專利名稱：從實時核酸擴(kuò)增數(shù)據(jù)中定量核酸初始濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及定量初始核酸濃度的方法，更具體的，涉及從通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)，滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)等等得到的實時核酸擴(kuò)增數(shù)據(jù)中定量初始核酸濃度的方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在多種用于檢測和定量核酸的分析方法中是應(yīng)用最為廣泛的。PCR的原理在美國專利4,683,195和4,683,202中公開。
常規(guī)PCR只能給出在端點擴(kuò)增的DNA通過瓊脂糖凝膠的定性結(jié)果。然而，這樣的常規(guī)PCR有一個問題即它不能用于定量分析。為了解決這個問題，開發(fā)了實時PCR(real-time PCR)。實時PCR應(yīng)用光學(xué)檢測系統(tǒng)實時檢測與擴(kuò)增的DNA的濃度成比例的熒光強(qiáng)度，于是進(jìn)行DNA的定量分析成為可能。
從核酸擴(kuò)增數(shù)據(jù)中定量核酸初始濃度的常規(guī)方法在美國專利6,303,305和6,503,720中公開。在這些常規(guī)方法中，擴(kuò)增了核酸而且得到了在每個擴(kuò)增循環(huán)中表示核酸量的函數(shù)。然后，計算函數(shù)的第n階導(dǎo)數(shù)(n-th orderderivative of the function)并由結(jié)果計算核酸的初始濃度。而且，應(yīng)用導(dǎo)數(shù)的最大值作為閾值循環(huán)(threshold cycle)(Ct)的定量分析方法在美國專利6,303,305中公開，而應(yīng)用導(dǎo)數(shù)的最大、最小和零值作為Ct的定量分析方法在美國專利6,503,720中公開。
而且，從核酸擴(kuò)增數(shù)據(jù)中定量核酸的初始濃度的另一種方法在出版編號為2002-0031768的美國專利申請中公開。由此，應(yīng)用導(dǎo)數(shù)的特定值定量核酸的濃度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了由實時核酸擴(kuò)增數(shù)據(jù)不用微分或積分定量核酸初始濃度的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，定量核酸初始濃度的方法包括擴(kuò)增核酸；產(chǎn)生表示與核酸量成比例升高或降低的熒光強(qiáng)度和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或擴(kuò)增時間之間的相關(guān)性的函數(shù)；應(yīng)用上述函數(shù)計算當(dāng)核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度后為其最大值的一半時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間；和由特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間計算核酸的初始濃度。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，定量核酸初始濃度的方法包括擴(kuò)增核酸；產(chǎn)生表示與核酸量成比例的熒光強(qiáng)度和核酸的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或擴(kuò)增時間之間的相關(guān)性的函數(shù)；應(yīng)用上述函數(shù)計算擴(kuò)增前核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度；和由算得的擴(kuò)增前的熒光強(qiáng)度減去背景熒光強(qiáng)度計算核酸的初始濃度。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，定量核酸初始濃度的方法包括擴(kuò)增核酸；產(chǎn)生表示核酸的擴(kuò)增效率和核酸的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或擴(kuò)增時間之間的相關(guān)性的函數(shù)；應(yīng)用上述函數(shù)計算擴(kuò)增效率為最大值或最小值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間；和由特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間計算核酸的初始濃度。
根據(jù)本發(fā)明，核酸的初始濃度可以不用微分或積分進(jìn)行定量。


根據(jù)附圖，通過其詳細(xì)的代表性的實施方案中的描述，本發(fā)明的上述或其他特點和優(yōu)點會更加明顯，其中圖1為顯示擴(kuò)增的核酸的熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的相關(guān)性的數(shù)學(xué)模型的圖；圖2A至2F為顯示核酸的實時擴(kuò)增數(shù)據(jù)和這些數(shù)據(jù)以圖1的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行最小二乘擬合(least-square