專利名稱：大容量組織陣列制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，具體涉及大容量組織陣列制作方法。
背景技術(shù)：
組織微陣列(tissue microarray，TMA)是將數(shù)十個到上百個的組織樣本整齊有序地排列在同一張載玻片上而形成的微縮組織切片，所以又稱組織芯片(tissue chip)技術(shù)。它是將若干石蠟包埋塊上的各種典型組織轉(zhuǎn)移到一個新石蠟塊上重新構(gòu)建微型化高通量組織陣列。用該組織微陣列塊進行組織切片，可在原位對眾多的腫瘤組織進行DNA、RNA及蛋白質(zhì)水平進行高通量的研究。對于通過免疫細胞化學、免疫組織化學(IHC)、熒光原位雜交(FISH)等方法篩選標志而言，組織微陣列是一個理想的手段。該技術(shù)不僅有助于腫瘤表征、快速篩選癌的基因擴增等，而且還可以進一步分析經(jīng)過cDNA微陣列鑒定的新基因在腫瘤中的表達特征，評價其診斷和判定預后的意義，是一種快速經(jīng)濟的評價生物標志的方法。
傳統(tǒng)制作組織微陣列的方法是將待檢測的組織排列于同一受體蠟塊內(nèi)。因為蠟塊大小限制，所能排列組織芯的數(shù)目是有限的，一般在一張組織芯片上適宜做做200-400個點，文獻報道(Moch H，Kononen T，Kallioniemi OP et al.Tissue microarrayswhat will they bring tomolecular and anatomic pathology.Adv Anat Pathol，2001，814-20.)最多是1000個組織芯。通過增加組織芯數(shù)目提高陣列容量就存在切片難以切全或切片困難等問題。
目前制作微陣列的貼片方法有兩種。一種是膠帶法用膠帶粘貼連續(xù)的TMA，然后轉(zhuǎn)移到涂有聚合膠的載玻片上，用滾筒輕輕壓平，使膠帶上的組織緊緊粘在玻片上，紫外線照射2min，再用特制的去油污洗液浸泡，使膠帶從玻片上脫離。另一種是水中展片法貼片方式就象日常工作中的石蠟切片貼片法，將4μm連續(xù)切片在溫水中展開，再貼于玻片上。采用膠帶方法存在問題主要是膠帶很難從玻片上分離，經(jīng)常會帶一部分組織下來，造成貼片不完整，而且操作有一定難度，價格也較昂貴。水中展片法存在的問題是難以控制水溫，使組織陣列切片易于彌散或不能充分展開。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種大容量組織陣列的制作方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)解決方案是一種大容量組織陣列制作方法，含有以下步驟首先制備多張組織陣列切片，其特征是把組織陣列切片排列在同一張載玻片上；然后在載玻片上滴加43～49℃的水，展開組織陣列切片；再排出載玻片上的水，使切片貼在載玻片上；最后在60℃下加熱1～2小時后用二甲苯脫蠟(參見圖1)。
本發(fā)明所述的組織陣列切片其中含組織芯的石蠟膜周邊向外延伸一空白石蠟膜凸起至載玻片的邊緣外。所述空白石蠟膜凸起的長度以將組織陣列切片放置到載玻片上時，其端頭能夠伸至載玻片邊緣外為宜(如圖3所示)。
本發(fā)明大容量組織陣列制作方法中所述的組織陣列切片上含有組織芯的部分為矩形。
本發(fā)明所述的組織陣列切片的制備方法，采用本領(lǐng)域常用的組織陣列切片的制備方法。
本發(fā)明所述的組織陣列切片的制備方法，可以是將包裹組織芯的石蠟在40℃下干烤10min，然后-20℃2冷凍30min后進行切片。
