專利名稱：一種中藥復方二次新藥開發(fā)的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種中藥新藥開發(fā)的方法，特別關于一種在現代中醫(yī)藥理論指導下，通過對中藥復方配伍的研究，進行二次新藥開發(fā)的方法。
背景技術：
中藥復方是中醫(yī)用藥的精髓，隨看天然藥物提取物廣泛運用于疾病藥物治療的替代治療，中藥特別是中藥復方受到了藥物研究人員的普遍重視，其治療效果也獲得了廣泛認同，但是由于長期整體用藥和宏觀治療理念的影響，中藥治療并不能很好的融入現代藥物治療體系，也不能完善地從組分的角度說明藥物作用的確切物質基礎，這使得中藥的發(fā)展以及國際化受到了干擾，阻礙了中藥的進一步發(fā)展。由于中藥學是新藥學的基礎，中藥復方的相關內容又是中藥學的靈魂和中醫(yī)用藥的最重要的方式，因此完全有可能，在未來新的藥學研究體系中，其藥物配合使用的規(guī)律，將會以中藥復方的研究為基礎和核心。同時中藥復方在中醫(yī)藥學理論體系中，是醫(yī)和藥的重要聯結點，即既能體現中藥學相關理論和內容，又能體現中醫(yī)學的相關理論和內容。故中藥復方的現代研究，不僅是中藥學現代化的重要組成部分，更能促進中醫(yī)學的現代化。
中藥復方，在中醫(yī)藥學理論體系中，是臨床使用的最基本、最重要的形式；獨特的組方規(guī)律，體現著中醫(yī)藥理論的特色；致病因素的多樣性和機體的復雜性，也只有以多種藥物的配合使用，才能更有效的防治疾病。隨著科學發(fā)展和社會進步，人們知識和認識水平的提高，對中藥復方提出新的要求并進行了一定程度的研究，中藥復方的現狀，已與古代不完全相同，對中藥復方的研究現在主要是從以下三個方面進行的1、按傳統(tǒng)的方法所做的研究，亦即按照古代的科學知識和技能所做的研究，主要是結合臨床應用，對已有復方進行加減化裁或者組成新的復方。這種研究方法適應了臨床的要求，但總的來看，對中藥復方的相關內容，如組方規(guī)律，已有復方組合的合理性等，沒有較大的進展。這使得在中藥復方的數量上有很大的增加，但是質量上沒有什么太大的提高，這樣帶來的直接問題是使得現代根據復方生產中成藥的工作缺少規(guī)范性。不過，近些年，這種研究狀況有所改觀，研究人員漸漸將重點放在組方規(guī)律、療效確認、優(yōu)劣對比等方面，這樣使得可以去劣存優(yōu)，精練了組方的嚴密性。2、按中醫(yī)藥學理論所做的現代科學研究，這方面的研究所做面較廣，但深入不多。這個方面的研究主要是生物活性方面研究較多，化學成分研究較少；確證復方中藥的整體性研究較多，而將復方作為一個整體而給予現代科學闡述的研究較少；對中藥復方進行拆方研究多，對中藥復方的組方規(guī)律研究少；另外對中藥復方肯定性的研究多，否定性的研究少。由于對中藥復方的系統(tǒng)研究剛剛開始，所以到現在對中藥復方的很多重要方面，缺乏現代科學闡述。如到底中藥復方中哪些化合物真正起到作用(包括主要治療作用和配合作用)，至今能說明這一點的中藥復方，尚未見報道；方中各藥，如何從現代科學角度闡述君臣佐使關系，即將組方規(guī)律給以現代科學闡述，研究結果也很少，因此這一方面研究有待深入。3、按西醫(yī)藥學理論所做的現代科學研究，這主要集中在植物化學分離和成分活性篩選等方面，近來出現的高通量藥物篩選也屬于這方面的研究。這種研究方式，通常是將中藥復方作為一種分離分析原料，通過現代生物活性指標的篩選，針對相應的生物活性，研究其全方或全方中部分成分乃至單體化合物，從而尋找新的藥物?，F在有治療感冒、氣管炎、降低血壓等多方面疾病的藥物，有不少來自復方，這里不再舉例。但是這種研究方式，脫離了中醫(yī)藥學理論體系，在使用時不再考慮組方規(guī)律，機體的綜合情況-證候等，所以這方面的研究是復方研究的一個很好的借鑒，但需要與中醫(yī)藥理論相結合。
從以上中藥復方研究的現狀看，第2種方式提出了較全面，完整的復方研究體系，但仍然還處于起步階段，中藥有效治療及成分的化學分析工作亟待開展。另外，由于技術原因，中藥的基礎研究多集中于單味藥，很難對由幾味，甚至十幾味藥組成的方劑進行深入研究，難以闡明中藥的治療機理，嚴重制約了中藥的研究和發(fā)展。
目前中藥復方研究的方向可以有以下十條1、復方的拆方研究，主要是研究復方中起主要作用的藥物和成分，它是通過研究單味藥藥理和成分的方法來研究復方，這種方式忽略了復方的整體性。2、復方的整體性研究與方內藥物的協同作用研究，利用全方作用和方中藥對的組合闡明復方作用機理的整體綜合，這方面的研究也越來越受到人們的重視。3、復方配伍關系的研究，復方是兩種或兩種以上的藥物，按一定的法度加以組合，并按一定的分量比例制定的，通過復方的藥理學和組合成分研究，可以了解配伍的實質。4、研究復方來精簡藥物，改進劑型，提高臨床療效，通過復方中藥味的精簡和再配比，提取，可以減少藥味，利于改進藥物形式，便于質量控制。5、改革原方，組成新方，通過對復方的成分和藥效研究，可以發(fā)現新的作用靶位，新的作用環(huán)節(jié)，提示改變原有復方組成，達到新的組方。6、發(fā)現復方的新用途，擴大主治范圍，結合復方成分提取分離，達到發(fā)現新藥物的目的。7、闡明復方的作用機理，方劑學中有許多方義、方解非?；\統(tǒng)，在復方研究中可以與具體西醫(yī)理論相結合，對其中模糊之處，可以有一個現代的解釋。8、對復方毒副作用的闡述，復方結合單味藥的成分及藥理學研究，可以解釋復方增效減毒，藥材炮制過程中毒性成分的變化，有利于發(fā)現藥物新的配伍法度。9、復方研究中的辨證用藥與辨病用藥的結合性研究，有利于分解復方的作用靶點靶向，促進藥效學研究。10、結合中醫(yī)藥理論的復方研究，從中醫(yī)用藥理論出發(fā)，結合現代用藥理念，發(fā)掘其中藥物作用規(guī)律和方式，從而推動中醫(yī)藥的現代發(fā)展。
縱觀其中，每一個研究方向中，均與復方的物質基礎相聯系，復方的化學物質基礎以及對它最終的闡釋方式，是復方研究的根本，只有闡明復方的物質基礎，物質形式才能對復方用藥的精髓有所把握。但是，長期以來復方的研究由于物質基礎的表達、作用機理的闡釋以及配伍規(guī)律現代解釋等種種制約因素的影響，尚不能形成一條完整合理的研究途徑。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是結合已有的研究方向，提出一種綜合整體的中藥復方二次新藥開發(fā)的方法，利用本方法可以結合現代化學和藥效學研究結果，結合中藥指紋圖譜這一有效途徑，對可靠穩(wěn)定的數據結果進行分析，對中藥復方進行再評價和解釋，從疾病和復方中對應活性組分相關性的角度，看待復方組合及治療的針對性，從而對中藥復方進行再次配伍或者組合，發(fā)展出療效明確，作用明顯的復方新藥。
為實現上述目的，本發(fā)明采取以下技術方案一種中藥復方二次新藥的開發(fā)方法，其包括以下步驟(1)選擇中醫(yī)長期使用的古方或驗方，根據其中藥物的性味，結合長期臨床應用的經驗和疾病治療情況，進行藥物成分和配伍分析，并結合疾病的中醫(yī)理論，對藥材進行合并和拆減，實現在整體藥材層次上對復方的再認識；(2)對各藥材進行化學物質基礎分析，并利用指紋圖譜綜合分析藥材以及藥材組合物中物質成分，將復方組成物質群進行組分鑒別和歸類；(3)通過步驟(2)的指紋圖譜分析結果，以及不同藥材及其組合物的藥理實驗結果，結合現代中醫(yī)用藥理論，在對原方增效或減毒的基礎上提出新的藥味配伍組合；(4)對新藥復方進行指紋圖譜分析和化學成分鑒定，并確定新藥復方的生產工藝；(5)運用均勻設計方案設計組方配比，分別進行相關藥效藥理實驗，比較各組方的實驗結果，最終確定新藥復方組方的最佳配比。
步驟(1)中的對藥材進行合并和拆減，包括對復方各藥材根據性味和臨床藥用功能的不同進行分類，把性味或臨床藥用性質相同或相近相近的藥材歸并為一類，并在中醫(yī)理論指導下，針對某些來源稀少或價格昂貴的藥味進行拆減，或使用替代品。
步驟(2)中的化學物質基礎分析，包括使用現代化學分離和分析手段，對各味藥材中的化學成分進行鑒定，并按照化學性質和藥理藥效性質進行分類，從化學層次上闡釋復方的組成物質群。
步驟(2)中的利用指紋圖譜綜合分析藥材以及藥材組合物中物質成分，包括用中藥指紋圖譜技術定性或定量分析藥材、藥材組合物、復方中的物質成分，對復方中源于不同藥材的各成分的來源進行分析，并按照各物質成分化學結構和藥理藥效性質的不同進行分類，得到具備不同化學結構和藥理藥效性質的化學組分群。
步驟(3)中的新的藥味配伍組合，包括根據不同藥味的主要化學成分及藥理藥效性質，在中醫(yī)理論指導下，以增效或減毒為原則，進行重新組合或者加減味、拆方，形成新的藥味配伍組合。
步驟(4)中的確定新藥復方的生產工藝，包括對復方進行指紋圖譜分析和化學成分鑒定，確定其中的主要有效成分，以主要有效成分的含量為指標調整相關工藝參數，確定新藥復方的最佳工藝。
步驟(5)中的均勻設計方案，包括根據均勻設計方案，設計含有不同相對比例的各味藥材的新藥組方，從中篩選除最優(yōu)組方方案。
步驟(5)中的各組方的實驗結果，包括按照不同新藥組方制備新藥，進行相關藥理藥效實驗，根據不同實驗結果綜合考察各組方新藥的臨床藥效，確定出新藥組方的最佳配比。
本發(fā)明由于采取以上技術方案，其具有以下優(yōu)點1、本發(fā)明選取有獨特療效的中藥名方為新藥開發(fā)對象，其藥效已經千百年來的臨床實踐所證實，很大程度上避免了普通新藥開發(fā)過程中的部分活性研究和活性篩選的復雜過程，大大縮短中藥新藥開發(fā)周期，降低新藥開發(fā)成本和風險。2、本發(fā)明把中藥指紋圖譜技術首次應用于新藥開發(fā)上，克服了傳統(tǒng)的中藥研究方法僅僅著眼于藥材和藥對，通過指紋圖譜技術從化學層面上反應出中藥復雜體系的整體特征和個性特征，從而特別符合中藥特點。與其他新藥開發(fā)手段比較，本發(fā)明有明顯的優(yōu)勢。3、本發(fā)明兼顧傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論和現代化技術手段，在傳統(tǒng)用藥理論指導下，通過長期臨床應用經驗和中藥配伍研究結果，確保中藥的整體療效，而現代化技術手段基本闡釋了中藥復方的藥效物質基礎和作用機理，通過有效的再配伍過程，可以在原方臨床藥效的基礎上，進一步達到增效、減毒的目的。4、本發(fā)明針對中藥復方中部分藥材來源稀少或價格昂貴等特點，在中醫(yī)用藥理論指導下，結合現代化學分析技術和中藥指紋圖譜技術，在保證中藥有效性和安全性的基礎上，使用替代品重新組方，是一種“綠色中藥”，符合時代發(fā)展的潮流。5、本發(fā)明提供了一種對中藥傳統(tǒng)方劑進行現代化新劑型轉化的新方法新思路。傳統(tǒng)中藥復方多為丸、散、膏、丹等劑型，服用不便、起效慢、技術含量低，本發(fā)明結合使用中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論和現代技術手段，把傳統(tǒng)中藥開發(fā)成為有效的現代化制劑，提高了產品的技術含量和附加值，從而使祖國傳統(tǒng)醫(yī)學煥發(fā)出新的活力。6、本發(fā)明通過藥味再配伍研究，根據各藥味的藥效大小進行加減拆方，不僅實現了增效、減毒，而且可以使新藥適應癥的針對性更強，即針對某些病癥，容易開發(fā)出的新藥有著更佳的療效，從而開發(fā)出有明確適應癥的獨具市場前景的中藥新藥。


