專利名稱：一種酚紅比色雙試劑及其測(cè)定血清碳酸氫根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在臨床檢查中用于分析測(cè)定血清碳酸氫根的酚紅比色雙試劑及使用該試劑分析測(cè)定血清碳酸氫根的方法。
背景技術(shù)：
血清碳酸氫根是臨床常規(guī)測(cè)定項(xiàng)目，對(duì)診斷酸堿平衡紊亂有著重要意義。目前國內(nèi)外測(cè)定血清碳酸氫根(分子式HCO3-)的方法主要有血?dú)夥治鰞x法、電極法、酶法及滴定法。但這些方法都不同程度地存在著一定的缺陷.
1、血?dú)夥? 原理根據(jù)pH＝pk+log[HCO3-]/α.PCO2，通過測(cè)出pH、PCO2計(jì)算出HCO3-濃度。需要價(jià)格10萬至幾十萬元昂貴的血?dú)夥治鰞x才能測(cè)定，分析儀中有三個(gè)電極即pH電極、CO2分壓電極、氧分壓電極?；鶎俞t(yī)院因經(jīng)濟(jì)原因難以采用，而且需抽取動(dòng)脈血，也不適合臨床常規(guī)應(yīng)用。
2、電極法 原理樣品酸化后CO2穿過硅橡膠膜擴(kuò)散到稀釋的碳酸氫鹽緩沖液中，結(jié)果引起的PH改變后若用PH電極測(cè)定，則與總CO2含量有關(guān)。雖簡(jiǎn)便快速，但儀器昂貴且測(cè)定成本較高，基層醫(yī)院仍難以應(yīng)用，結(jié)果的準(zhǔn)確性受CO2電極的狀態(tài)影響較大，測(cè)定線性在10-50mmol/L，低于10mmol/L的標(biāo)本結(jié)果測(cè)定不準(zhǔn)。
3、酶法 原理磷酸烯醇丙酮酸(PEP)+HCO3-后在PEP羧化酶作用下生成草酰乙酸和磷酸；乙酰乙酸+NADH+H+在蘋果酸脫氫酶作用下生成蘋果酸和NAD+。
酶法優(yōu)點(diǎn)是特異性較強(qiáng)，可以進(jìn)行半自動(dòng)和全自動(dòng)測(cè)定。但缺陷是試劑主要依賴進(jìn)口，多為干粉單一試劑，受溶解液的pH值、試劑瓶口徑、平衡時(shí)間長(zhǎng)短等因素影響較大，試劑空白不穩(wěn)定，需經(jīng)常進(jìn)行定標(biāo)，試劑成本高(4-10元/ml)，試劑保存期短，單一試劑不能自動(dòng)消除樣本空白對(duì)結(jié)果的干擾。測(cè)定線性5-40mmol/L，高于40mmol/L的標(biāo)本需要稀釋后重做，相對(duì)較麻煩，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液為單一碳酸氫鈉溶液，穩(wěn)定性差。
4、滴定法原理血清中加入過量標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液，使酸與HCO3-起中和反應(yīng)，釋放出CO2，然后以標(biāo)準(zhǔn)的NaOH溶液滴定剩余的鹽酸，以NaOH的消耗量計(jì)算出血清HCO3-含量，以血清原來的pH值作為滴定終點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)本量少時(shí)省時(shí)省力，成本低廉，但缺點(diǎn)是精密度差，特別是低結(jié)果標(biāo)本滴定準(zhǔn)確非常困難，大批量測(cè)定時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能用于自動(dòng)化分析。
通過比較以上現(xiàn)有測(cè)定技術(shù)，綜合存在以下缺陷(1)測(cè)定條件要求高，需要昂貴的儀器，不能在各級(jí)醫(yī)院開展應(yīng)用(如血?dú)夥ê碗姌O法)。(2)測(cè)定試劑需要依賴進(jìn)口(酶法)，成本高，酶試劑不穩(wěn)定保存期短，單一試劑不能消除標(biāo)本內(nèi)源性干擾。