專利名稱：抗人心肌肌鈣蛋白i合成多肽抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以抗體為特征的體外實(shí)驗(yàn)用的生物制品，更具體的說，是一種抗人心肌肌鈣蛋白I(cTnI)合成多肽抗體及其制備方法和測定cTnI的膠體金免疫檢測卡。
背景技術(shù)：
目前在工業(yè)化國家，心血管疾病是威脅人類生命的主要疾病之一，發(fā)病率和死亡率均很高，對此類疾病進(jìn)行早期診斷和治療具有重大意義。心臟病的診斷包括臨床表現(xiàn)，心電圖的變化和心肌損傷生化標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)室檢測，其中心肌損傷生化標(biāo)志物的檢測在心肌損傷和急性心肌梗死的診斷方面起重要作用。而尋找和篩選早期、靈敏、特異的心肌損傷標(biāo)志物和簡便、快捷、靈敏的檢測分析方法，一直是該領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。
隨著對心肌損傷標(biāo)志物的深入研究和長期的臨床實(shí)踐驗(yàn)證，以前常用的標(biāo)志物如AST(門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)，LDH(乳酸脫氫酶)及其同工酶，CK(肌酸磷酸激酶)及CK-MB(肌酸磷酸激酶同工酶)存在許多缺陷和不足，特異性不強(qiáng)是其最主要的缺點(diǎn)。此外，在早期診斷和靈敏度方面也不理想，有可能造成漏診或誤診，因此已呈現(xiàn)出逐漸被新標(biāo)志物取代的趨勢。如目前常用的采用免疫學(xué)技術(shù)測定血清cTnI(心肌肌鈣蛋白I)、cTnT(心肌肌鈣蛋白T)和Mb(肌紅蛋白)等，它們在診斷心肌損傷方面價(jià)值更高，有取代心肌酶學(xué)指標(biāo)的趨勢。
在這些生化指標(biāo)中，抗人心肌肌鈣蛋白cTnI尤為突出，它是心肌損傷的一種特異、靈敏的血清標(biāo)志物，具有以下特點(diǎn)在急性心肌梗死發(fā)生后4-12h即有明顯升高，可持續(xù)4-10d，可作為早期診斷的指標(biāo)，且對心肌損傷的靈敏度和特異性都很高，因此cTnI的檢測不僅可以用來早期診斷急性心肌梗死和心絞痛等，還可作為晚入院病人的回顧診斷和動態(tài)診斷指標(biāo)。
人心肌肌鈣蛋白I(cTnI)是含210個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，相對分子量為24KD，據(jù)NCBIProtein提供的cTnI氨基酸序列為1 madgssdaar eprpapapir rrssnyraya tephakkksk isasrklqlk tlllqiakqe61 lereaeerrg ekgralstrc qpleltglgf aelqdlcrql harvdkvdee rydieakvtk121 niteiadltq kifdlrgkfk rptlrrvris adammqallg arakesldlr ahlkqvkked181 tekenrevgd wrknidalsg megrkkkfes據(jù)報(bào)道，cTnI中心區(qū)域的第96-116的氨基酸殘基因?yàn)楹幸种菩詤^(qū)域，能促進(jìn)與cTnC相結(jié)合，進(jìn)而具有更強(qiáng)的抵抗蛋白水解酶的水解作用。也就是說，當(dāng)心肌損傷時(shí)包含這段氨基酸殘基的cTnI可與cTnC相結(jié)合，被cTnC所保護(hù)大量存在血液循環(huán)中，因此將這段肽段作為抗原進(jìn)行免疫制備抗體進(jìn)而組裝成膠體金免疫檢測卡可以提高檢測敏感性和特異性。
但是由于人心肌組織難以獲得，因此從組織中大量提取純化cTnI，把它作為研究或者診斷用的抗原是極其困難的，不但價(jià)格昂貴，提取純化成本高，臨床上很難滿足早期診斷急性心肌梗死和心絞痛的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性高的抗人心肌肌鈣蛋白I(cTnI)合成多肽抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抗cTnI多克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是公開了抗人cTnI合成多肽抗體在制備心肌損傷膠體金免疫檢測卡中的應(yīng)用及其使用方法。
