專利名稱：一種偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，尤其涉及一種可以直接檢測(cè)體液中結(jié)核菌所分泌特異性抗原的偵測(cè)方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核病的感染途徑主要是經(jīng)由空氣中飛沫傳染，而造成結(jié)核病的主要致病菌為結(jié)核菌(Mycobacterium tuberculosis)，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，目前每年約有八百多萬的結(jié)核病新增病例，且每年約有3百萬人因結(jié)核病死亡，而全世界約有33％的人口為潛伏性結(jié)核病患，因此如何快速正確的偵測(cè)診斷出結(jié)核病患是非常重要的。
目前常見的結(jié)核病診斷方法不外乎下列幾種1、皮膚測(cè)試(Skin test)這是檢測(cè)結(jié)核病最常見的初步診斷方法，在前臂以皮下注射約0.1ml的結(jié)核菌的純化抗原(Tuberculin purified proteinderivate，PPD)，在注射48～72小時(shí)后該處皮膚會(huì)出現(xiàn)腫脹的情狀，此方法偵測(cè)為陽性的病患代表此人曾受過結(jié)核菌感染，若要確定是否為活動(dòng)性結(jié)核病(active TB)則需再配合X光檢查及其它診斷方法。結(jié)核素皮膚測(cè)試的靈敏度大約65％。
2、胸部X光(Chest x-ray)胸部X光檢查對(duì)于肺部結(jié)核病的診斷是十分重要的，此方法除可以判斷是否感染肺部結(jié)核病外，也可以幫助皮膚測(cè)試陽性的病患做更進(jìn)一步的確認(rèn)，但對(duì)于非肺部結(jié)核病則無法診斷。胸部X光檢測(cè)的靈敏度大約50％。
3、抗酸性染色(Acid-fast stain，AFB)由于結(jié)核菌的細(xì)胞壁含有較厚的脂質(zhì)層，故當(dāng)以酸性的染劑進(jìn)行染色后，染劑較不易脫色，可在顯微鏡下觀察到粉紅色的桿菌存在，且此方法檢測(cè)十分快速。痰液檢測(cè)樣本最好是從肺部咳出的深層痰液，若病患無法自行咳出痰液，可以霧狀高滲透壓的食鹽水幫助引流，或可以胃部抽取液、支氣管沖洗液為檢測(cè)物?？顾嵝匀旧撵`敏度約50％。
4、細(xì)菌培養(yǎng)(Culture)為了正確的診斷結(jié)核病目前最準(zhǔn)確的方法仍為細(xì)菌培養(yǎng)，且細(xì)菌培養(yǎng)后可做抗藥性測(cè)試，提供醫(yī)師給藥的依據(jù)，但結(jié)核菌的生長(zhǎng)十分緩慢，實(shí)驗(yàn)室診斷需費(fèi)時(shí)4～6周，再加上抗藥性測(cè)試約需2～3周，是一種十分耗時(shí)的診斷方法。細(xì)菌培養(yǎng)的特異度大約95％。
5、聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)聚合酶鏈反應(yīng)是目前積極發(fā)展的診斷工具之一，它對(duì)于診斷初期的結(jié)核病感染較其它方法靈敏，因此有些醫(yī)院機(jī)構(gòu)也開始以此方法做為結(jié)核病診斷方法，但此方法所需花費(fèi)較高，操作人員需經(jīng)訓(xùn)練，故此方法仍然較適合應(yīng)用于研發(fā)工作上。聚合酶鏈反應(yīng)的靈敏度大約95％。
6、血清學(xué)測(cè)試(Serology test)近十年來很多的研發(fā)團(tuán)隊(duì)都在發(fā)展診斷結(jié)核病的血清檢驗(yàn)，但發(fā)現(xiàn)此方法無法分辨活動(dòng)性結(jié)核病患或曾經(jīng)感染的結(jié)核病患；且對(duì)于接種過卡介苗的人們?nèi)菀桩a(chǎn)生偽陽性的情形。血清測(cè)試的靈敏度大約60～85％。
全世界約有三分之一的人口受到結(jié)核菌的感染，因此如何早期診斷出結(jié)核病及其相關(guān)疾病是非常重要的，特別是如何隔離結(jié)核病患者或感染多重抗藥性結(jié)核菌的病患是控制結(jié)核病傳染的一大難題，但由于目前在臨床上診斷結(jié)核病的方法仍不夠完備，故造成診斷正確率偏低。