fitting)的結(jié)果的圖；圖3為顯示擴(kuò)增效率與不同核酸初始濃度的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間關(guān)系的圖；圖4為顯示計算當(dāng)擴(kuò)增效率為圖3中的最大值時的特征循環(huán)數(shù)的計算方法的圖；圖5為顯示圖1的數(shù)學(xué)模型中核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度為熒光強(qiáng)度最大值的一半時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(n1/2)與核酸的初始濃度的關(guān)系，擴(kuò)增效率為圖3的最大值時特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(nEmax)與核酸的初始濃度的關(guān)系，和當(dāng)熒光強(qiáng)度的二階導(dǎo)數(shù)為最大值時的常規(guī)特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct與核酸的初始濃度的關(guān)系的圖；圖6為顯示R0(圖1的數(shù)學(xué)模型中擴(kuò)增前核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度)與核酸的初始濃度之間關(guān)系的圖；圖7A至7C為顯示根據(jù)本發(fā)明計算核酸的初始濃度的方法和已有技術(shù)的結(jié)果的表；圖8為顯示核酸的熒光強(qiáng)度和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系變化的圖和顯示擴(kuò)增效率和核酸的不同初始濃度的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系變化的圖；圖9為顯示當(dāng)擴(kuò)增效率為最大值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和由圖8的測試結(jié)果得到的核酸初始濃度之間關(guān)系的圖；圖10為顯示采用不同的值作為核酸的背景熒光強(qiáng)度時，背景修正的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間關(guān)系的圖；圖11為顯示不同初始濃度下核酸的熒光強(qiáng)度的初始行為的變化的圖；圖12A和12B為顯示采用不同的值作為背景熒光強(qiáng)度時，不同的核酸初始濃度下背景修正的擴(kuò)增效率曲線的變化的圖；圖12C為顯示核酸的初始濃度與當(dāng)背景修正的擴(kuò)增效率具有最大或最小值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系變化的圖，和顯示核酸的初始濃度與圖12A和12B中不同的Rb值下，當(dāng)背景修正的擴(kuò)增效率具有最大或最小值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的CV％之間的關(guān)系變化的圖；圖13為顯示對于不同背景熒光強(qiáng)度的采用方法，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系變化的圖；圖14為顯示圖13中不同的背景熒光強(qiáng)度的采用方法下，背景修正的擴(kuò)增效率與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系變化的圖；圖15為顯示進(jìn)行或不進(jìn)行背景熒光強(qiáng)度修正時，核酸的初始濃度與當(dāng)背景修正的擴(kuò)增效率為最大值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間關(guān)系的圖；圖16顯示背景熒光強(qiáng)度修正對核酸初始濃度的定量方法精確度的影響，所述定量方法使用當(dāng)背景修正的擴(kuò)增效率為最大值時的特征擴(kuò)增周期數(shù)，所述特征循環(huán)周期數(shù)是利用圖15的關(guān)系式得到的。
圖17為顯示一個實例以說明特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的CV％對于核酸初始濃度的定量的精確度的影響的圖。
具體實施例方式
現(xiàn)在根據(jù)附圖，對一種從實時核酸擴(kuò)增數(shù)據(jù)，特別是PCR數(shù)據(jù)，定量核酸初始濃度的方法進(jìn)行描述。
圖1為顯示擴(kuò)增的核酸的熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系的數(shù)學(xué)模型的圖。
應(yīng)用酶的核酸擴(kuò)增通過需要熱循環(huán)的方法，諸如PCR、RT-PCR、嵌套PCR(nested PCR)和LCR或等熱的核酸擴(kuò)增方法，諸如SDA、NASBA、TMA和RCA進(jìn)行。這里，核酸可從生物體或病毒中提取。
在實時PCR實驗的每一個擴(kuò)增循環(huán)中，核酸的熒光強(qiáng)度的測量結(jié)果可以圖1所示的圖作為模型。圖1的S型模型可由下面的式1表示。
R=Rb+Rmax1+en-n1/2k]]>其中，R核酸的熒光強(qiáng)度Rb核酸的背景熒光強(qiáng)度Rmax核酸的最大熒光強(qiáng)度n擴(kuò)增循環(huán)數(shù)n1/2當(dāng)核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度為其最大值的一半時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)k擴(kuò)增反應(yīng)中與熒光強(qiáng)度的改變速率相關(guān)的參數(shù)數(shù)學(xué)模型與實際PCR數(shù)據(jù)的誤差可由下面的式2進(jìn)行計算。
ϵ2=Σn[Rn-{Rb+Rmax1+en-n1/2k}]2]]>其中Rn表示實時PCR中第n個擴(kuò)增循環(huán)時的核酸的實際熒光強(qiáng)度。
為了計算圖1數(shù)學(xué)模型中的參數(shù)Rb、Rmax、n1/2和k應(yīng)用最小二乘法，得到了式3或式4a到4d的非線性方程組且該方程組可以應(yīng)用Newton-Raphson方法解。

