專利名稱：一種臨床檢測(cè)試劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種臨床檢測(cè)試劑的制備方法。
背景技術(shù)：
目前，在細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法中，凝膠法的鱟試劑只能半定量樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素；比濁定量法可以定量檢測(cè)藥品中的細(xì)菌內(nèi)毒素，但在檢驗(yàn)有色藥品和臨床血液及各種體液標(biāo)本中細(xì)菌內(nèi)毒素時(shí)，由于這些標(biāo)本中含有干擾物質(zhì)，使標(biāo)本含有顏色或濁度而影響了比濁定量法的測(cè)定。因此，原有的鱟試劑不能用于臨床檢驗(yàn)各種血液、體液標(biāo)本中細(xì)菌內(nèi)毒素及有色藥品發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種臨床檢測(cè)試劑的制備方法，其成品可用于更精密、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素。
本發(fā)明所述的一種臨床檢測(cè)試劑的制備方法的特征在于，所述的臨床檢測(cè)試劑按以下步驟配制(1)活鱟加抗凝劑采血后，離心，棄上清液，收集細(xì)胞，再加洗滌液洗滌，棄去上清液；(2)收集的細(xì)胞加崩解液進(jìn)行細(xì)胞崩解，之后進(jìn)行離心，收集提取液；(3)提取液進(jìn)行親和層析柱，用不同鹽濃度的洗脫液洗柱，收集洗脫液；(4)對(duì)洗脫液進(jìn)行鑒別后，將相同成分的洗脫液進(jìn)行合并，用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行低溫濃縮；(5)濃縮液重新復(fù)溶，進(jìn)行脫鹽，并收集不含鹽的洗脫液；(6)將不含鹽的洗脫液加入0.2～1.0mg/mL蛋白酶保護(hù)劑(人血白蛋白)8～12ml，再進(jìn)行低溫濃縮；(7)將濃縮液重新溶解后，按1∶15～20的比例加入0.9～1.6mg/ml Boc-LGR-pNA發(fā)色物質(zhì)，再按1∶10～18的比例加入0.2～1.0mg/ml蛋白酶保護(hù)劑，混合均勻后，進(jìn)行分裝、凍干、封口，即得成品臨床檢測(cè)試劑。
其中，洗滌液組成為NaCl 1.0～4.0mol/L和Tris-HCl 0.01～0.2mol/L pH 7.5～8.0，崩解液組成為NaCl 0.02～0.15mol/L和Tris-HCl 0.01～0.025mol/L pH7.5～8.0，洗脫液組成為NaCl 0.01～2.1mol/L和Tris-HCl 0.01～0.025mol/L pH7.5～8.0。
臨床檢測(cè)試劑與緩沖液、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品及重氮化試劑構(gòu)成可用于檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的臨床檢測(cè)試劑盒，其中緩沖液為0.05～0.1mol/L pH7.8～8.0 Tris-HCl溶液。其檢測(cè)方法為取標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素或其他樣品，加入臨床檢測(cè)試劑，混合均勻后，在37℃下恒溫30min后，加入重氮化試劑進(jìn)行重氮化，于545nm處測(cè)定。按標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中內(nèi)毒素的含量。其中，重氮化試劑組成為0.02～0.08％亞硝酸鈉、0.15～0.5％氨基磺酸、0.03～0.15％萘基鹽酸二氨基乙烯、0.35～0.8mol/L鹽酸溶液及無(wú)熱原水。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于制成的臨床檢測(cè)試劑與其它試劑構(gòu)成的臨床檢測(cè)試劑盒能定量檢測(cè)人體血液及體液標(biāo)本中微量細(xì)菌內(nèi)毒素，診斷出敗血癥、膽囊炎、肺炎、腎炎等革蘭氏陰性細(xì)菌感染者血液中革蘭氏陰性感染疾病，并可監(jiān)測(cè)肝病嚴(yán)重性及愈后情況。
具體實(shí)施例方式
活鱟加抗凝劑采血后，于1000rpm下離心，棄上清液，收集細(xì)胞，再加入含NaCl3mol/L和Tris-HCl 0.05mol/L pH8.0的洗滌液洗滌，棄去上清液；收集的細(xì)胞加入含有NaCl 0.1mol/L和Tris-HCl 0.02mol/L pH8.0的崩解液進(jìn)行細(xì)胞崩解，之后進(jìn)行離心，收集提取液；提取液進(jìn)行親和層析柱，用不同鹽濃度的NaCl和Tris-HCl洗脫液洗柱，收集洗脫液；對(duì)洗脫液進(jìn)行鑒別后，將相同成分的洗脫液進(jìn)行合并，用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行低溫濃縮；濃縮液重新復(fù)溶，進(jìn)行脫鹽，并收集不含鹽的洗脫液；將不含鹽的洗脫液加入0.5mg/mL蛋白酶保護(hù)劑(人血白蛋白)10ml，再進(jìn)行低溫濃縮；將濃縮液重新溶解后，加入1.0mg/mlBoc-LGR-pNA發(fā)色物質(zhì)4ml、0.5mg/ml蛋白酶保護(hù)劑10ml，混合均勻后，進(jìn)行分裝、凍干、封口，即得成品臨床檢測(cè)試劑。
