專利名稱：一種普瑞巴林手性異構(gòu)體的分離測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及化合物柱前的衍生化及測定方法，具體涉及Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺與普瑞巴林(C8H17NO2)柱前衍生化后，用高效液相色譜法來分離測定普瑞巴林的手性異構(gòu)體的方法。
背景技術(shù)：
柱前衍生化是提高檢測靈敏度的方法，大多數(shù)無紫外吸收或紫外吸收較弱的化合物，采用合適的衍生化方法，可以進(jìn)行包括含量和手性異構(gòu)體的準(zhǔn)確測定。
普瑞巴林是一種治療癲癇和神經(jīng)痛的手性藥物，其化學(xué)名為(S)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，分子式為C8H17NO2；普瑞巴林的手性異構(gòu)體，其化學(xué)名為(R)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸。普瑞巴林其紫外吸收很弱，用紫外檢測器測定困難?，F(xiàn)有技術(shù)中已有采用衍生化方法測定普瑞巴林含量的報(bào)道“參見Journal of Chromatography B 674(1995)143-148”，但未見采用手性衍生化試劑與普瑞巴林進(jìn)行衍生化反應(yīng)，測定其手性異構(gòu)體的報(bào)道。
普瑞巴林的手性異構(gòu)體為普瑞巴林的雜質(zhì)，是普瑞巴林質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。采用手性色譜柱分離測定普瑞巴林的手性異構(gòu)體不但成本高，而且分離難度大。本發(fā)明采用手性衍生化試劑柱前衍生化，實(shí)現(xiàn)了用一般的分離色譜柱(C18或C8色譜柱)快速、準(zhǔn)確進(jìn)行普瑞巴林手性異構(gòu)體的分離和測定，經(jīng)衍生化后，普瑞巴林與其手性異構(gòu)體的衍生化產(chǎn)物，其分離度達(dá)到4.5，從而實(shí)現(xiàn)了普瑞巴林手性雜質(zhì)的控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用液相色譜法分離測定普瑞巴林的手性異構(gòu)體的方法，其特征在于普瑞巴林用衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生化，其中衍生化試劑為Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸類化合物。普瑞巴林在被衍生化的同時(shí)，其手性異構(gòu)體也被衍生化，從而實(shí)現(xiàn)采用一般色譜柱進(jìn)行普瑞巴林及其手性異構(gòu)體(雜質(zhì))的分離測定。這里說的普瑞巴林手性異構(gòu)體被視為普瑞巴林的重要雜質(zhì)。
本發(fā)所說的普瑞巴林的異構(gòu)體是指(R)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸。
上述的衍生化試劑選自下述化合物Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯胺酰胺或Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-纈胺酰胺，優(yōu)選Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺。
普瑞巴林進(jìn)柱前衍生化是指普瑞巴林及其手性異構(gòu)體與衍生化試劑經(jīng)定量反應(yīng)生成衍生化物，普瑞巴林與衍生化試劑的用量摩爾比為1∶1～1∶500，優(yōu)選1∶1～1∶5。
上述說的液相色譜法是指高效液相色譜法或是高效液相色譜法與質(zhì)譜法聯(lián)合應(yīng)用。
上述所說的分離測定方法主要包括以下步驟①、取普瑞巴林或含普瑞巴林的制劑適量，用稀酸溶液溶解，再用堿溶液調(diào)pH值至6.0～8.0，加水適量，搖勻，配制成含普瑞巴林0.5％～5.0％的溶液；②、取普瑞巴林溶液和1mol/L碳酸鹽溶液，混合，加入Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L--氨基酸類化合物溶液，混勻；③、于20～60℃反應(yīng)20～120分鐘，反應(yīng)完畢加入2mol/L鹽酸溶液；④、反應(yīng)物在預(yù)置五氧化二磷與氫氧化鉀的干燥系統(tǒng)中干燥至溶劑充分揮盡后，加二甲亞砜或N，N-二甲基甲酰胺4ml使剩余物溶解，濾過，濾液作為供試品溶液；⑤、用高效液相色譜法或高效液相色譜—質(zhì)譜法分離測定普瑞巴林上一步供試品溶液上述步驟①所說的普瑞巴林可以是含有其手性異構(gòu)體(稱為普瑞巴林消旋體)，或是含極少量其手性異構(gòu)體(雜質(zhì))，或不含其手性異構(gòu)體。
上述步驟①所說的稀酸溶液或是無機(jī)酸如稀鹽酸，稀硫酸，稀磷酸等溶液，還可以是有機(jī)酸如甲酸、乙酸、三氟乙酸；所說的堿溶液或是無機(jī)堿溶液如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨水，還可以是有機(jī)堿溶液如三乙胺，上述步驟②所說的碳酸鹽溶液可以是碳酸氫鈉，碳酸氫鉀，碳酸鉀，碳酸鈉溶液；還可以上述碳酸鹽按照任意比混合后所得的組合物。
上述步驟②所說的Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L--氨基酸類化合物選自Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯胺酰胺或Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-纈胺酰胺。