因此，本發(fā)明人為了改善目前結(jié)核病診斷方法正確率偏低的缺點(diǎn)選擇了結(jié)核菌所分泌的蛋白為特異抗原，并制作其多株和單株抗體。由于結(jié)核菌所分泌的蛋白可經(jīng)過體液交換后而存在于人體的各種體液中，因此，利用特異性的抗原抗體反應(yīng)，本發(fā)明為一種可以直接檢測(cè)體液中結(jié)核菌所分泌特異抗原的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在提供一種可以直接檢測(cè)體液中結(jié)核菌所分泌特異抗原并提高檢測(cè)正確率的結(jié)核病偵測(cè)方法。
本發(fā)明涉及一種偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，其特征在于，其包括
(a)選擇和制備一種結(jié)核菌特異性抗原，該抗原系可以用任何以抗原抗體結(jié)合反應(yīng)法檢測(cè)的、結(jié)核菌分泌于各種體液中的特異抗原；(b)制備對(duì)抗該結(jié)核菌特異性抗原的單株及多株抗體；(c)制各檢測(cè)該結(jié)核菌所分泌的特異抗原的試劑藥盒；以及(d)利用以上所述的抗體或試劑藥盒進(jìn)行結(jié)核菌抗原的偵測(cè)。
本發(fā)明所偵測(cè)的各種體液包括全血、血漿、血清、痰液、尿液、腦脊髓液、肋膜液及組織液等各種生物性體液，更具體來說，所述偵測(cè)方法步驟如下1、結(jié)核菌分泌的特異抗原的選擇所述結(jié)核菌分泌的特異抗原是由結(jié)核菌基因中的RD1、RD2或RD3等基因群轉(zhuǎn)譯的。
2、該抗原的制備可以現(xiàn)有技術(shù)基因工程的方式由大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白的方法來制備。
該重組蛋白抗原可以是由RD1、RD2或RD3等基因群克隆出的單一蛋白或融合蛋白。具體說來主要選定的抗原為RDs基因上所轉(zhuǎn)譯的CFP-10(culture filtrated protein-10)(編碼CFP-10蛋白的核苷酸序列見SEQ ID NO.1所示)、ESAT-6(編碼ESAT-6蛋白的核苷酸序列見SEQ ID NO.2所示)及CFP10/ESAT6(early secreting antigen-6)融合蛋白(編碼CFP10/ESAT-6融合蛋白的核苷酸序列見SEQ ID NO.3所示)。
3、單株抗體及多株抗體的制備可經(jīng)由上述重組蛋白抗原或其片段做為抗原來免疫動(dòng)物而制造出來。本發(fā)明制備了anti-CFP-10、anti-ESAT-6及anti-CFP10/ESAT6的單株及多株抗體。
4、檢測(cè)結(jié)核菌所分泌的特異抗原的試劑藥盒的制備；所述藥盒包括固定相上的上述抗體、二級(jí)抗體上所接的標(biāo)志、做為標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對(duì)照用的重組蛋白和合成的多肽。
5、免疫檢測(cè)方法可用上述單株及多株抗體進(jìn)行包括酶免疫分析法、熒光免疫分析法、冷光免疫分析法、免疫凝膠法、快速免疫色層分析及抗體芯片等方法來進(jìn)行檢測(cè)。此研究最終理想的免疫分析法為酶免疫分析法或快速免疫色層分析，將一級(jí)的反應(yīng)抗體吸附在固體上，并以顏色物質(zhì)或酶結(jié)合于另一抗體做為顯色偵測(cè)之用。
上述方法中，所述的RD1、RD2和RD3基因序列通過登錄GenBank即查到其全部序列，其查閱代碼及其它信息如下

本發(fā)明可檢測(cè)結(jié)核菌分泌于體液中的特異抗原，體液包括血液、血漿、血清、痰液、尿液、腦脊髓液、肋膜液及組織液等各種生物性體液。
接下來舉一較佳實(shí)施例做進(jìn)一步的說明，以使對(duì)本發(fā)明有更詳盡的了解，以下所述僅用來解釋本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非據(jù)以對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制，因此，凡以本發(fā)明為基礎(chǔ)所做的任何形式的修飾或變更，皆仍應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)的范疇。