本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種用于檢測心肌損傷的包被有cTnI-PcAb和羊抗兔IgG的硝酸纖維素膜的膠體金免疫檢測卡。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)一種抗人心肌肌鈣蛋白I合成多肽抗體，其特征在于該抗體的效價(jià)為1∶200000，親和常數(shù)為0.985×109L/mol，作為合成多肽的氨基酸序列為N端98-110的氨基酸序列Arg-Gln-leu-His-Ala-Arg-Val-Asp-Lys-Val-Asp-Glu-Glu。
本發(fā)明的抗人心肌肌鈣蛋白I合成多肽抗體的制備方法，它是以人心肌肌鈣蛋白氨基酸序列中N端98-110的氨基酸肽段序列RQLHARVDKVDEE作為抗原肽，在氨基酸C端加入Cys(半胱氨酸)殘基，使合成肽具有游離的巰基，蛋白載體具有游離的氨基，將它設(shè)計(jì)與血藍(lán)蛋白(KLH)相偶聯(lián)，合成人心肌肌鈣蛋白I抗原肽。經(jīng)高效液相層析純化后，免疫動物，制備多肽抗體，經(jīng)檢測抗血清效價(jià)，達(dá)到要求后，收獲抗血清，并經(jīng)辛酸—硫酸銨沉淀法純化而成。
本發(fā)明所述的膠體金免疫檢測卡，它是由樣品墊、含有膠體金標(biāo)記抗體的玻璃纖維、包被有人心肌肌鈣蛋白I多克隆抗體、羊抗兔IgG的硝酸纖維素膜、吸收墊組成，其制備方法如下(1)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，用納米級膠體金顆粒標(biāo)記制備的抗體并將玻璃纖維浸泡在該抗體溶液中；用純化的人心肌肌鈣蛋白I多克隆抗體包被微孔硝酸纖維素膜，即在硝酸纖維素膜上劃線，使抗體包被在硝酸纖維素膜上，以捕捉樣品中的抗原；用羊抗兔IgG的多克隆抗體另劃一條線，以捕捉膠體金標(biāo)記的多克隆抗體，作為免疫檢測卡的質(zhì)量控制線；(2).晾干后完全浸泡于含1％牛血清白蛋白的pH7.2的磷酸鹽緩沖液中，以封閉纖維素膜的殘余吸附能力，4℃冰箱過夜；(3).取出封閉的纖維素膜，用磷酸鹽緩沖液洗滌，每次將纖維素膜浸泡洗滌，置于室溫中干燥，再放于通風(fēng)干燥箱內(nèi)通風(fēng)干燥，密封于塑料袋中，保存于4℃冰箱備用。
本發(fā)明選取cTnI上N端第98-110的氨基酸，為13個(gè)氨基酸的多肽，合成肽主要通過固相多肽合成方法制備。以Fmoc保護(hù)氨基酸為原料，在固相載體(樹脂)上以逐步縮合的方式合成所需肽段，最后以適當(dāng)?shù)姆椒◤妮d體上“切”下肽段，并脫去所有的保護(hù)基團(tuán)。將此多肽用高效液相色譜分析純化純度可達(dá)95％，制得純的合成肽抗原，其特點(diǎn)是選擇合成天然cTnI蛋白上的一段氨基酸多肽，具有免疫原性、且水溶性好，經(jīng)高效液相層析純化和質(zhì)譜分析證實(shí)所合成多肽達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。同時(shí)為了加強(qiáng)這段多肽的免疫原性，把它和血藍(lán)蛋白(KLH)載體偶聯(lián)，用該連接物免疫家兔，采用經(jīng)典的多克隆抗體制備技術(shù)制備cTnI合成多肽抗體，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)對cTnI抗體進(jìn)行檢測，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，用納米級膠體金顆粒標(biāo)記制備的抗體并將玻璃纖維浸泡在該抗體溶液中；用純化的人心肌肌鈣蛋白I多克隆抗體包被微孔硝酸纖維素膜，(nitrocellulose membrane，NCM)，并結(jié)合層析技術(shù)建立了cTnI的膠體金免疫層析分析法(colloidal gold immuno-chromatographicassay，GICA)，從而制備了簡便、快速的膠體金免疫檢測卡，以滿足臨床檢測、診斷的需要，具體表現(xiàn)為一、高質(zhì)量的兔抗人cTnI合成肽段多克隆抗血清本實(shí)驗(yàn)用連接物免疫家兔，制備多克隆抗體，用間接ELISA法測家兔血清抗體效價(jià)水平，用cTnI合成肽純品制備抗原包被板，抗體效價(jià)可達(dá)到1∶200000，說明選取的肽段是暴露于蛋白質(zhì)外部的親水區(qū)，具有較高抗原性，可產(chǎn)生效價(jià)較高的抗肽抗體，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)用天然人cTnI抗原制備抗原包被板，抗體效價(jià)可達(dá)到1∶10000，說明本實(shí)驗(yàn)選取的cTnI合成肽段與天然cTnI抗原具有很好的交叉反應(yīng)，證實(shí)cTnI合成肽段與天然cTnI抗原在空間構(gòu)象上具有相似性，同時(shí)用辛酸—硫酸銨法進(jìn)行抗體的純化，獲得純化抗體濃度為3.8mg/ml。