專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞毒性測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞毒性相關(guān)酶的切割來(lái)檢測(cè)CTL活性的方法。
背景技術(shù)：
30多年來(lái)，51Cr釋放測(cè)定法是測(cè)量免疫應(yīng)答期間CTL活性的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，該測(cè)定法有許多技術(shù)局限，并且最近的數(shù)據(jù)對(duì)于51Cr釋放測(cè)定法的生理學(xué)相關(guān)性和它是否是針對(duì)體內(nèi)靶細(xì)胞，特別是實(shí)體瘤中靶細(xì)胞測(cè)量的CTL活性的真實(shí)測(cè)量產(chǎn)生了質(zhì)疑。體外CTL測(cè)定法中靶細(xì)胞的裂解可以通過(guò)兩種不同的機(jī)制誘導(dǎo)1)當(dāng)穿孔素簡(jiǎn)單地插入到靶細(xì)胞膜時(shí)介導(dǎo)的細(xì)胞膜破裂；和2)由粒酶B和粒酶A通過(guò)穿孔素進(jìn)入靶細(xì)胞的作用和/或靶細(xì)胞表面的小泡融合事件誘導(dǎo)的DNA斷裂(細(xì)胞凋亡)。51Cr釋放測(cè)定法測(cè)量這兩種讀出的第一種。后一種機(jī)制具有更大生理學(xué)相關(guān)性并且對(duì)于靶細(xì)胞殺死是體內(nèi)所需的。最近的觀察表明通過(guò)51Cr釋放測(cè)定法對(duì)效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞毒性的測(cè)量可能不準(zhǔn)確或者在一些情況中，甚至是不相關(guān)的?；谶@些觀察，研究人員必須認(rèn)識(shí)到基于51Cr釋放測(cè)定法測(cè)定為細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞可能實(shí)際上不是能夠通過(guò)體內(nèi)DNA斷裂殺死腫瘤細(xì)胞的CTL。這可以解釋癌癥免疫治療文獻(xiàn)中的許多結(jié)果，其中體外監(jiān)控的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答可能不與患者中疫苗功效相關(guān)。例如，使用51Cr釋放測(cè)定法通過(guò)產(chǎn)生的陽(yáng)性效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞毒性日期選擇的肽疫苗可能不能準(zhǔn)確地反映通過(guò)DNA斷裂在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL裂解中有活性的實(shí)際表位。此外，在基于51Cr的測(cè)定的使用中存在許多其他問(wèn)題，包括需要使用有害的放射性，和與閃爍計(jì)數(shù)器使用有關(guān)的問(wèn)題。
JAM測(cè)定法是較新的方法，其解決了51Cr-釋放的一些問(wèn)題。盡管它有效測(cè)量DNA斷裂，但是它存在嚴(yán)重的局限，因?yàn)樾枰弥T如3H-胸苷或者125I-脫氧尿苷標(biāo)記靶細(xì)胞的DNA。該方法總是在CTL測(cè)定前導(dǎo)致DNA損傷和靶細(xì)胞的生理改變。此外，3H-胸苷標(biāo)記方法不提供與51Cr相同程度的靈敏性，并且125I是危險(xiǎn)的試劑，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員和實(shí)驗(yàn)室區(qū)域的相當(dāng)大的鉛屏。總之，在CTL攻擊期間測(cè)量靶細(xì)胞中細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)和DNA斷裂的非放射性方法將是更理想的測(cè)定法，特別當(dāng)預(yù)計(jì)該方法用于臨床試驗(yàn)監(jiān)控時(shí)。
用熒光天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶底物檢測(cè)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶切割也已經(jīng)用于證明細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性(Liu，等人，Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicityusing cell-permeable fluorogenic caspase substrates.Nature Medicine，Jan.2003，9(1)4-5.)。此外，已經(jīng)介紹了用于計(jì)數(shù)抗原特異的CD8+T細(xì)胞的其他高度靈敏的方法，如細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色、ELISPOT測(cè)定和用I類(lèi)MHC四聚體對(duì)T細(xì)胞染色。然而，這些測(cè)定法不測(cè)量最終的細(xì)胞溶解功能，其在分析抗腫瘤免疫應(yīng)答中特別重要。缺少提供適宜水平的靈敏性、特異性、安全性和易于使用性的測(cè)定法。本文提供了用于檢測(cè)CTL活性的新的且靈敏的測(cè)定系統(tǒng)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了細(xì)胞毒性測(cè)定法，其檢測(cè)靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞接觸后靶細(xì)胞中DNA斷裂和/或細(xì)胞凋亡相關(guān)的改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，用檢測(cè)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的切割或者組蛋白的磷酸化的一種或多種試劑進(jìn)行測(cè)定。