本發(fā)明所述組織陣列切片的制備方法，具體步驟是將含組織芯的石蠟塊在40℃下干烤10分鐘，然后-20℃冷凍30分鐘后進行切片；再切除組織芯1上下及左邊的空白蠟膜，最后切除右邊下部一半的空白蠟膜，保留上部的空白蠟膜形成一凸起2(參見圖2)。
本發(fā)明所述組織陣列切片中的組織可以是相同的，也可以是不相同的。本發(fā)明所述組織陣列切片中的組織可以是慢性扁桃體炎組織、淋巴結(jié)反應增生、淋巴瘤、鼻咽癌、大腸癌、肺癌組織、乳腺癌其中一種或兩種以上。
本發(fā)明大容量組織陣列制作方法中所滴加的水的溫度最好是45℃。
本發(fā)明大容量組織陣列制作方法，將多個組織陣列切片聚合在同一載玻片上，制作出的組織陣列容量增大，可以同時在同一張載玻片上進行更大樣本量的實驗，節(jié)約試劑及時間。同時本發(fā)明大容量組織陣列制作方法，在載玻片上滴溫水，使石蠟軟化，同時組織切片在水的表面張力作用下容易展片。
本發(fā)明大容量組織陣列制作方法制作出的組織陣列容量大，制備簡單方便；同時采用了在玻片上滴溫水的展片方法，使展片效果易于控制。微陣列中包含的標本樣本大，檢測時更能補償發(fā)生在同一亞組組織同在一個微陣列中可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果的影響。組織微陣列可進一步應用于免疫組織化學染色，mRNA原位雜效，熒光原位雜交(FISH)等檢測。在進行mRNA原位雜交檢測時可以用經(jīng)DEPC處理過的水，避免RNA的降解。


圖1制作大容量組織陣列的方法示意圖；圖2一種具體的含組織芯的組織陣列切片結(jié)構(gòu)示意圖，圖中虛線為具有組芯部分與空白部分的分界線；圖3在載玻片上整齊排列含有組織芯的組織陣列切片示意圖；圖4本發(fā)明大容量組織陣列未染色前示意圖；圖5本發(fā)明大容量組織陣列染色(HE染色)后示意圖；圖6一例彌漫性大B細胞淋巴瘤的組織芯放大圖(免疫組化檢測CD20蛋白表達)；圖7一例彌漫性大B細胞淋巴巴瘤的組織芯放大圖，放大1000倍(FISH檢測bcl2/Igh基因重排)；圖8一例鼻咽癌的組織芯放大圖，放大400倍(mRNA原位雜交檢測KIAA1173基因)。
具體實施例方式
以下實施例使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1一、組織陣列切片的制備每例標本在標記區(qū)域內(nèi)隨機取4條組織芯。在組織樣本填入蠟孔時記錄每個樣本在二維陣列中的具體位置，并在一定位置上標記出組織微陣列的方位。每例空白蠟塊做成19×17個點，最后一排少打三個點做為陣列方位的標記。每個陣列內(nèi)可有320個組織芯，共制做了8個含有320個組織芯的蠟塊。將通過上述方法制作的8個蠟塊在40℃下干烤10分，然后-20℃冷凍30min，利用組織切片機制出含有組織芯的石蠟膜，然后切除組織芯1上下及左邊的空白蠟膜，最后切除右邊下部一半的空白蠟膜，保留上部的空白蠟膜形成一凸起2(參見圖2)。所述的切片厚4微米。
二、大容量組織微陣列的制作將上述制備的組織陣列切片排列在載玻片上(如圖3)；用加樣器吸取45℃溫水，滴注于載玻片表面，這時凸起2會因水及重力的作用向下彎曲，貼于載玻片的邊緣，使組織陣列片固定，沒有凸起的部分會浮于水的表面而充分展開，然后輕輕向兩側(cè)傾斜載玻片，載玻片上的水會從組織芯外側(cè)切除空白蠟膜的地方排出，使組織陣列切片貼于載玻片上；將載玻片在60℃干烤1h，然后用二甲苯脫蠟得到大容量組織陣列(圖4、圖5)。
