(cè)試劑盒型號(hào)生化試劑產(chǎn)品代碼DC-ACE規(guī)格ACE底物溶液150ml，ACE標(biāo)準(zhǔn)品(凍干)1ml/1瓶，ACE正常血清(凍干)1ml/1瓶，ACE異常血清(凍干)1ml/1瓶，600測(cè)試/盒。
檢測(cè)介質(zhì)血清適用于體外診斷用途血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)檢測(cè)試劑盒適用于體外定量測(cè)定人血清中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)活性。ACE測(cè)定有助于結(jié)節(jié)病的診斷、激素治療、高血壓和心衰ACE阻斷劑用藥療效的監(jiān)測(cè)。
概述血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)亦稱為激肽酶II是分子量為129KDa的二肽酰羧肽酶(EC3.4.15.1)。ACE在許多細(xì)胞上表達(dá)，諸如神經(jīng)元細(xì)胞，近端腎小管細(xì)胞，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞。膜蛋白ACE可從膜上切除成為可溶性ACE進(jìn)入血液循環(huán)。血清ACE顯著增高見于節(jié)結(jié)病和高血壓。
ACE連續(xù)監(jiān)測(cè)法不僅適用于診斷/預(yù)后節(jié)結(jié)病，高血壓和心衰ACE阻斷劑用藥療效的監(jiān)測(cè)，該法亦可用于篩選ACE阻斷物，后者是高血壓的有效治療藥物。ACE連續(xù)監(jiān)測(cè)法準(zhǔn)確性好、精密度高，適宜在臨床和新藥開發(fā)上推廣應(yīng)用。
原理應(yīng)用ACE酶解苯丙氨酰雙甘氨肽類化合物(furylacryloylphenylalanylglycylglycine，F(xiàn)APGG)生成苯丙氨酰類化合物(furylacryloylphenylalanine，F(xiàn)AP)及雙甘氨肽(glycylglycine，GG)。FAPGG最大吸收峰在340nm，酶促反應(yīng)造成340nm處吸光度下降。通過連續(xù)監(jiān)測(cè)測(cè)定FAPGG在340nm處吸光度下降的速度，再以ACE標(biāo)準(zhǔn)品的活性為參照，定量測(cè)定生物樣本中的ACE活性。
一個(gè)單位ACE活性定義為在本法條件下37℃每分鐘消耗一個(gè)微摩爾底物FAPGG所需ACE酶量。其原理反應(yīng)方程式如下 試劑盒組份每個(gè)ACE試劑盒含有1.ACE底物溶液150ml/1瓶2.ACE標(biāo)準(zhǔn)品(凍干)1ml/1瓶3.ACE正常血清(凍干) 1ml/1瓶4.ACE異常血清(凍干) 1ml/1瓶5.檢驗(yàn)證明6.1份使用說明。
試劑組成ACE底物溶液 FAPGG緩沖液pH8.2ACE標(biāo)準(zhǔn)品人源基因重組蛋白ACE質(zhì)控血清 人源基因重組蛋白和人血清試劑配制ACE底物溶液為液體試劑，可直接上機(jī)使用。
ACE標(biāo)準(zhǔn)品和ACE質(zhì)控血清是凍干品，需要溶于1ml蒸餾水中方可使用。
試劑的穩(wěn)定與貯存期試劑避光保存2-8℃一年。配制好的ACE標(biāo)準(zhǔn)品和ACE質(zhì)控血清2-8℃可至少保存一月，-20℃冷凍可保存半年。
樣本收集僅用非溶血的血清?？鼓獫{含EDTA，它抑制ACE活性。血清中ACE活性2-8℃穩(wěn)定7天，-20℃中半年。
試驗(yàn)參數(shù)與操作步驟溫度37℃波長340nm比色杯光徑 1.0cm測(cè)試方法定時(shí)速率法反應(yīng)方向負(fù)反應(yīng)時(shí)間10分鐘樣本/試劑 1∶10水調(diào)零(340nm)予孵育 ACE底物溶液和樣本預(yù)溫至37℃啟動(dòng)反應(yīng)0.25ml ACE底物溶液+0.025ml樣本讀吸光值A(chǔ)0(340nm)孵育時(shí)間10分鐘終止反應(yīng) 讀吸光值A(chǔ)10(340nm)計(jì)算計(jì)算測(cè)試時(shí)間段每分鐘平均吸光度的變化(ΔA/min)。
ΔA/min=(A10-A0)10]]>樣本ACE(U/L)＝(ΔAx/ΔAc)×Ec其中ΔAx＝樣本ΔA/minΔAc＝標(biāo)準(zhǔn)品ΔA/minEc＝ACE標(biāo)準(zhǔn)品的活性(U/L)注意事項(xiàng)1.試劑和樣品用量可因儀器不同，按比例增減。
2.若樣品ACE＞200U/L，也即用1cm比色杯光徑反應(yīng)吸光值變化(A0-A10)大于0.1，須用生理鹽水稀釋樣品，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。
3.如保存不當(dāng)，試劑發(fā)現(xiàn)有混濁時(shí)，應(yīng)棄用。
試劑性能線性范圍0-200U/L(r2＞0.998)精密度 批內(nèi)CV 2.9％和批間CV 5.2％特異性 1.32mM Angiotensin I、4.68mM EDTA和15.6mM H-val-Trp-OH*2H2O分別抑制ACE活性82％、94％和93％。
