專利名稱：篩查痛風(fēng)疑似患者及高尿酸血癥疑似患者血清的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩查痛風(fēng)疑似患者及高尿酸血癥疑似患者血清的方法。
背景技術(shù)：
痛風(fēng)是嘌呤代謝紊亂及(或)尿酸排泄減少所引起的一類疾病。臨床特點(diǎn)為高尿酸血癥(hyperuricemia)、反復(fù)發(fā)作的急性單一關(guān)節(jié)炎(recurrent acute monoarthritis)、尿酸鈉鹽形成痛風(fēng)石(tophi)沉積、痛風(fēng)石性慢性關(guān)節(jié)炎，若未經(jīng)適當(dāng)治療，最終通常發(fā)展為痛風(fēng)性腎病(gouty nephropathy)。
高尿酸血癥是痛風(fēng)最重要的生化基礎(chǔ)，但并不是痛風(fēng)的同義詞。正常人群中高尿酸血癥的發(fā)病率為5％～10％，但高尿酸血癥患者中只有5％～18.8％最終發(fā)展為痛風(fēng)。因此如果能在高尿酸血癥的發(fā)病階段檢測(cè)到與痛風(fēng)發(fā)病的相關(guān)因子，就可以對(duì)患者進(jìn)行及早治療。目前臨床檢測(cè)只測(cè)定血液中尿酸含量，但臨床上也有少數(shù)患者的尿酸值正常，如果而且能同時(shí)測(cè)定其它相關(guān)嘌呤代謝因子，就能對(duì)高尿酸血癥和痛風(fēng)患者的診斷提供更大的幫助。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩查痛風(fēng)疑似患者及高尿酸血癥疑似患者血清的方法。
本發(fā)明所提供的篩查痛風(fēng)疑似患者及高尿酸血癥疑似患者血清的方法，是檢測(cè)待測(cè)血清中包括黃嘌呤和次黃嘌呤在內(nèi)的嘌呤化合物的含量，如待測(cè)血清中黃嘌呤含量為1.00-2.35mg/L，和/或次黃嘌呤含量為4.1-16.00mg/L，則待測(cè)血清為痛風(fēng)疑似患者血清；如待測(cè)血清中黃嘌呤含量為0.20-1.20mg/L，和/或次黃嘌呤含量為1.30-3.50mg/L，則待測(cè)血清為高尿酸血癥疑似患者血清。
所述嘌呤化合物還包括尿酸、腺苷、鳥苷、2’-脫氧鳥苷、2’-脫氧腺苷、肌苷、2’-脫氧肌苷、腺嘌呤。
所述檢測(cè)待測(cè)血清中嘌呤化合物的方法，包括用高效液相色譜對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行分離，用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)每個(gè)高效液相色譜峰進(jìn)行定性鑒定，用在線紫外檢測(cè)對(duì)包括黃嘌呤和次黃嘌呤在內(nèi)的嘌呤化合物進(jìn)行定量的步驟。
所述檢測(cè)待測(cè)血清中嘌呤化合物的方法中，還包括如下對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行前處理的步驟取1體積待測(cè)血清加入到5體積的甲醇中，在4℃下以12000r/min的速度離心10min，將得到的上清液在50℃下用氮?dú)獯蹈?，將剩余的殘?jiān)尤氲?體積的純水中溶解，然后以12000r/min的速度離心10min，得到的上清溶液即可用于檢測(cè)。
所述高效液相色譜所采用的色譜柱是supelcosil LC-18-DB柱。
所述高效液相色譜分析中，流動(dòng)相為pH6.5的10mM的醋酸銨溶液和甲醇。
所述高效液相色譜分析中，用A和B進(jìn)行如下梯度洗脫0min至10min100％A0％B16min 92％A 8％B30min 80％A 20％B60min 0％A 100％B；所述A為pH6.5的10mM醋酸銨溶液，所述B為甲醇；所述百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。
所述串聯(lián)質(zhì)譜分析中的質(zhì)譜條件為干燥氣(N2)流量8.0L/min；霧化氣(N2)流量1.72×105Pa；干燥氣溫度325℃；目標(biāo)質(zhì)量參數(shù)200m/z；化合物穩(wěn)定性參數(shù)60％；離子阱驅(qū)動(dòng)度50％；ICC目標(biāo)參數(shù)20000。
本發(fā)明創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)了高尿酸血癥和痛風(fēng)的相關(guān)因子黃嘌呤和次黃嘌呤，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)血清中黃嘌呤和次黃嘌呤，并通過(guò)外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行定量；通過(guò)檢測(cè)血清中黃嘌呤和次黃嘌呤的含量，即可篩查出痛風(fēng)疑似患者及高尿酸血癥疑似患者。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便，避免了使用昂貴的同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，使得此方法易于在臨床上應(yīng)用，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)并進(jìn)行早期治療有重要的參考價(jià)值。