通過以上方法，制備的大容量組織陣列中包含慢性扁桃體炎組織50例，淋巴結(jié)反應增生50例，淋巴瘤120例，鼻咽癌50例，大腸癌140例，肺癌組織110例，乳腺癌120例，共640個病例，每個病例在陣列中有4個組織芯，共有2560個組織芯。
三、應用將得到的大容量組織陣列，對其進行免疫組織化學染色檢測CD20的蛋白的表達(圖6)，熒光原位雜交檢測bcl-6/Igh基因重排(圖7)，mRNA原位雜交檢測KIAA1173基因的轉(zhuǎn)錄(圖8)，均取得了良好的效果。
實施例2一、組織陣列切片的制備收集了南方醫(yī)院病理科1998-2004年外檢的B細胞淋巴瘤石蠟包埋標本160例，對每例標本先進行切片，HE染色，確定標本中腫瘤集中的部位，并進行標記，然后在標記區(qū)域內(nèi)隨機取5條組織芯填入受體蠟塊中。每例空白蠟塊做成15×14個點，最后一排少打十個點做為陣列方位的標記，每個陣列內(nèi)可有200個組織芯，共制做了4個含有200個組織芯的蠟塊。將上述石蠟塊置于40℃下干烤10分鐘，然后-20℃冷凍30分鐘，利用組織切片機制出含有組織芯的石蠟膜切片，然后切除組織芯1上下及左邊的空白蠟膜，最后切除右邊下部的空白蠟膜，保留上部的空白蠟膜形成一凸起2(參見圖2)。所述的切片厚4微米。
二、大組織容量陣列的制備將上述制作的組織陣列切片排列在載玻片上；吸取43℃溫水，滴注于載玻片表面，使組織陣列切片充分展開，然后輕輕向兩側(cè)傾斜載玻片，倒掉載玻片上的水，將組織陣列切片展開貼在載玻片上；將載玻片在60℃下干烤2h后以二甲苯脫蠟，得到大容量組織陣列。本大容量組織陣列含有160個病例，每個病例在陣列中有5個組織芯，共有800個組織芯。
三、應用將得到的大容量組織陣列進行HE染色及免疫組織化學染色檢測MUM1基因蛋白，Bcl-6基因蛋白及CD10基因蛋白的表達，效果良好。其中組織芯的利用率在98％以上，沒有出現(xiàn)同一病例的組織芯全部脫片而無法檢測的情況。
實施例3一、組織陣列切片的制備收集了南方醫(yī)院病理科1998-2004年外檢的大腸癌石蠟包埋標本150例，癌旁組織150例，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)120例，對每例標本先進行切片，HE染色，確定取材部位，并進行標記，然后在標記區(qū)域內(nèi)隨機取3條組織芯填入受體蠟塊中同時錄每個樣本在二維陣列中的具體位置。每例空白蠟塊做成18×18個點，最后一排少打9個點做為陣列方位的標記，所以每個陣列內(nèi)可有315個組織芯，共制做了4個含有315個組織芯的蠟塊。將上述含組織芯石蠟塊置于40℃烤箱中干烤10分鐘，然后-20℃冷凍30分鐘，利用組織切片機制出含有組織芯的石蠟膜切片，然后切除組織芯1上下及左邊的空白蠟膜，最后切除右邊下部的空白蠟膜，保留上部的空白蠟膜形成一凸起2(參見圖2)，所述的切片厚4微米。
二、大組織容量陣列制備將組織陣列切片排列在載玻片上，空白蠟膜的部分向外。吸取44℃溫水，滴注于載玻片表面，使組織陣列切片充分展開，然后輕輕向兩側(cè)傾斜載玻片，排出載玻片上的水，將組織陣列切片展開貼在載玻片上；將載玻片在60℃下干烤2h后用二甲苯脫蠟，得到大容量組織陣列。通過此方法制作的大容量組織陣列含有420個病例，每個病例在陣列中有3個組織芯，共有1260個組織芯。
三、應用對上述大容量組織陣列，分別進行了HE染色及免疫組織化學染色檢測p53基因蛋白。其中組織芯的利用率為99％，沒有出現(xiàn)同一病例的組織芯全部脫片而無法檢測的情況。