∂ϵ2∂Rb=0,∂ϵ2∂Rmax,∂ϵ2∂n1/2=0,∂ϵ2∂k=0]]>[式4a]Σn[Rn-{Rb+Rmax1+e-(n-n1/2)k}]2=0]]>[式4b]Σn[Rn-{Rb-Rmax1+e-(n-n1/2)k}×11+e-n-n1/2k]=0]]>[式4c]Σn[Rn-{Rb+Rmax1+e-(n-n1/2)k}×e-n-n1/2k{1+e-n-n1/2k}2]=0]]>[式4d]Σn[Rn-{Rb-Rmax1+e-(n-n1/2)k}×(n-n1/2)e-n-n1/2k{1+en-n1/2k}2]=0]]>當(dāng)式1中n＝0，擴(kuò)增反應(yīng)前核酸的熒光強(qiáng)度減去背景熒光強(qiáng)度Rb可用式5定義。
R0=Rmax1+en1/2/k]]>圖2A至2F為顯示HBV質(zhì)粒DNA的實時擴(kuò)增數(shù)據(jù)和這些數(shù)據(jù)以圖1的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行最小二乘擬合的結(jié)果的圖。
圖2A是當(dāng)核酸的初始濃度為107拷貝/反應(yīng)(反應(yīng)體積中的拷貝數(shù))時的結(jié)果，圖2B是當(dāng)初始濃度為106拷貝/反應(yīng)時的結(jié)果，圖2C是當(dāng)初始濃度為105拷貝/反應(yīng)時的結(jié)果，圖2D是當(dāng)初始濃度為104拷貝/反應(yīng)時的結(jié)果，圖2E是當(dāng)初始濃度為105拷貝/反應(yīng)時的結(jié)果，和圖2F是當(dāng)初始濃度為2.5×106拷貝/反應(yīng)時的結(jié)果?？梢钥闯?，當(dāng)核酸的初始濃度增加時，核酸開始快速擴(kuò)增時的循環(huán)數(shù)減少。
而且可以看出，核酸的熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的相關(guān)性的有關(guān)實驗結(jié)果的圖幾乎與應(yīng)用式1的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行最小二乘擬合結(jié)果的圖相似。
擴(kuò)增效率可以式6a和6b作為數(shù)學(xué)模型。
Rn＝(1+En)Rn-1其中，Rn第n個擴(kuò)增循環(huán)中的熒光強(qiáng)度Rn-1第(n-1)個擴(kuò)增循環(huán)中的熒光強(qiáng)度En第n個擴(kuò)增循環(huán)的擴(kuò)增效率式6a可以重寫為下面的式6b。
En=Rn-Rn-1Rn-1]]>圖3為顯示擴(kuò)增效率與核酸不同初始濃度的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間關(guān)系的圖。關(guān)于圖3，可以看出在PCR循環(huán)中擴(kuò)增效率不是不變的。
圖4為顯示當(dāng)擴(kuò)增效率為圖3中的最大值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的判定方法的圖。
關(guān)于圖4，假定在最大值或最小值附近的三個點的x-y坐標(biāo)已知?，F(xiàn)在對應(yīng)用拋物曲線擬合判定使y值最大或最小的x值的數(shù)學(xué)方法進(jìn)行描述。
首先，對于三個坐標(biāo)(x1，y1)，(x2，y2)，(x3，y3)建立下面的式7a。
y1=ax12+bx1+c,y2=ax22+bx2+c,y3=ax32+bx3+c]]>如果式7a重寫為矩陣格式，結(jié)果由式7b給出。
x12x11x22x21x32x31abc=y1y2y3]]>如果定義x12x11x22x21x32x31=det(A),]]>常數(shù)a，b和c可以由克菜姆法則(Cramer’srule)表示如下。

a=|y1x11y2x21y3x31|/det(A)]]>b=|x12y11x22y21x32y31/det(A)]]>c=x12x1y1x22x2y2x32x3y3/det(A)]]>然后，xmax可以由下面的式7d計算。
xmax=-b2a=y1(x22-x32)+y2(x32-x12)+y3(x12-x22)2[y1(x2-x3)+y2(x3-x1)+y3(x1-x2)]]]>至此，描述了應(yīng)用數(shù)學(xué)模型實現(xiàn)核酸的熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的相關(guān)性的方法和數(shù)學(xué)模型參數(shù)的計算方法?，F(xiàn)在，對數(shù)學(xué)模型中的具體參數(shù)與核酸的初始濃度之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行描述。并且，基于這種關(guān)聯(lián)對核酸的初始濃度的定量方法進(jìn)行描述。
圖5為顯示圖1的數(shù)學(xué)模型中核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度為其最大值的一半時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(n1/2)與核酸的初始濃度的關(guān)系，擴(kuò)增效率為圖3的最大值時特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(nEmax)與核酸的初始濃度的關(guān)系，和當(dāng)熒光強(qiáng)度的二階導(dǎo)數(shù)為最大值時的常規(guī)特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Ct與核酸的初始濃度的關(guān)系的圖。
關(guān)于圖5，當(dāng)初始濃度(log[拷貝/反應(yīng)])較高時，特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)n1/2和nEmax都減少。而且可以看出，應(yīng)用[a]二階導(dǎo)數(shù)[值value]計算核酸初始濃度的常規(guī)方法的斜率幾乎與本發(fā)明應(yīng)用的采用n1/2和nEmax計算時一致。這里，應(yīng)用nEmax的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線位于應(yīng)用n1/2的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線之下。因此，當(dāng)應(yīng)用nEmax時，核酸的初始濃度相比應(yīng)用n1/2的情況，可以在更少的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)下定量。