圖1是10種嘌呤化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液HPLC色譜分離圖(254nm下)圖2是10種嘌呤化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入空白血清的HPLC色譜分離圖(254nm下)圖3是其中一名痛風(fēng)患者血清的HPLC色譜分離圖(254nm下)圖4是其中一名無(wú)癥狀高尿酸血癥患者血清的HPLC色譜分離圖(254nm下)圖5是其中一名正常人血清的HPLC色譜分離圖(254nm下)具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、檢測(cè)血清中10種嘌呤化合物的方法標(biāo)準(zhǔn)品尿酸、次黃嘌呤和黃嘌呤購(gòu)自Fluka公司；腺嘌呤、腺苷、肌苷、鳥苷、2’-脫氧腺苷、2’-脫氧肌苷、2’-脫氧鳥苷購(gòu)自Sigma公司。
本方法通過(guò)高效液相色譜(HPLC)對(duì)血清進(jìn)行分離，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)對(duì)每個(gè)色譜峰進(jìn)行定性鑒定，用在線紫外檢測(cè)(UV)對(duì)10個(gè)嘌呤化合物進(jìn)行定量。其具體操作過(guò)程如下
一、樣品前處理將于-80℃下保存的冰凍牛血清(作為空白對(duì)照)、正常人血清、痛風(fēng)患者血清、無(wú)癥狀高尿酸血癥患者血清分別在冰浴中慢慢融解，然后取0.1mL上清液加入到500μL甲醇中，在4℃下以12000r/min的速度離心10min，使上清液中的蛋白沉淀。轉(zhuǎn)移出上清液，將其在50℃下用氮?dú)獯蹈?，將溶液吹干后剩余的殘?jiān)尤氲?00μL純水中溶解，然后以12000r/min的速度離心10min，取離心后的上清溶液用于進(jìn)樣檢測(cè)。
二、色譜及質(zhì)譜條件1、色譜條件儀器Agilent 1100series LC/MSD Trap色譜柱supelcosilTMLC-18-DB柱(25cm×4.6mm(id)，填料膜厚5μm).
流動(dòng)相A10mM的醋酸銨溶液，用冰醋酸和氨水調(diào)至pH＝6.5B甲醇流速1mL/min柱溫25℃進(jìn)樣量20μL梯度洗脫程序(每次進(jìn)樣之間平衡柱子10分鐘)時(shí)間(min)A％(體積百分?jǐn)?shù))B％(體積百分?jǐn)?shù))0100010 100016 92 830 80 2060 0 10070 0 1002、在線紫外檢測(cè)條件利用Agilent 1100series LC/MSD Trap系統(tǒng)自帶的紫外檢測(cè)器用254nm紫外線進(jìn)行紫外檢測(cè)。
3、質(zhì)譜條件質(zhì)譜檢測(cè)在ESI電離負(fù)離子模式下進(jìn)行，電離電壓為3.5KV。質(zhì)譜優(yōu)化后條件為干燥氣(N2)流量8.0L/min；霧化氣(N2)流量1.72×105Pa；干燥氣溫度325℃；目標(biāo)質(zhì)量參數(shù)200m/z；化合物穩(wěn)定性參數(shù)60％；離子阱驅(qū)動(dòng)度50％；ICC目標(biāo)參數(shù)20000。
三、檢測(cè)(1)質(zhì)譜定性鑒定所有色譜峰都做自動(dòng)的二級(jí)質(zhì)譜。將10個(gè)嘌呤化合物標(biāo)準(zhǔn)品(尿酸，次黃嘌呤，黃嘌呤，腺嘌呤，肌苷，鳥苷，2’-脫氧肌苷，2’-脫氧鳥苷，腺苷和2’-脫氧腺苷)溶于10mM的醋酸銨中，使其終濃度均為5mg/L。鑒定每種嘌呤化合物的母離子和子離子碎片，如表1所示表1.10種嘌呤化合物的質(zhì)譜鑒定母離子和子離子