實施例4一、組織陣列切片的制備收集了南方醫(yī)院病理科1998-2004年外檢的乳腺癌石蠟包埋標本150例，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)100例，對每例標本先進行切片，HE染色，確定取材部位，并進行標記，然后在標記區(qū)域內(nèi)隨機取3條組織芯填入受體蠟塊中同時錄每個樣本在二維陣列中的具體位置。在制作過程中，每例空白蠟塊做成16×16個點，最后一排少打6個點做為陣列方位的標記，所以每個陣列內(nèi)可有250個組織芯，共制做了4個含有250個組織芯的蠟塊。將上述含有組織芯的石蠟塊置于40℃烤箱中干烤30分鐘，然后-20℃冷凍30分鐘，利用組織切片機制出含有組織芯的石蠟膜，然后切除組織芯1上下及左邊的空白蠟膜，最后切除右邊下部的空白蠟膜，保留上部的空白蠟膜形成一凸起2(參見圖2)。所述的切片厚4微米。
二、大組織容量陣列制備將上述組織陣列切片排列在載玻片上，空白蠟膜的部分向外；吸取44℃溫水，滴注于載玻片表面，使組織陣列切片充分展開，然后輕輕向兩側(cè)傾斜載玻片，排出載玻片上的水，將組織陣列切片展開貼于玻片上；將載玻片在60℃下干烤2h后用二甲苯脫蠟，得到大容量組織陣列。通過此方法制作的大容量組織陣列含有250個病例，每個病例在陣列中有4個組織芯，共有1000個組織芯的。
三、應用將上述大容量組織陣列，分別進行了HE染色及免疫組織化學染色檢測雌激素受體蛋白及孕激素受體蛋白的表達。其中組織芯的利用率為98％，沒有出現(xiàn)同一病例的組織芯全部脫片而無法檢測的情況，檢測效果良好。
權(quán)利要求
1.一種大容量組織陣列制作方法，含有以下步驟首先制備多張組織陣列切片，其特征是把組織陣列切片排列在同一張載玻片上；然后在載玻片上滴加43～49℃的水，展開組織陣列切片；再排出載玻片上的水，使切片貼在載玻片上；最后在60℃下加熱1～2小時后用二甲苯脫蠟。
2.權(quán)利要求1所述的大容量組織陣列制作方法，其特征在于所述的組織陣列切片的周邊向外延伸一空白石蠟切片凸起至載玻片的邊緣外。
3.權(quán)利要求1或2所述的大容量組織陣列制作方法，其特征在于所述的組織陣列切片上含有組織芯的部分為矩形。
4.權(quán)利要求1所述的大容量組織陣列制作方法，其特征在于所滴加的水的溫度是45℃。
5.權(quán)利要求3所述的大容量組織陣列制作方法，其特征在于所述的組織陣列切片由以下方法制備將含組織芯的石蠟塊在40℃下干烤10分鐘，再-20℃冷凍30分鐘后進行切片，然后切除切片組織芯1上下及左邊的空自蠟膜，最后切除右邊下部的空白蠟膜，保留上部的空白蠟膜形成一凸起2。
6.權(quán)利要求1所述的大容量組織陣列制作方法，其特征在于組織芯含有慢性扁桃體炎組織、淋巴結(jié)反應增生、淋巴瘤、鼻咽癌、大腸癌、肺癌組織、乳腺癌其中一種或兩種以上。
全文摘要
本發(fā)明大容量組織陣列制備方法是首先制備多張組織陣列切片，其特征是把多張組織陣列切片排列在同一張載玻片上；然后在載玻片上滴加43～49℃的水將組織陣列切片展開；再排出載玻片上的水，使切片貼在載玻片上；最后在60℃下加熱1－2小時用二甲苯脫蠟。本發(fā)明制作出的組織微陣列容量大，制備簡單方便；同時采用了在玻片上滴溫水的展片方法，使展片效果易于控制。并且微陣列中包含的標本樣本大，檢測時更能彌補發(fā)生在同一亞組組織同在一個微陣列中可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果的影響。
文檔編號G01N33/50GK1763228SQ20051010021
公開日2006年4月26日 申請日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日
發(fā)明者蔣會勇, 趙彤 申請人:南方醫(yī)科大學