圖1為板藍根藥材指紋圖譜(254nm)圖2為珍珠母和水牛角水解液指紋圖譜(254nm)圖3為金銀花藥材指紋圖譜(254nm)圖4為梔子藥材指紋圖譜(254nm)圖5為黃芩藥材指紋圖譜(254nm)圖6為膽酸藥材指紋圖譜圖7為清開靈全方HPLC/ELSD指紋圖譜圖8為水牛角和珍珠母藥對有效組分指紋圖譜圖9為黃芩和梔子藥對有效組分指紋圖譜圖10為板藍根和金銀花藥對有效組部分指紋圖譜圖11為膽酸和豬去氧膽酸藥對指紋圖譜圖12為板藍根加梔子指紋圖譜圖13為珍珠母水解液指紋圖指紋圖譜圖14為清開靈一級質譜指紋圖譜圖15為清開靈二級質譜指紋圖譜圖16為水牛角有效部分的指紋圖譜(CE)圖17為珍珠母有效組分的指紋圖譜(ICP/MS)圖18為梔子提取物(主峰為梔子苷按色譜歸一化計算梔子苷占總固體物75％)圖19為黃芩提取物指紋圖譜(黃芩苷含量93％)圖20為珍珠母水解液和梔子提取物混合液指紋圖譜圖21為小方注射液指紋圖譜(9號為梔子苷，12號為黃芩苷)圖22為梔子部分指紋圖譜圖23為黃芩藥材指紋圖譜(254nm)
圖24為膽酸藥材指紋圖譜圖25為小方注射液指紋圖譜圖26為小方與清開靈原方指紋圖譜對比圖27為小方生產工藝流程28為不同配比組方對缺血腦組織TNF-α含量的影響圖29為不同配比組方對缺血腦組織IL-1β含量的影響圖30為不同配比組方對腦缺血大鼠血漿vWF含量的影響圖31為不同配比組方對腦缺血大鼠血清NSE含量的影響圖32為不同配比組方對缺血腦組織iNOS活性的影響圖33為不同配比組方對缺血腦組織MDA含量的影響具體實施方式
下面結合附圖，并以清開靈注射液的二次新藥開發(fā)為例，對本發(fā)明方法進行詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不應限于此實施例，根據本發(fā)明的方法，可以對各種中藥復方進行二次新藥的開發(fā)。
一、清開靈注射液基本方劑分析1、清開靈注射液源于古方安宮牛黃丸清開靈注射液是70年代由北京中醫(yī)學院(現北京中醫(yī)藥大學)主持研發(fā)的中藥新制劑，它是由古方安宮牛黃丸方通過拆方改制而成。安宮牛黃丸為傳統(tǒng)名貴中成藥，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神、避穢開竅的功能，藥效顯著，故和“紫雪丹”，“局方至寶丹”通稱“溫病三寶”，但由于原方藥材稀缺，價格較貴，直接影響安宮牛黃丸的生產，且對昏厥等病人不能產生急救作用，因此對原方需進行改造。
安宮牛黃丸方牛黃、郁金、犀角、黃連、朱砂、冰片、麝香、珍珠、山梔、雄黃、黃芩上述藥材細粉制成蜜丸，金箔為衣，蠟護，其中脈虛者人參湯服下，脈實者銀花、薄荷湯服下。
以上藥材分為四大類藥物(1)牛黃、犀角和珍珠為主藥(君)，主要成分為膽酸類和氨基酸類；(2)冰片、郁金、麝香、雄黃為輔藥(臣)，大多為揮發(fā)性成分，其中冰片及郁金油為有效物質；(3)黃連、黃芩和梔子與1類物質配伍相合(佐)，主要有黃芩素、小檗堿、梔子苷及藏紅花素類；
(4)朱砂、金箔、人參、銀花和薄荷等(使)，其中銀花與(3)類物質相合，薄荷與(2)類物質相合(使)；以上四類藥材按功用及所含成分理化性質分類可有兩大類物質成分第一類為具有清熱解毒，鎮(zhèn)靜安神類，有牛黃、犀角、珍珠、黃連、黃芩、銀花、梔子等藥材，含膽酸類、氨基酸類、黃芩素、小檗堿、梔子苷、綠原酸及藏紅花素等，可溶于水，均為治療溫病之本的物質成分；第二類是芳香開濁，避穢開竅類，有冰片、郁金、麝香、薄荷、雄黃等，大多為芳香揮發(fā)物質，可溶于醇及有機溶劑，為治療溫病之標的物質成分。
因此從安宮牛黃丸方可拆為兩個方劑，即清開靈1號和2號，其中清開靈1號為現在的清開靈注射液。
清開靈注射液的配方如下膽 酸3.25g 豬去氧膽酸3.75g 水牛角25.0g黃芩苷5.0g 珍珠母50.0g 梔子25.0g板藍根200.0g金銀花提取液5.0g注射用水 適量使成全量為1000mL清開靈注射液方證如下牛黃 改為膽酸、豬去氧膽酸為主藥，具有清熱鎮(zhèn)驚，開竅的作用，主要成分為膽酸與豬去氧膽酸；水牛角與珍珠母 水牛角為犀角的代用品，二者均含角蛋白，其中氨基酸種類和含量相似，藥理實驗說明對動物強心、鎮(zhèn)靜、解毒等作用相似，水牛角原粉或水解液組成的單方或復方制劑，功用與犀角相似；珍珠母為養(yǎng)殖的馬氏珍珠貝的貝殼珍珠層，其與珍珠所含的氨基酸基本相同，有清熱解毒，安神養(yǎng)明功效；水牛角與珍珠母混合水解液含14種以上氨基酸，其與膽酸類成分構成方劑的主藥；黃芩與金銀花 注射液以黃芩和金銀花的有效部位入藥，黃芩中主要有黃芩苷；金銀花中主要為綠原酸，與黃芩可以組成銀黃注射液，二者具有清熱除濕，消炎解毒，可輔助膽酸與混合氨基酸起到清熱解毒的功能；梔子 安宮牛黃丸中，梔子與黃芩，黃連合用，可協助瀉心及三焦火，其中所含梔子苷、藏紅花素類成分有消炎利膽的功能，清熱解毒，瀉火除煩。但清開靈注射液中只用梔子一味瀉火解毒，由于梔子提取物的收率不穩(wěn)定，在處方中以飲片入藥；板藍根 該藥材是根據中醫(yī)藥理論，除去黃連后，加入板藍根，用于保證處方清熱解毒的作用，其中成分主要為靛苷及氨基酸類成分，處方中起到佐使的作用，用量為板藍根注射液的2/5量。
作為一個有一定臨床使用經驗的中藥新型制劑，清開靈注射液有著穩(wěn)定的臨床應用面，特別是腦部栓塞性疾病的急救，臨床醫(yī)生廣為使用。清開靈注射液是一個脫胎于古方的現代中藥制劑，有著完備的中醫(yī)藥配伍規(guī)律，同時具備現代化學物質成分基礎，現代應用中臨床針對性較強，它的質量控制研究、成分與臨床效應相關性研究、物質成分闡釋、現代有效部位配伍規(guī)律研究都將為中藥的現代研究提供思路和方法。
2、清開靈注射液基本配伍關系和藥性特征清開靈注射液由八味藥材或提取物組成，有三大類成分組成，包括無機離子、有機小分子和生物大分子，“清開靈”注射液八味藥材和提取物的基本成分組成情況如下珍珠母和水牛角無機離子和多肽，氨基酸；膽酸和豬去氧膽酸膽酸、去氧膽酸、異去氧膽酸；黃芩黃芩苷及其類似物，其中80％以上為黃芩苷；梔子環(huán)烯醚萜苷、有機酸和色素；板藍根靛苷和氨基酸，其中經測定靛苷含量極少；金銀花綠原酸、異綠原酸等有機酸；藥物通過一定的配伍組成方劑，既可以發(fā)揮出藥物整體綜合的作用，又能夠調和藥物之間的偏勝，發(fā)揮出藥物應有的治療功能。
從復方的配伍情況看，君臣佐使的配伍原則一般為二味以上藥物的配合，而兩種藥物或少量藥物間常從七情合和的角度去看待藥物配合關系。實際上，在一個大的復方中，藥物可以按照藥物的功效和性味劃分一定的組合，從而復方可以看作由不同的相須藥物的組合組成的復合關系。在清開靈注射液中，具有如下的君臣佐使關系(如表1所示)表1 清開靈注射液藥物配伍關系