(3)滴定法為手工測(cè)定法，誤差大，不能用于儀器測(cè)定，成本雖低，應(yīng)用越來越少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酚紅雙色對(duì)比的酚紅比色雙試劑，該試劑成份穩(wěn)定，保存期長(zhǎng)，所采用的標(biāo)準(zhǔn)液基質(zhì)成份與血清基本相同；以及利用該試劑進(jìn)行測(cè)定血清碳酸氫根的方法，該方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，能適應(yīng)各級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是本發(fā)明是將血?dú)夥ê偷味ǚǖ臏y(cè)定原理科學(xué)地結(jié)合起來，根據(jù)朗-伯比爾定律，利用酚紅雙色對(duì)比法，采用液體雙試劑分步反應(yīng)與顯色，通過自動(dòng)測(cè)定顯色液吸光度來計(jì)算血清碳酸氫根濃度。
本發(fā)明的試劑為雙試劑，包含有測(cè)定液和標(biāo)準(zhǔn)液；測(cè)定液包含有R1試劑、R2試劑；R1試劑為中和血清中部分碳酸氫根的酸性反應(yīng)試劑，R2試劑為顯色的酚紅溶液。標(biāo)準(zhǔn)液包含有A液、B液；在測(cè)定時(shí)把A液和B液等量混合為標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)成分與血清基本接近。標(biāo)準(zhǔn)液中的A液、B液具有成分穩(wěn)定，保存期長(zhǎng)的特點(diǎn)。
R1試劑包含有氯化鈉、疊氮鈉、鹽酸、TritonX-100、蒸餾水等，pH4.5～6.8；氯化鈉、疊氮鈉、鹽酸、TritonX-100、蒸餾水的配比為氯化鈉(AR級(jí))3.0g～15.0g，疊氮鈉(AR級(jí))0.5g～5.0g，1mol/L鹽酸0.6ml～2.0ml(可用相同摩爾數(shù)的硫酸、草酸、硝酸代替)；TritonX-100(AR級(jí))0.5ml～5.0ml。
蒸餾水1000ml。
R1試劑的制取方法將氯化鈉、疊氮鈉、鹽酸、TritonX-100、溶于蒸餾水中，并調(diào)整pH值。
R2試劑包含有酚紅、氯化鈉、TritonX-100、蒸餾水等，酚紅、氯化鈉、TritonX-100、蒸餾水的配比為1.0g/L～10.0g/L酚紅濃溶液0.6ml～20.0ml，氯化鈉(AR級(jí))3.0g～15.0g，TritonX-100(AR級(jí))0.5～5.0ml，蒸餾水1000ml。
R2試劑的制取方法將精確稱取1.0g/L～10.0g/L酚紅溶于蒸餾水中，加1mol/LNaOH10ml～40ml，制取中間液，過濾備用。在使用時(shí)，將該中間液與氯化鈉、TritonX-100溶于蒸餾水中，制取R2試劑。
為適應(yīng)各型全自動(dòng)生化儀的使用，R2試劑可以是濃縮型R2試劑。濃縮型R2試劑包含有酚紅、氯化鈉、TritonX-100、蒸餾水等，酚紅、氯化鈉、TritonX-100、蒸餾水的配比為1.0g/L～10.0g/L酚紅濃溶液0.6ml～20.0ml，氯化鈉(AR級(jí))3.0g～15.0g，TritonX-100(AR級(jí))0.5～5.0ml，蒸餾水250ml。
濃縮型R2試劑的制取方法在使用時(shí)，將中間液、氯化鈉、TritonX～100溶于蒸餾水中。
A液為30.0mmol/L～80.0mmol/LNaHCO3溶液，A液的制取方法將NaHCO3(AR級(jí))溶于新鮮煮沸冷卻的蒸餾水中。
B液為pH7.20～7.50磷酸鹽緩沖液B液包含有KH2PO4、Na2HPO4.12H2O、TritonX-100、疊氮鈉、蒸餾水等。KH2PO4、Na2HPO4.12H2O、TritonX-100、疊氮鈉、蒸餾水的配比為KH2PO4(AR級(jí))1.0g～2.0g，Na2HPO4.12H2O(AR級(jí))10.0g～20.0g，TritonX-100(AR級(jí))0.5ml～5.0ml，疊氮鈉(AR級(jí))0.5g～5.0g，蒸餾水1000ml。
B液的制取方法將KH2PO4、Na2HPO4.12H2O、TritonX-100、疊氮鈉溶于新鮮煮沸冷卻的蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH值在7.20～7.50范圍內(nèi)。