表1表明，其中堿基的母離子容易掉43(HNCO)的碎片，核苷類母離子易脫掉132(核糖)的碎片，脫氧核糖母離子易脫掉116(脫氧核糖)的碎片。這些特征丟失對(duì)于定性鑒定這些化合物是非常有意義的。
(2)HPLC對(duì)10種嘌呤化合物標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果將上述10種嘌呤化合物標(biāo)準(zhǔn)品配成標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，在步驟二的色譜條件下進(jìn)行HPLC色譜分離(254nm)，其分離效果如圖1所示，表明在步驟二的色譜條件下，該10種嘌呤化合物可得到很好的分離。圖1中，1是尿酸，2是次黃嘌呤，3是黃嘌呤，4是腺嘌呤，5是肌苷，6是鳥苷，7是2’-脫氧肌苷，8是2’-脫氧鳥苷，9是腺苷，10是2’-脫氧腺苷。
在經(jīng)步驟一處理的作為空白對(duì)照的牛血清中加入上述10種嘌呤化合物標(biāo)準(zhǔn)品，在步驟二的色譜條件下進(jìn)行HPLC色譜分離(254nm)，其分離效果如圖2所示，表明在步驟二的色譜條件下，該10種嘌呤化合物可得到很好的分離。圖2中，1是尿酸，2是次黃嘌呤，3是黃嘌呤，4是腺嘌呤，5是肌苷，6是鳥苷，7是2’-脫氧肌苷，8是2’-脫氧鳥苷，9是腺苷，10是2’-脫氧腺苷。
(3)定量工作曲線制定除尿酸外，所有標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備液(水溶液)濃度為20mg/L，尿酸儲(chǔ)備液(水溶液)的濃度為50mg/L。由儲(chǔ)備液稀釋得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液(水溶液)，繪制工作曲線，如表2所示。
表2.10種嘌呤類化合物的檢出限和工作曲線

注工作曲線中的y為峰面積，x為濃度(ug/L)。
其中檢出限為3倍信噪比，定量下限為5～10倍信噪比，工作曲線范圍均為3個(gè)數(shù)量級(jí)，方法的檢出限較其它的方法低1倍，所有化合物工作曲線的R2都超過(guò)0.999，線性良好。
(4)方法的日內(nèi)精密度一日內(nèi)重復(fù)7次測(cè)定一份高尿酸血癥患者血清樣品—血清-空白和三份加樣樣品(1mL原始患者血清樣品中復(fù)溶各100ng的上述10種嘌呤類化合物得到加樣樣品—血清-低，1ml原始血清樣品中復(fù)溶各500ng的上述10種嘌呤類化合物得到加樣樣品—血清-中，1ml原始血清樣品中復(fù)溶各5μg的上述10種嘌呤類化合物得到加樣樣品—血清-高)中10種嘌呤類化合物的含量，精密度結(jié)果如表3所示。
表3中的數(shù)據(jù)表明，方法的日間精密度的CV基本都低于10％，高濃度樣品的精密度要優(yōu)于低濃度樣品的精密度，總體的精密度能夠滿足臨床檢測(cè)的需要，而且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)在臨床檢測(cè)尿酸的方法。
(5)方法的日間精密度分別在7日內(nèi)每日測(cè)定一份高尿酸血癥患者血清樣品—血清-空白和一份加樣樣品(在1ml原始血清樣品中復(fù)溶各500ng的上述10種嘌呤類化合得到加樣樣品—血清-加樣)中10種嘌呤類化合物的含量精密度結(jié)果如表4所示
表3.血清樣品的日內(nèi)精密度

表4.血清樣品的日間精密度

表4表明，雖然日間精密度略高于日內(nèi)精密度，但基本都在20％以內(nèi)，其中低濃度的精密度稍差，但是方法足夠滿足目前臨床檢測(cè)需要。
(6)方法的回收率分別測(cè)定7份三種不同濃度加樣血清樣品(1mL原始患者血清樣品中復(fù)溶各100ng的上述10種嘌呤類化合物得到加樣樣品—血清-低，1ml原始血清樣品中復(fù)溶各500ng的上述10種嘌呤類化合物得到加樣樣品—血清-中，1ml原始血清樣品中復(fù)溶各5μg的上述10種嘌呤類化合物得到加樣樣品—血清-高)中加樣的回收率，結(jié)果如表5所示
表5.方法回收率

表5表明，三個(gè)濃度的加樣血清樣品的回收率都高于85％，絕大多數(shù)都高于90％，在血液等復(fù)雜基質(zhì)的檢測(cè)中屬于非常好的結(jié)果。而且每個(gè)濃度回收率的CV％都小于10，絕大多數(shù)都低于5，也完全能滿足臨床檢測(cè)的需要。
實(shí)施例2、檢測(cè)正常人、痛風(fēng)和無(wú)痛風(fēng)癥狀高尿酸血癥患者的血清中嘌呤化合物臨床選擇男性未治療痛風(fēng)患者49名，未治療無(wú)痛風(fēng)癥狀高尿酸血癥患者20名，正常人35名。每名受檢者靜脈抽取血樣2mL，血樣經(jīng)離心得到血清后，采取與實(shí)施例1同樣的檢測(cè)步驟進(jìn)行對(duì)血清中10種嘌呤化合物進(jìn)行定性定量檢測(cè)，痛風(fēng)，無(wú)癥狀高尿酸血癥患者和正常人血清的HPLC檢測(cè)圖譜如圖3、圖4和圖5所示。圖3、圖4和圖5中，1是尿酸，2是次黃嘌呤，3是黃嘌呤，4是腺嘌呤，5是肌苷，6是鳥苷，7是2’-脫氧肌苷，8是2’-脫氧鳥苷，9是腺苷，10是2’-脫氧腺苷。在所檢測(cè)的10種嘌呤化合物中，有8種含量有差別，含量有差別的8種嘌呤化合物定量檢測(cè)結(jié)果如表6所示表6.正常人，痛風(fēng)和高尿酸血癥患者血清中嘌呤化合物的含量