穩(wěn)定性 ACE底物溶液置于37℃下72小時(shí)對(duì)其效力無影響。
參考值正常人血清ACE活性參考值37-110U/L。建議各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)條件自行訂定正常人血清ACE活性范圍。
儀器全自動(dòng)、半自動(dòng)生化分析儀或可見光分光光度計(jì)產(chǎn)品特征液體單試劑特異性測(cè)定ACE測(cè)定精密度高抗干擾能力強(qiáng)適合自動(dòng)化快速測(cè)定參考文獻(xiàn)參閱實(shí)申參考資料。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定生物樣本中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的方法，其特征是借助Hurst氏法(1981)確定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶標(biāo)準(zhǔn)品的活性，再應(yīng)用Buttery氏法(1993)通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶酶解FAPGG生成FAP和GG，以連續(xù)監(jiān)測(cè)測(cè)定FAPGG在340nm處吸光度下降的速度結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的活性為參照，定量測(cè)定生物樣本中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性。
2.一種按權(quán)利要求1制造的測(cè)定生物樣本中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的產(chǎn)品，其特征是借助Hurst氏法(1981)確定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶標(biāo)準(zhǔn)品的活性，再應(yīng)用Buttery氏法(1993)通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶酶解FAPGG生成FAP和GG，以連續(xù)監(jiān)測(cè)測(cè)定FAPGG在340nm處吸光度下降的速度結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的活性為參照，定量測(cè)定生物樣本中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性。
全文摘要
Buttery(1993)的FAPGG速率法定量測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性在臨床化學(xué)檢驗(yàn)上應(yīng)用較為普遍。但是，Buttery氏法缺點(diǎn)在于沒能使用一種公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)法定標(biāo)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶標(biāo)準(zhǔn)品，從而造成測(cè)試精確度下降，不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用不同生化分析儀引起的儀器誤差，還是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶正常參考范圍數(shù)據(jù)混亂、不可比性的主要原因。本發(fā)明用Hurst氏法(1981)確定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶標(biāo)準(zhǔn)品的活性。再應(yīng)用Buttery氏法以標(biāo)準(zhǔn)品的活性為參照，定量測(cè)定生物樣本中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性。本發(fā)明解決了Buttery氏法的缺陷，提高了測(cè)試精確度、減少了儀器誤差和增強(qiáng)了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶正常參考范圍數(shù)據(jù)的可比性。本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行上述方法的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N21/33GK1693878SQ200510053208
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2005年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月6日
發(fā)明者蔡楓 申請(qǐng)人:浙江亞克藥業(yè)有限公司, 蔡楓