標(biāo)準(zhǔn)液臨用前取A、B二液等量混合為標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液的濃度值在15.0mmol/L～40.0mmol/L之間，pH值在7.45～7.85之間。
利用本發(fā)明的酚紅比色雙試劑對(duì)血清碳酸氫根(HCO3-)進(jìn)行測(cè)定，其測(cè)定原理如下根據(jù)H-H方程即pH＝pK+log[HCO3-]/α.pCO2原理，pH的高低主要取決于血清HCO3-與pCO2的比值大小，當(dāng)待測(cè)血清和標(biāo)準(zhǔn)液與試劑R1混合，中和掉血清和標(biāo)準(zhǔn)液中部分HCO3-，顯色液pH的高低則主要取決于血清中剩余部分HCO3-濃度。用試劑R2酚紅顯色，其顯色液吸光度在558nm與血清HCO3-濃度成線性關(guān)系。與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出血清中碳酸氫根濃度。
本發(fā)明的血清碳酸氫根測(cè)定的方法有兩種全自動(dòng)分析法、手工測(cè)定法。
手工測(cè)定法取三支試管，分別標(biāo)記測(cè)定管(R)、標(biāo)準(zhǔn)管(S)、對(duì)照管(B)。在測(cè)定管(R)中加入待測(cè)血清，在標(biāo)準(zhǔn)管(S)中加入與血清等量的標(biāo)準(zhǔn)液；然后在測(cè)定管(R)、標(biāo)準(zhǔn)管(S)、對(duì)照管(B)中各加入血清10倍量的R1試劑(此時(shí)對(duì)照管(B)中只有R1試劑)；混勻放36～38℃水浴580～620秒鐘；R1試劑中的酸中和掉部分碳酸氫根，經(jīng)加溫反應(yīng)后CO2分壓下降在0.32～0.34kPa左右；取出再各加入與R1試劑等量的R2試劑(顯色反應(yīng))，置半自動(dòng)生化儀以對(duì)照管(B)調(diào)零比色測(cè)定(測(cè)定結(jié)果)。
在半自動(dòng)生化儀比色測(cè)定時(shí)，設(shè)置參數(shù)為比色法為終點(diǎn)法，波長(zhǎng)546nm，溫度37℃，比色光徑1cm，吸液量不少于500μl，標(biāo)準(zhǔn)液濃度25.0mmol/L。
根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算出血清HCO3-濃度。計(jì)算方法為血清HCO3-濃度(mmol/L)＝AR/AS×標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度(mmol/L)。
式中AR為測(cè)定管(R)吸光度值，AS為標(biāo)準(zhǔn)管(S)吸光度值。
全自動(dòng)分析法首先確定主要線性參數(shù)，然后測(cè)定血清，與線性參數(shù)進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算出血清HCO3-。
主要線性參數(shù)的確定反應(yīng)類型兩點(diǎn)終點(diǎn)法；反應(yīng)溫度36～38℃；主波長(zhǎng)530～570nm，次波長(zhǎng)不設(shè)；孵育時(shí)間580～620秒鐘；標(biāo)準(zhǔn)液置于標(biāo)準(zhǔn)管(S)內(nèi)，R1試劑、R2試劑均為標(biāo)準(zhǔn)液的10倍的量(R2試劑為濃縮型時(shí)，濃縮型R2試劑為標(biāo)準(zhǔn)液的2.5倍的量)；反應(yīng)方向正反應(yīng)。第一點(diǎn)讀數(shù)290～310秒鐘，第二點(diǎn)讀數(shù)580～620秒鐘；兩點(diǎn)線性校正，以此為基準(zhǔn)。
將待測(cè)血清置于測(cè)定管(R)內(nèi)，R1試劑、R2試劑均為血清的10倍的量；采用濃縮型R2試劑時(shí)，濃縮型R2試劑為血清的2.5倍的量；反應(yīng)方向正反應(yīng)；反應(yīng)溫度36～38℃；主波長(zhǎng)530～570nm，次波長(zhǎng)不設(shè)；孵育時(shí)間580～620秒鐘；第一點(diǎn)讀數(shù)290～310秒鐘，第二點(diǎn)讀數(shù)580～620秒鐘。再將讀數(shù)與基準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算出血清HCO3-濃度。其計(jì)算方法同手工測(cè)定方法中的計(jì)算方法。