圖6為顯示式5中的R0與核酸的初始濃度之間關(guān)系的圖。關(guān)于圖6，可以看出，log(核酸初始濃度)與log(R0)成線性比例。
描述了應(yīng)用圖5和6的比例關(guān)系得到核酸初始濃度的三種新方法。第一種方法是應(yīng)用當(dāng)核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度為其最大值的一半時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或時間n1/2，第二種方法是應(yīng)用當(dāng)核酸的擴(kuò)增效率為最大值(nEmax)或最小值(nEmin)時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間，第三種方法是應(yīng)用R0，擴(kuò)增前的熒光強(qiáng)度減去背景熒光強(qiáng)度。
現(xiàn)在，對關(guān)于應(yīng)用上述新方法，定量其初始濃度未知的核酸的初始濃度的方法進(jìn)行描述。
首先，核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如，PCR，LCR，SDA，NASBA，TMA，RCA等等)在預(yù)定的其初始濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)核酸樣品中進(jìn)行。然后，計算圖1或3所示的數(shù)學(xué)模型中的參數(shù)。然后，應(yīng)用n1/2，nEmax和R0中的參數(shù)得到如圖5或6的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線。
同時，在未知的樣品中進(jìn)行同樣的核酸擴(kuò)增反應(yīng)并計算標(biāo)準(zhǔn)校正曲線中應(yīng)用的同樣的參數(shù)(n1/2或nEmax或R0)。然后，未知核酸樣品的初始濃度由圖5或6所示的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線得到。具體地，當(dāng)應(yīng)用nEmax時，可以花費非常少的數(shù)值計算的氣力，在實時得到并且顯示擴(kuò)增效率。而且，核酸的初始濃度可以用非常簡單的計算進(jìn)行定量，從而降低定量未知核酸樣品所需的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。
圖7A至7C為顯示應(yīng)用本發(fā)明的方法和由已有技術(shù)中的熒光強(qiáng)度的二階導(dǎo)數(shù)得到的Ct進(jìn)行核酸定量的結(jié)果的實例的表。
圖7A顯示算得的用于核酸定量的參數(shù)值，核酸初始濃度為104，105，106和107拷貝/反應(yīng)，以得到如圖5或6所示的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線(重復(fù)6次)。圖7B和7C顯示應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明圖7A得到的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線和應(yīng)用已有技術(shù)得到的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，測試的核酸樣品的定量結(jié)果。關(guān)于圖7B和7C，替代Ct，n1/2、nEmax或R0可用作核酸定量分析的特征因子。在圖7B中，誤差為以[(用校正曲線算得的拷貝/反應(yīng)值)-(實際拷貝/反應(yīng)值)]的絕對值除以(實際拷貝/反應(yīng)值)得到的值的百分?jǐn)?shù)。例如，誤差(Ct)的第一個值計算為(5.4E+0.5-5.0E+05)/5.0E+05，即8.08％。在圖7C中，在5.0E05時的平均誤差代表圖7B中的重復(fù)6次實驗的誤差平均值。
圖8為顯示核酸的熒光強(qiáng)度和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系變化的圖和顯示100，101，102，103，104，105，106，107和108拷貝/反應(yīng)的不同初始核酸濃度下(重復(fù)9次)，擴(kuò)增效率和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系變化的圖。
關(guān)于圖8，顯示熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系的圖中減去了核酸的背景熒光信號。由圖11可以看出，熒光強(qiáng)度從一個正值開始，在初始階段減小而后又增加。這是由熒光染料的眾所周知的特征—光漂白效應(yīng)造成的。圖11中所有的熒光強(qiáng)度的最小值均為0，因為減去了背景熒光強(qiáng)度。這引起擴(kuò)增效率圖中出現(xiàn)如圖8的突出而尖銳的最大值。圖8中的最大效率大于1.0，這不能作為一個物理上的效率的概念被接受。
圖9為顯示特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)nEmax和由圖8的測試結(jié)果得到的核酸初始濃度之間關(guān)系的圖。
關(guān)于圖9，核酸的初始濃度范圍為103-107時圖是線性的，所以該圖可以用作在此范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線以根據(jù)本發(fā)明計算初始濃度。然而，當(dāng)核酸的初始濃度低于103時，數(shù)據(jù)具有不規(guī)則的圖案。
為了防止擴(kuò)增效率圖型具有突出而尖銳的大于1.0的最大值，表示擴(kuò)增效率的式6b可以如下面重寫。