根據藥物性味和功效，藥物可以劃為黃芩/梔子、金銀花/板藍根、水牛角/珍珠母、膽酸/豬去氧膽酸四個組合，從七情合和的角度看，均為相須使用的藥物，各個組合又通過相互間的配合組成了全方。
各味藥材的藥性如下梔子瀉火除煩，清熱利濕，涼血止血。本品苦寒降泄，輕清上行，表里有熱時可起雙解之效。能瀉心、肺、胃火而除煩止嘔，且能去肌膚之熱，清泄三焦?jié)駸帷Ｈ∑浣舛纠蛐?，可治黃疸；以其涼血解毒作用，可治血淋瘡瘍。
膽酸和豬去氧膽酸在清開靈注射液中，原作為人工牛黃的替代。一般來說作用是，清熱解毒，息風止痙，化痰開竅。本品味苦性涼，其氣芬芳，走肝經，有涼肝息風定驚之效。入心經，有清心開竅豁痰之功，且有良好的涼血解毒功能，常用于熱病神昏譫語、中風痰迷昏厥、及驚風抽搐、驚厥等。
黃芩清熱燥濕，止血，安胎。本品苦能燥濕，寒能清熱，為清熱燥濕之品，能清肺、大小腸、脾、膽諸經之濕熱，而尤長于泄肺火，行肌表，清大腸之熱。常用于熱病煩熱不退，或肺熱咳嗽，或濕熱泄痢，以及黃疸、目赤、胎熱不安等癥。凡上、中二焦?jié)駸嵝盎鹬Y，最為常用。
板藍根清熱涼血解毒。本品苦寒，清熱涼血能力較強，長于清利咽喉。為清熱解毒之要品，是治療咽喉腫痛，頭面丹毒、發(fā)頤、熱病發(fā)斑的常用藥?，F臨床常用于治療病毒性傳染病。板藍根較偏于降。
金銀花清熱解表，涼血止痢。本品甘寒輕揚，氣味芳香。甘寒解毒，既可清氣分邪熱，又可解血中熱毒。輕揚宣散，既能疏解表邪，又能透熱外出，為溫熱并初起及熱毒瘡癰的要藥。
水牛角清熱解毒，涼血定驚。本品苦寒。歸心，肝經。用于溫病高熱，神昏譫語，發(fā)斑發(fā)疹，吐血，驚風，癲狂。
珍珠母平肝潛陽，清肝明目。本品咸寒質重，歸心、肝經，既能清心肝二經之熱，又能平肝陽，鎮(zhèn)心神。故凡心肝熱盛，陽浮于上的眩暈耳鳴、心悸失眠、癲狂驚悸及肝虛目暗、肝熱目赤之癥均可用之。
黃芩/梔子藥對黃芩苦寒，其治在肺，偏于清瀉上中二焦火熱，酒炒偏于入氣分，清降肺中之熱，治上焦?jié)駸?。梔子苦寒，其治在三焦，善清三焦火熱，祛濕解毒，清血分郁熱又能止血。二藥相須為用，降泄同施，氣血并治。且黃芩得梔子的幫助清肺之伏火之力增加，梔芩合用，能清三焦，肺熱，止血熱妄行。
板藍根/金銀花藥對板藍根苦寒，能清熱解毒，涼血利咽。金銀花性味甘寒，氣味芳香，功能清熱解毒，性平穩(wěn)而功效顯著。二者配伍為相須之中又兼調和之義。
膽酸/豬去氧膽酸藥對、珍珠目/水牛角藥對可以加強清熱解毒、定驚息風、豁痰開竅的功力。
二、清開靈注射液的化學成分分析1、清開靈注射液藥材成分分析在對清開靈全方的藥材成分研究中，對藥材按工藝提取物進行了一系列的物質成分分析，其中板藍根含有一定量腺苷類成分和一些氨基酸(具強烈的茚三酮反應)。常見的靛藍、靛玉紅等色素類成分在清開靈注射液中未檢出。
金銀花通過提取分離，可以確定其中含有喹尼酸、木樨草素、咖啡酸、綠原酸、異綠原酸等成分。
水牛角水解液中含有氨基酸(工藝不同會含有少量雜蛋白)以及處于游離和結合態(tài)的微量元素。
珍珠母含有95％碳酸鈣，經過水解及沉淀，除去大量的鈣，仍存留少量鈣，和其它微量元素，主要以螯合物形式存在，其中角蛋白經過水解過程大部分變?yōu)榘被?，不排除尚存有少量的雜蛋白及多肽物質存在。
膽酸含膽酸90％以上。
豬去氧膽酸含豬去氧膽酸90％以上。
黃芩苷含黃芩苷90％以上。
梔子經過對梔子指紋圖譜的研究和相應成分分類，大致將梔子提取物的成分為梔子苷類(含京尼平苷，異羥梔子苷等)、有機酸類(綠原酸，熊果酸等)、色素類(藏紅花素、梔子黃、梔子藍、梔子紅等)、多糖類，在分離提取中，運用大孔樹脂進行分段分離收集，得到梔子苷部分和多糖類，上兩類成分中混雜有色素及有機酸。
2、清開靈注射液中間品成分分析對清開靈注射液中間品的分析，包括各藥材提取物、各中間品混配液和成品等十幾個樣品。通過HPLC/DAD/MS，確定了各中間品有關成分的分子量，進而對清開靈注射劑物質成分及其變化規(guī)律做出分析。如圖1～6所示，是板藍根、水解液、金銀花、梔子、黃芩、膽酸的HPLC/UV指紋圖譜，如圖7所示，是清開靈全方的HPLC/ELSD指紋圖譜；如圖8～11所示，是水牛角/珍珠母、黃芩/梔子、板藍根/金銀花、膽酸/豬去氧膽酸四種藥對的指紋圖譜，如圖12、圖13所示，是板藍根+梔子藥材組合物指紋圖譜和珍珠母水解液指紋圖譜；如圖14、圖15所示，是清開靈一級質譜指紋圖譜和二級質譜指紋圖譜。
實施例中分析的中間品樣品編號、名稱及規(guī)格401牛膽酸3.25mg/mL402膽酸 3.75mg/mL403黃芩提取物5.00mg/mL404梔子提取物25.00mg/mL405金銀花提取物 5.00mg/mL406板藍根提取物 200.00mg/mL407珍珠母+水牛角水解液 珍珠母50.00mg/mL+水牛角25mg/mL408407+板藍根提取物+梔子提取物409408+膽酸液；410清開靈；411注射用水。
11個樣品均進行HPLC/DAD/MS分析，紫外檢測波長為254nm，質譜使用正負離子兩種掃描方式。
清開靈成品的HPLC/UV指紋圖譜，本發(fā)明根據極性大小，把整個譜圖分為極性區(qū)、中等極性區(qū)和弱極性區(qū)三個部分。
為適應質譜檢測，清開靈指紋圖譜(UV)的獲取條件是A乙腈，B0.01％氨水溶液，0～90分鐘線性梯度，流速1ml/min，色譜柱為ODS-C18。
獲取HPLC/UV圖譜后，再通過HPLC/UV/MS聯用分析各峰的分子量信息，分析結果與上述中間品質譜分析結果進行對照，可以發(fā)現UV指紋圖譜各峰的來源以及清開靈各中間品成分之間的相互作用等規(guī)律。
通過上述分析結果的綜合比較分析，我們得出如下結論從以上數據可以看出，410即清開靈樣品由幾部分組成1、2、3、4、5、6號峰由406(板藍根)而來；8、9、10由407(珍珠母+水牛角水解液)而來；11、12、21、22、23由405(金銀花)而來；13、14、17、19、21由404(梔子)而來；24、25由403(黃芩)而來；膽酸區(qū)同409及402樣品；其余的峰7、15、16、18、20、26、27為新產生的物質峰。從410譜圖可以看出膽酸的峰形(TIC)與409及402有所差別，說明膽酸與其他物質產生了作用。
由物質來源可以看出，清開靈的物質基礎依賴于其每一味藥材的貢獻，不能具體的排除某一味藥物的存在，但是，由具體物質分布可以看出，藥材提供的物質均較為集中于全方的某一部分，有利于下一步的純化。
值得注意的是來自板藍根的物質，主要集中在極性區(qū)，可以單獨分出，比較其剩余部分與全方的藥效差異；另外梔子部分集中在中等極性區(qū)前半部分，黃芩部分在后半部分，與金銀花、梔子部分界限分明，金銀花則交叉分布于中等極性區(qū)；膽酸則在弱極性區(qū)。
由于珍珠母的主要成分為碳酸鈣(＞90％)、角蛋白(3％左右)和其它一些微量元素，故對珍珠母水解液的分析除了角蛋白的水解產物以外，還必須對無機元素進行分析?，F代藥理學研究發(fā)現，鈣是腦出血、腦水腫等疾病癥狀惡化的主要誘因之一，由于鈣離子向細胞內大量內流，激活興奮性谷氨酸，導致癥狀惡化，而清開靈注射液可以拮抗，阻止鈣離子大量內流，減輕癥狀，其中組成藥味珍珠母是其主要離子來源(如鈣、鎂等)，因此有必要對清開靈注射液、珍珠母水解液中鈣含量進行測定，并通過測定中鈣的形態(tài)進行對比。
本發(fā)明通過建立確定鈣的形態(tài)的方法，即用原子光譜法測定樣品中的總鈣含量，再用離子色譜法測定游離態(tài)的鈣含量，由此可以得到鈣在清開靈注射液中的形態(tài)，對清開靈作用于腦水腫的作用機理起到一定的積極作用。采用原子光譜法測定鈣元素，受到的干擾較多，需要采用一些技術消除干擾。本發(fā)明采取消除干擾的方法有兩種1、加入適量的Sr，用來消除；2、將樣品消解，盡量消除由于部分鈣不能原子化造成的干擾。
同時，為了測定水解液中其它的無機元素，將樣品做適當處理后，進行ICP-MS實驗，得到了水解液中微量元素的信息，結論如下珍珠母水解液中總鈣平均含有230PPM左右，而其中以游離狀態(tài)存在的鈣離子平均在50PPM左右，二者存在較大的差異，說明鈣在水解液中主要以結合狀態(tài)的鈣存在。除了鈣以外，水解液中還存在Mg、Si、K、Ti等其他微量無機元素。
3、清開靈注射液成分分析通過以上關于清開靈藥材、中間品和成品的成分分析，包括有機成分和無機成分的分析，并按照提取工藝制備所得樣品的分離以及結合相關對照品的比對，進而通過相關儀器分析方法的確證，基本可以總結清開靈注射液的主要成分如下(1)膽汁酸類成分去氧膽酸、異去氧膽酸和牛膽酸(來自膽酸)。
(2)氨基酸類成分組氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、頡氨酸、亮氨酸等(來自水牛角、珍珠母和板藍根)。
(3)無機元素Mg、Si、K、Ti、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、Se、Sr等，另外主要含有的無機元素為Ca，包括無機游離和有機螯合兩種狀態(tài)。
(4)黃酮類成分黃芩苷、黃芩苷元、去甲黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷、木樨草素、二氫黃芩苷、查爾酮、三羥基黃酮醇以及黃酮醇等；(5)有機酸類成分綠原酸、異綠原酸、奎尼酸以及梔子酸和藏紅花酸等；(6)核苷類成分腺苷等(主要來自板藍根)(7)環(huán)烯醚萜苷類成分異梔子苷、梔子苷、去羥梔子苷和梔子酮苷等(主要來自梔子)(8)色素類成分藏紅花素、梔子素等(9)揮發(fā)性成分芳樟醇、棕櫚酸和蒎烯等。
三、清開靈注射液有效組分的指紋圖譜分析1、清開靈注射液指紋圖譜測定方法為了全面表征清開靈注射液指紋圖譜，本發(fā)明主要建立了以反相高效液相指紋圖譜來表達黃芩、梔子、板藍根和金銀花的指紋特性，以HPLC/ELSD檢測表達和定量測定其中膽酸的量，通過ICP/MS表達其中的無機離子，CE表達其中的多肽類物質。但經過對比研究發(fā)現，其主要成分均可以用反相色譜利用紫外進行檢測，所以其指紋圖譜獲取的主要部分仍然為色譜指紋圖譜。
清開靈指紋圖譜方法的優(yōu)化步驟，首先從確定的流動相體系進行全方紫外掃描，掃描結果可以看出，主要檢測波長不明確。其中波長分為四個區(qū)帶，主要最大吸收峰為220、240、270、315nm，但實際分離中發(fā)現，以上波長針對的是方中個別有效成分的最大吸收波長，而大部分成分的響應被掩蓋在這些吸收中，隨著分離的過程，不同成分響應波長也會脫離基質混合的影響而得以分辨。結果證明主要響應波長為254nm，個別的針對性響應特征波長可以作為個別成分監(jiān)測的最佳波長。這一情況也說明，復雜樣品指紋圖譜測定波長的選擇需要在分離后進行綜合考慮，在清開靈指紋圖譜測定中選用通常針對未知體系的測定波長254nm，同時選取240、280、330nm作為監(jiān)測波長；選用線性洗脫梯度，70分鐘內，有機相比例從0線性增加到100％。