抗體親和常數(shù)Ka為0.985×109L/mol，親和力強(qiáng)；特異性高，與人cTnT、CK-MB無交叉反應(yīng)。經(jīng)免疫3只雌性處于成長期的純系新西蘭大耳白家兔，經(jīng)過初次免疫和加強(qiáng)免疫，于加強(qiáng)免疫2周后用間接ELISA法測家兔血清抗體效價(jià)水平，發(fā)現(xiàn)1號、2號和3號家兔的抗體效價(jià)均較高，抗體效價(jià)可達(dá)到1∶200000。(見表1)表1免疫家兔ELISA法檢測結(jié)果OD492nm(連接物抗原包被濃度5μg/ml)


注以上數(shù)值均為酶標(biāo)儀在492nm處測定的OD值，P/N比值≥2.1為陽性，其中P和N分別為陽性孔和陰性孔的OD492nm值。
檢驗(yàn)本發(fā)明選取的cTnI肽段與天然cTnI的交叉反應(yīng)。其中3號家兔血清抗體效價(jià)可達(dá)到110000(見表2)，說明本實(shí)驗(yàn)課題選取的cTnI肽段制備的抗體與天然cTnI具有很好的交叉反應(yīng)，用此抗體可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，制備膠體金免疫檢測卡。
表2免疫家兔ELISA法檢測結(jié)果OD492nm(天然cTnI抗原包被濃度5μg/ml)

注以上數(shù)值均為酶標(biāo)儀在492nm處測定的OD值，P/N比值≥2.1為陽性，其中P和N分別為陽性孔和陰性孔的OD492nm值。
二、兔抗人cTnI合成肽多克隆抗體親和力的鑒定親和力表示抗體與抗原結(jié)合的緊密程度，以親和常數(shù)Ka表示，親和常數(shù)以濃度的倒數(shù)為單位，即克分子濃度-1(mol-1)。其值越高表示抗原抗體結(jié)合的緊密程度越高。對不同抗體，親和常數(shù)具有一個(gè)很大的范圍可從1012～105mol-1或更小。本實(shí)驗(yàn)采用非競爭性ELESA法測定抗體的親和常數(shù)，這是美國David Beaty用包被抗原檢測抗體的方法，通過質(zhì)量作用定律歸納出一個(gè)以抗體濃度計(jì)算抗體親和常數(shù)的方法。本實(shí)驗(yàn)中以cTnI合成肽制備抗原包被板，包被濃度梯度為5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml(8∶4∶2∶1共4個(gè)濃度梯度)；將純化的抗體以磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成10個(gè)濃度梯度40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、1.5625×10-1、7.8×10-2(μg/ml)均加入各濃度包被的抗原孔中，測定OD492nm值并作出曲線，最佳的抗體的親和常數(shù)Ka＝0.985×109L/mol。
三、人cTnI膠體金免疫檢測卡測定結(jié)果本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸三鈉還原法制備出酒紅色的膠體金溶液，通過紫外可見分光光度計(jì)在400-700nm處進(jìn)行掃描，在520nm處具有最大吸收峰。通過膠體金溶液的顏色以及紫外最大吸收值進(jìn)一步證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)制備的膠體金顆粒直徑為24nm左右。制備直徑在24nm的膠體金粒子是因?yàn)榇肆郊饶鼙ＷC膠體金在NCM上合適的泳動速度，又是肉眼觀察時(shí)最敏感的顏色，因而保證了檢測的快速性和敏感性。