En=(Rn+Rb)-(Rn-1+Rb)Rn-1+Rb=Rn-Rn-1Rn-1+Rb]]>其中，Rn為第n個擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度，Rn-1為第(n-1)個擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度，Rb為表示背景熒光強(qiáng)度的任意常數(shù)，和En為第n個擴(kuò)增循環(huán)的擴(kuò)增效率。
圖10為顯示根據(jù)在六次重復(fù)實驗中當(dāng)核酸的初始濃度為107拷貝/反應(yīng)時四種不同的背景熒光強(qiáng)度Rb的定義的背景修正的擴(kuò)增效率圖型的圖。當(dāng)Rb為0時，即，當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)中熒光強(qiáng)度的最小值Rmin為0，擴(kuò)增效率的圖型具有突出(pointed)而尖銳的形狀，如圖8。雖然當(dāng)Rb為0時，出現(xiàn)最大擴(kuò)增效率的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)看起來幾乎為不變，但是當(dāng)重復(fù)6次后，它出現(xiàn)在更早的循環(huán)數(shù)并且它的值也不是常數(shù)。
相反地，當(dāng)Rb為非零(即R1，0.01，-(Rb)S型(sigmoidal))，出現(xiàn)最大擴(kuò)增效率的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)看起來幾乎為不變且重復(fù)6次的擴(kuò)增效率的最大值也不變。
現(xiàn)在根據(jù)圖15-17，描述了可接受作為常數(shù)Rb的常數(shù)和當(dāng)Rb以擴(kuò)增效率的定義加以考慮時的改進(jìn)。
首先，由所有擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)以式1中的S型模型進(jìn)行最小二乘擬合得到的-(Rb)S型，可以用作式8中的Rb。
第二，當(dāng)熒光強(qiáng)度在擴(kuò)增反應(yīng)的初始階段自非零開始，減少到0然后又增加(參考圖11)，對應(yīng)于初始熒光強(qiáng)度的值可以用作Rb的值。例如，參考圖11，雖然初始熒光強(qiáng)度與不同的核酸初始濃度有微小的不同，它平均為0.01。因此，0.01的值可以用作Rb的值。如果擴(kuò)增條件，諸如試劑、熒光染料和視覺曝光時間不改變，初始熒光強(qiáng)度就不會顯著變化。因此，一旦與初始熒光強(qiáng)度對應(yīng)的值由實驗確定，它可以從那時起被用作Rb。相反，如果擴(kuò)增條件，諸如試劑、熒光染料和視覺曝光時間改變，對應(yīng)于初始熒光強(qiáng)度的值就必須由實驗重新確定。
第三，第一個擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度R1，可以用作Rb的值。即使擴(kuò)增條件，諸如試劑、熒光染料和視覺曝光時間改變，這種方法具有的優(yōu)勢為使用者不需要多花費額外氣力來確定Rb，因為每次實驗時第一個擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度總是要進(jìn)行測定的。雖然這種方法比第二種方法具有這個優(yōu)勢，但是當(dāng)?shù)谝粋€擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度非常接近0時，定量誤差會增加第四，式8的擴(kuò)增效率函數(shù)中使最大擴(kuò)增效率為“1”(單位)的值可以用作Rb的值。為了獲得最大擴(kuò)增效率為1的Rb，Rb的值必須以迭代法(iterativemethod)如在每輪擴(kuò)增實驗進(jìn)行連續(xù)的置換得到。雖然此法在原則上是理想的，但迭代計算是復(fù)雜或耗費時間的。
如上所述，背景熒光強(qiáng)度Rb可以設(shè)為下列的值之一1)由所有擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)以式1中的S型模型進(jìn)行最小二乘擬合得到的-(Rb)S型；2)對應(yīng)于初始熒光強(qiáng)度的值(圖11中大約0.01)；3)第一個擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度[的R1強(qiáng)度]，R1；和4)使擴(kuò)增效率的最大值為“1”的值。
這里，背景熒光強(qiáng)度-(Rb)S型的應(yīng)用是不方便的，因為它必須通過S型模型的非線性曲線擬合計算得到。然而，本發(fā)明的其他方法(初始熒光強(qiáng)度R1，和使最大擴(kuò)增效率為“1”的值)則不需要用曲線擬合。
為了計算背景修正的擴(kuò)增效率，甚至更大的正值或負(fù)值可以用作Rb的值。這將根據(jù)圖12A至12C進(jìn)行描述。
圖12A和12B為顯示應(yīng)用如圖8中同樣的實驗數(shù)據(jù)，在背景熒光強(qiáng)度的不同值下，背景修正的擴(kuò)增效率的變化的圖。
當(dāng)Rb為正值0.01、0.1、1、10、100和1000時的情況如圖12A所示。由于各個情況下背景修正的擴(kuò)增效率具有可很好地辨別的正峰，并根據(jù)核酸初始濃度在擴(kuò)增循環(huán)數(shù)有幾乎相等的間隔，根據(jù)本發(fā)明，它們可以用于定量核酸的初始濃度。然而，當(dāng)Rb的值大于0.1時，背景修正的擴(kuò)增效率的最大值變得遠(yuǎn)小于1，這在擴(kuò)增效率的意義上沒有物理意義。但是，如圖12A可以看出，各個背景修正的擴(kuò)增效率圖型具有最大值時的擴(kuò)增循環(huán)nEmax位于幾乎相等的區(qū)間。這樣，它們所有都可用于定量核酸的初始濃度。但是，優(yōu)選應(yīng)用背景修正的擴(kuò)增效率在0-1的范圍內(nèi)的情況，即Rb的值為0.01(此值對應(yīng)于核酸的初始熒光強(qiáng)度)的情況。
