專利名稱：番茄青枯病抗性鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蔬菜抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其是屬于番茄青枯病抗性鑒定的一種方法。
背景技術(shù)：
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)起源于南美洲和墨西哥，是世界上最重要的茄科作物之一。由于長期連作和土壤酸化的影響，青枯病(Ralstoniasolanacearum E.F.Smith)嚴重限制了番茄在熱帶和亞熱帶地區(qū)的生產(chǎn)，因此，番茄抗病品種的選育與引進是對青枯病綜合防治的重要措施之一，但由于青枯病致病菌—假單孢桿菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)其基因的多樣性和寄主范圍的廣泛性，以及對番茄材料或品系進行抗性鑒定方法本身還存在有缺陷，這在一定程度上限制了對青枯病的控制。因此，準確有效的抗性鑒定方法對番茄抗性材料的鑒定和抗病品種的選育是至關(guān)重要的。
在以往青枯病抗性材料的鑒定中，一般采用苗期接種鑒定和/或病圃抗性鑒定，主要根據(jù)青枯病的發(fā)病病癥——植株的萎蔫率來確定材料的抗性水平。其中，病圃抗性鑒定主要應用于番茄成株鑒定，其鑒定結(jié)果易受地塊細菌濃度的均勻性及其氣候影響，導致不同年份之間的鑒定結(jié)果存在一定的差異，而且病圃鑒定也因面積有限，無法同期對大批量的材料進行抗性鑒定；苗期接種鑒定在一定程度上克服了病圃鑒定的局限性，但在應用過程中由于接種苗齡、接種方法、病菌的株系以及培養(yǎng)環(huán)境的不同，鑒定結(jié)果往往也不一致；上述兩種鑒定結(jié)果只是反映了番茄苗期或成株期對青枯病菌的耐受能力，而并非是該品種或材料的真正抗性水平，因為在番茄的種植過程中往往還存在有潛性感染現(xiàn)象，即青枯菌(假單孢桿菌)通過植株根部的傷口，入侵植株后在莖桿等維管束內(nèi)不斷擴繁延伸，只有當植株內(nèi)假單孢桿菌群體數(shù)超過108cfu，植株才表現(xiàn)出萎蔫癥狀；同時，不同的抗性材料對抑制假單孢桿菌擴繁延伸的能力也是不同的，所以不表現(xiàn)出萎蔫癥狀的植株不一定就不感染假單孢桿菌，故單純依靠植株病癥表現(xiàn)來判斷，還無法真實評價出不同材料的抗性水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是克服上述已有技術(shù)的不足之處，提出一種在以往番茄苗期和成株期對青枯病耐受能力鑒定基礎(chǔ)上，進一步結(jié)合青枯病潛在感染以及菌系與寄主植物的互作關(guān)系，即假單孢桿菌在植株體內(nèi)數(shù)量及群體分布的檢測結(jié)果，綜合評價番茄材料抗青枯病水平的抗病鑒定方法，提高抗性鑒定的準確程度，以加速番茄抗青枯病新品種的選育或引進抗病品種的篩選與推廣應用。
本發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案得以實現(xiàn)一種番茄青枯病抗性鑒定方法，按以下步驟進行(1)番茄苗期接種鑒定①采用常規(guī)育苗方法，培育生長基本一致的番茄苗，至5-6葉時備用；②以LB培養(yǎng)基接種假單孢桿菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)進行擴繁培養(yǎng)；將擴繁后的假單孢桿菌用無菌水稀釋至濃度為108cfu/ml的細菌懸浮液；該懸浮液的OD(A600)值等于0.4；③番茄苗傷根接種，每株接菌種懸浮液30ml；④接種苗在氣溫25-30℃，土壤相對濕度60％以上條件下培育管理；⑤接種后7天開始調(diào)查統(tǒng)計植株萎蔫率，每7天調(diào)查一次，共調(diào)查4次，匯總后進行番茄苗期抗性鑒定評價；(2)番茄植株內(nèi)假單孢桿菌群體及其分布檢測