在硝酸纖維素膜上包被cTnI PcAb，最佳包被濃度3.5mg/ml，本實(shí)驗(yàn)選定噴涂量為2μl/0.05cm2；硝酸纖維素膜上包被羊抗兔IgG的多克隆抗體，最佳包被濃度2mg/ml，選定噴涂量為3μl/0.05cm2。是根據(jù)表12中Millipore公司提供HF135的Hi-Flow Plus膜對羊IgG的吸附能力＞95μg/cm2，本實(shí)驗(yàn)中對于0.05cm2膜面積選定包被抗體的量為5-7μg，達(dá)到最適吸附蛋白量使檢測線、質(zhì)控線最為清晰。
通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化和選擇，確立了人cTnI合成肽膠體金免疫檢測卡分析法的最佳方案。 包括膠體金最佳標(biāo)記抗體濃度測定，以及硝酸纖維膜上最佳包被抗體濃度的測定等最佳反應(yīng)體系的選擇。并進(jìn)行方法學(xué)鑒定本發(fā)明的人cTnI GICA法制備的膠體金免疫檢測卡的積極效果在于使復(fù)雜的操作簡化為只需加樣一步操作；只需微量檢樣；用肉眼觀察試紙條顯色與否即可判斷陽性、陰性結(jié)果，無需任何儀器，也不受場地限制；檢測只需10-15min就可知道結(jié)果。所以，該方法既可單人份檢測，又可批量檢測，無需特殊儀器設(shè)備，肉眼觀察即可判斷結(jié)果，具有簡便、快速、直觀、單份測定的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于基層醫(yī)院和大規(guī)模普查。


圖1cTnI合成肽-KLH連接物的高效液相層析圖；圖2合成肽與KLH連接物的質(zhì)譜圖；圖3膠體金免疫檢測卡組裝示意圖；圖4檢測卡各種檢測結(jié)果示意圖，其中1為操作方法，2為陰性結(jié)果，3為陽性結(jié)果，4為試紙條失效，a為質(zhì)控線，b為檢測線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1抗人心肌肌鈣蛋白I多肽的合成用Protscale軟件中的Hopp&Woods模型預(yù)測cTnI分子的親水性、抗原型及同源性分析，選取cTnI上N端第98-110的氨基酸，為13個(gè)氨基酸的多肽，合成肽主要通過固相多肽合成方法制備。以Fmoc保護(hù)氨基酸為原料，在固相載體(樹脂)上以逐步縮合的方式合成所需肽段RQLHARVDKVDEE氨基酸序列。最后以適當(dāng)?shù)姆椒◤妮d體上“切”下肽段，并脫去所有的保護(hù)基團(tuán)。將此多肽用高效液相色譜分析純化可達(dá)95％(具體見圖1)，制得純的合成肽抗原。
實(shí)施例2合成肽與載體蛋白(KLH)的連接(MBS連接法)(1)將5mgKLH溶于0.5ml PBS中，置透析袋內(nèi)，于4℃用PBS透析過夜后，轉(zhuǎn)入玻璃試管內(nèi)。(2)加入MBS/DMF 70ul，室溫?cái)嚢?0分鐘。(3)取經(jīng)PB預(yù)平衡的PD-10層析柱，緩慢加樣，PB洗脫，大約收集12-20管，每管0.5ml，通過紫外可見分光光度計(jì)測定洗脫液280nm OD值。第一峰代表MBS/KLH結(jié)合物，呈絮狀；第二峰含游離的MBS。收集MBS/KLH結(jié)合物部分。(4)將5mg合成肽溶于PBS中，如合成肽不溶于PBS，則可溶于6mol/0.1mol/lPB中。(5)將合成肽溶液與MBS/KLH結(jié)合物混合，以0.1mol/l鹽酸或0.1mol/l氫氧化鈉調(diào)PH至7.3，室溫磁力攪拌3h，置4℃蒸餾水透析過夜，換一次蒸餾水后，繼續(xù)透析≥4h。連接物置-20℃保存?zhèn)溆茫|(zhì)譜鑒定見圖2。
實(shí)施例3
cTnI合成肽抗原的多克隆抗體制備多克隆抗體制備技術(shù)的具體流程包括動物免疫，抗血清效價(jià)檢測，收獲抗血清，抗體純化以及抗體質(zhì)量鑒定幾個(gè)部分，現(xiàn)分述如下一、動物免疫選擇新西蘭大耳白家兔體重1.5-1.8Kg，經(jīng)初次及多次加強(qiáng)免疫制備人cTnI多肽合成抗體；(1).免疫效果的檢測在第二次加強(qiáng)免疫后10-14天于家兔耳緣靜脈少量采血，分離血清，用間接ELISA法檢測家兔血清中的抗體效價(jià)。
(2).收集抗血清一次性大量放血，當(dāng)抗血清效價(jià)達(dá)到最大并不再升高(或開始下降)時(shí)，采用頸動脈放血收集血清(a)實(shí)驗(yàn)兔的四肢和頭部固定在實(shí)驗(yàn)臺上用手術(shù)剪剪開頸部皮膚，暴露出頸動脈，將頸動脈用眼科剪剪一小口，插入一段細(xì)塑料管，放開止血鉗，用三只50ml離心管接血，血液總量約100-150ml。