圖1為本發(fā)明重組蛋白ESAT-6及CFP-10的制備示意圖，A表現(xiàn)重組蛋白CFP-10，B表現(xiàn)重組蛋白CFP-10/ESAT-6融合蛋白，C純化重組蛋白CFP-10及CFP-10/ESAT-6；圖2為本發(fā)明以“Westen印跡法”偵測(cè)體液中CFP-10及ESAT-6的存在的示意圖，A為血清，B為肋膜液；圖3為本發(fā)明以酶結(jié)合免疫吸附法偵測(cè)培養(yǎng)物濾液(culture filtrate)并與PCR及細(xì)菌培養(yǎng)法結(jié)果進(jìn)行比較的表格；圖4為本發(fā)明以酶結(jié)合免疫吸附法偵測(cè)肋膜液結(jié)果的示意圖；圖5為本發(fā)明以酶結(jié)合免疫吸附法偵測(cè)血清結(jié)果的示意圖；圖6為本發(fā)明以酶結(jié)合免疫吸附法偵測(cè)痰液并與抗酸性染色抹片法及細(xì)菌培養(yǎng)法結(jié)果進(jìn)行比較的示意圖；圖7為本發(fā)明以酶結(jié)合免疫吸附法偵測(cè)健康者的血清結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是一種偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，其主要包括下列各方面內(nèi)容
(a)任何以抗原抗體結(jié)合反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)核菌所分泌于各種體液中的特異抗原；(b)對(duì)抗結(jié)核菌特異性抗原的單株及多株抗體；(c)；結(jié)核菌所分泌的特異抗原的試劑藥盒，以及(d)利用以上所述的抗體或藥盒進(jìn)行結(jié)核菌抗原偵測(cè)。
其中，所述試劑藥盒包括(a)固定相的抗體，有能力辨識(shí)結(jié)核菌中RD1、RD2、RD3基因群所轉(zhuǎn)譯出的抗原或合成的多肽；(b)二級(jí)抗體上所接的標(biāo)志，可以包含酶、熒光、冷光、放射性物質(zhì)標(biāo)志；以及；(c)可做為標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對(duì)照用的重組蛋白和合成的多肽，。
該試劑藥盒亦可包括(a)固定相上的抗體，有能力辨識(shí)結(jié)核菌中RD1、RD2、RD3基因群所轉(zhuǎn)譯出的抗原或合成的多肽；(b)固定抗體的材料，包括顏色的顆粒球、膠態(tài)金粒、磁性顆粒、生物感測(cè)換能器例如壓電式晶體、表面微波聲換能器、電極、半導(dǎo)體和任何光電換能器；以及(c)可做為標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對(duì)照用的重組蛋白和合成的多肽，。
以下對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容更詳細(xì)分述如下1、結(jié)核菌所分泌于各種體液中的特異抗原的選擇請(qǐng)配合參閱圖1至圖7所示，為提高結(jié)核病檢測(cè)的準(zhǔn)確性，近年來不斷有研究再尋找結(jié)核菌特異性抗原，研究報(bào)告指出結(jié)核菌在感染的老鼠組織中會(huì)表達(dá)ESAT-6(early-secretedantigenic target 6-kDa protein)蛋白，此蛋白屬分泌性蛋白，且可引起T細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，而esat-6基因只存在于M.tuberculosis和會(huì)致病的M.bovis中，在M.bovis BCG(Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin)疫苗和其它許多非典型肺結(jié)核菌種中則不具此基因，因此推論ESAT-6的存在可以區(qū)分真正的結(jié)核病與BCG疫苗接種的不同。為了更清楚地知道ESAT-6的調(diào)控表達(dá)機(jī)制，便有學(xué)者以分子生物的方法分析會(huì)致病的M.bovis與M.bovis BCG，發(fā)現(xiàn)二者在RD1(region of deletion 1)、RD2與RD3三區(qū)的基因有所差異，這些RDs只存在于致病性分支桿菌，在所有的BCG中皆沒有RDs的存在，RDsoperon有許多基因，而esat-6基因即位于RD1，另外發(fā)現(xiàn)esat-6基因的啟動(dòng)子除調(diào)控esat-6基因外還調(diào)控另一lbp基因，此基因可轉(zhuǎn)譯出另一蛋白CFP-10(culture filtrate protein)，此蛋白亦為分泌性蛋白，可引起T細(xì)胞引發(fā)的免疫反應(yīng)。本發(fā)明中以已知常規(guī)基因克隆方法表達(dá)出ESAT-6及CFP-10兩種蛋白，并以已知常規(guī)方法制造對(duì)抗此兩種蛋白的單株及雙株抗體，進(jìn)而利用各式免疫檢測(cè)方法，包括酶免疫分析法、免疫凝膠法、快速免疫色層分析及抗體芯片等，這些體外檢測(cè)方法可以在人體各種體液中偵測(cè)到結(jié)核菌所分泌的特異性抗原，進(jìn)而提高診斷的速度及正確性。
