專利名稱：染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法，主要用于各醫(yī)療單位細胞遺傳實驗室或產(chǎn)前診斷實驗室作染色體核型分析時的質(zhì)量控制。
染色體核型分析就是對染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目有否異常進行分析。染色體由DNA、組蛋白和RNA組成，而DNA由帶有遺傳信息的基因組成。人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為決定男女性別的性染色體，任何人體如果染色體數(shù)目增多或減少，或某染色體有缺失或結(jié)構(gòu)改變，均會發(fā)生相應的染色體病，臨床表現(xiàn)為智力低下、發(fā)育障礙、性異常、死胎流產(chǎn)等異常妊娠、不育不孕、原發(fā)或繼發(fā)閉經(jīng)等染色體病特征。染色體常位于細胞核內(nèi)，經(jīng)細胞培養(yǎng)、制片、染色后，可在顯微鏡下分析染色體有無數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，作為胎兒產(chǎn)前染色體病的診斷指標，或出生后染色體病的診斷指標。某些實驗項目的質(zhì)量控制就是由各醫(yī)療或科研機構(gòu)的主管部門將已知某種物質(zhì)(含量)的質(zhì)控品定期分發(fā)給受控實驗室檢測，根據(jù)受控實驗室對質(zhì)控品的測定值，通過與質(zhì)控品實際值的比較處理，可知實驗測定值與質(zhì)控品實際值的差距，從而全面系統(tǒng)地考核受控實驗室的儀器、器材、試劑等實驗條件及實驗人員的技術(shù)水平，對質(zhì)控試驗不合格的實驗室，要求其作出整改措施，這就是實驗項目的質(zhì)量控制。但目前尚未見國內(nèi)外文獻報道以及有相關(guān)實驗室用淋巴細胞建株的方法來制備染色體核型分析質(zhì)控細胞并作相關(guān)的室內(nèi)與室間質(zhì)量控制。
本發(fā)明的目的是要提供以淋巴細胞建株的方法來制備染色體核型分折質(zhì)控細胞系(株)以及這類質(zhì)控細胞系(株)的保存和質(zhì)控方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的取已確診的各類染色體病患者(可包括部分染色體正常者)的外周血、骨髓或羊水標本，用常規(guī)淋巴細胞分離液經(jīng)離心分離出的白細胞(包括淋巴細胞)與RPMI1640細胞培養(yǎng)液及EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化液定量混合，經(jīng)37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，EBV能選擇性地轉(zhuǎn)化人類B淋巴細胞，并使其成為持續(xù)分裂、永久生存的細胞系或細胞株，當細胞數(shù)達到105/ml時，離心培養(yǎng)液收集細胞沉淀，根據(jù)細胞數(shù)量加入定量的凍存液使成105/ml的細胞懸液，以每管1mL的量分裝在凍存管中，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后凍存在-196℃液氮中作為備用的質(zhì)控細胞，用時復蘇質(zhì)控細胞，經(jīng)進一步培養(yǎng)增殖細胞數(shù)后或直接分發(fā)給受控實驗室，作細胞培養(yǎng)及染色體制片核型分析，受控實驗室將實驗結(jié)果反饋給質(zhì)控管理機構(gòu)，以判斷受控實驗室是否準確地鑒定出質(zhì)控細胞的異常染色體。
本發(fā)明主要由已確診的染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常的臨床病例包括21三體型、18三體型、13三體型、5P部分單體、45XO、X三體綜合癥、47XXY、47XYY、各類嵌合體、染色體易位、缺失、倒位、環(huán)狀以及等臂染色體等染色體病患者外周血淋巴細胞、骨髓細胞或羊水胎兒細胞作為原代細胞，以常規(guī)淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞(包括白細胞)，運用常規(guī)細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)法以及EB病毒(EBV)能選擇性地轉(zhuǎn)化人類B淋巴細胞、并使其成為持續(xù)分裂、永久生存的細胞系或細胞株的原理，經(jīng)凍存和復蘇，來制備染色體核型分析專用的質(zhì)控細胞系(株)，凍存?zhèn)溆?，?jīng)實驗證實，淋巴細胞在經(jīng)EBV轉(zhuǎn)染持續(xù)分裂的過程中染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)不會發(fā)生改變，即使有所改變，也剛好用來考核受控實驗室鑒別染色體核型改變的水平(參考實驗室與受控實驗室同時做)，且可建立核型異常染色體細胞庫，為其他相關(guān)科研提供異常染色體的細胞系(株)。