(b)將采集的血液置于室溫，靜置2小時(shí)后，置4℃冰箱過夜，用長玻璃吸管剝離凝血塊，使血清便于析出。
(c)將血液在1000rpm×10min離心，收集血清(血清總量40-50ml)，加0.1％疊氮鈉防腐，按1ml/管和0.5ml/管分裝后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 二、ELISA法檢測家兔血清效價(jià)(a)包被抗原，用包被緩沖液將抗原分別稀釋至2μg/ml、5μg/ml和10μg/ml，共鋪兩塊抗原包被板(聚苯乙烯酶聯(lián)板)，每孔100μl，4℃過夜，然后棄去孔內(nèi)液體，緩沖液洗三次，每次3分鐘，拍干?？瞻讓φ湛准尤氩缓乖木彌_液。
(b)每孔加入含0.5％BSA的封閉液100μl，4℃過夜，洗滌液洗三次，每次3分鐘，拍干。
(c)于家兔耳緣靜脈少量采血，靜置沉淀4小時(shí)后，分離血清，將血清分別稀釋至1∶100、1∶2000、1∶5000、1∶1萬、1∶5萬、1∶10萬、1∶20萬，分別取不同稀釋度血清加入抗原包被板，每孔100μl，37℃水浴2小時(shí)，洗滌液洗三次，每次3分鐘，拍干。陰性對照孔加入未經(jīng)免疫的正常家兔的血清。
(d)將HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體用含0.05％Tween-20的PBS稀釋100倍，每孔加入100μl，37℃水浴2小時(shí)，洗滌液洗三次，每次3分鐘，拍干；每孔加入鄰苯二胺底物溶液100μl，室溫避光放置30分鐘；每孔加入2mol/L的濃硫酸50μl終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀于492nm處測OD值并判斷結(jié)果。
三、cTnI合成多肽抗血清的純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化。
(1)取cTnI抗血清1ml，加入4ml的0.06mol/L pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖液。用1mol/L Tris溶液調(diào)上液pH至4.5。緩慢滴加125μl的辛酸溶液，常溫?cái)嚢?0min，然后，10000rpm(4℃)，離心30min。棄沉淀，上清液用0.45μm濾膜過濾后，用1mol/L Tris溶液調(diào)pH至7.4。
(2)加等量飽和硫酸銨后，調(diào)pH至7.0，然后4℃攪拌30min，10000rpm(4℃)，離心15min，棄上清，沉淀用三蒸水溶解后，透析48小時(shí)(以三蒸水透析)。
(3)透析袋內(nèi)溶液在280nm處測O.D值。
四、純化后的cTnI合成多肽抗血清蛋白含量的測定紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量。原理由于蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在280nm處。本實(shí)驗(yàn)將純化后的抗血清稀釋20倍后，測O.D260nm和O.D280nm。
實(shí)施例4人cTnI膠體金免疫檢測卡的制備(1)膠體金的制備玻璃容器的硅化按使用說明書將硅烷化試劑(Sigmacote)加入玻璃容器中，輕輕晃動，使容器內(nèi)壁表面與試劑充分作用，室溫干燥后即可使用。專用的清潔器皿以第一次生成的膠體金穩(wěn)定其表面，棄去后以三蒸水淋洗，即可繼續(xù)使用。
稱取氯金酸(HAuCl4)1克，溶解于100ml去離子水中，配成1％的氯金酸溶液。取1ml該溶液置于250ml燒杯內(nèi)，加入99ml去離子水，加熱至沸騰，立即加入2ml 1％的檸檬酸三鈉溶液，迅速攪拌均勻，觀察顏色變化，1分鐘后出現(xiàn)藍(lán)色，繼續(xù)加熱，變?yōu)榛疑^而黑色，2-3分鐘后出現(xiàn)淺紫—深紫—深紅—橙紅—酒紅，顏色穩(wěn)定不變。繼續(xù)加熱10min，冷卻至室溫，補(bǔ)充去離子水至100ml。經(jīng)一次性滅菌過濾器過濾，裝入潔凈玻璃瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)膠體金的鑒定用紫外可見分光光度計(jì)在400-700nm處進(jìn)行掃描，在520nm處具有最大吸收峰。