①苗期接種抗性鑒定結(jié)束后，將未萎蔫植株經(jīng)沖洗、拭干、75％酒精消毒后，把莖段截取成0-2、2-4、4-6、6-8、8-10cm長度；②分別將各莖段置于10ml無菌水中，在30℃條件下培養(yǎng)，2h后獲得細菌懸浮液；③將各莖段細菌懸浮液稀釋至該假單孢桿菌的典型菌落在培養(yǎng)基上能清晰明顯，易于統(tǒng)計為標準，從中取0.1ml稀釋液于TZC選擇培養(yǎng)基上推成平板，在30℃，RH＝60％條件下培養(yǎng)24-48h；④統(tǒng)計各培養(yǎng)基上形成的紅色菌落，得出假單孢桿菌在各番茄試材植株內(nèi)群體的大小及其分布情況，匯總后進行參試材料的抗性評價；(3)病圃抗性鑒定①將歷年青枯病發(fā)病病圃作為青枯病鑒定病圃；②將步驟(2)獲得的抗病材料的種子，培育成生長一致的番茄苗后定植于病圃內(nèi)；③調(diào)查統(tǒng)計植株萎蔫率，進行番茄生長結(jié)果期的抗性鑒定；(4)根據(jù)番茄各試材(1)苗期接種鑒定和(2)植株內(nèi)假單孢桿菌群體大小及其分布檢測與(3)病圃抗性鑒定的結(jié)果，進行綜合評價，劃定抗性水平。
所述的TZC選擇培養(yǎng)基中TZC的濃度為50mg/L，余量為LB培養(yǎng)基。
本發(fā)明在傳統(tǒng)的番茄苗期接種鑒定和成株病圃抗性鑒定的基礎(chǔ)上，科學地在兩階段之間增加了植株內(nèi)假單孢桿菌群體大小及其分布的檢測，使番茄苗期或成株期對青枯病菌外在表現(xiàn)的耐受能力與植株內(nèi)在感染病菌的程度及其抑制假單孢桿菌在體內(nèi)擴繁延伸的能力有機地結(jié)合起來，進行綜合評價，劃定抗性水平，從而顯著提高了對參試材料抗番茄青枯病的準確水平(見表1)。


圖1假單孢桿菌TTS小種接種后番茄不同品系、不同莖段假單孢桿菌菌落群體的變化曲線圖具體實施方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
實施例1試驗材料番茄品種85254、51255、47254、7585、51198、519230、1466EA、203和85198共9個品種；其中1466EA和203分別作為抗病對照和感病對照。
番茄青枯病菌源假單孢桿菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)TT4小種；(浙江省農(nóng)科院蔬菜所分離出的青枯病番茄致病菌，屬于假單孢桿菌race1，biovar 3)。
TZC選擇培養(yǎng)基配方LB培養(yǎng)基+TZC 50mg/l。
LB培養(yǎng)基配方蔗糖10g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸餾水1L。
試驗于2002年11月-2003年7月在浙江省農(nóng)科院蔬菜所試驗基地進行；一種番茄青枯病抗性鑒定方法，按以下步驟進行(1)番茄苗期接種鑒定①采用常規(guī)育苗方法，將種子播于裝有營養(yǎng)基質(zhì)的10cm的營養(yǎng)缽，培育生長基本一致的番茄苗，至5-6葉時備用；②以LB培養(yǎng)基接種假單孢桿菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)進行擴繁培養(yǎng)；將擴繁后的假單孢桿菌用無菌水稀釋獲得細菌懸浮液，并根據(jù)細菌懸浮液的OD值調(diào)節(jié)細菌的濃度，使最終獲得的細菌懸浮液的OD(A600)值等于0.4(細菌濃度相當于108cfu/ml)；③接種時離根基部2cm處用刀自上而下