專利名稱：彩色多形式hcg測(cè)試試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，具體是涉及一種彩色多形式HCG測(cè)試試紙條。
背景技術(shù)：
成熟女性因受精的卵子移動(dòng)到子宮腔內(nèi)著床后，形成胚胎，在發(fā)育成長(zhǎng)為胎兒過程中，胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生大量的人絨毛膜促性腺激素(HCG)，可通過孕婦血液循環(huán)而排泄到尿中。HCG在受孕后10～14天開始分泌，35-50天可升至大于2500IU/L，60～70天達(dá)到分泌高峰8萬萬IU/L，是早期妊娠的靈敏指標(biāo)。與此同時(shí)，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們?cè)絹碓蕉嗟匕l(fā)現(xiàn)HCG的含量與許多腫瘤性疾病有著密切聯(lián)系，如絨毛膜上皮癌以及生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤發(fā)生時(shí)，尿中會(huì)出現(xiàn)異常HCG。另外一些非正常妊娠，如宮外孕，葡萄胎等也會(huì)導(dǎo)致尿中HCG異常。因此HCG在尿中濃度的準(zhǔn)確檢測(cè)，不僅可用作早孕診斷，還可作為一種腫瘤性疾病的輔助檢測(cè)方法。目前在我國(guó)復(fù)雜自動(dòng)化儀器及其配套試劑落后于國(guó)外的情況下，研制生產(chǎn)特異簡(jiǎn)便、快速的HCG檢測(cè)產(chǎn)品對(duì)早期妊娠、病理妊娠職宮外孕及胎盤滋養(yǎng)層疾病的診斷、鑒別、治療及追蹤觀察等均有著廣泛的應(yīng)用前景及廣闊的發(fā)展空間。
HCG異常的診斷主要以檢測(cè)尿液中的HCG為標(biāo)準(zhǔn)，其檢查方法以免疫法為主。目前國(guó)內(nèi)外的檢測(cè)方法主要包括膠乳或血凝抑制試驗(yàn)、放射免疫、酶免疫、膠體金法等。這幾種方法相比較有以下一些特點(diǎn)。
膠乳凝集抑制試驗(yàn)(latex agglutination inhibitiontest，LAIT)和血細(xì)胞的血凝抑制試驗(yàn)(hemoagglutination inhibition test，HAIT)這兩種試驗(yàn)方便簡(jiǎn)便，靈敏度為100-500mU/ml，適合大批標(biāo)本檢查，但因特異性差，不能定量，已逐漸被取代。
放射免疫試驗(yàn)(RIA)需一定設(shè)備，試驗(yàn)手續(xù)煩瑣，且有核素污染問題，不適用于臨床常規(guī)應(yīng)用。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)操作程序較復(fù)雜，易造成假陽(yáng)性和假陰性，并易造成操作者受害和環(huán)境污染，試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，需要兩個(gè)小時(shí)以上才能得出檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)必須具備酶標(biāo)儀和洗板機(jī)，這在基層實(shí)驗(yàn)室和小型門診較難達(dá)到，且試驗(yàn)受溫度等條件限制，給檢測(cè)帶來不便。
而免疫金標(biāo)法技術(shù)(Immunochromatography Assay)是九十年代初發(fā)展起來的，因其快速、操作簡(jiǎn)便、試劑穩(wěn)定、可室溫儲(chǔ)運(yùn)、不易污染的特點(diǎn)得到廣泛的應(yīng)用。它是免疫親和技術(shù)、印跡技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)和層析技術(shù)的組合。將包被抗體，膠體金標(biāo)記抗體固相化，與樣本吸附材料等組合在一起，制備為免疫層析診斷試條/板，使用時(shí)只需要把試紙條下插入樣本溶液，數(shù)分鐘就可以判斷結(jié)果。與免疫滲濾法比較，穩(wěn)定性好，操作更簡(jiǎn)便、快速，且由于為干試條/試板形式，無需低溫保存，儲(chǔ)運(yùn)方便。