(3)cTnI多克隆抗體(PcAb)膠體金標(biāo)記最佳pH值的選定(a)取7支試管，每管各加入上述制備的膠體金溶液2ml。用0.1mol/L的碳酸鉀溶液將其pH值分別調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。
(b)將上述不同pH值的膠體金溶液分別各取1ml分別轉(zhuǎn)移至另外的7支試管中，每管加入10μg純化的cTnI PcAb，混合均勻，室溫反應(yīng)10min后加入10％的氯化鈉溶液100μl，靜置2h，觀察溶液顏色變化。
(c)然后，12000rpm離心10min，去掉上清，加入含1％BSA的PBS溶解沉淀，觀察各管底部膠體金的顏色和溶解情況。以沉淀完全溶解呈均勻的透明紫紅色溶液管的pH值為最佳pH值。最佳pH值為8.0。
(4)cTnI-PcAb膠體金標(biāo)記最佳蛋白濃度的選擇(a)用0.1mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.0的最佳值，在6支試管中各加入1ml膠體金溶液。然后，分別加入1μg、2.5μg、5.0g、7.5μg、10μg、15μg純化的PcAb，反應(yīng)10min后，各管加入10％氯化鈉溶液100μl，靜置2h，觀察各管顏色變化。
(b)然后，12000rpm離心20min，去掉上清，加入含1％BSA的PBS溶解沉淀，觀察各管底部膠體金的顏色和溶解情況，以沉淀完全溶解成均勻的紫紅色溶液管的最低蛋白濃度加其20％為最佳蛋白濃度。
(5)cTnI-PcAb的膠體金標(biāo)記(a)將100ml制備好的膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié)到8.0，從中取1ml加入純化的cTnIPcAb 6μg混勻，室溫反應(yīng)10min，2000rpm，4℃，離心20min，去掉沉淀。上清液12000rpm，4℃，離心20min，棄上清。
(b)沉淀分別溶于100μl、200μ1、300μl、400μl含0.2％BSA的0.01mol/L pH8.0的PBS溶液，即制備成10％、5％、3％、2.5％濃縮的膠體金標(biāo)記物。
(c)將玻璃纖維浸泡在不同濃縮度的膠體金標(biāo)記的抗體溶液中，充分浸泡30min后取出。室溫干燥18h以上，塑料袋密封，4℃冰箱保存。
(6)抗體在硝酸纖維素膜上的包被(a)將純化的cTnI-PcAb用0.01mol/L含0.14M氯化鈉的PBS(pH7.2)稀釋至濃度為3.5mg/ml，3.0mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5 mg/ml各1ml。用微量注射器分別吸取5μl，分別在硝酸纖維素膜(NCM)上劃線，線寬1mm，噴涂量為0.4μg/mm2，使抗體包被在NCM上，以捕捉樣品中的抗原。
(b)在離抗體劃線4mm處用濃度為3mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml的羊抗兔IgG的多克隆抗體另劃一條線，噴涂量為0.8μg/mm2以捕捉膠體金標(biāo)記的PcAb，作為試紙條的質(zhì)量控制線。
(c)半小時(shí)晾干后完全浸泡于含1％牛血清白蛋白(BSA)的pH7.2的PBS溶液中，以封閉纖維素膜的殘余吸附能力，4℃冰箱過夜。次日取出封閉的纖維素膜，用PBS洗滌3次，每次將纖維素膜浸泡5min，洗滌后的纖維素膜置于室溫中干燥3h以上，再放于30℃通風(fēng)干燥箱內(nèi)通風(fēng)干燥1h，密封于塑料袋中，保存于4℃冰箱備用。
(7).人cTnI膠體金免疫檢測卡的組裝、切割免疫層析分析試紙條切割尺寸樣品墊(2cm×0.5cm)吸收墊(1.7cm×0.5cm)玻璃纖維結(jié)合墊(1cm×0.5cm)白色聚苯乙烯塑料墊板PVC(6cm×0.5cm)粘合膠條(2cm×0.5cm)NCM(2.5cm×0.5cm)取切割好的PVC板一塊，將包被有cTnI PcAb和羊抗兔IgG的硝酸纖維素膜沿PVC板長徑粘貼于PVC板中央，將吸收墊(引水纖維)貼于靠近包被有羊抗兔IgG的多克隆抗體的一端，并與硝酸纖維素膜密切接觸，約重疊2mm。將含有膠體金標(biāo)記抗體的玻璃纖維(寬0.5mm)貼于NCM膜下方與之相接觸重疊。將樣品墊貼于PVC板上，與結(jié)合墊相重疊約2mm。組裝成0.5×6cm的膠體金免疫檢測卡(具體見附圖3)。