在傳統(tǒng)的復方研究方法中，首先涉及復方的分離，即采取液相萃取、柱層析、固相萃取等多種分離手段進行初步分離，然后在中醫(yī)藥理論的指導下，對有效成分進行進一步分離和活性跟蹤，以解釋有效部分的來源及歸屬，但是，在分離過程中發(fā)現，具體分離到單個或者較純的組分群時，有些可能會失去原有的藥效，并且由于物質成分及其相互作用的復雜性，很難從大量零散的成分信息中得出整體的作用性質，而且增添了研究的困難。從成分研究結果可以看出，清開靈是由非常復雜的成分組成，從單一類別的成分并不能推斷出復方整體的作用，并且通過單一提取物的相關藥效結果可以看到，復方作用的結果是藥材提取物相互組合協同的結果，這也為復方的研究提供了另外一條途徑，就是必須從物質組合，即有效組分出發(fā)進行物質基礎研究，因此在獲得一定成分研究結果的基礎上，轉而利用性質相近物質成分歸類所得的有效組分配伍，研究復方的配伍規(guī)律，結合物質成分的來源、歸屬、變化和有效組分類別性質等，采取指紋圖譜的方式，將有效組分的成分信息轉化為綜合的定性、定量指標，闡釋復方的量效配伍、功能配伍等在物質成分上的含義，為中醫(yī)藥中關于藥材配伍的規(guī)律得出一定的相對準確的物質定位。同時，發(fā)現單味藥材起到了復方的部分作用，在對整個證的治療中，均分別利用相應的途徑作用于相應的靶點，而并不由單味藥對整個病證有所作用，充分印證了中藥治療的多途徑、多靶點協同整合的治療理念。
2、清開靈注射液及其藥材有效組分的指紋圖譜按照清開靈所含物質成分，將清開靈指紋圖譜定義為三種一種是有機成分指紋圖譜。采取的研究方式是利用HPLC/DAD/MS/MS的方法，對其中有機成分進行分離分析，比較全方與單味藥和中間產物的指紋圖譜，對于每一個物質按照響應值分類，并歸納物質的歸屬。如圖1、圖3～6，板藍根、金銀花、梔子、黃芩苷單味植物藥材和膽酸/豬去氧膽酸的指紋圖譜，如圖7，清開靈注射液HPLC/ELSD指紋圖譜，可以看到來自板藍根的物質主要集中在極性區(qū)，可以單獨分出，比較其剩余部分與全方的藥效差異；另外梔子部分集中在中等極性區(qū)前半部分，黃芩部分在后半部分，與金銀花、梔子部分界限分明，金銀花則交叉分布于中等極性區(qū)；膽酸則在弱極性區(qū)。
第二種指紋圖譜是多肽分析，采取的是CE(毛細管電泳)方法，其肽譜如圖16所示，是水牛角有效部分指紋圖譜第三種指紋圖譜是針對其中無機離子，分析的是無機離子形態(tài)及與其它物質體系的作用，利用的方式是ICP/MS及原子吸收光譜等方法。如圖17所示，是珍珠母有效組分ICP/MS指紋圖譜。
清開靈注射液中的四個藥對黃芩與梔子、金銀花與板藍根、珍珠母與水牛角、膽酸與豬去氧膽酸。藥對是中醫(yī)藥理論中藥物運用的基礎，它是根據藥物的性味和功用，通過七情合和，運用組合的，因此也必然在藥物的化學物質基礎上有所顯示。如圖8～11可見，各個藥對在全方的譜圖中均有所顯示，可以認為全方的物質基礎來源于不同藥對的貢獻，同時對比前單味藥的指紋圖譜，發(fā)現藥對圖譜大致可以看作單味藥物質的相加得到了藥對譜，而全方譜并不單純?yōu)樗帉χg譜峰的相加，因此，這為我們揭示藥物之間相互作用，協同產生藥效的物質根源提供了線索。
方劑配伍規(guī)律的分析是中藥基礎性研究的重點，而對配伍規(guī)律的闡釋，有兩個基礎，一是其物質基礎，二是其藥效特性。那么作為物質基礎研究的瓶頸在于對其內含物質的描述。指紋圖譜作為一種剖析復雜體系的方式，是在物質成分還沒有充分清楚的情況下，解決分析方法論的另外一條捷徑，并且在整體性上，具有先天的優(yōu)勢，能夠很好地通過整體綜合顯示描述中藥的特征，進行定性和定量。
四、清開靈小方的開發(fā)1、清開靈小方的確定在研究分析指紋圖譜和藥理學的基礎上，對于清開靈注射液的配伍規(guī)律有了進一步認識，發(fā)現組成藥味中去氧膽酸、膽酸、黃芩、梔子、珍珠母在其中有重要的作用，黃芩與梔子配伍應用后對于SOD、LPO、vWF等的良性效應獲得了顯著提高，開竅醒神作用的珍珠母對于抗損傷能力(SOD、Na+-K+-ATP酶)的提高具有顯著的特異性，而板藍根、金銀花和水牛角則作用較前藥材作用不顯著，但板蘭根、金銀花等清熱解毒可發(fā)揮一定減輕損害(vWF、LPO、MDA)的作用，并有提高抗損害能力的作用。
膽酸、黃芩苷能夠降低模型動物死亡率，梔子、金銀花、板蘭根、珍珠母和水牛角等單個有效組分對模型動物死亡率的影響不顯著或有加重趨勢。
金銀花、板蘭根、珍珠母和水牛角能夠顯著提高模型動物腦組織的SOD水平，而膽酸、黃芩苷、梔子對模型動物腦組織SOD水平無改善作用。配伍作用顯示，黃芩苷與梔子配合產生了顯著的提高模型動物腦組織SOD水平的作用，說明二者可能存在著協同作用，而金銀花與板蘭根配合則無協同作用。
梔子、板蘭根、珍珠母和水牛角能夠顯著降低模型動物腦組織中鈉-鉀-ATP酶的水平，黃芩苷的作用相反，而膽酸、金銀花無顯著作用。配伍作用顯示，將膽酸加入珍珠母和水牛角后以及將黃芩苷加入梔子后，均可使后者降低模型動物腦組織鈉-鉀-ATP酶水平的作用顯著減弱，提示此兩組配伍對鈉-鉀-ATP酶活性均可能存在著拮抗作用，金銀花與板蘭根配伍未呈現明顯的協同作用。
珍珠母和水牛角對腦能荷有顯著的改善趨勢，膽酸、黃芩苷、梔子無顯著作用，金銀花、板蘭根有一定改善趨勢，配伍作用表明，珍珠母和水牛角配伍膽酸后仍保持了原有效應，而黃芩苷與梔子、金銀花與板蘭根配伍后對腦能荷變化仍無顯著影響，珍珠母和水牛角中配入黃芩、梔子、金銀花和板蘭根則對其原有效應產生了消極影響。
板蘭根能夠顯著降低模型動物血漿中vWF的水平，而膽酸、黃芩苷、梔子、金銀花、珍珠母和水牛角對模型動物vWF水平無顯著改善作用，膽酸甚至會產生消極的影響。配伍作用顯示，膽酸與珍珠母和水牛角配合以及黃芩與梔子配合均產生了顯著的降低模型動物血漿vWF水平的作用，說明此兩組配伍均可能存在著協同作用，而金銀花與板蘭根配合則未顯現出顯著的協同作用。
清開靈全方的各組成藥物多數無顯著效果，而全方的效果較顯著。膽酸、黃芩苷能夠顯著降低模型動物腦組織的NOS水平，而梔子、金銀花、板蘭根、珍珠母和水牛角對模型動物腦組織NOS水平無改善作用。配伍作用顯示，黃芩苷與梔子配伍后作用被顯著地削弱，而金銀花與板蘭根配合則無明顯的協同作用，膽酸與珍珠母和水牛角配合也未見明顯的協同作用。
綜合以上動物實驗結果，說明在配伍過程中，板藍根金銀花配合入復方在各個環(huán)節(jié)作用并不顯著，結合指紋圖譜分析結果，板藍根和金銀花配伍后與單味藥材提取物比較，指紋圖譜有較大的變化，成分峰差別顯著，證明在物質成分上在配伍前后有變異，配伍后存在一定的消極影響，同時考慮珍珠母和水牛角的成分，水解后均為無機離子和角蛋白水解產物，而珍珠母中存在一定的鈣離子和腦水腫的成因有一定關系。因此認為保留去氧膽酸、膽酸、黃芩、梔子、珍珠母組成小方，將可能在減毒增效或減毒保效的基礎上獲得新的配伍組合。
按照中醫(yī)用藥理論，牛黃與珍珠、黃芩與梔子均為相須藥對。其中黃芩梔子藥對二者相須為用，降泄同施，氣血并治，梔子得黃芩之助加強了其清三焦火熱，祛濕解毒的功效；而黃芩得梔子之助清肺之伏火之力增加，梔芩合用，能清三焦、肺熱、止血熱妄行。牛黃珍珠藥對牛黃苦寒，清熱解毒力甚，有清心定驚，豁痰開竅之功。珍珠甘咸而寒，除鎮(zhèn)心定驚外，還有良好的清熱、墜痰、解毒的作用。二藥合用，加強清熱解毒，定驚息風，豁痰開竅之力。膽酸是牛黃的代用品，具有相似的功效。四味藥配合，加強了清熱解毒、醒神開竅的作用。
2、小方的指紋圖譜分析針對小方，我們進行了系列指紋圖譜的測定和分析，如圖18～21所示，是梔子提取物、黃芩提取物、珍珠母水解液與梔子提取物組合物和小方注射液指紋圖譜)。
指紋圖譜測定采用的流動相體系如下水相為0.1％甲酸溶液，有機相為乙腈和甲醇(比例為3∶2)。色譜柱為Luna C18，5μ，4.6×250mm，檢測波長為238、254和280nm，測定波長為254nm，柱溫為35℃。方法的精密度、重復性以及樣品的穩(wěn)定性均可以滿足指紋圖譜測定的要求，測定中，發(fā)現來源于同一藥材指紋峰的總響應值是一個顯示藥材配伍關系的關鍵，是總方的特征值，這是建立在總體指紋圖譜可以分化為各藥材有效部位指紋部分的結果。
如圖22所示，是梔子部分指紋圖譜(240、220、440nm)，其中1是梔子酸；2是異梔子苷；3是京尼平龍膽二糖苷；4是梔子苷；5是綠原酸；6是藏紅花素1；7是藏紅花素2；8是藏紅花素3；9是藏紅花酸。
清開靈小方注射液的指紋圖譜對成分的顯示包括梔子，黃芩苷和膽酸的對應成分，珍珠母則通過總氮和鈣的測定進行指標確認；具體梔子指紋圖譜的測定是針對梔子的三個有效部位進行的，可以從不同側面反映出梔子藥材的藥效特性。測定的藥效成分也基本概括了梔子的主要藥效組成，包括環(huán)烯醚萜類成分異梔子苷、京尼平龍膽二糖苷、梔子苷，有機酸類成分梔子酸、綠原酸、藏紅花酸和色素類成分藏紅花素1、藏紅花素2、藏紅花素3。
黃芩苷部分指紋圖譜測定的是黃芩苷及其同系物(如圖23所示)，其中1是黃芩苷；2是漢黃芩苷；3是野黃芩苷。膽酸和豬去氧膽酸部分指紋圖譜(如圖24所示)，是膽酸藥材指紋圖譜，其中1是異去氧膽酸；2是去氧膽酸；3是膽酸。
如圖25所示，是小方注射液指紋圖譜，其中8號是異梔子苷，9號是梔子苷，10號是綠原酸，12號是黃芩苷，14號是野黃芩苷。小方指紋圖譜主要測定的是254nm液相圖譜，其中可以確定的指標為梔子苷和黃芩苷，從指紋圖譜可以看出，小方的配制過程不引起每種藥材入藥部位明顯的變化，其中除膽酸無法顯示外，珍珠母、梔子提取物和黃芩提取物三者依次有明顯的顯示，0～25分鐘為珍珠母水解液指紋部分；25～45分鐘為梔子提取物指紋部分；45～60分鐘為黃芩提取物指紋部分。在色譜圖中顯示出藥材有效部位的歸屬，可以較好的利用指紋圖譜各部位的顯示表征出藥材有效部位的入藥情況，這在復方指紋圖譜的測定中，為有效組分與最終藥效結果的相關提供了有效的分析方向，并最終為闡釋復方配伍規(guī)律提供了一定的佐證。
在相同測定條件下，將小方指紋圖譜與清開靈原方指紋圖譜進行對比(如圖26所示)，可以看到二者有較高的相似程度(相似度為98％，去除峰值最高的黃芩苷主峰后，相似度仍高達87.5％)。從小方和全方指紋圖譜比較看，小方在物質成分上更加明確，清開靈全方中的主要有效成分得到保留。
分析顯示，清開靈阻抑腦缺血級連反應的多環(huán)節(jié)作用，突出表現在膽酸、黃芩苷、梔子提取物、珍珠母水解液的配伍當中。這些藥物配伍在抑制脂質過氧化反應對腦微血管內皮細胞和神經元的損傷方面具有較好的作用，同時，在調控神經生長因子產生而保護神經元抵抗損傷方面也顯示了作用優(yōu)勢。為進一步對四個部分的配伍效應與組分分離的深度的相關性進行確定，進行了以下的實驗工作。
3、清開靈小方的活性分析以Waster大鼠制作MCAT(Middle Cerebral Artery Thrombosis MCAT)腦梗塞模型，比較前述四部分不同配伍的生物效應，測定腦組織SOD、MDA、NOS含量。以清開靈全方為對照，共觀察了A、B、C三種配方，其中三個方劑的配比仍然按照原方藥材量進行，A方是按照原有注射液制備工藝制備；B方改變了珍珠母水解的方法，方法改變如下按處方量稱取珍珠母，置耐酸容器中，加入3～4倍量8M硫酸溶液，加熱水解。開始注意，有大量二氧化碳放出，產生氣泡，勿使藥液溢出，然后繼續(xù)加熱水解10～12小時，待珍珠母粉末由灰色轉為黃色沉淀，停止加熱，放冷至45～50℃，過濾，濾渣用少量熱水洗滌3次，洗液與濾液合并，放冷后又有白色針狀結晶析出，再過濾除去，得淡黃色透明溶液。
C方保留珍珠母水解方法，改變了梔子的提取工藝，改變如下按處方量稱取梔子，加6倍量水煮沸1小時，濾取煎汁，藥渣再加4倍量水，再煮提半小時，濾取煎汁，合并兩次煎汁。加熱蒸發(fā)濃縮至原料重量相當的體積，放冷后在攪拌下加入濃乙醇，使含醇量達70％，冷藏2～3天，抽濾，取澄清濾液，沉淀用70％冷乙醇洗滌，合并洗液和濾液，減壓回收乙醇；冷藏24小時后，過濾得澄清梔子提取液，提取液濃縮，上AB-8大孔樹脂柱，以30％乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液至薄層顯示無梔子苷，洗脫液回收乙醇，濃縮，過濾，供配液使用。
三種制備方法分別測試了小方中需要調整的工藝步驟，從表觀制備情況觀察，C方顏色最淺，而且其總固體物量較少。實驗測定結果如下(如表2所示)
表2 清開靈小方的活性指標測定結果