由于本發(fā)明采用測(cè)定液與血清分步反應(yīng)、顯色，再利用測(cè)定液與標(biāo)準(zhǔn)液分步反應(yīng)、顯色，將兩者顯色結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，來計(jì)算血清碳酸氫根濃度。測(cè)定液包含有R1試劑、R2試劑；R1試劑為中和血清中部分碳酸氫根的酸性反應(yīng)試劑，R2為顯色的酚紅溶液。標(biāo)準(zhǔn)液包含有A液、B液；在測(cè)定時(shí)把A液和B液等量混合為標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)成分與血清基本接近。標(biāo)準(zhǔn)液中的A液、B液成分穩(wěn)定，保存期長(zhǎng)。測(cè)定方法可用手工測(cè)定法，該方法操作簡(jiǎn)單。試劑和標(biāo)準(zhǔn)液所用的藥品為常見和價(jià)格低廉的藥品，成本低。因此本發(fā)明具有試劑成份穩(wěn)定，保存期長(zhǎng)，基質(zhì)成份與血清基本相同；以及利用該試劑進(jìn)行測(cè)定血清碳酸氫根的方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，是一種能適應(yīng)各級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的血清碳酸氫根測(cè)定的方法；該測(cè)定方法既能滿足手工測(cè)定，也能滿足全自動(dòng)、半自動(dòng)的測(cè)定等特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的酚紅比色試劑為雙試劑，包含有測(cè)定液和標(biāo)準(zhǔn)液；測(cè)定液包含有R1試劑、R2試劑；R1試劑為中和血清中部分碳酸氫根的酸性反應(yīng)試劑，R2為顯色的酚紅溶液。標(biāo)準(zhǔn)液包含有A液、B液；在測(cè)定時(shí)把A液和B液等量混合為標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)成分與血清基本接近。
測(cè)定液的實(shí)施例測(cè)定液實(shí)施例1R1試劑pH4.5～pH5.0氯化鈉(AR級(jí))4.0g～6.0g；疊氮鈉(AR級(jí))0.5g～1.0g；lmol/L鹽酸1.6ml～2.0ml(可用相同摩爾數(shù)的硫酸、草酸、硝酸代替)、TritonX-100(AR級(jí))0.5ml～1.5ml。
溶于1000ml蒸餾水中。
R2試劑1.0g/L～3.0g/L酚紅濃溶液精確稱取酚紅(AR級(jí))1.0g～3.0g，溶于1000ml
蒸餾水中，加1mol/LNaOH20ml～40ml，制取中間液，過濾備用。
在使用時(shí)，取中間液4.5ml～20.0ml，氯化鈉(AR級(jí))3.0g～7.0g，TritonX-100(AR級(jí))0.5ml～1.5ml，溶于蒸餾水1000ml。
當(dāng)R2試劑為濃縮型時(shí)R1試劑與R2試劑體積為4∶1劑型(主要適用各型全自動(dòng)生化儀)R1試劑配制方法不變。只將R2試劑體積濃縮4倍(蒸餾水體積為250ml，試劑成份不變)。
測(cè)定液實(shí)施例2R1試劑與R2試劑體積為1∶1劑型(適用于半自動(dòng)和全自動(dòng))R1試劑pH5.1～pH5.5氯化鈉(AR級(jí))5.0g～12.0g；疊氮鈉(AR級(jí))1.0g～3.5g；1mol/L鹽酸1.1ml～1.5ml(可用相同摩爾數(shù)的硫酸、草酸、硝酸代替)，TritonX-100(AR級(jí))1.5ml～3.5ml。
溶于1000ml蒸餾水中。