本發(fā)明的細胞培養(yǎng)液(基)選用RPMI1640培養(yǎng)基，其配方是稱取市售RPMI1640培養(yǎng)基粉末10.4g，溶于1000ml的雙蒸水中，40℃保存，有效期為1至2個月，存放-20℃可較長期保存，也可選用市售的TC199、Eagle、Ham’s F10、F12、MEM等培養(yǎng)基，B95-8細胞株為狨猴B淋巴細胞株，可由中科院遺傳研究所提供，B95-8細胞株經(jīng)復蘇后在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-7天，上清液中可得到含大量EBV的EBV懸液，凍存液含95％胎牛血清及5％二甲亞砜。
本發(fā)明按以下具體方法進行染色體核型分析質(zhì)控細胞建株并進行質(zhì)量控制。
外周血淋巴細胞染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法取已確診為相關(guān)染色體病患者的靜脈血5-10ml，肝素抗凝，放無菌離心管中3000rpm離心30分鐘，取血漿及其與紅細胞層之間的灰白色白細胞層，放入另一離心管中，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌3次，然后用2mlRPMI1640重懸，加入EBV懸液1.2ml，環(huán)孢菌素A 0.4ml混勻，等份轉(zhuǎn)入兩個10ml培養(yǎng)瓶中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-48h后觀察細胞轉(zhuǎn)化生長情況，當細胞數(shù)達到105/ml時，將細胞懸液收集到10ml離心管中1200rpm離心10分鐘，棄上清液，加入凍存液，分裝在數(shù)支凍存管中，每管1ml凍存液，將蓋擰緊，標明質(zhì)控細胞名稱、代數(shù)、凍存日期及操作人，置-20℃2h，再置-70℃2h后放入-196℃液氮罐中保存。此即為染色體核型分折質(zhì)控細胞，需用質(zhì)控細胞來做質(zhì)控時，將質(zhì)控細胞復蘇，方法是取出凍存管，迅速入37℃水浴，不斷震搖，盡快融化，然后離心去上清液，用新鮮培養(yǎng)液清洗細胞懸液一次，用培養(yǎng)液適當稀釋后裝入培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，以后按常規(guī)培養(yǎng)、制片、染色、作染色體核型鑒定。如果要將質(zhì)控細胞運送到較遠的實驗室，可用液氮或干冰保存運送法作短期運輸效果較好，或選生長狀態(tài)較好的細胞，待細胞生長達80％-90％匯合時，去掉舊培養(yǎng)液換入新培養(yǎng)液達到瓶的頸部，保留小許空間運輸，到達后倒出大部分培養(yǎng)液，保留正常量，置37℃培養(yǎng)，次日傳代培養(yǎng)，制片、染色、作染色體鑒定。骨髓染色體鑒定質(zhì)控細胞的制備方法同外周血淋巴細胞質(zhì)控細胞的制備方法。
羊水胎兒細胞染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法取已確診的染色體病患兒羊水以無菌操作分裝入若干個試管內(nèi)，每管10-15ml，1000r/min離心10min，去上清液，留約1.5ml，輕輕混勻后，用RPMI1640洗3次，然后按外周血淋巴細胞染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法進行建株與質(zhì)控。
染色體核型分析質(zhì)控方法由質(zhì)控主管機構(gòu)、學術(shù)機構(gòu)、參考實驗室及各受控實驗室組成質(zhì)控網(wǎng)絡(luò)，由參考實驗室定期選擇數(shù)種染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常的質(zhì)控細胞發(fā)放給各受控實驗室，由受控實驗室將質(zhì)控細胞與被檢細胞在同等條件下作細胞培養(yǎng)、制片、分帶及染色體鑒定，結(jié)果通過計算機網(wǎng)絡(luò)等方式反饋給參考實驗室；由參考實驗室核對其結(jié)果是否準確。