與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01.
上述結果顯示，A、B、C三方對于腦組織MDA含量均具有顯著的降低作用，C方組的作用最為突出；對NOS的影響上，清開靈組、A方組、C方組均有顯著作用，以前兩者最為突出。但是，從微血管調節(jié)功能出發(fā)，NO即是一種導致神經元損傷的介質，也是一種重要的微血管調節(jié)物質，在缺血性病理過程的一定階段有其積極的生理學意義?？梢哉J為，對于缺血損傷特別是脂質過氧化反應過程這一重要環(huán)節(jié)來說，C方組意義更大。初步的藥效實驗結果表明，針對腦水腫的治療，小方在一些指標上與原方基本接近，在一些配比下某些方面還優(yōu)于原方，這說明了中藥復方本身具有一定的發(fā)展?jié)摿?，在通過對其組成物質基礎信息的分析—指紋圖譜分析，結合中醫(yī)藥理論指導和藥效實驗，可以對中藥復方進行簡化和在配伍，這為中藥新藥的研究提供了一種新的方式。
4、清開靈小方的工藝路線確定(1)工藝路線按照前期研究結果制定如下小方工藝路線(如圖27所示)按照清開靈注射液生產工藝制備珍珠母水解液；梔子藥材用水煎煮，大孔樹脂分離得到梔子苷提取物，溶解；把珍珠母水解液和梔子提取液混合，加入膽酸和豬脫氧(比例1∶1)，混合均勻，再加入黃芩苷，溶解，過濾，添加注射用水至1000毫升，調節(jié)PH值為6.8～7.2。
(2)工藝說明因珍珠母水解液是直接加入的，故珍珠母的水解工藝可直接按照清開靈全方的工藝進行水解；膽酸與黃芩苷是提純物溶解投料，用稀HCl或NaOH溶液調節(jié)適當的pH值使其完全溶解即可，故亦可按照原標準進行配置；唯梔子的提取工藝為了滿足更高的質量標準要求，采用有效部位入藥取代了原來的藥材入藥。因此，梔子藥材有效部位的提取是小方工藝優(yōu)化的核心和重點。以梔子苷含量為指標，從提取溶劑、提取方式等方面全面考察了梔子有效部位的提取工藝，最終確定梔子的最優(yōu)提取工藝為，梔子藥材經水提純沉后，經大孔樹脂柱洗脫。
采用HPLC-DAD法測定所得梔子藥效部分中梔子苷及藏紅花素類物質占總固體物的含量，結果如下(如表3所示)表3 HPLC-DAD法測定所得梔子藥效部分固體物的含量