目前，已有的利用免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)HCG的產(chǎn)品具有以下缺點(diǎn)1.采用4條帶顯色的方法，對(duì)于高濃度的樣品特異性較差。
2.顯帶顏色和形式單一。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是提供一種彩色多形式HCG測(cè)試試紙條，其采用兩條帶顯色的膠體金層析法制備，顯帶顏色豐富(紅，蘭，黑、紫等)，形式多樣(條型，加號(hào)形，圓點(diǎn)形，梅花形等)，因而其能更加準(zhǔn)確檢測(cè)出尿液中HCG的含量且能滿足不同人群的需求，更加廣泛的應(yīng)用于家庭和個(gè)人的自檢。
本實(shí)用新型所述的彩色多形式HCG測(cè)試試紙條，是在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜、包被膜以及吸水紙而形成，包被膜有檢測(cè)線和控制線，檢測(cè)線包被HCG抗體，控制線包被抗鼠抗體；所述檢測(cè)線和控制線的顯色顏色具有多樣性，是通過控制膠體金顆粒的大小，得到不同顏色的膠體金顆粒，或者采用不同顏色的乳膠微粒；所述檢測(cè)線和控制線的顯色形式具有多樣性，是通過調(diào)節(jié)生產(chǎn)工藝中噴膜機(jī)的設(shè)置程序，噴制為條形、菱形、圓形、梅花形、十字形多種不同形狀的條帶。
所述膠乳微?？梢詮膰?guó)外如magsphere等公司購(gòu)買。
所述包被的HCG抗體為高純度的抗單克隆抗體和/或多克隆抗體，所述彩色膠體金顆粒或者彩色膠乳顆粒上標(biāo)記抗β-HCG單克隆抗體。
本實(shí)用新型所述的彩色多形式HCG測(cè)試試紙條的制備方法，包括以下步驟A.包被膜的制備檢測(cè)線調(diào)試噴膜機(jī)，噴液量為20微升/35厘米，用包被緩沖液稀釋HCG單克隆抗體，濃度為80μg/ml，機(jī)器劃線，室溫涼干20分鐘；控制線調(diào)試噴膜機(jī)，噴液量為20微升/35厘米，用包被緩沖液稀釋抗鼠IgG多克隆抗體，濃度為2mg/ml，機(jī)器劃線，兩線間隔5mm，應(yīng)細(xì)致均勻，室溫涼干二十分鐘。37℃封閉60分鐘，取出后置37℃烘干處理兩小時(shí)，封袋備用；B.金標(biāo)抗體的制備用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金pH值至7.5，按10微克抗體/毫升膠體金加入抗β-HCG單克隆抗體，混勻，靜置30分鐘，13000rpm離心三十分鐘，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上清，將沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標(biāo)抗體保存液溶解，置4℃?zhèn)溆茫谝恢?；C.將制備好的金標(biāo)抗體涂覆在玻璃纖維膜或聚酯膜上；所述涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜可以用普通方法將金標(biāo)抗原涂覆在玻璃纖維膜上，也可以通過下述方法得到將標(biāo)記好的膠體金均勻地鋪在玻璃纖維膜上，每毫升溶液鋪10平方厘米，冷凍干燥，封袋，置4℃?zhèn)溆谩?br> D.在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆金標(biāo)抗原的玻璃纖維膜、包被膜以及吸水紙，得到試紙板，按照要求切割成不同寬度的試紙條。
所述包被緩沖液和封閉液的配方及制備方法是本領(lǐng)域通用的技術(shù)。
