專利名稱：檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種檢測動(dòng)物組織、飼料、尿液等樣品中雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
雌二醇(Estradiol，E2)是應(yīng)用廣泛的甾類同化激素，被大量用于促進(jìn)反芻動(dòng)物的生長。因其可以促進(jìn)動(dòng)物成長及提高畜禽瘦肉比，在禽獸養(yǎng)殖業(yè)曾經(jīng)應(yīng)用。但由于雌二醇可在動(dòng)物組織內(nèi)高殘留，通過食物鏈危害人類健康，使女性兒童提前發(fā)育，男性兒童乳腺發(fā)育呈女性化；男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常或引起病變；并導(dǎo)致女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生率上升，且雌二醇存在明顯的致癌性，歐美等發(fā)達(dá)國家已相繼禁止或嚴(yán)格禁止使用。中華人民共和國中務(wù)院令第226號文件，《飼料和飼料添加劑管理?xiàng)l例》中規(guī)定雌二醇在飼料中不得檢出。
由于常用的氣相色譜(GC)分析法樣本前處理及測定操作繁瑣且費(fèi)用高，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，推廣應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查的檢測雌二醇?xì)埩舻拿嘎?lián)免疫試劑盒。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明是一種檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有(1)包被了雌二醇抗原的酶標(biāo)板或抗抗體的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(4)抗體工作液；
(5)底物顯色液；(6)濃縮洗滌液；(7)終止液；(8)濃縮復(fù)溶液。
本發(fā)明所述的試劑盒中包被雌二醇抗原的酶標(biāo)板在制備過程中，所用包被原是采用水溶性碳化二亞胺法將雌二醇和載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的；所述的包被抗抗體的酶標(biāo)板在制備過程中，所用的抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。
本發(fā)明所述的試劑盒中羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體作為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體作為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到。
本發(fā)明所述的試劑盒中，洗滌液為0.01M、pH 7.4、含有0.8％～1.2％吐溫20、0.5％的疊氮化鈉防腐劑磷酸鹽緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺、終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，底物液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。
在磷酸鹽緩沖液中加入一定量的吐溫20和疊氮化鈉的作用在于磷酸鹽緩沖液中的吐溫20能減少抗體的非特異性吸附，還能對蛋白起到一定的保護(hù)作用，加入疊氮化鈉后，則疊氮化鈉在溶液中抑制細(xì)菌的生長，對溶液的穩(wěn)定性起到一個(gè)保護(hù)作用。
本發(fā)明所述的試劑盒中，雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L。
本發(fā)明所述的試劑盒中，抗體工作液濃度為雌二醇單克隆抗體或多克隆抗體的工作液，濃度為0.5-5.0μg/L本發(fā)明所述的試劑盒中，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)記雌二醇抗原，酶標(biāo)記抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到，酶標(biāo)記雌二醇抗原是采用混合酸酐法將標(biāo)記酶與雌二醇半抗原進(jìn)行偶聯(lián)得到。
本發(fā)明所述的試劑盒中，標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶。
優(yōu)選地，標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶。
本發(fā)明還提供了一種檢測雌二醇的方法，包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)用試劑盒進(jìn)行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。
其中當(dāng)酶標(biāo)板包被的是雌二醇抗原時(shí)，試劑盒檢測方法為向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液及加入抗體工作液，溫育后洗滌拍干，然后再加酶標(biāo)抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)酶標(biāo)板包被的是抗抗體時(shí)，試劑盒檢測方法為向酶標(biāo)板微孔中加入抗體工作液，溫育后洗滌拍干，然后加標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液及酶標(biāo)抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。
所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以雌二醇濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。
檢測結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液濃度。
半抗原合成100mg雌二醇溶于4mL丙酮中，加入0.42mM的溴代丁酸乙酯，70-80℃水浴恒溫回流反應(yīng)4h，抽干溶劑后加入2N NaOH 4mL繼續(xù)回流1.5h后用6N HCL調(diào)節(jié)到pH2左右，用石油醚提取二次，合并二次的有機(jī)相，旋干得到淡黃色的固體粉末即半抗原。
效果將雌二醇和溴代丁酸乙酯通化合反應(yīng)合成雌二醇半抗原，給雌二醇接出了一個(gè)含苯環(huán)的間隔臂，這樣突出了雌二醇的特征結(jié)構(gòu)，同時(shí)也增加了半抗原的抗原性。可以制備出高效價(jià)的雌二醇抗體并且對雌二醇的特異性很好。