處理檢品或按藥典規(guī)定稀釋內(nèi)毒素，分裝至10×75mm的小試管中，每管200μl；將0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl溶液按臨床檢測(cè)試劑標(biāo)示量加入臨床檢測(cè)試劑中，用滅菌錫箔紙蓋上，并用手輕輕搖動(dòng)溶解后放入冰水浴中冷卻；接著將臨床檢測(cè)試劑分裝于前面裝有處理過(guò)檢品的小試管中，每支200μl，并置于漩渦混合器中振動(dòng)混勻，以水作為空白對(duì)照，于37℃下恒溫水浴30min；再將小試管從恒溫水浴中移至冰水浴中，加入重氮化試劑(分別加入配制好的0.04％亞硝酸鈉溶液200μl，0.3％氨基磺酸銨溶液200μl，0.07％萘基鹽酸二氨基乙烯溶液200μl)，并在漩渦混合器上混合，進(jìn)行反應(yīng)后，在545nm處測(cè)定吸光度；最后，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算檢品的內(nèi)毒素含量。
本發(fā)明為臨床診斷革蘭氏陰性細(xì)菌感染提供了一種更精密、準(zhǔn)確、快速的新方法，具有較大的推廣應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種臨床檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于所述的臨床檢測(cè)試劑按以下步驟配制(1)活鱟加抗凝劑采血后，離心，棄上清液，收集細(xì)胞，再加洗滌液洗滌，棄去上清液；(2)收集的細(xì)胞加崩解液進(jìn)行細(xì)胞崩解，之后進(jìn)行離心，收集提取液；(3)提取液進(jìn)行親和層析柱，用不同鹽濃度的洗脫液洗柱，收集洗脫液；(4)對(duì)洗脫液進(jìn)行鑒別后，將相同成分的洗脫液進(jìn)行合并，用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行低溫濃縮；(5)濃縮液重新復(fù)溶，進(jìn)行脫鹽，并收集不含鹽的洗脫液；(6)按1∶10～18的比例，在不含鹽的洗脫液中加入0.2～1.0mg/mL蛋白酶保護(hù)劑，再進(jìn)行低溫濃縮；(7)將濃縮液重新溶解后，按1∶15～20的比例加入0.9～1.6mg/ml Boc-LGR-pNA發(fā)色物質(zhì)，再按1∶10～18的比例加入0.2～1.0mg/ml蛋白酶保護(hù)劑，混合均勻后，進(jìn)行分裝、凍干、封口，即得臨床檢測(cè)試劑成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臨床檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于所述的洗滌液組成為NaCl 1.0～4.0mol/L和Tris-HCl 0.01～0.2mol/L pH 7.5～8.0，崩解液組成為NaCl 0.02～0.15mol/L和Tris-HCl 0.01～0.025mol/L pH 7.5～8.0，洗脫液組成為NaCl 0.01～2.1mol/L和Tris-HCl 0.01～0.025mol/L pH 7.5～8.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臨床檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于所制得的臨床檢測(cè)試劑檢測(cè)內(nèi)毒素的方法為取標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素或其他樣品，加入臨床檢測(cè)試劑，混合均勻后，在37℃下恒溫30min后，加入重氮化試劑進(jìn)行重氮化，于545nm處測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中內(nèi)毒素的含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種臨床檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于所述的重氮化試劑組成為0.02～0.08％亞硝酸鈉、0.15～0.5％氨基磺酸、0.03～0.15％萘基鹽酸二氨基乙烯、0.35～0.8mol/L鹽酸溶液及無(wú)熱原水。
全文摘要
一種臨床檢測(cè)試劑的制備方法，是將活鱟加抗凝血?jiǎng)┎裳?，收集鱟細(xì)胞，將細(xì)胞崩解后進(jìn)行親和層析柱，收集不同鹽濃度的洗脫液，鑒別后將相同成分的洗脫液進(jìn)行合并、低溫濃縮，復(fù)溶后脫鹽，加保護(hù)劑低溫濃縮，再溶解，混入發(fā)色物質(zhì)和保護(hù)劑，最后分裝、凍干、封口，即得臨床檢測(cè)試劑。臨床檢測(cè)試劑與Tris－HCl緩沖液及重氮化試劑組成臨床檢測(cè)試劑盒，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是能夠定量地檢測(cè)人體血液及體液標(biāo)本中微量細(xì)菌內(nèi)毒素，診斷出革蘭氏陰性細(xì)菌感染者血液中的革蘭氏陰性感染疾病，并可監(jiān)測(cè)肝病嚴(yán)重性及愈后情況，為臨床診斷革蘭氏陰性細(xì)菌感染提供了一種更精密、準(zhǔn)確、快速的新方法，具有較大的推廣應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1632580SQ200510200028
公開日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2005年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月13日
發(fā)明者丁友玲 申請(qǐng)人:丁友玲