注表中數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
表6表明，兩類患者及正常人血清中黃嘌呤和次黃嘌呤的含量差別較大，由t檢驗(yàn)兩者存在顯著性差異(P＜0.01)。因此黃嘌呤和次黃嘌呤是區(qū)分兩類患者較好的代謝標(biāo)志物，監(jiān)控?zé)o癥狀高尿酸血癥患者血液中此兩個(gè)化合物的含量，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)并進(jìn)行早期治療有重要的參考價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種篩查痛風(fēng)疑似患者及高尿酸血癥疑似患者血清的方法，是檢測(cè)待測(cè)血清中包括黃嘌呤和次黃嘌呤在內(nèi)的嘌呤化合物的含量，如待測(cè)血清中黃嘌呤含量為1.00-2.35mg/L，和/或次黃嘌呤含量為4.1-16.00mg/L，則待測(cè)血清為痛風(fēng)疑似患者血清；如待測(cè)血清中黃嘌呤含量為0.20-1.20mg/L，和/或次黃嘌呤含量為1.30-3.50mg/L，則待測(cè)血清為高尿酸血癥疑似患者血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述嘌呤化合物還包括尿酸、腺苷、鳥苷、2’-脫氧鳥苷、2’-脫氧腺苷、肌苷、2’-脫氧肌苷、腺嘌呤。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)待測(cè)血清中嘌呤化合物的方法，包括用高效液相色譜對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行分離，用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)每個(gè)高效液相色譜峰進(jìn)行定性鑒定，用在線紫外檢測(cè)對(duì)包括黃嘌呤和次黃嘌呤在內(nèi)的嘌呤化合物進(jìn)行定量的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)待測(cè)血清中嘌呤化合物的方法中，還包括如下對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行前處理的步驟取1體積待測(cè)血清加入到5體積的甲醇中，在4℃下以12000r/min的速度離心10min，將得到的上清液在50℃下用氮?dú)獯蹈?，將剩余的殘?jiān)尤氲?體積的純水中溶解，然后以12000r/min的速度離心10min，得到的上清溶液即可用于檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述高效液相色譜所采用的色譜柱是supelcosil LC-18-DB柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述高效液相色譜分析中，流動(dòng)相為pH6.5的10mM的醋酸銨溶液和甲醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述高效液相色譜分析中，用A和B進(jìn)行如下梯度洗脫0min至10min 100％A 0％B16min92％A8％B30min80％A20％B60min0％A 100％B；所述A為pH6.5的10mM醋酸銨溶液，所述B為甲醇；所述百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述串聯(lián)質(zhì)譜分析中的質(zhì)譜條件為所述串聯(lián)質(zhì)譜分析中的質(zhì)譜條件為干燥氣流量8.0L/min；霧化氣流量1.72×105Pa；干燥氣溫度325℃；目標(biāo)質(zhì)量參數(shù)200m/z；化合物穩(wěn)定性參數(shù)60％；離子阱驅(qū)動(dòng)度50％；ICC目標(biāo)參數(shù)20000。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種篩查痛風(fēng)疑似患者及高尿酸血癥疑似患者血清的方法。本發(fā)明所提供的篩查痛風(fēng)疑似患者及高尿酸血癥疑似患者血清的方法，是檢測(cè)待測(cè)血清中包括黃嘌呤和次黃嘌呤在內(nèi)的嘌呤化合物的含量，如待測(cè)血清中黃嘌呤含量為1.00－2.35mg/L，和/或次黃嘌呤含量為4.1－16.00mg/L，則待測(cè)血清為痛風(fēng)疑似患者血清；如待測(cè)血清中黃嘌呤含量為0.20－1.20mg/L，和/或次黃嘌呤含量為1.30－3.50mg/L，則待測(cè)血清為高尿酸血癥疑似患者血清。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便，避免了使用昂貴的同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，使得此方法易于在臨床上應(yīng)用，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)并進(jìn)行早期治療有重要的參考價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N30/60GK1854730SQ200510064468
公開(kāi)日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2005年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月18日
發(fā)明者羅國(guó)安, 王義明, 趙基源, 梁瓊麟, 張?chǎng)? 蔣明, 吳建新 申請(qǐng)人:清華大學(xué)