當(dāng)Rb為負(fù)值-0.01、-0.1、-1、-10、-100和-1000時的情況如圖12B所示。當(dāng)Rb的值為-0.01和-0.1，背景修正的擴(kuò)增效率函數(shù)(式8)的除數(shù)(divisor)非常接近0，這樣背景修正的擴(kuò)增效率圖型具有突出而尖銳的峰且不呈現(xiàn)當(dāng)Rb的絕對值大時的常規(guī)區(qū)間圖樣，背景修正的擴(kuò)增效率圖型具有可很好地辨別的負(fù)峰，并根據(jù)核酸初始濃度在擴(kuò)增循環(huán)數(shù)有幾乎相等的間隔。具體地，當(dāng)Rb小于-1時，背景修正的擴(kuò)增效率值為負(fù)值。由于擴(kuò)增效率只在從0到1的范圍內(nèi)具有物理意義，雖然核酸的初始濃度可以用圖12B給出的值進(jìn)行定量，但是擴(kuò)增效率沒有物理意義。但是，如圖12B可以看出，當(dāng)Rb的值小于-1(例如-1、-10、-100、-1000)時，各自的背景修正的擴(kuò)增效率圖型具有最小值時的擴(kuò)增循環(huán)nEmin位于幾乎相等的區(qū)間。這樣，它們所有都可用于定量核酸的初始濃度。
圖12C為顯示核酸的初始濃度與當(dāng)背景修正的擴(kuò)增效率具有最大或最小值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)nEmax或nEmin之間的關(guān)系變化的圖，和顯示核酸的初始濃度與圖12A和12B中不同的Rb值下nEmax或nEmin的CV％之間的關(guān)系變化的圖。
關(guān)于圖12C，當(dāng)Rb的值增加到正值(圖12A)或減小到負(fù)值(圖12B)時，核酸的初始濃度和nEmax或nEmin之間的關(guān)系的圖分別收斂到曲線(converge toa curve)。除去Rb的值為0和-0.01的情況之外，當(dāng)核酸的初始濃度在103-108拷貝/反應(yīng)的范圍內(nèi)時，nEmax的CV％不超過5％。核酸初始濃度的定量誤差與nEmax或nEmin的CV％之間的關(guān)系將根據(jù)圖17進(jìn)行描述。
當(dāng)Rb的值大于某些值，CV％的值幾乎不改變。這樣，這些值除去圖10中Rb＝0即，R1，0.01之外，-(Rb)S型可以優(yōu)選作為Rb的值以在擴(kuò)增效率在0-1的范圍內(nèi)改善nEmax的CV％。
圖13為顯示對于不同的背景熒光強(qiáng)度的采用方法，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系變化的圖。
圖14為顯示圖13中不同的背景熒光強(qiáng)度的采用方法下，背景修正的擴(kuò)增效率與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系變化的圖。
關(guān)于圖13和14，當(dāng)Rb的值為0，該值是熒光強(qiáng)度圖型的最小值(即，Rb＝Rbmin＝0)，所以式8中的除數(shù)(Rn-1+Rb)接近0。這樣，擴(kuò)增效率En增加太大，Emax峰變得突出而尖銳。而且，擴(kuò)增效率容易被噪音影響。當(dāng)Rb的值為非零，擴(kuò)增效率圖型具有可完全辨別的峰，并根據(jù)核酸初始濃度在擴(kuò)增循環(huán)數(shù)有幾乎相等的間隔。然而，在圖14中，如果Rb＝R1，背景修正的擴(kuò)增效率的最大值在擴(kuò)增循環(huán)的初始階段(循環(huán)數(shù)＝5)大于1而且峰型非常尖銳而突出。在擴(kuò)增核酸的常規(guī)方法中，在這一早期階段通常不發(fā)生這樣的快速擴(kuò)增而且大于1的擴(kuò)增效率沒有物理意義。因此，必須忽視這些峰而且應(yīng)用第二大的峰值定量核酸的初始濃度。
圖15為顯示核酸的初始濃度與進(jìn)行(Rb＝0.01)或不進(jìn)行(Rb＝0)背景熒光強(qiáng)度修正時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)nEmax之間的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線的圖。
關(guān)于圖15，進(jìn)行和不進(jìn)行背景熒光修正時的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線在核酸初始濃度范圍從103到108下均為線性。[后圖置于前圖之上。]可以看出，進(jìn)行背景熒光修正的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線位于不進(jìn)行背景熒光修正的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線之上。
圖16顯示背景熒光強(qiáng)度修正對使用特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)nEmax定量核酸初始濃度的方法的精確度的影響，所述特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)nEmax是應(yīng)用利用圖15的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線得到的。
由圖16可以看出，應(yīng)用背景熒光修正(Rb＝0.01)，nEmax的CV％(＝St.Dev(標(biāo)準(zhǔn)偏差)/Avg(平均值))明顯地減小。
圖17為顯示實例以說明特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的CV％對于核酸初始濃度的定量的精確度的影響的圖。
關(guān)于圖17，當(dāng)特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的CV％從0.5變到5.0，誤差(拷貝誤差)發(fā)生很大變化，從6.85％變到48.5％。即，即使是特征擴(kuò)增循環(huán)的誤差輕微地增加，也會引起核酸初始濃度的定量結(jié)果產(chǎn)生大的誤差。由于這些原因，非常精確的定量方法是不可缺少的。如圖16所示，應(yīng)用背景熒光校正(Rb＝0.01)，nEmax的CV％極大地減少，所以與不應(yīng)用背景熒光修正的情況(Rb＝0)比較，定量精確度得到了極大地改進(jìn)。