本發(fā)明所使用的結(jié)核菌抗原包含了重組蛋白CFP-10、ESAT-6及CFP10/ESAT-6融合蛋白。利用已知常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以特異性的引物放大結(jié)核菌上lhp及esat-6基因。將PCR產(chǎn)物接入pGEM-T載體并送入E.coli(DH5a)，接著在具有抗生素的培養(yǎng)基中挑取代有l(wèi)hp及esat-6基因的單一菌落，并以基因定序方法確認(rèn)序列無誤，以限制酶切下基因并進(jìn)行接合反應(yīng)，使兩基因接合在一起，最后分別將lhp、esat-6結(jié)合后的基因與表達(dá)載體pET29b結(jié)合送入E.coli(BL21DE3)。
上面所涉及的基因重組、表達(dá)、融合、及聚合酶鏈反應(yīng)等方法，均為現(xiàn)有技術(shù)常用之方法，故此不再贅述。
很多研究顯示了結(jié)核菌、BCG菌株及環(huán)境中的結(jié)核桿菌類菌種具有很多相同的抗原，而這些抗原或許能夠應(yīng)用于疫苗的設(shè)計(jì)上，但可能因?yàn)榻徊娣磻?yīng)所以無法作為診斷用途上的抗原，因此，越來越多的研究在尋找結(jié)核菌的特異抗原，而目前所使用的結(jié)核菌純化抗原(PPD)就會(huì)與卡介苗發(fā)生交叉反應(yīng)，故如要預(yù)測(cè)抗原是否會(huì)與疫苗或環(huán)境菌株發(fā)生交叉反應(yīng)是較困難的，因此，所要尋找作為診斷結(jié)核病的抗原必須具有極高的特異性，需為疫苗或環(huán)境菌株所沒有的。
Mahairas等人利用新穎的生物技術(shù)定義結(jié)核菌特異性抗原，并利用基因雜交反應(yīng)比對(duì)出致病性的結(jié)核桿菌屬和1925年所發(fā)展出的BCG菌株在某些基因上是有所差異的，這些在BCG菌株上所不存在的基因分別被命名為RD1、RD2及RD3，因此，有很多研究便想利用這些區(qū)域所轉(zhuǎn)譯出的蛋白作為疫苗或檢驗(yàn)診斷上的候選抗原。而RD2尚可轉(zhuǎn)譯一種名為MPT64的分泌蛋白，此蛋白大小約為32kD，很多研究發(fā)現(xiàn)此蛋白可刺激T細(xì)胞而發(fā)生遲發(fā)性過敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)，由于BCG菌株不具有mpt64基因，故利用MTP64作為皮膚測(cè)試的抗原，可分辨受結(jié)核菌感染的病患及接受卡介苗注射的健康者。Mpt64基因可存在于下列菌株M.tuberculosis H37Rv、M.tuberculosis H37Ra、M.bovis BCG substrans Tokyo，Moreau，Russian等；而下列菌株則不具有mpt64基因M.leprae、M.bovis BCG substrains Glaxo，Pasteur，Canadian，Tice，Danish 1331。但對(duì)于原始的BCG菌株(Pasteur)來說，MPT64是一種非常有效的皮膚測(cè)試抗原。
在結(jié)核菌的RD1基因群中，ESAT-6是目前特性被了解最多的蛋白，而在所有的BCG菌株中皆不具有esat-6基因，ESAT-6為一分泌性蛋白，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)ESAT-6可以刺激受結(jié)核菌感染后的記憶性免疫細(xì)胞，使其釋放出大量的IFN-γ，且ESAT-6是結(jié)核菌中一種主要引起Th1免疫反應(yīng)的抗原，在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ESAT-6可以區(qū)分由M.tuberculosis或M.avium所引起的肺部疾病，故ESAT-6極具有作為診斷結(jié)合的特異性抗原的潛力。