R2試劑3.1g/L～5.0g/L酚紅濃溶液精確稱取酚紅(AR級(jí))3.1g～5.0g，溶于1000ml蒸餾水中，加lmol/LNaOH 20ml～25ml，制取中間液，過濾備用。使用時(shí)，取中間液1.5ml～6.0ml，氯化鈉(AR級(jí))5.0g～9.0g，TritonX-100(AR級(jí))2.0ml～5.0ml，溶于蒸餾水1000ml。
R1試劑與R2試劑體積為4∶1劑型(主要適用各型全自動(dòng)生化儀)R1試劑配制方法不變。只將R2試劑體積濃縮4倍(蒸餾水體積為250ml，試劑成份不變)。
測(cè)定液實(shí)施例3R1試劑與R2試劑體積為1∶1劑型(適用于半自動(dòng)和全自動(dòng))Rl試劑pH5.6～PH6.0氯化鈉(AR級(jí))6.0g～11.0g，疊氮鈉(AR級(jí))2.5g～4.0g，1mol/L鹽酸0.7ml～1.5ml(可用相同摩爾數(shù)的硫酸、草酸、硝酸代替)，TritonX-100(AR級(jí))1.0ml～3.5ml，溶于1000ml蒸餾水中。
R2試劑5.1g/L～8.0g/L酚紅濃溶液精確稱取酚紅(AR級(jí))5.1g～8.0g，溶于1000ml蒸餾水中，加1mol/LNaOH 22ml-30ml，制取中間液，過濾備用。使用時(shí)，取中間液1.0ml～4.5ml，氯化鈉(AR級(jí))5.0g～13.0g，TritonX-100(AR級(jí))1.5ml～3.6ml，溶于蒸餾水1000ml。
R1試劑與R2試劑體積為4∶1劑型(主要適用各型全自動(dòng)生化儀)R1試劑配制方法不變。只將R2試劑體積濃縮4倍(蒸餾水體積為250ml，試劑成份不變)。
測(cè)定液實(shí)施例4R1試劑與R2試劑體積為1∶1劑型(適用于半自動(dòng)和全自動(dòng))R1試劑pH6.0～pH6.8，氯化鈉(AR級(jí))8.0g～15.0g，疊氮鈉(AR級(jí))3.5g～5.0g，1mol/L鹽酸0.6ml～1.2ml(可用相同摩爾數(shù)的硫酸、草酸、硝酸代替)，TritonX-100(AR級(jí))1.0ml～2.5ml。
溶于1000ml蒸餾水中。
R2試劑8.1g/L～10.0g/L酚紅濃溶液精確稱取酚紅(AR級(jí))8.1g～10.0g，溶于1000ml蒸餾水中，加lmol/LNaOH 30ml～40ml，制取中間液，過濾備用。使用時(shí)，取中間液0.6ml～4.0ml，氯化鈉(AR級(jí))4.0g～10.0g，TritonX-100(AR級(jí))2.3ml～3.8ml，溶于蒸餾水1000ml。
R1試劑與R2試劑體積為4∶1劑型(主要適用各型全自動(dòng)生化儀)R1試劑配制方法不變。只將R2試劑體積濃縮4倍(蒸餾水體積為250ml，試劑成份不變)。
標(biāo)準(zhǔn)液實(shí)施例1A液(30mmol/L～35mmol/LNaHCO3溶液)精確稱取NaHCO3(AR級(jí))2.52克～2.94克溶于新鮮煮沸冷卻的蒸餾水1000ml中。
B液pH7.20～7.25磷酸鹽緩沖液KH2PO4(AR級(jí))1.0g～1.8g，Na2HPO4.12H2O(AR級(jí))10.0g～19.1g，TritonX-100(AR級(jí))0.5ml～3.0ml，疊氮鈉(AR級(jí))0.5g～1.9g，溶于新鮮煮沸冷卻的蒸餾水1000ml。
用時(shí)取A、B等量混合即為標(biāo)準(zhǔn)液(濃度15.0mmol/L～17.5mmol/L)。
標(biāo)準(zhǔn)液實(shí)施例2A液(40mmol/L～50mmol/LNaHCO3溶液)精確稱取NaHCO3(AR級(jí))3.36g～4.2g溶于新鮮煮沸冷卻的蒸餾水1000ml中。
B液pH7.3～7.35磷酸鹽緩沖液KH2PO4(AR級(jí))1.1g～1.9g，Na2HPO4.12H2O(AR級(jí))10.6g～19.3g，TritonX-100(AR級(jí))2.0ml～4.5ml，疊氮鈉(AR級(jí))1.5g～3.5g，溶于新鮮煮沸冷卻的蒸餾水1000ml。
用時(shí)取A、B等量混合即為標(biāo)準(zhǔn)液(濃度20.0mmol/L～25.0mmol/L)。