免疫原制備將半抗原和人血清白蛋白(HSA)、血藍(lán)蛋白(KLH)等載體蛋白，分別采用水溶性碳二亞胺法(EDC)、混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)、活性酯法(DCC、NHS)進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
包被原制備將雌二醇半抗原和卵清蛋白(OVA)、兔血清白蛋白(RSA)、鼠血清白蛋白(MSA)等載體蛋白，分別采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)、混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)、活性酯法(DCC、NHS)進(jìn)行偶聯(lián)得到包被原。
本發(fā)明的抗體制備過程如下a.雌二醇單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以雌二醇半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為80～100μg/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2～3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5～10∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1～5×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7～14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×105～106個(gè)/只，7～10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
b.雌二醇兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以雌二醇與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1mg/kg，首次免疫時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7-10天后采血，測定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
c.抗抗體的制備以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到羊抗鼠抗抗體，以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到羊抗兔抗抗體。
d.酶標(biāo)記物的制備酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原的制備其中所述的標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標(biāo)記抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到，酶標(biāo)記雌二醇抗原是采用混合酸酐法將辣根過氧化物酶與雌二醇半抗原進(jìn)行偶聯(lián)得到。
過碘酸鈉法標(biāo)記抗體的原理傳統(tǒng)的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉辣根過氧化物酶(HRP)上殘留的α-和ε-氨基以避免酶分子之間的交聯(lián)。本發(fā)明改用在低pH值下使NaIO4氧化辣根過氧化物酶(HRP)，從而省去了二硝基氟苯封閉辣根過氧化物酶步驟。辣根過氧化物酶經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。
用改良的過碘酸鈉法優(yōu)點(diǎn)在于(1)省去了氨基的封閉過程，因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身連接的氨基實(shí)際很少；(2)降低酶/抗體的摩爾濃度比至2∶1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡便，對酶活性的損失也減少。
本發(fā)明的酶標(biāo)板有兩種，一種是包被雌二醇與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板，另一種是包被抗抗體的酶標(biāo)板，其制備方法如下a.包被雌二醇與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板制備方法用包被緩沖液(pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液)將雌二醇與載體蛋白偶聯(lián)物稀釋成0.1-1μg/mL，每孔加入100μL，37℃溫育2h，并4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μL封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
b.包被抗抗體的酶標(biāo)板制備方法用包被緩沖液(pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液)將抗抗體稀釋成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，并4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
本發(fā)明試劑盒的檢測原理為試劑盒采用間接競爭ELISA方法，當(dāng)微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原時(shí)，樣本中的殘留物雌二醇將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗雌二醇抗體，加入酶標(biāo)抗抗體后，用底物顯色劑顯色；當(dāng)微孔條上為包被抗抗體時(shí)，樣本中的殘留物雌二醇將和酶標(biāo)抗原競爭雌二醇抗體，顯色；樣本吸光值與其所含殘留物雌二醇的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物雌二醇的含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上樣本顏色的深淺，與系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可以判斷出樣本的濃度范圍。