本實(shí)用新型采用雙抗體夾心法，可用來檢測(cè)女性尿液樣本。與現(xiàn)有檢測(cè)試劑盒比較，由于對(duì)金標(biāo)抗體進(jìn)行特殊的處理，使其能夠產(chǎn)生多種的顏色；同時(shí)對(duì)檢測(cè)線(T線)和控制線(C線)進(jìn)行了特殊的處理，使其能夠產(chǎn)生各種檢測(cè)形式，如條形、圓形、加號(hào)形，梅花形等。所述檢測(cè)線和控制線是通過調(diào)節(jié)生產(chǎn)工藝中噴膜機(jī)的設(shè)置程序，噴制成不同形狀的條帶，從而滿足不同人、不同年齡層對(duì)檢測(cè)形式多樣性的需求。
本實(shí)用新型利用現(xiàn)代國(guó)際最先進(jìn)的膠體金及膠乳免疫層析技術(shù)，提供一種用于醫(yī)院或個(gè)人家庭自測(cè)等檢測(cè)早早孕的快速診斷試劑。該試劑具有高度特異性、靈敏度、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，特別是顯帶顏色豐富，形式多樣的特點(diǎn)。且不需使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作簡(jiǎn)便，能廣泛應(yīng)用于醫(yī)院、家庭及個(gè)人對(duì)于HCG的檢測(cè)。該試紙條可以直接使用，也可以裝配在塑料裝置中以檢測(cè)板、檢測(cè)筆形式使用。


圖1為本實(shí)用新型所述試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為檢測(cè)結(jié)果示意圖。
圖3為檢測(cè)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型所述的彩色多形式HCG測(cè)試試紙條，如圖1所示，該試紙條是在底襯1上順次相互搭接地粘貼樣品墊2、涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜3、包被膜4以及吸水紙5而形成，包被膜4有檢測(cè)線6和控制線7，檢測(cè)線6包被HCG抗體，控制線7包被抗鼠抗體；所述檢測(cè)線6和控制線7的顯色顏色具有多樣性，是通過控制膠體金顆粒的大小，得到不同顏色的膠體金顆粒，或者采用不同顏色的乳膠微粒；所述檢測(cè)線6和控制線7的顯色形式具有多樣性，是通過調(diào)節(jié)生產(chǎn)工藝中噴膜機(jī)的設(shè)置程序，噴制為條形、菱形、圓形、梅花形、十字形多種不同形狀的條帶。
制造方法如下A抗原制備采用高純度的抗β-HCG單克隆抗體作為包被抗原。
B抗原膜的制備包被緩沖液的制備0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液為包被溶液，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆?，效期一周?br> 封閉液的配制配制0.01M pH7.0磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆?，效期一周。配制封閉工作液2％BSA，2％脫脂奶，0.01M pH7.0PBS，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆?，效期三天?br> 檢測(cè)線制備調(diào)試噴膜機(jī)，噴液量為20微升/35厘米，用包被緩沖液稀釋HCG單克隆抗體，濃度為80μg/ml，機(jī)器劃線，室溫涼干二十分鐘。
控制線制備調(diào)試噴膜機(jī)，噴液量為20微升/35厘米，用包被緩沖液稀釋抗鼠IgG多克隆抗體，濃度為2mg/ml，機(jī)器劃線，兩線間隔5mm，應(yīng)細(xì)致均勻，室溫涼干二十分鐘。37℃封閉60分鐘，取出后置37℃烘干處理兩小時(shí)，封袋備用。
C標(biāo)抗體的制造規(guī)程氯金酸的配制用雙蒸水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃?zhèn)溆?，效期三天?000ml 1％氯金酸溶液配方10g氯金酸；1000ml雙蒸水。
檸檬酸三鈉的配制用雙蒸水溶解檸檬酸三鈉，配成1％溶液，置4℃?zhèn)溆?，效期三天?br> 1000ml 1％檸檬酸三鈉溶液配方10g檸檬酸三鈉；1000ml雙蒸水。