標(biāo)準(zhǔn)液實(shí)施例3A液(55mmol/L～60mmol/LNaHCO3溶液)精確稱取NaHCO3(AR級(jí))4.62克～5.04克溶于新鮮煮沸冷卻的蒸餾水1000ml中。
B液pH7.4～7.45磷酸鹽緩沖液KH2PO4(AR級(jí))1.2g～1.95g，Na2HPO4.12H2O(AR級(jí))11.0g～19.6g，TritonX-100(AR級(jí))1.5～2.8ml，疊氮鈉(AR級(jí))3.6～5.0g，溶于新鮮煮沸冷卻的蒸餾水1000ml。
用時(shí)取A、B等量混合即為標(biāo)準(zhǔn)液(濃度27.5mmol/L～30.0mmol/L)。
標(biāo)準(zhǔn)液實(shí)施例4A液(70mmol/L～80mmol/LNaHCO3溶液)精確稱取NaHCO3(AR級(jí))5.88克～6.72克溶于新鮮煮沸冷卻的蒸餾水1000ml中。
B液pH7.46～7.5磷酸鹽緩沖液KH2PO4(AR級(jí))1.3g～2.0g，Na2HPO4.12H2O(AR級(jí))11.5g～20.0g，TritonX-100(AR級(jí))0.5ml～4.0ml，疊氮鈉(AR級(jí))2.0g～5.0g，溶于新鮮煮沸冷卻的蒸餾水1000ml。
用時(shí)取A、B等量混合即為標(biāo)準(zhǔn)液(濃度35.0mmol/L～40.0mmol/L)。
本發(fā)明的血清碳酸氫根測(cè)定方法的實(shí)施例手工測(cè)定法取三支一次性塑料試管，分別標(biāo)記測(cè)定管(R)、標(biāo)準(zhǔn)管(S)、對(duì)照管(B)。分別在測(cè)定管(R)、標(biāo)準(zhǔn)管(S)中加入30μl待測(cè)血清和標(biāo)準(zhǔn)液，在測(cè)定管(R)、標(biāo)準(zhǔn)管(S)、對(duì)照管(B)中各加入R1試劑300μl，混勻放37℃水浴10分鐘；試劑R1中的酸中和掉部分碳酸氫根，經(jīng)加溫反應(yīng)后CO2分壓下降在0.33kPa左右；取出再各加入R2試劑300μl(顯色反應(yīng))，置半自動(dòng)生化儀以對(duì)照管(B)調(diào)零比色測(cè)定(測(cè)定結(jié)果)。設(shè)置參數(shù)為比色法為終點(diǎn)法，波長(zhǎng)546nm，溫度37℃，比色光徑1cm，吸液量500μl，標(biāo)準(zhǔn)液濃度25.0mmol/L。
根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算出血清HCO3-濃度。計(jì)算方法為血清HCO3-濃度(mmol/L)＝AR/AS×標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度(mmol/L)。
式中AR為測(cè)定管(R)吸光度值，AS為標(biāo)準(zhǔn)管(S)吸光度值。
全自動(dòng)分析法首先確定主要線形參數(shù)，然后測(cè)定血清，與線形參數(shù)進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算出血清HCO3-。
主要線性參數(shù)的確定反應(yīng)類型兩點(diǎn)終點(diǎn)法；反應(yīng)溫度37℃；主波長(zhǎng)546nm，次波長(zhǎng)不設(shè)；孵育時(shí)間600s；標(biāo)準(zhǔn)液20μl，R1試劑200μl，R2試劑200μl(R2試劑為濃縮型時(shí)，濃縮型R2試劑為50μl)；反應(yīng)方向正反應(yīng)。第一點(diǎn)讀數(shù)300s，第二點(diǎn)讀數(shù)600s；兩點(diǎn)線性校正，以此為基準(zhǔn)。
將血清樣品20μl，R1試劑200μl，R2試劑200μl(R2試劑為濃縮型時(shí)，濃縮型R2試劑為50μl)；反應(yīng)方向正反應(yīng)；反應(yīng)溫度37℃；主波長(zhǎng)546nm，次波長(zhǎng)不設(shè)；孵育時(shí)間600s；第一點(diǎn)讀數(shù)300s，第二點(diǎn)讀數(shù)600s。再將讀數(shù)與基準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算出血清HCO3-濃度。其計(jì)算方法同手工測(cè)定方法中的計(jì)算方法。