上述步驟⑤所說的高效液相色譜法或高效液相色譜—質(zhì)譜法使用的色譜柱可以是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，還可以是辛基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱。
上述步驟⑤所說的高效液相色譜法測定普瑞巴林及其手性異構(gòu)體，檢測波長為200～380nm，最佳檢測波長為340±3nm。
本發(fā)明所說的采用高效液相色譜法分離測定普瑞巴林及其手性異構(gòu)體的方法，流動(dòng)相可以是三乙胺水溶液—乙腈體系，還可以是三乙胺水溶液—甲醇體系，三乙胺溶液與乙腈或甲醇的比例為1∶2～2∶1，其中三乙胺的濃度為0.1～5％，用磷酸調(diào)pH2.0～5.0。
本發(fā)明方法具體通過以下技術(shù)方案和步驟實(shí)現(xiàn)取普瑞巴林或含普瑞巴林的制劑樣品，加稀鹽酸溶液振搖使溶解，并用稀堿溶液調(diào)至pH值至5.0～9.0(優(yōu)選pH值6.0～8.0)，加水搖勻，取溶液加手性衍生化試劑和碳酸氫鈉溶液適量，于20～60℃(優(yōu)選35～45℃)，反應(yīng)20～120分鐘(優(yōu)選30～60分鐘)。反應(yīng)完畢，加稀鹽酸溶液，減壓抽干，再加二甲亞砜或N，N-二甲基甲酰胺適量配制溶液，采用高效液相色譜方法或高效液相色譜—質(zhì)譜法測定。
本發(fā)明采用Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺與普瑞巴林進(jìn)行柱前衍生化，不但使衍生化后的產(chǎn)物有較強(qiáng)的紫外吸收，而且可方便快捷地測定普瑞巴林的手性異構(gòu)體；本發(fā)明具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、過量衍生化試劑不干擾測定等優(yōu)點(diǎn)。且本發(fā)明衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定、分析靈敏度高，可以準(zhǔn)確測定普瑞巴林中0.05％的手性異構(gòu)體。該方法既克服了普瑞巴林紫外吸收弱，用紫外檢測器測定困難，又解決了用普通色譜柱(C18或C8色譜柱)分離測定普瑞巴林及其制劑的手性雜質(zhì)的問題。


圖1試劑空白的高效液相色譜2普瑞巴林消旋體(R與S構(gòu)型)的高效液相色譜3普瑞巴林的高效液相色譜4普瑞巴林膠囊的高效液相色譜圖
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不限于本實(shí)施的范圍。
實(shí)施例1儀器與條件美國Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)及工作站；自動(dòng)進(jìn)樣；色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；紫外檢測波長340nm；流動(dòng)相三乙胺溶液(取三乙胺5ml，加水1000ml，用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0)—乙腈(55∶45)。
實(shí)驗(yàn)步驟取普瑞巴林的消旋體約160mg至10ml量瓶中，用1mol/L鹽酸溶液適量，振搖使溶解，并用1mol/L氫氧化鈉溶液中和，加水稀釋至刻度。搖勻，作為樣品溶液；另取Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺10.0mg，加丙酮1ml，搖勻，作為衍生化試劑溶液。取樣品溶液50μl、衍生化試劑溶液200μl和1mol/L碳酸氫鈉溶液20μl置2ml樣品瓶中，密閉，在40℃加熱反應(yīng)45分鐘；反應(yīng)完畢后加入2mol/L鹽酸溶液10μl，在預(yù)置五氧化二磷與氫氧化鉀的減壓干燥系統(tǒng)中干燥至溶劑充分揮盡。再加二甲亞砜4ml振搖使剩余物溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。取供試品溶液在上述條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果見圖2。
圖2中保留時(shí)間3.608分鐘的色譜峰為過量的衍生化試劑峰；保留時(shí)間7.904分鐘和9.397分鐘的色譜峰分別為普瑞巴林(S構(gòu)型)及其手性異構(gòu)體(R構(gòu)型)的色譜峰。表明普瑞巴林與其手性異構(gòu)體和過量的衍生化試劑可以達(dá)到基線分離。
實(shí)施例2取普瑞巴林約80mg至10ml量瓶中，以下按照實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)步驟制備供試品溶液，并按實(shí)施例1的條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果見圖3。
圖3中保留時(shí)間3.666分鐘的色譜峰為過量的衍生化試劑峰；保留時(shí)間8.212分鐘和9.9.8067分鐘的色譜峰分別為普瑞巴林(S構(gòu)型)及其手性異構(gòu)體雜質(zhì)(R構(gòu)型，0.5％)的色譜峰。圖3表明普瑞巴林與其手性異構(gòu)體和過量的衍生化試劑可以達(dá)到基線分離，并能準(zhǔn)確測定普瑞巴林中含有的手性異構(gòu)體雜質(zhì)。
實(shí)施例3取普瑞巴林膠囊內(nèi)容物適量(約相當(dāng)于普瑞巴林80mg)至10ml量瓶中，以下按照實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)步驟制備供試品溶液，并按實(shí)施例1的條件進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果見圖4。
圖4中保留時(shí)間3.633分鐘的色譜峰為過量的衍生化試劑峰；保留時(shí)間8.116分鐘的色譜峰為普瑞巴林的色譜峰。圖4表明普瑞巴林與過量的衍生化試劑可以達(dá)到基線分離，如果樣品中含有普瑞巴林的手性異構(gòu)體雜質(zhì)，用本法能準(zhǔn)確測定。