五、清開靈小方的組方配比優(yōu)化1、均勻設計方案(1)均勻設計表小方共五味藥材，涉及四個影響因素(膽酸與豬去氧膽酸等比例入藥)；每味藥材設三個量級，即三個水平。故采用4因素3水平混合因素均勻設計法，取U9(3×3×3×3)表(如表4所示)表4 U9(3×3×3×3)均勻設計表

注Xn(n＝1～4)為四味藥材配方用均勻設計法設計，第10組為清開靈同比例方，第11組為清開靈原方。
(2)組方試驗設計表按照上述均勻設計表進行組方，得到如下組方配伍表(如表5所示)
表5 組方配伍表(單位g)

2、實驗材料與方法(1)實驗動物與分組健康雄性清潔級SD大鼠，體重330±20克，由北京維通利華實驗動物公司提供。取造模成功的大鼠156只隨機分成缺血24h模型組、藥1、藥2、藥3、藥4、藥5、藥6、藥7、藥8、藥9、藥10、藥11組(每組n＝12)。另設正常組(n＝12)。藥11為清開靈注射液全方。
(2)動物模型制備用10％的水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠。頸部正中切口，手術顯微鏡下暴露左側頸外動脈。沿頸外動脈依次分離其分支枕動脈、甲狀腺上動脈，使用電刀凝閉。結扎頸外動脈遠心端，使頸外動脈殘端游離。在其殘端起始部做楔形切口，由此插入釣魚線(直徑0.25mm，頭端加熱呈直徑約0.3mm的圓球形)，使之由頸外動脈通過分叉部進入頸內動脈，至大腦中動脈的起點，阻斷了大腦中動脈的血液供應。用縫合線扎閉頸外動脈殘端，剪斷多余釣魚線，逐層縫合頸部切口。正常組不插入釣魚線，其它步驟同手術組。選取模型成功(模型成功的標志大鼠蘇醒后出現同側Horner征和對側以前肢為重的偏癱)的動物按不同缺血時間取材。
(3)給藥方式及途徑采取腹腔注射的方式給藥。除正常組與模型組外，其余各組造模前1h均預防性給藥一次。不同配比組方組分別給藥0.3ml/100g。上述給藥均用生理鹽水稀釋至0.9ml/100g以減輕對大鼠腹腔粘膜的刺激，間隔4h第二次給藥。各給藥組與第二次給藥時間間隔12h再給藥一次。模型組腹腔注射生理鹽水0.9ml/100g。
(4)取材處理各組動物按不同缺血時間點麻醉，頸動脈插管取血，用少量肝素鈉粉末抗凝，3500g/min離心15min，取血漿置-20℃冰箱中保存?zhèn)錅yvWF。腹腔切口暴露下腔靜脈，用注射器緩慢抽取靜脈血3ml并注入到試管中，室溫靜置10min，3500rpm離心10min，取血清分裝后-20℃冰箱中保存?zhèn)錅yNSE。斷頭處死動物，在冰盤上迅速取出缺血側(左側)大腦的紋狀體和皮層組織，稱重后加入冰生理鹽水(0.25ml/100mg)于冰浴中勻漿，4℃離心機中3500rpm離心15min，取上清液分裝后置-20℃冰箱中保存待測TNF-α、IL-1β、MDA、iNOS。
(5)主要試劑實驗中常用試劑為分析純，購自北京化學試劑總公司；vWF ELISA試劑盒，購自上海太陽生物技術公司；NSE RIA Kit，購自北京北方生物技術研究所；大鼠TNF-αRIA Kit，購自北京東亞免疫技術所；大鼠IL-1β RIA Kit，購自北京東亞免疫技術所；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、iNOS試劑盒和MDA試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。
(6)主要儀器微量移液器；電動勻漿器；電子分析天平；手術顯微鏡；高頻小電刀1411型(上海醫(yī)療器械技術公司)；低溫離心機DDL-5型(上海安亭科學儀器廠)；臺式離心機TDL-40B型(上海安亭科學儀器廠)；旋渦混合器MVS-1型(北京北德科學器材有限公司)；放射免疫γ計數器SN-682型(上海核福光電儀器有限公司)；小型三用水箱(北京醫(yī)療設備總廠)；酶標比色儀SPECOTRAL型(產地奧地利)；電熱恒溫培養(yǎng)箱型號78-1(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠)；旋渦混合器MVS-1型(北京北德科學器材有限公司)；721分光光度計(上海光學儀器廠)。
3、觀察指標在確定小方藥味的基礎上，采用與多環(huán)節(jié)阻抑腦缺血級聯反應密切相關的6個藥效指標作為評價指標，綜合比較了各個組方的藥理作用強度，并據此數值通過總分制對組方進行尋優(yōu)。
(1)TNF-α蛋白及IL-1β蛋白含量放射性免疫方法蛋白含量檢測腦組織勻漿上清液TNF-α、IL-1β蛋白含量。
(2)vWF蛋白及NSE蛋白含量采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法原理，測定血漿中vWF水平。采用雙抗體夾心法，NSE與包被球上NSE抗體結合，再與125I一抗NSE結合，形成免疫復合物，測定包被球的放射性計數(CPM)值，檢測樣品血清中NSE濃度。
(3)iNOS活性和MDA含量使用比色法檢測樣品腦組織勻漿上清中iNOS活性和MDA含量。
4、結果(1)不同配比組方對缺血腦組織TNF-α蛋白含量的影響腦缺血24h，模型組腦組織TNF-α蛋白含量升高(與正常組比較P＜0.05)。缺血24h，除藥6組外，各給藥組腦組織TNF-α蛋白含量都顯著低于模型組(與模型組比較P＜0.01)(如表6、圖28所示)表6 不同配比組方對缺血腦組織TNF-α含量和IL-1β含量的影響(x±s)