實(shí)施例5膠體金免疫檢測卡質(zhì)量鑒定(1)檢測結(jié)果判斷按檢測卡操作方法，在室溫條件下(15-30℃)，檢測以正常人陰性血清配制的cTnI合成肽純品標(biāo)準(zhǔn)溶液，上樣10-15min，5ng/ml的cTnI合成肽純品即可被檢出，5ng/ml以下的cTnI標(biāo)準(zhǔn)品則不出現(xiàn)檢測帶，即為陰性結(jié)果。因此我們把觀察結(jié)果的最佳時(shí)間定為上樣后15min。檢測靈敏度為5ng/ml，而高cTnI含量的樣品，當(dāng)其滲過檢測區(qū)時(shí)，即可看見檢測線出現(xiàn)，而不必等到15min。
檢測結(jié)果可能有三種情形1.在檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)各出現(xiàn)一條紫紅色的條帶，表示檢測結(jié)果為陽性。2.只在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色的條帶，表示檢測結(jié)果為陰性。3.在檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)均無紫紅色條帶出現(xiàn)，表示檢測試紙條失效。(具體見附圖4)(2)檢測范圍的測定檢測以正常人陰性血清配制的cTnI合成肽純品標(biāo)準(zhǔn)溶液，5ng/ml以下的cTnI合成肽純品不能被檢出，對5ng/ml到1μg/ml cTnI合成肽純品其檢測帶的顏色，呈現(xiàn)肉眼可見的由淺到深紫紅色變化，對濃度＞1μg/ml cTnI樣品其檢測線顏色肉眼判斷無差別。故該試紙條半定量檢測血清cTnI的適用范圍為5ng/ml-1μg/ml，(3)特異性的檢測在檢測樣本中加入幾種相關(guān)的蛋白質(zhì)cTnT、CK-MB對檢測結(jié)果無交叉反應(yīng)。
(4)反應(yīng)溫度的測定在4℃條件下操作，上樣后18min觀察結(jié)果，5ng/ml cTnI標(biāo)準(zhǔn)品的檢測線不出現(xiàn)，將觀察時(shí)間延長到20min，檢測線才出現(xiàn)，故4℃條件下操作，應(yīng)在上樣后20min時(shí)觀察結(jié)果。
(5)保存時(shí)間37℃保存的試紙條第2、3、4和5天檢測結(jié)果與第1天檢測結(jié)果相同，檢測線和控制線的顏色深淺在正常范圍內(nèi)。從第6天起，檢測線和質(zhì)控線的顏色均變淺，但仍在正常范圍內(nèi)，故37℃至少可保存5天。4℃保存的試紙條，至第12周其檢測結(jié)果仍在正常范圍內(nèi)，故該檢測試紙條在4℃至少可保存12周。
(6)檢測結(jié)果保存時(shí)間檢測過的試紙條放室溫干燥，等完全干燥后重新判斷一次結(jié)果，與15min時(shí)判斷的結(jié)果一致。干燥后的試紙條4℃保存12周，檢測結(jié)果無變化，故檢測結(jié)果至少可保存12周。
實(shí)施例6膠體金免疫檢測卡使用方法(1)檢測時(shí)，將標(biāo)有“marker”字樣的一端插入待測樣本中，等混合有膠體金的樣品出現(xiàn)在NCM上時(shí)，將試紙條取出，放在干凈、水平的臺面上，觀察結(jié)果。
(2)靈敏度測試將cTnI合成肽純品濃度為1.0mg/ml的貯備液用健康人血清配制成0ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1μg/ml、5μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，將本實(shí)驗(yàn)制備的試紙條分別插入上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中，5秒后取出，觀察各含量標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)陽性檢測帶，其中最低的cTnI濃度就是分析靈敏度。
(3)測定范圍的確定將cTnI合成肽純品用健康人血清配成10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml和1ng/ml濃度系列。按上述方法用試紙條分別檢測之，觀察檢測線顏色深淺的變化，以確定該試紙條用于半定量檢測時(shí)的適用范圍。
(4)特異性的檢測在檢測樣本中加入幾種相關(guān)的蛋白質(zhì)cTnT、CK-MB觀察檢測結(jié)果有無交叉反應(yīng)。