根據(jù)本發(fā)明，描述了從實時核酸擴(kuò)增(PCR、LCR、SDA、NASBA、TMA、RCA等)的數(shù)據(jù)中得到核酸的初始濃度的三種新方法，應(yīng)用當(dāng)核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度為其最大值的一半時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或時間，當(dāng)擴(kuò)增效率為最大值或最小值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或時間，和擴(kuò)增前的熒光強(qiáng)度減去背景熒光強(qiáng)度，基于關(guān)于核酸的擴(kuò)增量與擴(kuò)增循環(huán)之間的相關(guān)性的數(shù)學(xué)模型，不用進(jìn)行微分或積分。
具體地，當(dāng)應(yīng)用擴(kuò)增效率為最大值或最小值時的特征擴(kuò)增循環(huán)時，可以花費較少的數(shù)值計算的氣力從實時核酸擴(kuò)增數(shù)據(jù)中，得到并且在實時顯示擴(kuò)增效率。因此，可以比其他方法更快地得到核酸的初始濃度。
本發(fā)明也可以具體體現(xiàn)為計算機(jī)可讀的記錄介質(zhì)上的計算機(jī)可讀的編碼。計算機(jī)可讀的記錄介質(zhì)為任何數(shù)據(jù)存儲設(shè)備，該設(shè)備可以存儲此后可被計算機(jī)系統(tǒng)讀取的數(shù)據(jù)。計算機(jī)可讀的記錄介質(zhì)的實例包括只讀存儲器(ROM)、隨機(jī)存取存儲器(RAM)、CD-ROM、磁帶、軟盤、光學(xué)數(shù)據(jù)存儲設(shè)備，和載波(諸如通過Internet的數(shù)據(jù)傳輸)。計算機(jī)可讀的記錄介質(zhì)也可散布于網(wǎng)絡(luò)連接的計算機(jī)系統(tǒng)中，使得計算機(jī)可讀的編碼也以散布的方式被存儲和執(zhí)行。
當(dāng)具體顯示和以其例證性的實施方案描述本發(fā)明時，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解可以在其中的形式和細(xì)節(jié)上產(chǎn)生的而不脫離如下面的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的各種變化。
權(quán)利要求
1.定量核酸初始濃度的方法，包含擴(kuò)增核酸；產(chǎn)生表示與核酸量成比例升高或降低的熒光強(qiáng)度與核酸的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或擴(kuò)增時間之間的相關(guān)性的函數(shù)；利用所述函數(shù)計算當(dāng)核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度后為熒光強(qiáng)度最大值的一半時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間；和由特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間計算核酸的初始濃度。
2.權(quán)利要求1的方法，其中核酸是用酶擴(kuò)增的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中核酸是利用需要熱循環(huán)的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中核酸是利用等溫的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中表示相關(guān)性的函數(shù)是利用S型模型產(chǎn)生的。
6.權(quán)利要求5的方法，其中當(dāng)核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度后為熒光強(qiáng)度最大值的一半時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間是采用關(guān)于利用S型模型的函數(shù)的非線性最小二乘擬合法計算的。
7.權(quán)利要求1的方法，其中核酸的初始濃度是由特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間通過使用標(biāo)準(zhǔn)校正曲線計算的，該標(biāo)準(zhǔn)校正曲線表示核酸的初始濃度和核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度后為其最大值的一半時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間之間的關(guān)系。
8.定量核酸初始濃度的方法，包含擴(kuò)增核酸；產(chǎn)生表示與核酸量成比例升高或降低的熒光強(qiáng)度與核酸的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或擴(kuò)增時間之間的相關(guān)性的函數(shù)；利用所述函數(shù)計算擴(kuò)增前核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度；和由算得的擴(kuò)增前核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度計算核酸的初始濃度。
9.權(quán)利要求8的方法，其中核酸是用酶擴(kuò)增的。
10.權(quán)利要求8的方法，其中核酸是利用需要熱循環(huán)的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增的。
11.權(quán)利要求8的方法，其中核酸是利用等溫的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增的。
12.權(quán)利要求8的方法，其中表示相關(guān)性的函數(shù)是利用S型模型產(chǎn)生的。
13.權(quán)利要求12的方法，其中擴(kuò)增前核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度采用關(guān)于利用S型模型的函數(shù)的非線性最小二乘擬合法計算。