另外，RD1基因群上共有13個(gè)基因，除esat-6基因位于RD1，同時(shí)并發(fā)現(xiàn)esat-6基因的啟動(dòng)子除調(diào)控esat-6基因外還調(diào)控另一lbp基因，此基因可轉(zhuǎn)譯出另一蛋白CFP-10，此蛋白大小約為10kD，也是一種分泌性的蛋白。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)一群屬于ESAT-6家族(ESAT-6、CFP-10、TB10.4)的蛋白皆具有引發(fā)人類免疫反應(yīng)，刺激大量IFN-γ釋出的功能，而在血清測(cè)試上這些家族成員皆能增加診斷上的特異性，因此本發(fā)明選擇ESAT-6以及CFP-10蛋白作為特異抗原模式，以描述所研發(fā)的試劑在診斷結(jié)核病上的新穎性、進(jìn)步性以及實(shí)用性。
本發(fā)明抗體的制備主要包括多株抗體與單株抗體的制備與分析。
2、抗結(jié)核菌抗原的多株抗體制備與分析以上述結(jié)核菌抗原免疫NZW母兔，第一次免疫以完全性的佐劑混合定量的抗原進(jìn)行皮下注射(500μg/次)，之后每?jī)芍芤苑峭耆缘淖魟┗旌隙康目乖M(jìn)行肌肉注射(500μg/次)，再最后一次注射后兩周即可大量抽取兔血，已獲取具抗體的兔子血清，并以硫酸氨沉淀法及透析法使抗體存于PBS中冷凍于-20℃。以ELISA法測(cè)定抗體的效價(jià)，并與各種抗原偵測(cè)該抗體的特異性與親和性，最后再以現(xiàn)有技術(shù)方法將抗體加以定量。
3、抗結(jié)核菌抗原的單株抗體制備與分析以結(jié)核菌抗原免疫老鼠后再取其脾臟，使脾臟中的淋巴球細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，所產(chǎn)生的融合瘤細(xì)胞便會(huì)分泌抗體于培養(yǎng)液中，以極限稀釋法將融合瘤細(xì)胞稀釋，篩選辨識(shí)單一抗原位置的單株抗體，將單一的細(xì)胞株注射到Balb/c老鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水，由腹水中即可分離純化獲得的單株抗體。以ELISA法測(cè)定抗體的效價(jià)，并與各種抗原偵測(cè)該抗體的特異性與親和性，最后再將抗體加以定量。
4、制備檢測(cè)結(jié)核菌所分泌的特異抗原的試劑藥盒為滿足更方便、快捷地測(cè)試需要，可將本發(fā)明測(cè)試方法所用試劑制成試劑藥盒。用現(xiàn)有技術(shù)方法將上面制備的單株抗體或多株抗體吸附于固定相上，這些抗體有能力辨識(shí)結(jié)核菌中RD1、RD2、RD3基因群所轉(zhuǎn)譯出的抗原或合成的多肽；再用現(xiàn)有技術(shù)方法制作二級(jí)抗體上所接的標(biāo)志，可以包含酶、熒光、冷光、放射性物質(zhì)標(biāo)志；并選擇可做為標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對(duì)照用的現(xiàn)有技術(shù)重組蛋白和合成的多肽，；將所述抗體固定相、標(biāo)志物、對(duì)照物分別包裝好，置于同一藥盒中。
5、免疫測(cè)試方法本發(fā)明使用的測(cè)試方法為抗原抗體結(jié)合反應(yīng)法，包括酶免疫分析法、熒光免疫分析法、冷光免疫分析法、放射線免疫分析法、免疫凝膠法、快速免疫色層分析、免疫印跡法及抗體芯片等，以下針對(duì)免疫色層分析法、免疫凝膠法、酶免疫分析法以及免疫芯片法，茲分述如下(1)、免疫色層分析法免疫色層分析法是一種定性的分析方法，此方法所需的檢測(cè)樣本體積很少、只需單一步驟、不需要特殊儀器、非常的快速且結(jié)果十分容易判讀。是將一級(jí)抗體吸附在膜上，并將帶有熒光物質(zhì)的二級(jí)抗體標(biāo)示在具顏色的顆粒小球上。當(dāng)檢測(cè)樣本滴到分析膜上，檢測(cè)樣本中的結(jié)核菌抗原會(huì)與接有抗體的有顏色顆粒球發(fā)生反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，并借由毛細(xì)管擴(kuò)散原理將復(fù)合物帶到具有二級(jí)抗體吸附的固定相，再次借由抗原抗體的接合使有色顆粒球在固定相上形成可以判讀的顏色線。
(2)、免疫凝膠法免疫凝膠法是一種定性的分析方法，此方法所需的檢測(cè)樣本體積很少、只需單一步驟、不需要特殊儀器、非常的快速且結(jié)果十分容易判讀。當(dāng)檢測(cè)樣本中的抗原與表面附著結(jié)合菌抗體的凝膠發(fā)生反應(yīng)，由于抗原與抗體的接合或使得微小的凝膠連結(jié)在一起，形成凝集反應(yīng)，使檢測(cè)樣本濁度增加，以吸光度的改變便可得知是否有抗原存在。