染色體核型分析質(zhì)控結(jié)果評價方法可根據(jù)實際情況評分，如細胞培養(yǎng)質(zhì)量指標包括培養(yǎng)后細胞總數(shù)、推成規(guī)定數(shù)量的細胞玻片后平均每高倍視野細胞數(shù)，染色體分裂像質(zhì)量指標包括染色體分裂像分散度質(zhì)量指標如計數(shù)100個分裂像以觀察46條染色體分布在油鏡視野的個數(shù)、染色體相交、相接的數(shù)量及染色體分裂像總數(shù)指標包括全部細胞片子可計算、可分析分裂像數(shù)目，染色體帶紋是否清晰顯示，特別是質(zhì)控細胞中的異常染色體是否都被正確地鑒定出來等。
權(quán)利要求
1.一種用于醫(yī)療領(lǐng)域的染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法，其主要特征是取已確診的各類染色體病患者(可包括部分染色體正常者)的外周血、骨髓或羊水標本，用常規(guī)淋巴細胞分離液經(jīng)離心分離出的白細胞(包括淋巴細胞)與RPMI1640細胞培養(yǎng)液及EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化液定量混合，經(jīng)37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，EBV能選擇性地轉(zhuǎn)化人類B淋巴細胞，并使其成為持續(xù)分裂、永久生存的細胞系或細胞株，當細胞數(shù)達到105/ml時，離心培養(yǎng)液收集細胞沉淀，根據(jù)細胞數(shù)量加入定量的凍存液使成105/ml的細胞懸液，以每管1mL的量分裝在凍存管中，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后凍存在-196℃液氮中作為備用的質(zhì)控細胞，用時復蘇質(zhì)控細胞，經(jīng)進一步培養(yǎng)增殖細胞數(shù)后或直接分發(fā)給受控實驗室，作細胞培養(yǎng)及染色體制片核型分析，受控實驗室將實驗結(jié)果反饋給質(zhì)控管理機構(gòu)，以判斷受控實驗室是否準確地鑒定出質(zhì)控細胞的異常染色體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法，其特征是染色體病包含了所有染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常的疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法，其特征是質(zhì)控細胞是由各種染色體異常核型、正常核型及多態(tài)性核型的細胞制成的細胞系或細胞株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法，其特征是專用細胞培養(yǎng)基包含了RPMI1640、TC199、Eagle、Ham’sF10、F12、MEM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、3所述的染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法，其特征是質(zhì)控細胞凍存于液氮中實質(zhì)就是建立一種以細胞系或細胞株形式保存各類異常染色體核型細胞的細胞庫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法，其特征是質(zhì)控方法包含了由質(zhì)控主管者、參考實驗室及受控實驗室組成并由計算機進行網(wǎng)上會診的質(zhì)控網(wǎng)絡(luò)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于醫(yī)療領(lǐng)域的染色體核型分析質(zhì)控細胞建株及質(zhì)控方法，其主要特征是以常規(guī)淋巴細胞分離法分離受試染色體異常核型患者及正常者外周血、骨髓或羊水中淋巴細胞，經(jīng)與含EB病毒的RPMI1640培養(yǎng)液混合并置37℃5％CO2中培養(yǎng)，淋巴細胞被EB病毒轉(zhuǎn)化為持續(xù)分裂、永久生存的細胞系或細胞株，當細胞數(shù)達到10
文檔編號G01N33/50GK1916183SQ200510091259
公開日2007年2月21日 申請日期2005年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日
發(fā)明者翁炳煥 申請人:翁炳煥