利用本發(fā)明的酚紅比色雙試劑及其測(cè)定血清碳酸氫根的方法，經(jīng)吸收光譜、檢測(cè)線性、重復(fù)性、回收率、對(duì)照結(jié)果、干擾試驗(yàn)(溶血干擾、膽紅素干擾、脂血干擾、肝素干擾)、試劑穩(wěn)定性等試驗(yàn)，并與血?dú)夥ā㈦姌O法、酶法、滴定法對(duì)比(詳見附件酚紅比色雙試劑測(cè)定血清碳酸氫根的效果情況的報(bào)告)表明，本發(fā)明具有試劑成份穩(wěn)定，保存期長(zhǎng)，基質(zhì)成份與血清基本相同；以及利用該試劑進(jìn)行測(cè)定血清碳酸氫根的方法，該方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，能適應(yīng)各級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的血清碳酸氫根測(cè)定的方法等特點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)(1)柯軍、王以立二氧化碳酶法測(cè)定不穩(wěn)定的因素 臨床檢驗(yàn)雜志 1996，14(6)300(2)韓志鈞等主編血?dú)馑釅A分析 遼寧科學(xué)技術(shù)出版社 第一版 1993，144(3)孟澤姜?jiǎng)︺懷核釅A狀態(tài)簡(jiǎn)易化學(xué)測(cè)定 臨床檢驗(yàn)雜志 1988，6(3)127-129附件酚紅比色雙試劑測(cè)定血清碳酸氫根的效果情況的報(bào)告
權(quán)利要求
1.一種酚紅比色雙試劑，其特征在于包含有試劑和標(biāo)準(zhǔn)液；試劑包含有R1試劑、R2試劑；R1試劑為中和血清中部分碳酸氫根的酸性反應(yīng)試劑，R2為顯色的酚紅溶液；標(biāo)準(zhǔn)液包含有A液、B液；把A液和B液等量混合后為標(biāo)準(zhǔn)液；R1試劑包含有氯化鈉、疊氮鈉、鹽酸、TritonX-100、蒸餾水，pH4.5～6.8；氯化鈉、疊氮鈉、鹽酸、TritonX-100、蒸餾水的配比為氯化鈉(AR級(jí))3.0g～15.0g，疊氮鈉(AR級(jí))0.5g～5.0g，1mol/L鹽酸0.6ml～2.0ml，TritonX-100(AR級(jí))0.5ml～5.0ml，蒸餾水1000ml；R2試劑包含有酚紅、氯化鈉、TritonX-100、蒸餾水；酚紅、氯化鈉、TritonX-100、蒸餾水的配比為1.0g/L～10.0g/L酚紅濃溶液0.6ml～20.0ml，氯化鈉(AR級(jí))3.0g～15.0g，TritonX-100(AR級(jí))0.5ml～5.0ml，蒸餾水1000ml；A液為30.0mmol/L～80.0mmol/LNaHCO3溶液；B液為pH7.20～7.50磷酸鹽緩沖液，B液包含有KH2PO4、Na2HPO4.12H2O、TritonX-100、疊氮鈉、蒸餾水，KH2PO4、Na2HPO4.12H2O、TritonX-100、疊氮鈉、蒸餾水的配比為KH2PO4(AR級(jí))1.0g～2.0g，Na2HPO4.12H2O(AR級(jí))10.0g～20.0g，TritonX-100(AR級(jí))0.5ml～5.0ml，疊氮鈉(AR級(jí))0.5g～5.0g，蒸餾水1000ml；標(biāo)準(zhǔn)液臨用前取A、B二液等量混合為標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液的濃度值在15.0mmol/L～40.0mmol/L之間，PH值在7.45～7.85之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酚紅比色雙試劑，其特征在于所述的R2試劑為濃縮型R2試劑；濃縮型R2試劑包含有酚紅、氯化鈉、TritonX-100、蒸餾水，酚紅、氯化鈉、TritonX-100、蒸餾水的配比為1.0g/L～10.0g/L酚紅濃溶液0.6ml～20.0ml，氯化鈉(AR級(jí))3.0g～15.0g，TritonX-100(AR級(jí))0.5～5.0ml，蒸餾水250ml。