(3)、酶免疫分析法利用親和性管柱純化獲得兩種對(duì)抗結(jié)核菌抗原的抗體，使一種抗體吸附在固定相上，加入檢測(cè)樣本，檢測(cè)樣本中的抗原會(huì)被一級(jí)抗體所辨認(rèn)，因此也會(huì)吸附于固定相，接著加入帶有酶標(biāo)示的二級(jí)抗體，二級(jí)抗體亦會(huì)與固定相上的抗原發(fā)生接合反應(yīng)，最后利用酶特定的底物顯色，以顯色的深淺進(jìn)行判讀，此方法的一級(jí)與二級(jí)抗體最好來自不同物種所制造的，可增加專一性。
(4)、免疫芯片法結(jié)核菌特異性抗體可以特殊技術(shù)接合在一些電子傳導(dǎo)器上，例如壓電式晶體、液漿傳導(dǎo)器、聲波共振傳導(dǎo)器、電極、熱能或光能偵測(cè)器等，當(dāng)檢測(cè)樣本中的抗原與固定相上的抗體接合，抗原抗體反應(yīng)造成電子訊號(hào)的變動(dòng)，便可進(jìn)行檢測(cè)。
SEQUENCE LISTING<110>臺(tái)灣臺(tái)塑生醫(yī)科技股份有限公司<120>一種偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法<130>p00008<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>288<212>DNA<213>Mycobacterium tuberculosis<400>1atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcatag 288<210>2<211>303<212>DNA<213>Mycobacterium tuberculosis<400>2atggeagaga tgaagaccga tgccgctacc ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg 60atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag 120ggccagtggc gcggcgcggc ggggacggcc gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa 180gcagccaata agcagaagca ggaactcgac gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc 240gtccaatact cgagggccga cgaggagcag cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc 300tga303<210>3<211>588<212>DNA<213>Mycobacterium tuberculosis<400>3atggcagaga tgaagaccga tgccgctacc ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg 60atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag 120ggccagtggc gcggcgcggc ggggacggcc gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa 180gcagccaata agcagaagca ggaactcgac gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc 240gtccaatact cgagggccga cgaggagcag cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc 300atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 360aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 420gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 480acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 540caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcatag 588
權(quán)利要求