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用單克隆抗體檢測(cè)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的切割。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，用單克隆抗體檢測(cè)組蛋白的磷酸化。在其他實(shí)施方案中，用至少一種單克隆抗體偶聯(lián)流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶和/或磷酸化的組蛋白。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.靶細(xì)胞標(biāo)記染料的穩(wěn)定性和開(kāi)發(fā)用來(lái)使用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3-切割監(jiān)控靶細(xì)胞中CTL活性的門(mén)控(gating)策略。A.DDAO-SE細(xì)胞示蹤染料明亮并且穩(wěn)定地標(biāo)記CTL靶細(xì)胞系。所示為許多常用的懸浮培養(yǎng)的和貼壁細(xì)胞系的染色，這些細(xì)胞系為P815、EL4、T2淋巴瘤、NIH 3T3、4T1乳腺癌和B16F10黑素瘤。將細(xì)胞用DDAO-SE染色并溫育所指出的時(shí)間間隔(0、1、3或15小時(shí))，并通過(guò)FACS分析。顯示了每種細(xì)胞系的平均熒光強(qiáng)度和變異系數(shù)(CV)。顯示了兩個(gè)相似實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)的結(jié)果。B.用于計(jì)數(shù)DDAO-SE標(biāo)記的靶中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3-切割的門(mén)控策略。顯示了具有C57BL/6抗-Balb/e MLR細(xì)胞的DDAO-SE標(biāo)記的P815細(xì)胞的實(shí)例。第一個(gè)圖顯示了對(duì)整個(gè)群體(R1)進(jìn)行門(mén)控時(shí)的FSC相對(duì)于SSC。然后用SSC和FSC相對(duì)于FL4熒光(DDAO-SE陽(yáng)性)分析門(mén)控R1細(xì)胞。如所示的門(mén)控了DDAO-SE陽(yáng)性細(xì)胞(R2和R3)，其中低FSC(死亡)細(xì)胞除外。然后用FL2(PE標(biāo)記的切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3)相對(duì)于FL4(DDAO-SE)分析R2*R3細(xì)胞以測(cè)定細(xì)胞凋亡的靶(R4)的百分?jǐn)?shù)。
圖2.用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法測(cè)量鼠MLR中CTL活性和靶中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割對(duì)CTL的穿孔素和粒酶分泌的依賴(lài)。將C57BL/6抗-Balb/c或Balb/c抗-C57BL/6MLR效應(yīng)細(xì)胞與標(biāo)記的P815靶(A)溫育不同的時(shí)間間隔(0.5、1、2和3小時(shí))，然后如所示的對(duì)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割染色。僅用抗Balb/c MLR效應(yīng)子發(fā)現(xiàn)了天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割。B.將用DDAO-SE標(biāo)記的P815或者EL4靶與C57BL/6抗-Balb/c或Balb/c抗-C57BL/6MLR效應(yīng)子溫育如所示的不同時(shí)間間隔。顯示了天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割的靶細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明該測(cè)定法的特異性，其中MLR效應(yīng)子僅殺死H-2不匹配的靶。結(jié)果代表具有相似結(jié)果的三次實(shí)驗(yàn)。C.刀球骯霉素A——CTL的細(xì)胞溶解顆粒分泌的抑制劑——防止與C57BL/6抗-Balb/c MLR效應(yīng)細(xì)胞溫育的P815靶中的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割。將5天的MLR培養(yǎng)物分離并用首次用于實(shí)驗(yàn)的同基因C57BL/6脾淋巴細(xì)胞以1∶1、1∶3、1∶9稀釋或者不稀釋?zhuān)缢尽⑾♂尩男?yīng)子與經(jīng)標(biāo)記的P815細(xì)胞溫育。對(duì)照是不用MLR細(xì)胞的首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6脾細(xì)胞或者僅標(biāo)記的P815細(xì)胞。3小時(shí)后對(duì)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3-切割將測(cè)定染色。
圖3.天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法和51Cr釋放用于監(jiān)控CTL活性的比較，其中使用在小鼠中基于肽的疫苗反應(yīng)后分離的鼠MLR效應(yīng)子和CTL。A.將來(lái)自鼠MLR(b→d)的效應(yīng)細(xì)胞與100,000個(gè)P815或者EL4靶細(xì)胞(對(duì)照)在4小時(shí)的測(cè)定中以所示的E∶T比率進(jìn)行溫育。對(duì)于51Cr釋放測(cè)定，我們以16∶1稀度開(kāi)始并稀釋到0.2∶1，而天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3測(cè)定法以1∶1到0.1∶1E∶T比率進(jìn)行測(cè)試。顯示了兩個(gè)相似實(shí)驗(yàn)之一的結(jié)果。B.對(duì)于監(jiān)控來(lái)自肽免疫的小鼠的回憶應(yīng)答，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法與51Cr釋放測(cè)定同樣可靠和特異。用黑素瘤TRP2肽免疫小鼠并以所指出的E∶T比率進(jìn)行測(cè)試。