0.1M碳酸鉀的配制用雙蒸水配制，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆?，效期一周?000ml 0.1M碳酸鉀溶液配方13.8g碳酸鉀；1000ml雙蒸水。
3％PEG-20000的配制用雙蒸水配制，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆茫谝恢堋?000ml 3％PEG溶液配方30g PEG-20000；1000ml雙蒸水。
標(biāo)記洗滌液的配制2％BSA，0.01M pH7.0PBS溶液，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆?，效期兩周?000ml標(biāo)記洗滌液配方20gBSA；1000ml0.01M pH7.0PBS溶液。
金標(biāo)抗體保存液的配制1％BSA，0.5％脫脂奶，5/萬NaN3，0.1％Tween-20，0.01MpH7.0 PBS溶液，0.22μ膜濾過，置4℃?zhèn)溆?，效期十五天?000ml金標(biāo)抗體保存液配方10g BSA；5g脫脂奶；0.5gNaN3；1ml Tween-20；1000ml0.01M pH7.0PBS溶液。
膠體金的燒制用雙蒸水將1％氯金酸稀釋成0.01％，置電爐煮沸，按每100毫升0.01％氯金酸加入4毫升1％檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。外觀應(yīng)純凈，透亮，無沉淀和漂浮物。
金標(biāo)抗體的制備用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金pH值至7.5，按10微克抗體/毫升膠體金加入抗β-HCG單克隆抗體，混勻，靜置30分鐘，13000rpm離心三十分鐘，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上清，將沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標(biāo)抗體保存液溶解，置4℃?zhèn)溆茫谝恢堋?br> D金標(biāo)抗體的干燥將標(biāo)記好的膠體金均勻地鋪在玻璃纖維膜上，每毫升溶液鋪10平方厘米，干燥，封袋，置4℃?zhèn)溆谩?br> E金標(biāo)抗體包被的玻璃纖維膜寬度的確定將膠體金玻璃纖維膜裁成4毫米、5毫米、6毫米規(guī)格，與包被膜組成測(cè)試條，每條寬4毫米。選擇能檢出室內(nèi)質(zhì)控樣本，無非特異性反應(yīng)的金標(biāo)玻璃纖維膜寬度定為使用寬度。
F金標(biāo)抗體玻璃纖維膜的裁切根據(jù)滴配實(shí)驗(yàn)確定的寬度，將金標(biāo)抗體玻璃纖維膜進(jìn)行裁切，置干燥房間備用。
G吸水紙的裁切用裁紙機(jī)將吸水紙切成35厘米長(zhǎng)，4.2厘米寬，置干燥房間備用。
H玻璃纖維膜的裁切將玻璃纖維膜切成長(zhǎng)35厘米，寬2厘米的長(zhǎng)條，置干燥房間備用。
I大板的粘貼按要求把包被膜、吸水紙、凍干金標(biāo)抗體、玻璃纖維膜粘貼在塑料底板上，組成大板。組裝車間溫度控制在25℃，濕度20％-30％。
J切條用切條機(jī)將大板切成單個(gè)人份，每人份寬度3毫米，隨機(jī)抽檢，靈敏度能檢出室內(nèi)質(zhì)控，條帶顯色程度達(dá)到一個(gè)“+”號(hào)，無非特異性條帶，能夠通過衛(wèi)生部Panel。
K封裝與組盒將100人份已切好的試紙條與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內(nèi)，放入試劑盒，每盒一份說明書。于4-30℃避光保存，不得凍存。