本發(fā)明的樣品前處理方法為(1)動(dòng)物組織(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)、飼料前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織、飼料樣品，加入乙腈/氫氧化鈉(0.2M)，振蕩后離心，取乙腈/氫氧化鈉(0.1M)在氮?dú)饬飨峦耆稍?，用三氯甲烷充分混合，加入氫氧化鈉(1M)溶液進(jìn)行反萃取，強(qiáng)烈振蕩后室溫離心，靜置分層后取上層氫氧化鈉溶液。加入三氯甲烷進(jìn)行萃取，離心(反復(fù)兩次)，合并下層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍?，用?fù)溶液溶解干燥的殘留物，取水相進(jìn)行分析。
(2)尿液前處理方法尿液在室溫離心至澄清，移取到離心管中，加三氯甲烷進(jìn)行萃取，室溫離心(反復(fù)兩次)，合并下層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍?，用?fù)溶液溶解干燥的殘留物，取水相進(jìn)行分析。
(三)有益效果本發(fā)明的檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用ELISA方法定性或定量檢測動(dòng)物組織(肌肉、肝臟等)、飼料、尿液等樣品中雌二醇的殘留量使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測，對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批樣品；檢驗(yàn)方法方便易行；具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)。


圖1雌二醇試劑盒曲線圖具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1試劑盒組分的制備1.抗原合成a.半抗原合成100mg雌二醇溶于4mL丙酮中，加入0.42mM的溴代丁酸乙酯，70℃水浴恒溫回流反應(yīng)4h，抽干溶劑后加入2N NaOH 4mL繼續(xù)回流1.5h后，用6N HCL調(diào)節(jié)至pH2，用石油醚提取二次，合并二次的有機(jī)相，旋干得到淡黃色的固體粉末即半抗原。
b.免疫原的合成稱取上述制備的半抗原20mg用1mLN，N’-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加入用1mL去離子水溶解的40mg羥琥珀酰亞胺(NHS)、40mg碳化二亞胺(EDC)、30mgN，N’-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶液，攪拌反應(yīng)過夜，將上述的溶液逐滴加到用30％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)溶解20mg血藍(lán)蛋白(KLH)溶液中，反應(yīng)過夜，經(jīng)透析后得到。
c.包被原的合成將雌二醇半抗原和兔血清蛋白(RSA)采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)進(jìn)行偶聯(lián)得到包被原。
2.抗體制備a.雌二醇單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以雌二醇半抗原與卵請蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為80μg/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×105個(gè)/只，7天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
b.抗抗體的制備 以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到羊抗鼠抗抗體。
c.酶標(biāo)抗抗體的制備 羊抗鼠抗抗體和辣根過氧化物酶采用過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)，得到辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗抗體。
過碘酸鈉法標(biāo)記抗體的原理傳統(tǒng)的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉辣根過氧化物酶(HRP)上殘留的α-和ε-氨基以避免酶分子之間的交聯(lián)。本發(fā)明改用在低pH值下使NaIO4氧化辣根過氧化物酶(HRP)，從而省去了二硝基氟苯封閉辣根過氧化物酶步驟。辣根過氧化物酶經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。
標(biāo)記步驟(1)稱取5mg辣根過氧化物酶(HRP)溶解于0.5ml蒸餾水中，加入新配制的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5ml，混勻，置4℃，30min；(2)取出后加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30min；(3)加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻，并裝入透析袋，對0.05mol/LpH9.5碳酸鹽緩緩攪拌透析6h，使之結(jié)合；(4)加0.2ml新配的5mg/ml NaBH4液，混勻，置4℃中2h；(5)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃，30min，離心，去上清，沉淀以少許0.02mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4℃透析過夜；
(6)次日取出離心，以除去不溶物，即得酶-抗體的結(jié)合物，加0.02mol/LpH7.4磷酸緩沖液至5ml；(7)效價(jià)測定合格后，加入等量優(yōu)質(zhì)甘油，小瓶分裝，低溫保存。
3.雌二醇與卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶標(biāo)板制備方法用pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液將雌二醇與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)物稀釋成1μg/mL，每孔加入100μL，37℃溫育2h，4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200μL封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實(shí)施例2試劑盒組分的制備1、抗原和抗體的制備(1)包被原的制備 以羊?yàn)槊庖邉?dòng)物，以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到。