向基質(zhì)內(nèi)切2刀，傷及部分根系，再在每個營養(yǎng)缽內(nèi)倒入30ml的細菌懸浮液(OD(A600)＝0.4)，以確保同等的細菌濃度；④接種苗在氣溫25-30℃，土壤相對濕度60％以上條件下栽培管理；⑤接種后7天開始調(diào)查統(tǒng)計植株萎蔫率，每7天調(diào)查一次，共調(diào)查4次，匯總統(tǒng)計病情指數(shù)和植株萎蔫率，進行番茄苗期抗性鑒定評價；(2)番茄植株內(nèi)假單孢桿菌群體及其分布檢測①苗期接種抗性鑒定結(jié)束后，將未萎蔫植株經(jīng)沖洗、拭干、75％酒精消毒后，把莖段截取成0-2、2-4、4-6、6-8、8-10cm長度；②分別將各莖段置于10ml無菌水中，在30℃條件下培養(yǎng)，2h后獲得細菌懸浮液；③將各莖段細菌懸浮液稀釋至該假單孢桿菌的典型菌落在培養(yǎng)基上能清晰明顯，易于統(tǒng)計為標準，從中取0.1ml稀釋液于TZC選擇培養(yǎng)基上推成平板，在30℃，RH＝60％條件下培養(yǎng)24-48h；④統(tǒng)計各培養(yǎng)基上形成的紅色菌落，得出假單孢桿菌在各番茄試材植株內(nèi)群體的大小及其分布情況，其中0-2莖段所含的假單孢桿菌數(shù)量即代表植株的假單孢桿菌的群體大小，0-2，2-4，4-6，6-8，8-10莖段分別所含的假單孢桿菌數(shù)量構(gòu)成的變化曲線構(gòu)成假單孢桿菌在植株內(nèi)的分布，匯總后進行參試材料的抗性評價；(3)病圃抗性鑒定①將歷年青枯病發(fā)病病圃作為青枯病鑒定病圃；
②將步驟(2)獲得的抗病材料的種子，培育成生長一致的番茄苗，至7-8葉時定植于病圃內(nèi)；③定植后1周開始調(diào)查，每10天調(diào)查一次，共延續(xù)3個月，并統(tǒng)計植株萎蔫率，進行番茄生長結(jié)果期的抗性鑒定；(4)根據(jù)番茄各試材(1)苗期接種鑒定和(2)植株內(nèi)假單孢桿菌群體大小及其分布檢測與(3)病圃抗性鑒定的結(jié)果，進行綜合評價，劃定抗性水平。
通過上述番茄苗期接種鑒定、假單孢桿菌在植株內(nèi)群體及其分布的檢測和病圃抗性鑒定這三個階段對9個不同抗性材料進行抗性評價。苗期接種鑒定和田間抗性鑒定從植株對病菌的(外在)表現(xiàn)來評價品系之間的抗性差異；植株內(nèi)假單孢桿菌群體及分布的檢測體現(xiàn)了病菌在植株(內(nèi)在抗性)體內(nèi)擴繁及延伸能力，亦即不同材料對相同病菌的不同抑制能力，從病菌的角度來評價品系之間的抗性差異。
通過苗期接種鑒定對9個抗性材料進行初步鑒定，認為203在9個抗性材料中抗性水平最低，85198次之，其它7個材料抗性水平相同，均屬于高抗材料，植株萎蔫率為0(表1)。
但通過0-2莖段假單孢桿菌菌落數(shù)檢測(表1)，認為203和85198抗性水平和苗期接種鑒定結(jié)果一致，而51198等7個材料存在一定抗性差異；進一步對假單孢桿菌在番茄植株內(nèi)群體分布進行檢測，從其結(jié)果來看(圖1)，可認為在這9個抗性材料中85254，51255，47254和75854個品系的抗性最強，51198次之，519230和1466EA的抗性水平屬于第三層次，而抗性水平最差的是203和85198。
在上述兩階段鑒定的結(jié)果上，對這9個抗性材料進行病圃抗性鑒定，驗證這9個抗性材料成株對青枯病的耐受能力。鑒定結(jié)果(表1)表明85254、51255、47254和7585對青枯病抗性最強，519230和1466EA較強，51198較次，而203和85198依然是抗病能力最差。
經(jīng)過幾種鑒定方法的綜合鑒定，可以準確地對這9個抗性材料進行抗性評價，認為在這9個品系中，存在如下的抗性梯度(高抗-感病)(51255，47254)-(85254，7585)-(519230，1466EA)-(51198)-(203，85198)。