本實(shí)用新型所述的彩色多形式HCG測(cè)試試紙條，采用高純度的抗β-HCG單克隆抗體作為包被抗原進(jìn)行特異的HCG檢查。其原理是試紙條中含均勻分布的膠體金標(biāo)記β-HCG單克隆抗體，抗β-HCG抗體及抗鼠IgG抗體分別固定于硝酰膜上并呈兩條線上下排列，抗鼠IgG抗體在上方為陰性對(duì)照，抗α-HCG抗體在下方為檢測(cè)線。當(dāng)被檢尿樣中含有HCG抗原時(shí)，β-HCG先和金標(biāo)記的β-HCG抗體進(jìn)行特異性吸附，形成Ag-Abβ復(fù)合物。由于微孔濾膜的毛細(xì)管作用和層析作用，反應(yīng)復(fù)合物沿硝酰膜向前移動(dòng)，待行至抗α-HCG抗體線時(shí)，形成Abα-Ag-Abβ-Au復(fù)合物而富集在包被線上，最終形成一條紅色沉淀線，是為HCG陽(yáng)性反應(yīng)。而試紙條上無關(guān)的金標(biāo)記鼠IgG隨尿液繼續(xù)上行至抗鼠IgG抗體處，與之形成紅色標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物是為陰性對(duì)照。
用于檢測(cè)時(shí)，觀察檢測(cè)線6和控制線7的顯色和形狀來判斷陽(yáng)性還是陰性。如圖2(a1)所示，當(dāng)檢測(cè)線6和控制線7均顯色時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性；如圖2(a2)所示，當(dāng)控制線7顯色而檢測(cè)線6不顯色時(shí)，結(jié)果為陰性。
所述檢測(cè)線6和控制線7的顯色形式具有多樣性，是通過調(diào)節(jié)生產(chǎn)工藝中噴膜機(jī)的設(shè)置程序，噴制為條形、圓形、梅花形、十字形多種不同形狀的條帶。如圖2(a1)和圖2(a2)所示，檢測(cè)線6和控制線7的顯色為條形；如圖2(b1)和圖2(b2)所示，檢測(cè)線6和控制線7的顯色為菱形、圓形、梅花形。
如圖3(a)所示，出現(xiàn)十字形條帶，即檢測(cè)線6和控制線7交叉為十字形，結(jié)果為陽(yáng)性；如圖3(b)所示，只在控制線7顯示條形帶的，結(jié)果為陰性。
權(quán)利要求1.彩色多形式HCG測(cè)試試紙條，其特征在于該試紙條是在底襯(1)上順次相互搭接地粘貼樣品墊(2)、涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜(3)、包被膜(4)以及吸水紙(5)而形成，包被膜(4)有檢測(cè)線(6)和控制線(7)，檢測(cè)線(6)包被HCG抗體，控制線(7)包被抗鼠抗體；所述檢測(cè)線(6)和控制線(7)的顯色顏色具有多樣性，是通過控制膠體金顆粒的大小，得到不同顏色的膠體金顆粒，或者采用不同顏色的乳膠微粒；所述檢測(cè)線(6)和控制線(7)的顯色形式具有多樣性，是通過調(diào)節(jié)生產(chǎn)工藝中噴膜機(jī)的設(shè)置程序，噴制為條形、菱形、圓形、梅花形、十字形多種不同形狀的條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的彩色多形式HCG測(cè)試試紙條，其特征在于所述包被的HCG抗體為高純度的抗單克隆抗體和/或多克隆抗體，所述彩色膠體金顆?；蛘卟噬z乳顆粒上標(biāo)記抗β-HCG單克隆抗體。
專利摘要本實(shí)用新型屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體是涉及一種彩色多形式HCG測(cè)試試紙條。所述的試紙條是在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜、包被膜以及吸水紙而形成，包被膜有檢測(cè)線和控制線，檢測(cè)線包被HCG抗體，控制線包被抗鼠抗體；所述檢測(cè)線和控制線的顯色顏色具有多樣性，是通過控制膠體金顆粒的大小，得到不同顏色的膠體金顆粒，或者采用不同顏色的乳膠微粒；所述檢測(cè)線和控制線的顯色形式具有多樣性，是通過調(diào)節(jié)生產(chǎn)工藝中噴膜機(jī)的設(shè)置程序，噴制為條形、菱形、圓形、梅花形、十字形多種不同形狀的條帶。本實(shí)用新型顯帶顏色豐富，形式多樣，因而其能更加準(zhǔn)確檢測(cè)出尿液中HCG的含量且能滿足不同人群的需求，更加廣泛的應(yīng)用于家庭和個(gè)人的自檢。
文檔編號(hào)G01N33/52GK2779402SQ200520056329
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月30日
發(fā)明者王繼華 申請(qǐng)人:王繼華