(5)反應(yīng)溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響在室溫(約25℃)、4℃條件下進(jìn)行檢測操作，觀察不同溫度對檢測結(jié)果的影響。
(6)保存條件和保存時(shí)間的確定將切割好的檢測試紙條分別存放于37℃和4℃，觀察溫度對試紙條的影響。保存于37℃的試紙條每天取出3條分別檢測0ng/ml、5ng/ml、50ng/ml的cTnI合成肽純品，直至第12周。
(7)檢測結(jié)果保存時(shí)間的觀察上述檢測過的試紙條干燥后密封于塑料袋內(nèi)，室溫保存，每周觀察一次結(jié)果，以觀察檢測結(jié)果的保存時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種抗人心肌肌鈣蛋白I合成多肽抗體，其特征在于，該抗體的效價(jià)為1∶200000，親和常數(shù)為0.985×109L/mol；制備該抗體的抗原為合成多肽，其氨基酸序列為人心肌肌鈣蛋白IN端98-110的RQLHARVDKVDEE氨基酸序列。
2.一種抗人心肌肌鈣蛋白I合成多肽抗體的制備方法，其特征在于，以人心肌肌鈣蛋白I氨基酸序列中N端98-110的RQLHARVDKVDEE氨基酸肽段序列作為抗原肽，合成人心肌肌鈣蛋白I抗原肽；純化的抗原肽與血藍(lán)蛋白載體偶聯(lián)合成人工抗原，經(jīng)高效液相層析純化后，免疫動物，制備多肽抗體，經(jīng)檢測抗血清效價(jià)，達(dá)到要求后，收獲抗血清，并經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化而成。
3.如權(quán)利要求1所述的抗人心肌肌鈣蛋白I合成多肽抗體在制備心肌損傷膠體金免疫檢測卡中的應(yīng)用。
4.一種檢測人心肌肌鈣蛋白I的膠體金免疫檢測卡，其特征在于，所述免疫檢測卡它是由樣品墊、含有膠體金標(biāo)記抗體的玻璃纖維、包被有人心肌肌鈣蛋白I多克隆抗體、羊抗兔IgG的硝酸纖維素膜、吸收墊組成。
5.一種檢測人心肌肌鈣蛋白I膠體金免疫檢測卡的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行(1)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，用納米級膠體金顆粒標(biāo)記制備的抗體并將玻璃纖維浸泡在該抗體溶液中；用純化的人心肌肌鈣蛋白I多克隆抗體包被微孔硝酸纖維素膜，使抗體包被在硝酸纖維素膜上，以捕捉樣品中的抗原；用羊抗兔IgG的多克隆抗體另劃一條線，以捕捉膠體金標(biāo)記的多克隆抗體，作為免疫檢測卡的質(zhì)量控制線；(2).晾干后完全浸泡于含1％牛血清白蛋白的pH7.2的磷酸鹽緩沖液中，以封閉纖維素膜的殘余吸附能力，4℃冰箱過夜；(3).取出封閉的纖維素膜，用磷酸鹽緩沖液洗滌，每次將纖維素膜浸泡洗滌，置于室溫中干燥，再放于通風(fēng)干燥箱內(nèi)通風(fēng)干燥，密封于塑料袋中，保存于4℃冰箱備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人心肌肌鈣蛋白I(cTnI)合成多肽抗體及其制備方法與應(yīng)用。其制備方法是以cTnI氨基酸序列中的一段(N端98－110氨基酸)合成多肽，其氨基酸序列RQLHARVDKVDEE，以此作為半抗原與蛋白載體連接后，制備出人工免疫原，對動物進(jìn)行免疫，有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而得到抗體。本發(fā)明制備的cTnI合成多肽抗體可與天然心肌肌鈣蛋白I分子發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用該抗體包被微孔硝酸纖維素膜，用檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金顆粒標(biāo)記該抗體，并結(jié)合層析技術(shù)制備的cTnI膠體金免疫檢測卡，其具有較高的靈敏度和特異性。為急性心肌梗的早期診斷提供了特異、靈敏、簡便、快速的診斷技術(shù)。
文檔編號G01N33/53GK1982337SQ20051012233
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月14日
發(fā)明者張春明, 王德芝, 陳冀瑩, 趙啟仁, 穆傳杰, 秦麗莉, 李玉彬, 胡曉林 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所