(2)多克隆抗體的制備 采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以雌二醇與血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1mg/kg，首次免疫時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
(3)抗抗體的制備 以羊?yàn)槊庖邉?dòng)物，以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到。
(4)酶標(biāo)抗原的制備 取2g雌二醇半抗原溶于20ml，0.5M的氫氧化鈉溶液中，再取2g羥琥珀酰亞胺(NHS)活性酯溶于8ml純水中。雌二醇半抗原溶液和羥琥珀酰亞胺活性酯溶液在室溫混合攪拌2小時(shí)。取22g載體蛋白溶于75ml pH9碳酸鹽緩沖液中，再將辣根過氧化物酶滴加到半抗原中4℃攪拌過夜。將反應(yīng)完的人工抗原在0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液4次，最后得到酶標(biāo)抗原。
2、酶標(biāo)板的制備方法為
用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h并4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200μl封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實(shí)施例3檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被了雌二醇與卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板；(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠的抗抗體稀釋液；(3)雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(4)雌二醇單克隆抗體工作液為濃度為0.5μgL；(5)底物顯色液A液為過氧化脲，B液為四甲基聯(lián)苯胺；(6)濃縮洗滌液為含有0.01M pH 7.4，含有0.8％吐溫20和0.5％疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(7)終止液為1mol/L鹽酸；(8)濃縮復(fù)溶液為含0.2％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
實(shí)施例4檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被了羊抗鼠抗抗體的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記雌二雌抗原的稀釋液；(3)雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(4)雌二醇多克隆抗體濃度為5.0μg/L；(5)底物顯色液為硝基磷酸鹽緩沖液；(6)濃縮洗滌液為含有0.01M pH 7.4，含有1.2％吐溫20和0.5％疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；
(7)終止液為2mol/L氫氧化鈉；(8)濃縮復(fù)溶液為含0.5％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
實(shí)施例5檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被了羊抗兔抗抗體的酶標(biāo)板；(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記雌二醇抗原工作液；(3)雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(4)雌二醇單克隆抗體工作液為濃度為0.5μg/L；(5)底物顯色液A液為過氧化脲，B液為四甲基聯(lián)苯胺；(6)濃縮洗滌液為含有0.01M pH 7.4，含有0.8％吐溫20和0.5％疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(7)終止液為1mol/L硫酸；(8)濃縮復(fù)溶液為含0.5％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
實(shí)施例6檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被了羊抗兔抗抗體的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記雌二醇抗原工作液；(3)雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(4)雌二醇多克隆抗體工作液為濃度為0.5μg/L；(5)底物顯色液為硝基磷酸鹽緩沖液；(6)濃縮洗滌液為含有0.01M pH 7.4，含有1.2％吐溫20和0.5％疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(7)終止液為2mol/L氫氧化鈉；(8)濃縮復(fù)溶液為含0.5％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
實(shí)施例7雞肉中雌二醇的檢測(1)樣品前處理用均質(zhì)器均質(zhì)雞肉樣品，稱2g均質(zhì)物，加入10mL乙腈/氫氧化鈉(0.2M)，振蕩10min，室溫4000g，離心10min，取1mL乙腈/氫氧化鈉(0.1M)在氮?dú)饬飨峦耆稍铮?mL三氯甲烷充分混合，加入4mL氫氧化鈉(1M)溶液進(jìn)行反萃取，強(qiáng)烈振蕩1min后，室溫4000g離心10min，靜置分層后取1mL上層氫氧化鈉溶液。加入5mL三氯甲烷進(jìn)行萃取振蕩10min，室溫3000g以上，離心10min(反復(fù)兩次)，合并下層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍?，?mL復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，取50μL水相進(jìn)行分析。
(2)用試劑盒檢測向雌二醇與卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液(各2孔)50μL，然后加入雌二醇單克隆抗體工作液50μL，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250μL洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μL，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。取出酶標(biāo)板，如前述洗板5次。每孔加入底物顯色液A液50μL，再加B液50μL，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度值(OD值)。