1.一種偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，其特征在于，其包括(a)選擇和制備一種結(jié)核菌特異性抗原，該抗原系可以用任何以抗原抗體結(jié)合反應(yīng)法檢測(cè)的、結(jié)核菌所分泌于各種體液中的特異抗原；(b)制備對(duì)抗該結(jié)核菌特異性抗原的單株及多株抗體；(c)制備檢測(cè)結(jié)核菌所分泌的特異抗原的試劑藥盒；以及(d)利用以上所述的抗體或試劑藥盒進(jìn)行結(jié)核菌抗原的偵測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，其特征在于，所述的結(jié)核菌特異性抗原包含結(jié)核菌RD1、RD2、RD3基因群轉(zhuǎn)譯出的任何蛋白；合成的RDs區(qū)域多肽、利用細(xì)菌培養(yǎng)或基因工程等技術(shù)純化的任何以上所述的抗原片段。
3.如權(quán)利要求1所述的偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，其特征在于，所述結(jié)核菌特異性抗體最主要是針對(duì)culture filtrated protein-10(CFP-10)、earlysecretion antigene-6(ESAT-6)及兩者的融合蛋白(CFP-10/ESAT-6)所衍生出的多株和單株抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，其特征在于，利用抗原抗體結(jié)合反應(yīng)法，其包括酶免疫分析法、熒光免疫分析法、冷光免疫分析法、放射線免疫分析法、免疫凝膠法、快速免疫色層分析法、免疫印跡法及抗體芯片法等。
5.如權(quán)利要求4所述的偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，其特征在于，快速免疫色層分析，是將一級(jí)抗體吸附在膜上，并將帶有熒光物質(zhì)的二級(jí)抗體標(biāo)示在具顏色的顆粒小球上。
6.如權(quán)利要求1所述的偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，其特征在于，所偵測(cè)的檢測(cè)樣本包括血液、血漿、血清、痰液、尿液、腦脊髓液、肋膜液及組織液等各種生物性體液。
7.如權(quán)利要求1所述的偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，其特征在于，所述的試劑藥盒包括(a)固定相的抗體，有能力辨識(shí)結(jié)核菌中RD1、RD2、RD3基因群所轉(zhuǎn)譯出的抗原或合成的多肽；(b)二級(jí)抗體上所接的標(biāo)志，可以包含酶、熒光、冷光、放射性物質(zhì)標(biāo)志；以及(c)可做為標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對(duì)照用的重組蛋白和合成的多肽。
8.如權(quán)利要求1所述的偵測(cè)體液中結(jié)核菌抗原的方法，其特征在于，所述的試劑藥盒可包括(a)固定相上的抗體，有能力辨識(shí)結(jié)核菌中RD1、RD2、RD3基因群所轉(zhuǎn)譯出的抗原或合成的多肽；(b)固定抗體的材料，包括顏色的顆粒球、膠態(tài)金粒、磁性顆粒、生物感測(cè)換能器例如壓電式晶體、表面微波聲換能器、電極、半導(dǎo)體和任何光電換能器；以及(c)可做為標(biāo)準(zhǔn)品或陽性對(duì)照用的重組蛋白和合成的多肽。
全文摘要
一種偵測(cè)結(jié)核液中結(jié)核菌抗原的方法，包括下列各方面內(nèi)容(a)選擇和制備任何以抗原抗體結(jié)合反應(yīng)法可檢測(cè)的、結(jié)核菌所分泌于各種體液中的特異抗原；(b)制備對(duì)抗結(jié)核菌特異性抗原的單株及多株抗體；(c)制備檢測(cè)結(jié)核菌所分泌的特異抗原的試劑藥盒；(d)利用以上所述的抗體或藥盒進(jìn)行結(jié)核菌抗原偵測(cè)。借由上述步驟達(dá)到檢驗(yàn)快速且正確率高的檢驗(yàn)?zāi)康摹?br> 文檔編號(hào)G01N33/569GK1936582SQ20051010486
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月21日
發(fā)明者詹爾昌, 楊明熒 申請(qǐng)人:臺(tái)塑生醫(yī)科技股份有限公司