注與正常組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較★P＜0.05，★★P＜0.01(2)不同配比組方對缺血腦組織IL-1β蛋白含量的影響腦缺血24h，腦組織IL-1β蛋白含量升高(與正常組比較P＜0.05)。缺血24h，藥4組與模型組比較IL-1β蛋白含量降低(P＜0.05)，藥2、6、7、8、9、11組與模型組比較IL-1β蛋白含量有所升高(P＜0.05或P＜0.01)(如表6、圖29所示)。
(3)不同配比組方對缺血大鼠血漿vWF蛋白含量的影響與缺血24h正常組比較，大鼠腦缺血24h后血漿vWF蛋白含量明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，藥1、3、4、9、10、11血漿vWF蛋白含量有所降低(P＜0.05或P＜0.01)(如表7、圖30所示)。
表7 不同配比組方對腦缺血大鼠血漿vWF和血清NSE含量的影響(x±s)

注與正常組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較★P＜0.05，★★P＜0.01(4)不同配比組方對缺血大鼠血清NSE蛋白含量的影響與缺血24h正常組比較，大鼠腦缺血24h后血清NSE蛋白含量明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，藥1、11組血清NSE蛋白含量有所降低(P＜0.05或P＜0.01)，藥2組血清NSE含量顯著高于模型組(P＜0.01)(如表7、圖31所示)。
(5)不同配比組方對缺血腦組織iNOS活性的影響與缺血24h正常組比較，大鼠腦缺血24h后腦組織iNOS活性含量明顯降低(P＜0.01)。除藥7組值低于模型組(P＜0.01)外，各給藥組與模型組數值無顯著差異(如表8、圖32所示)。
表8 不同配比組方對缺血腦組織iNOS活性和MDA含量的影響(x±s)


注與正常組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較★P＜0.05，★★P＜0.0(6)不同配比組方對腦缺血24h腦組織MDA含量的影響腦缺血24h，腦組織MDA含量升高(與正常組比較P＜0.05)。缺血24h，藥1、2、3、7組與模型組比較腦組織MDA含量降低(P＜0.01或P＜0.05)(如表8、圖33所示)。
(7)總分制數據處理結果生物指標按照總分制進行處理，結果如下A、不同組方NSE值的統(tǒng)計處理數據如下(如表9、表10所示)表9 組NSE試驗數據結果


注N為正常對照組；M為模型組；1～9為均勻設計組；10為清開靈等比組(四味藥)；11為清開靈原方組(七味藥)；0為無數據。
表10 13組NSE試驗數據(去除奇異點)結果

注N為正常對照組；M為模型組；1～9為均勻設計組；10為清開靈等比組(四味藥)；11為清開靈原方組(七味藥)；0為去除奇異點和/或無數據。
B、不同組方Il-1β值的統(tǒng)計處理如表11、表12、表13、表14所示，Il-1β值分兩次試驗，分為Il-1β(1)和Il-1β(2)組，分別設置各自的空白對照組和模型組。
表11 13組Il-1β(1)試驗數據結果

注Il-1β(1)為Il-1β第一組試驗數據(未有均勻設計第1，7～11組)N為正常對照組；M為模型組；2～6為均勻設計組；0為無數據。
表12 13組Il-1β(2)試驗數據結果

注Il-1β(2)為Il-1β第二組試驗數據(未有均勻設計第2～6組)；N為正常對照組；M為模型組；1，7～11為均勻設計組；0為無數據。
表13 13組Il-1β(1)試驗數據(去除奇異點)結果

注Il-1β(1)為Il-1β第一組試驗去除奇異點數據(未有均勻設計第1，7～11組)；N為正常對照組；M為模型組；2～6為均勻設計組；0為去除奇異點和/或無數據。
表14 13組Il-1β(2)試驗數據(去除奇異點)結果

注Il-1β(2)為Il-1β第二組試驗去除奇異點數據(未有均勻設計第2～6組)；N為正常對照組；M為模型組；1，7～11為均勻設計組；0為去除奇異點和/或無數據。
C、不同組方iNOS值的統(tǒng)計處理數據如下(如表15、表16所示)表15 13組iNOS值測定試驗數據結果

注N為正常對照組；M為模型組；1～9為均勻設計組；10為清開靈等比組(四味藥)；11為清開靈原方組(七味藥)；0為無數據。
表16 13組iNOS值測定試驗數據(去除奇異點)結果

注N為正常對照組；M為模型組；1～9為均勻設計組；10為清開靈等比組(四味藥)；11為清開靈原方組(七味藥)；0為去除奇異點和/或無數據。
D、不同組方MDA值的統(tǒng)計處理(如表17、表18所示)表17 13組MDA值測定試驗數據結果

注N為正常對照組；M為模型組；1～9為均勻設計組；10為清開靈等比組(四味藥)；11為清開靈原方組(七味藥)；0為無數據。
表18 13組MDA值測定試驗數據(去除奇異點)結果

注N為正常對照組；M為模型組；1～9為均勻設計組；10為清開靈等比組(四味藥)；11為清開靈原方組(七味藥)；0為去除奇異點和/或無數據。
E、不同組方TNF-α值的統(tǒng)計處理數據如下(如表19、表20、表21、表22所示)，其中TNF-α值分兩次測定，分為TNF-α(1)和TNF-α(2)組，分別設置各自的空白對照組和模型組。
表19 13組TNF-α(1)值測定試驗數據結果

注TNF-α(1)為TNF-α第一組試驗數據(未有均勻設計第2～6組)；N為正常對照組；M為模型組；1，7～9為均勻設計組；10為清開靈等比組(四味藥)；11為清開靈原方組(七味藥)；0為無數據。
表20 13組TNF-α(2)值測定試驗數據結果

注TNF-α(2)為TNF-α值測定第二組試驗數據(未有均勻設計第1，7～11組)；N為正常對照組；M為模型組；2～6為均勻設計組；0為無數據。
表21 13組TNF-α(1)值測定試驗數據(去除奇異點)結果

注TNF-α(1)為TNF-α第一組試驗數據(未有均勻設計第2～6組)；N為正常對照組；M為模型組；1，7～9為均勻設計組，10為清開靈等比組(四味藥)；11為清開靈原方組(七味藥)；0為去除奇異點和/或無數據。
表22 13組TNF-α(2)值測定試驗數據(去除奇異點)結果

注TNF-α(2)為TNF-α值測定第二組試驗數據(未有均勻設計第1，7～11組)；N為正常對照組；M為模型組；2～6為均勻設計組；0為去除奇異點和/或無數據。
F、不同組方wVF值的統(tǒng)計處理如表23、表24、表25、表26所示，wVF值分兩次試驗，分為wVF(1)和wVF(2)組，分別設置各自空白對照組和模型組。
表23 13組vWF(1)試驗數據結果

注vWF(1)為vWF第一組試驗數據(未有均勻設計第7-11組)；N為正常對照組；M為模型組；1～6為均勻設計組；0為無數據。
表24 13組vWF(2)試驗數據結果


注vWF(2)為vWF第一組試驗數據(未有均勻設計第1～6組)；N為正常對照組；M為模型組；7～9為均勻設計組；10為清開靈比例組(四味藥)；11為清開靈原方組(七味藥)；0為無數據。
表25 13組vWF(1)試驗數據(去除奇異點)結果

注vWF(1)為vWF第一組試驗數據(未有均勻設計第7～11組)；N為正常對照組；M為模型組；1～6為均勻設計組；0為去除奇異點和/或無數據。
表26 13組vWF(2)試驗數據(去除奇異點)結果