實(shí)施例4按照實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)步驟制備試劑空白溶液，并按實(shí)施例1的條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果見圖1。
圖1中保留時(shí)間3.684分鐘的色譜峰為衍生化試劑峰；在保留時(shí)間5～10分鐘范圍無色譜峰，表明衍生化試劑不干擾測定。
權(quán)利要求
1.一種用液相色譜法分離測定普瑞巴林的手性異構(gòu)體的方法，其特征在于普瑞巴林在進(jìn)柱前用衍生化試劑進(jìn)行衍生化，其中衍生化試劑為Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸類化合物。
2.如利要求1所述的方法，所說的衍生化試劑Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸類化合物包括Nα(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯胺酰胺或Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-纈胺酰胺。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，普瑞巴林在進(jìn)柱前需和衍生化試劑經(jīng)定量反應(yīng)生成衍生化物，其特征在于普瑞巴林與衍生化試劑的摩爾比為1∶1～1∶500。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，所說的液相色譜法為高效液相色譜法；或是高效液相色譜法與質(zhì)譜法聯(lián)合應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1所述方法，所說的分離測定方法包括以下步驟①、取普瑞巴林或含普瑞巴林的制劑適量，用稀酸溶液溶解，再用堿溶液調(diào)pH值至6.0～8.0，加水適量，搖勻，配制成含普瑞巴林0.5％～5.0％的溶液；②、取普瑞巴林溶液和碳酸鹽溶液，混合，加入Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸類化合物溶液，混勻；③、于20～60℃反應(yīng)20～120分鐘，反應(yīng)完畢加入鹽酸溶液；④、反應(yīng)物在預(yù)置五氧化二磷與氫氧化鉀的干燥系統(tǒng)中干燥至溶劑充分揮盡后，加二甲亞砜或N，N-二甲基甲酰胺使剩余物溶解，濾過，濾液作為供試品溶液；⑤、用高效液相色譜法或高效液相色譜-質(zhì)譜法分離測定上一步的供試品溶液。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中步驟①所說的稀酸溶液或是無機(jī)酸如稀鹽酸，稀硫酸，稀磷溶液，還可以是有機(jī)酸如甲酸、乙酸、三氟乙酸；所說的堿溶液是無機(jī)堿溶液如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水，或是有機(jī)堿溶液如三乙胺。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟②所說的Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸類化合物選自Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯胺酰胺或Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-纈胺酰胺。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟②所說的碳酸鹽溶液選自碳酸氫鈉，碳酸氫鉀，碳酸鉀或碳酸鈉溶液或它們按照任意比混合后所得的組合物。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟⑤所說的高效液相色譜法或高效液相色譜-質(zhì)譜法使用的色譜柱可以是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，或者是以辛基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟⑤所說的高效液相色譜法，其檢測波長為200～380nm，最佳檢測波長為340±3nm。
11.如權(quán)利要求1所述的的分離測定方法；其特征是采用高效液相色譜法或其與質(zhì)譜法聯(lián)用分離測定普瑞巴林的手性異構(gòu)體，其流動(dòng)相可以是三乙胺水溶液-乙腈體系，還可以是三乙胺水溶液-甲醇體系。
12.如權(quán)利要求11所述的測定方法，其特征是三乙胺溶液中三乙胺的濃度為0.1～5％，用磷酸調(diào)pH 2.0～5.0。
13.如權(quán)利要求11所述的測定方法，其特征是流動(dòng)相三乙胺溶液與乙腈或甲醇的比例為1∶2～2∶1。
全文摘要
本發(fā)明屬分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及普瑞巴林經(jīng)衍生化后用高效液色譜法分離測定普瑞巴林的手性異構(gòu)體(雜質(zhì))的方法。具體涉及以N
文檔編號(hào)G01N30/74GK1786703SQ20051005738
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2006年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月5日
發(fā)明者張道林, 付曉泰, 諸葛明, 蔡教泉, 樊斌 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司