(3)檢測結(jié)果分析所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以雌二醇濃度(μg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示。相對應(yīng)每一個(gè)樣品中雌二醇的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。
實(shí)施例8飼料中雌二醇的檢測(1)樣品前處理用均質(zhì)器均質(zhì)飼料樣品，稱2g均質(zhì)物，加入10mL乙腈/氫氧化鈉(0.2M)，振蕩10min，室溫3000g，離心10min，取1mL乙腈/氫氧化鈉(0.1M)在氮?dú)饬飨峦耆稍?，?mL三氯甲烷充分混合，加入4mL氫氧化鈉(1M)溶液進(jìn)行反萃取，強(qiáng)烈振蕩1min后，室溫3000g離心10min，靜置分層后取1mL上層氫氧化鈉溶液。加入5mL三氯甲烷進(jìn)行萃取振蕩10min，室溫3000g以上，離心10min(反復(fù)兩次)，合并下層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍?，?mL復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，取50μL水相進(jìn)行分析。
用試劑盒檢測及結(jié)果分析同實(shí)施例7。
實(shí)施例9尿液中雌二醇的檢測尿液前處理方法取2mL尿液到離心管中，室溫3000g離心10min至澄清，移取1mL尿液到離心管中，加入5mL三氯甲烷進(jìn)行萃取振蕩10min，室溫4000g，離心10min(反復(fù)兩次)，合并下層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍?，?mL復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，取50μL水相進(jìn)行分析。
用試劑盒檢測及結(jié)果分析同實(shí)施例7。
實(shí)施例10雞肉中雌二醇的檢測(1)樣品前處理用均質(zhì)器均質(zhì)雞肉樣品，稱2g均質(zhì)物，加入10mL乙腈/氫氧化鈉(0.2M)，振蕩10min，室溫4000g，離心10min，取1mL乙腈/氫氧化鈉(0.1M)在氮?dú)饬飨峦耆稍?，?mL三氯甲烷充分混合，加入4mL氫氧化鈉(1M)溶液進(jìn)行反萃取，強(qiáng)烈振蕩1min后，室溫4000g離心10min，靜置分層后取1mL上層氫氧化鈉溶液。加入5mL三氯甲烷進(jìn)行萃取振蕩10min，室溫3000g以上，離心10min(反復(fù)兩次)，合并下層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍铮?mL復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，取50μL水相進(jìn)行分析。
(2)用試劑盒檢測向羊抗鼠抗抗體包被的酶標(biāo)板微孔中加入雌二醇單克隆抗體工作液100μL，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250μL洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。然后加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體和系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣本各50μL，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250μL洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液硝基磷酸鹽緩沖液100μL，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min。每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度值(OD值)。
(3)檢測結(jié)果分析所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以雌二醇濃度的自然對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示。相對應(yīng)每一個(gè)樣品中雌二醇的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。
實(shí)施例11蜂蜜的前處理同實(shí)施例7，飼料、尿液的前處理方法分別同實(shí)施例8、9，用試劑盒檢測及結(jié)果分析同實(shí)施例10。
實(shí)施例12試劑盒精密度、準(zhǔn)確度和保存期試驗(yàn)(1)試劑盒精密度試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)從三批試劑盒中各取10個(gè)試劑盒，每塊酶聯(lián)板中抽出20個(gè)微孔，測定4.5μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值)，計(jì)算變異系數(shù)。測定結(jié)果見表1。
表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)(CV％)


三批試劑盒，各10次標(biāo)準(zhǔn)精密度的測定范圍在4.6％～10.4％之間，符合了變異系數(shù)小于20％的規(guī)定，說明本試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品精密度達(dá)到了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā) 17號附件2試劑盒備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)中第4點(diǎn)精密度和準(zhǔn)確度的精密度標(biāo)準(zhǔn)。
樣品可重復(fù)性取雌二醇標(biāo)樣，添加到樣品中，分別取三個(gè)不同批次的試劑盒各三個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表。
表2雞肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表3飼料樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