3.一種權(quán)利要求1所述的酚紅比色雙試劑測(cè)定血清碳酸氫根的方法，其特征在于手工測(cè)定方法取三支試管，分別標(biāo)記測(cè)定管(R)、標(biāo)準(zhǔn)管(S)、對(duì)照管(B)，在測(cè)定管(R)中加入待測(cè)血清，在標(biāo)準(zhǔn)管(S)中加入與血清等量的標(biāo)準(zhǔn)液；然后在測(cè)定管(R)、標(biāo)準(zhǔn)管(S)、對(duì)照管(B)中各加入血清10倍量的R1試劑；混勻放36～38℃水浴580～620秒鐘；R1試劑中的酸中和掉部分碳酸氫根，經(jīng)加溫反應(yīng)后CO2分壓下降在0.32～0.34kPa左右；取出再各加入與R1試劑等量的R2試劑(顯色反應(yīng))，置半自動(dòng)生化儀以對(duì)照管(B)調(diào)零比色測(cè)定(測(cè)定結(jié)果)；根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算出血清HCO3-濃度，計(jì)算方法為血清HCO3-濃度(mmol/L)＝AR/AS×標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度(mmol/L)；式中AR為測(cè)定管(R)吸光度值，AS為標(biāo)準(zhǔn)管(S)吸光度值。
4.一種權(quán)利要求1所述的酚紅比色雙試劑測(cè)定血清碳酸氫根的方法，其特征在于全自動(dòng)分析法首先確定主要線形參數(shù)，然后測(cè)定血清，與線形參數(shù)進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算出血清HCO3；主要線性參數(shù)的確定反應(yīng)類型兩點(diǎn)終點(diǎn)法；反應(yīng)溫度36～38℃；主波長(zhǎng)530～570nm，次波長(zhǎng)不設(shè)；孵育時(shí)間580～620秒鐘；標(biāo)準(zhǔn)液置于標(biāo)準(zhǔn)管(S)內(nèi)，R1試劑、R2試劑均為標(biāo)準(zhǔn)液的10倍的量(R2試劑為濃縮型時(shí)，濃縮型R2試劑為標(biāo)準(zhǔn)液的2.5倍的量)；反應(yīng)方向正反應(yīng)。第一點(diǎn)讀數(shù)290～310秒鐘，第二點(diǎn)讀數(shù)580～620秒鐘；兩點(diǎn)線性校正，以此為基準(zhǔn)；將待測(cè)血清置于測(cè)定管(R)內(nèi)，R1試劑、R2試劑均為血清的10倍的量；采用濃縮型R2試劑，濃縮型R2試劑為血清的2.5倍的量；反應(yīng)方向正反應(yīng)；反應(yīng)溫度36～38℃；主波長(zhǎng)530～570nm，次波長(zhǎng)不設(shè)；孵育時(shí)間580～620秒鐘；第一點(diǎn)讀數(shù)290～310秒鐘，第二點(diǎn)讀數(shù)580～620秒鐘。再將讀數(shù)與基準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算出血清HCO3-濃度；其計(jì)算方法同手工測(cè)定方法中的計(jì)算方法。
全文摘要
一種酚紅比色雙試劑及其測(cè)定血清碳酸氫根的方法，含R1、R2試劑組成的測(cè)定液和A、B液等量混合的標(biāo)準(zhǔn)液，R1試劑含3.0g～15.0g氯化鈉、0.5g～5.0g疊氮鈉、0.6ml～2.0ml鹽酸、0.5ml～5.0ml TritonX－100、1000ml蒸餾水等；R2試劑為1.0g/L～10.0g/L酚紅濃溶液；A液為30.0mmol/L～80.0mmol/L NaHCO
文檔編號(hào)G01N21/31GK1773263SQ20051010429
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者李和樓, 郭英艾 申請(qǐng)人:李和樓