注vWF(2)為vWF第一組試驗數據(未有均勻設計第1～6組)；N為正常對照組；M為模型組；7～9為均勻設計組；10為清開靈比例組(四味藥)；11為清開靈原方組(八味藥)；0為去除奇異點和/或無數據。
5、結論(1)不同配比組方對大鼠缺血腦組織TNF-α蛋白含量的影響實驗證明，腦缺血/再灌注損傷后血漿及腦組織勻漿中TNF-α表達增加，含量升高。腦缺血早期主要由缺血區(qū)神經元和小膠質細胞表達TNF-α，發(fā)揮損害作用TNF-α在不同時期不同部位能誘導敏感細胞發(fā)生以細胞腫脹、溶解為特征的壞死和以細胞核破裂成DNA片斷、細胞器皺縮為特征的凋亡。本實驗結果顯示以線栓法復制大鼠MCAO模型，在缺血24h，模型組腦組織TNF-α蛋白含量顯著高于正常組。分析藥物對TNF-α蛋白含量的影響，可以發(fā)現在對TNF-α的干預這一環(huán)節(jié)上，除藥6組不能阻抑腦缺血24h腦組織TNF-α蛋白含量的增加外，各給藥組都可以顯著阻抑腦缺血24h腦組織TNF-α蛋白含量的增加。
(2)不同配比組方對缺血腦組織IL-1β蛋白含量的影響腦缺血可誘導腦內IL-1βmRNA合成和蛋白表達增加，使IL-1β含量明顯增高。腦缺血狀態(tài)下過多持續(xù)的IL-1β的產生致使其濃度病理性急劇增高，通過促炎反應、促進自由基釋放、增強興奮性氨基酸毒性作用等機制參與了神經組織損傷。
本實驗表明，在腦缺血24h，腦組織IL-1β蛋白含量顯著升高，缺血24h，藥4阻抑了缺血后腦組織IL-1β蛋白含量的增加，除藥4組外，其余各給藥組均未表現出阻抑IL-1β蛋白含量增加的趨勢，而且藥2、6、7、8、9、11組表現出了促進IL-1β表達的趨勢。
(3)不同配比組方對腦缺血大鼠血漿vWF蛋白含量的影響內皮細胞凝血因子VIII相關抗原(血管性血友病因子)(vWF)主要由血管內皮細胞合成，凡是有血管內皮細胞損害的病變，如腦缺血及動脈硬化等，均可導致血漿中vWF水平增高，血漿vWF的水平可作為腦血管病變血管內皮細胞損害嚴重程度及判斷預后的重要指標。
與正常組比較，大鼠腦缺血24h后血漿vWF蛋白含量明顯升高。而藥1、3、4、9、10、11可以阻抑血漿vWF蛋白含量的增加，具有良好的保護血管內皮細胞的作用。
(4)不同配比組方對腦缺血大鼠血清NSE蛋白含量的影響局灶性腦缺血后，血和腦脊液中NSE含量升高，持續(xù)2～5天，其含量水平與梗塞體積大小呈線型關系。而本實驗顯示，大鼠腦缺血24h后血清NSE蛋白含量明顯升高。藥1、11阻抑了血清NSE蛋白含量的增加，顯示一定的神經元保護作用，而藥2表現出了促進NSE含量升高的趨勢，可能在此環(huán)節(jié)上具有一定的副作用。
(5)不同配比組方對缺血腦組織iNOS活性的影響本實驗發(fā)現，與缺血24h正常組比較，大鼠腦缺血24h后腦組織iNOS活性含量明顯降低，考慮與缺血損傷后iNOS過度消耗有關。除藥7組與模型組比較有阻抑iNOS增加的趨勢外，各給藥組與模型組變化趨勢無顯著差異。
(6)不同配比組方對缺血腦組織MDA含量的影響MDA是氧自由基引發(fā)的生物膜不飽和脂肪酸過氧化反應的代謝產物，氧自由基介導的自由基連鎖反應是急性腦缺血神經元損傷的重要因素，抗自由基治療可減少腦缺血的損傷，改善神經功能。
本實驗結果顯示，腦缺血24h，腦組織MDA含量升高。而藥1、2、3、7阻抑了缺血腦組織MDA含量的升高。
根據前述的討論，藥1、藥3、藥4表現出了良好的神經保護作用，其余用藥組或效果不明顯，或雖然在某些指標上有改善作用但同時在另外指標上有比較明顯的加重損傷的作用。
(7)總分排隊評判結果將同一組方下，各藥效指標值進行平均；再將同一組方的各個平均藥效指標值求和，和數為該組方總藥理效應值；對不同組方的總藥理效應值按照從小到大順序排序。因為，各種藥效指標基本是抑制型指標，故總藥理效應值越小，組方越優(yōu)。結果如下(如表27所示)表27 各組方藥效指標排序表

注Sum為同一組方下總藥理效應值，Sort根據總藥理效應著從小到大的順序號。
組方3、5和6為優(yōu)組，其中組方5最優(yōu)，其次為組方6，組方3；大部分的小方配伍組優(yōu)于清開靈全方組，提示在小方較全方具有減毒作用的同時，增效作用亦比較明顯；清開靈四味藥配伍組的總藥理效應值低于清開靈全方，但二者分值差距較小，提示在該比例下，小方所舍棄的藥味對總藥理效應是有貢獻的，但貢獻較小。
(8)最優(yōu)配比的對比評價藥效指標效應值組間比較的綜合優(yōu)勢分析顯示，組方1、3、4表現出了良好的神經保護作用，其余用藥組或效果不明顯，或雖然在某些指標上有改善作用，但同時在另外指標上有比較明顯的加重損傷的作用?？偡峙抨犜u判結果采用將同一組方下，各藥效指標值進行平均；再將同一組方的各個平均藥效指標值求和，和數為該組方總藥理效應值；對不同組方的總藥理效應值按照從小到大順序排序的方法。因為各種藥效指標基本是抑制型指標，故總藥理效應值越小，組方越優(yōu)。結果顯示，組方3、5和6為優(yōu)組，其中組方5最優(yōu)，其次為組方6，組方3；大部分的小方配伍組優(yōu)于清開靈全方組，提示在小方較全方具有減毒作用的同時，增效作用亦比較明顯；清開靈四味藥配伍組的總藥理效應值低于清開靈全方，但二者分值差距較小，提示在該比例下，小方所舍棄的藥味對總藥理效應是有貢獻的，但貢獻較小。
綜合兩種分析所得結果，確定組方3為最優(yōu)配伍，其配伍為1000毫升藥液含豬膽酸1.75g、膽酸1.75g、黃芩苷6.25g、梔子12.5g、珍珠母62.5g。
權利要求
1.一種中藥復方二次新藥的開發(fā)方法，其包括以下步驟(1)選擇中醫(yī)長期使用的古方或驗方，根據其中藥物的性味，結合長期臨床應用的經驗和疾病治療情況，進行藥物成分和配伍分析，并結合疾病的中醫(yī)理論，對藥材進行合并和拆減，實現在整體藥材層次上對復方的再認識；(2)對各藥材進行化學物質基礎分析，并利用指紋圖譜綜合分析藥材以及藥材組合物中物質成分，將復方組成物質群進行組分鑒別和歸類；(3)通過步驟(2)的指紋圖譜分析結果，以及不同藥材及其組合物的藥理實驗結果，結合現代中醫(yī)用藥理論，在對原方增效或減毒的基礎上提出新的藥味配伍組合；(4)對新藥復方進行指紋圖譜分析和化學成分鑒定，并確定新藥復方的生產工藝；(5)運用均勻設計方案設計組方配比，分別進行相關藥效藥理實驗，比較各組方的實驗結果，最終確定新藥復方組方的最佳配比。
2.如權利要求1所述的一種中藥復方二次新藥的開發(fā)方法，其特征在于步驟(1)中的對藥材進行合并和拆減，包括對復方各藥材根據性味和臨床藥用功能的不同進行分類，把性味或臨床藥用性質相同或相近相近的藥材歸并為一類，并在中醫(yī)理論指導下，針對某些來源稀少或價格昂貴的藥味進行拆減，或使用替代品。
3.如權利要求1所述的一種中藥復方二次新藥的開發(fā)方法，其特征在于步驟(2)中的化學物質基礎分析，包括使用現代化學分離和分析手段，對各味藥材中的化學成分進行鑒定，并按照化學性質和藥理藥效性質進行分類，從化學層次上闡釋復方的組成物質群。
4.如權利要求1所述的一種中藥復方二次新藥的開發(fā)方法，其特征在于步驟(2)中的利用指紋圖譜綜合分析藥材以及藥材組合物中物質成分，包括用中藥指紋圖譜技術定性或定量分析藥材、藥材組合物、復方中的物質成分，對復方中源于不同藥材的各成分的來源進行分析，并按照各物質成分化學結構和藥理藥效性質的不同進行分類，得到具備不同化學結構和藥理藥效性質的化學組分群。
5.如權利要求1所述的一種中藥復方二次新藥的開發(fā)方法，其特征在于步驟(3)中的新的藥味配伍組合，包括根據不同藥味的主要化學成分及藥理藥效性質，在中醫(yī)理論指導下，以增效或減毒為原則，進行重新組合或者加減味、拆方，形成新的藥味配伍組合。
6.如權利要求1所述的一種中藥復方二次新藥的開發(fā)方法，其特征在于步驟(4)中的確定新藥復方的生產工藝，包括對復方進行指紋圖譜分析和化學成分鑒定，確定其中的主要有效成分，以主要有效成分的含量為指標調整相關工藝參數，確定新藥復方的最佳工藝。
7.如權利要求1所述的一種中藥復方二次新藥的開發(fā)方法，其特征在于步驟(5)中的均勻設計方案，包括根據均勻設計方案，設計含有不同相對比例的各味藥材的新藥組方，從中篩選除最優(yōu)組方方案。
8.如權利要求1所述的一種中藥復方二次新藥的開發(fā)方法，其特征在于步驟(5)中的各組方的實驗結果，包括按照不同新藥組方制備新藥，進行相關藥理藥效實驗，根據不同實驗結果綜合考察各組方新藥的臨床藥效，確定出新藥組方的最佳配比。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥復方二次新藥的開發(fā)方法，其包括以下步驟(1)選擇中醫(yī)長期使用的古方或驗方，根據其中藥物的性味，結合長期臨床應用的經驗和疾病治療情況，進行藥物成分和配伍分析，并結合疾病的中醫(yī)理論，對藥材進行合并和拆減，實現在整體藥材層次上對復方的再認識；(2)對各藥材進行化學物質基礎分析，并利用指紋圖譜綜合分析藥材以及藥材組合物中物質成分，將復方組成物質群進行組分鑒別和歸類；(3)通過步驟(2)的指紋圖譜分析結果，以及不同藥材及其組合物的藥理實驗結果，結合現代中醫(yī)用藥理論，在對原方增效或減毒的基礎上提出新的藥味配伍組合；(4)對新藥復方進行指紋圖譜分析和化學成分鑒定，并確定新藥復方的生產工藝；(5)運用均勻設計方案設計組方配比，分別進行相關藥效藥理實驗，比較各組方的實驗結果，最終確定新藥復方組方的最佳配比。
文檔編號G01N30/00GK1899315SQ20051008550
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權日2005年7月22日
發(fā)明者羅國安, 王義明, 嚴詩凱, 曹進, 梁瓊麟 申請人:清華大學