14.權(quán)利要求8的方法，其中核酸的初始濃度是由擴(kuò)增前核酸樣品的熒光強(qiáng)度通過使用標(biāo)準(zhǔn)校正曲線計算的，該標(biāo)準(zhǔn)校正曲線表示核酸的初始濃度與擴(kuò)增前核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系。
15.定量核酸初始濃度的方法，包含擴(kuò)增核酸；產(chǎn)生表示核酸的擴(kuò)增效率和核酸的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或擴(kuò)增時間之間的相關(guān)性的函數(shù)；利用所述函數(shù)計算擴(kuò)增效率為最大值或最小值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間；和由特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間計算核酸的初始濃度。
16.權(quán)利要求15的方法，其中核酸是用酶擴(kuò)增的。
17.權(quán)利要求15的方法，其中核酸是利用需要熱循環(huán)的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增的。
18.權(quán)利要求15的方法，其中核酸是利用等溫的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增的。
19.權(quán)利要求15的方法，其中表示擴(kuò)增效率的函數(shù)表達(dá)為En=Rn-Rn-1Rn-1]]>其中，Rn為第n個擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度，Rn-1為第(n-1)個擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度，而En為第n個擴(kuò)增循環(huán)的擴(kuò)增效率。
20.權(quán)利要求15的方法，其中表示擴(kuò)增效率的函數(shù)表達(dá)為En=Rn-Rn-1Rn-1+Rb]]>其中，Rn為第n個擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度，Rn-1為第(n-1)個擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度，Rb為表示核酸的背景熒光強(qiáng)度的非零常數(shù)，而En為第n個擴(kuò)增循環(huán)的經(jīng)過背景校正的擴(kuò)增效率。
21.權(quán)利要求20的方法，其中Rb的值為相應(yīng)于核酸的初始熒光強(qiáng)度的值。
22.權(quán)利要求20的方法，其中Rb的值為第一個擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度值，R1。
23.權(quán)利要求20的方法，其中Rb的值為核酸的背景熒光強(qiáng)度，其由表示熒光強(qiáng)度和核酸的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或擴(kuò)增時間之間的相關(guān)性的函數(shù)得到。
24.權(quán)利要求23的方法，其中Rb的值為-(Rb)S型，其是從在所有擴(kuò)增循環(huán)中核酸的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)以S型模型進(jìn)行最小二乘擬合得到的。
25.權(quán)利要求20的方法，其中Rb的值是使擴(kuò)增效率(En)的最大值為1的值。
26.權(quán)利要求15的方法，其中擴(kuò)增效率為最大值或最小值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間通過最大或最小效率點附近函數(shù)的曲線擬合計算。
27.權(quán)利要求26的方法，其中曲線擬合使用第n次多項式，其中n為大于2的整數(shù)。
28.權(quán)利要求26的方法，其中曲線擬合使用正弦或余弦函數(shù)。
29.權(quán)利要求26的方法，其中曲線擬合使用Gaussian分布函數(shù)。
30.權(quán)利要求26的方法，其中曲線擬合使用Cupic樣條插值方法(splineinterpolation method)。
31.權(quán)利要求15的方法，其中核酸的初始濃度是由特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間通過使用標(biāo)準(zhǔn)校正曲線計算的，該標(biāo)準(zhǔn)校正曲線表示核酸的初始濃度與擴(kuò)增效率為最大或最小值時的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或擴(kuò)增時間之間的關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從實時核酸擴(kuò)增數(shù)據(jù)中定量核酸初始濃度的方法。從生物體或病毒中提取的核酸(DNA或RNA)應(yīng)用酶進(jìn)行擴(kuò)增。然后核酸的初始濃度通過計算當(dāng)核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度后為最大值的一半時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間，或者擴(kuò)增效率為最大或最小值時的特征擴(kuò)增循環(huán)數(shù)或特征擴(kuò)增時間，或者擴(kuò)增前核酸的熒光強(qiáng)度減去核酸的背景熒光強(qiáng)度的方法獲得。因此，核酸的初始濃度可不用微分或積分進(jìn)行計算。
文檔編號G01N21/78GK1769494SQ200510098030
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月1日
發(fā)明者南宮桷, 金珍泰, 李英善, 金玲雅 申請人:三星電子株式會社