表4尿樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)果表明雞肉樣品的變異系數(shù)均小于20％，飼料樣品的變異系數(shù)均小于20％，尿樣品的變異系數(shù)均小于20％，符合了變異系數(shù)小于35％的規(guī)定，說明本試劑盒樣本測定的精密度達(dá)到了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā) 17號附件2試劑盒備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)中第4點(diǎn)精密度和準(zhǔn)確度的精密度標(biāo)準(zhǔn)。
(2)試劑盒的準(zhǔn)確度取兩個(gè)濃度的雌二醇標(biāo)樣，對樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算回收率。
表5準(zhǔn)確度試驗(yàn)


結(jié)果表明雞肉樣本的添加回收率為73.1％～102.7％；飼料樣本添加回收率76.5％～95.6％；尿液樣本的添加回收率為72.9％～120.7％。
(3)試劑盒保存期試驗(yàn)試劑盒保存條件為2-8℃，經(jīng)過6個(gè)月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、雌二醇添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)。
考慮在運(yùn)輸和使用過程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。
考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃保存6個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有(1)包被了雌二醇抗原的酶標(biāo)板或抗抗體的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(4)抗體工作液；(5)底物顯色液；(6)濃縮洗滌液；(7)終止液；(8)濃縮復(fù)溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其中所述的包被雌二醇抗原的酶標(biāo)板在制備過程中，所用包被原是采用水溶性碳化二亞胺法將雌二醇和載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到，載體蛋白為卵清蛋白、兔血清白蛋白、鼠血清白蛋白、血藍(lán)蛋白；所述的包被抗抗體的酶標(biāo)板在制備過程中，所用的抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其中所述的羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體作為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體作為免疫原對無病原體山羊進(jìn)行免疫得到。
4.如權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的洗滌液為0.01M、pH 7.4、含有0.8％～1.2％吐溫20、0.5％疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺、終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，底物液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。
5.如權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L。
6.如權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的雌二醇單克隆抗體或多克隆抗體的工作液濃度為0.5-5.0μg/L。
7.如權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)記雌二醇抗原，酶標(biāo)記抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到，酶標(biāo)記雌二醇抗原是采用混合酸酐法將標(biāo)記酶與雌二醇半抗原進(jìn)行偶聯(lián)得到。
8.如權(quán)利要求7所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶。
9.一種檢測雌二醇的方法，其特征在于包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1～8之任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中當(dāng)酶標(biāo)板包被的是雌二醇抗原時(shí)，試劑盒檢測方法為向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液及加入抗體工作液，溫育后洗滌拍干，然后再加酶標(biāo)抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)酶標(biāo)板包被的是抗抗體時(shí)，試劑盒檢測方法為向酶標(biāo)板微孔中加入抗體工作液，溫育后洗滌拍干，然后加標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液及酶標(biāo)抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒的組成為包被了抗抗體或雌二醇抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、抗體工作液、底物顯色液、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測雌二醇的方法，它包括以下步驟首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明的檢測雌二醇的酶聯(lián)免疫試劑盒能同時(shí)快速檢測大量樣品，檢驗(yàn)方法方便易行，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)。
文檔編號G01N33/543GK1766626SQ20051008677
公開日2006年5月3日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者沈建忠, 何方洋, 馮才偉, 萬宇平, 吳小平, 馮才茂, 汪善良, 李軍, 趙正苗, 張照亮, 史為民, 張素霞, 丁雙陽, 羅曉琴, 孫倩 申請人:北京望爾生物技術(shù)有限公司