表1番茄不同品系苗期接種、假單孢桿菌在植株0-2莖段群體大小檢測、病圃鑒定結(jié)果比較

注表中字母表示Duncan’s多重比較結(jié)果，同一列之間有不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)。同一列之間有不同大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)。
權(quán)利要求
1.番茄青枯病抗性鑒定方法，其特征按以下步驟進行(1)番茄苗期接種鑒定①培育生長基本一致的番茄苗，至5-6葉時備用；②以LB培養(yǎng)基接種假單孢桿菌(Ralstonia solanacearumE.F.Smith)進行擴繁培養(yǎng)；將擴繁后的假單孢桿菌用無菌水稀釋至濃度為107cfu/ml的細菌懸浮液；③番茄苗傷根接種，每株接菌種懸浮液30ml；④接種苗在氣溫25-30℃，土壤相對濕度60％以上條件下培育管理；⑤接種后7天開始調(diào)查統(tǒng)計植株萎蔫率，進行番茄苗期抗性鑒定；(2)番茄植株內(nèi)假單孢桿菌群體及其分布檢測①苗期接種抗性鑒定結(jié)束后，將未萎蔫植株經(jīng)沖洗、拭干、75％酒精消毒后，把莖段截取成0-2、2-4、4-6、6-8、8-10cm長度；②分別將各莖段置于10ml無菌水中，在30℃條件下培養(yǎng)，2h后獲得細菌懸浮液；③將各莖段細菌懸浮液稀釋至該假單孢桿菌的典型菌落在培養(yǎng)基上能清晰明顯，易于統(tǒng)計為標準，從中取0.1ml稀釋液于TZC選擇培養(yǎng)基上推成平板，在30℃，RH＝60％條件下培養(yǎng)24-48h；④統(tǒng)計各培養(yǎng)基上形成的紅色菌落，得出假單孢桿菌在各番茄試材植株內(nèi)群體的大小及其分布情況，進行參試材料抗性評價；(3)病圃抗性鑒定①將歷年青枯病發(fā)病病圃作為青枯病鑒定病圃；②將步驟(2)獲得的抗病材料的種子，培育成生長一致的番茄苗后定植于病圃內(nèi)；③調(diào)查統(tǒng)計植株萎蔫率，進行番茄生長結(jié)果期的抗性鑒定；(4)根據(jù)番茄各試材(1)苗期接種鑒定和(2)植株內(nèi)假單孢桿菌群體大小及其分布檢測與(3)病圃鑒定的結(jié)果，進行綜合評價，劃定抗性水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的TZC選擇培養(yǎng)基中TZC的濃度為50mg/L，余量為LB培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明番茄青枯病抗性鑒定方法，屬于蔬菜抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域。該方法由番茄苗期接種鑒定、植株內(nèi)假單孢桿菌群體大小及其分布的檢測及成株病圃抗性鑒定三個階段組成；該方法在傳統(tǒng)的基礎(chǔ)上，增加了植株內(nèi)假單孢桿菌群體大小及其分布的檢測，使番茄苗期或成株期對青枯病菌外在表現(xiàn)的耐受能力與植株內(nèi)在感染病菌的程度及其抑制假單孢桿菌在體內(nèi)擴繁延伸的能力有機地結(jié)合起來，進行綜合評價，劃定抗性水平，從而顯著提高了對參試材料抗番茄青枯病的準確水平。
文檔編號G01N21/78GK1790018SQ20051006201
公開日2006年6月21日 申請日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者楊悅儉, 王榮青, 阮美穎, 葉青靜 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院