圖4.小鼠中基于病毒載體的接種后，用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3-切割CTL測(cè)定法監(jiān)控CD8+T細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生了與IFN-γELISPOT分析相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。用ALVAC-gp100免疫HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠并用gp100肽庫(kù)再次刺激脾細(xì)胞5天。分離存活細(xì)胞，并以每孔100,000個(gè)細(xì)胞以20∶1 E∶T比率用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定測(cè)試CTL活性(左圖)，或者在ELISPOT測(cè)定法中測(cè)試IFN-γ產(chǎn)生(右圖)。靶是用gp100肽或者對(duì)照A2結(jié)合的CMV pp65肽脈沖的P815-A2/Kb轉(zhuǎn)染子。顯示了兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。點(diǎn)代表從單個(gè)接種的小鼠得到的結(jié)果。
圖5.用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3-切割測(cè)定法監(jiān)控抗原特異的人CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。用如所述的肽脈沖的自體DC和活化的B細(xì)胞從HLA-A*0201+供體的PBMC產(chǎn)生原代肽-特異的人T細(xì)胞系。T細(xì)胞在測(cè)試CTL活性前經(jīng)歷四輪肽特異的刺激。A.對(duì)外來(lái)抗原特異的(HIV rev肽)T細(xì)胞系應(yīng)用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3-切割測(cè)定法。收獲T細(xì)胞并將其與DDAO-SE-標(biāo)記的T2淋巴瘤靶進(jìn)行溫育，所述靶已經(jīng)用HIV rev或者CMV pp65肽脈沖，或者不用肽脈沖。將T細(xì)胞用首次用于實(shí)驗(yàn)的自體PBMC以1∶1或者1∶5比率稀釋后與100,000個(gè)脈沖的靶以1∶1比率混合。如所示，將細(xì)胞溫育1或3小時(shí)，并對(duì)切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3染色。僅靶細(xì)胞(“僅T”)也用作對(duì)照。顯示了3次相似實(shí)驗(yàn)之一的結(jié)果。B.用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割或者膜聯(lián)蛋白V加上7-AAD染色測(cè)定法在自身抗原特異的(CEA CAP1肽)人T細(xì)胞系中測(cè)量的CTL活性。將效應(yīng)細(xì)胞以所指出的比率用首次用于實(shí)驗(yàn)的自體PBMC稀釋后與用CAP1特異肽或者非特異CMV pp65肽脈沖的肽脈沖的T2細(xì)胞混合。僅靶細(xì)胞(“僅T”)和來(lái)自供體的首次用于實(shí)驗(yàn)的PBMC用作負(fù)對(duì)照。顯示了3小時(shí)溫育的結(jié)果。1或者4小時(shí)溫育后的得到類(lèi)似結(jié)果(未顯示)。顯示了兩次相似實(shí)驗(yàn)之一的結(jié)果。
圖6.天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割是用于監(jiān)控鼠CTL活性的高度靈敏的測(cè)定法。從b→d MLR收獲脾細(xì)胞并將其與DDAO-SE-標(biāo)記的P815靶細(xì)胞溫育。將MLR效應(yīng)細(xì)胞用首次用于實(shí)驗(yàn)的同基因脾細(xì)胞以所指示的比率稀釋后與P815靶以1∶1的比率混合。測(cè)定中有10萬(wàn)個(gè)稀釋的效應(yīng)細(xì)胞和100,000個(gè)靶細(xì)胞。上圖(A)顯示了在MLR效應(yīng)細(xì)胞的不同稀度下FACS分析后DDAO-SE對(duì)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割的點(diǎn)圖。與靶細(xì)胞混合的首次用于實(shí)驗(yàn)的B6脾細(xì)胞顯示為負(fù)對(duì)照。B.兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，顯示了所指示的b→d MLR效應(yīng)細(xì)胞稀度下的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割。將效應(yīng)子和P815靶細(xì)胞溫育2或4小時(shí)后對(duì)切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3染色。
圖7.天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割是用于監(jiān)控人CD8+T細(xì)胞活性的高度靈敏的測(cè)定法，與用HLA-肽五聚體進(jìn)行TCR染色有相似水平的靈敏性。如以前產(chǎn)生HLA-A*0201-限制的HIV gag肽特異的人T細(xì)胞系并測(cè)試CTL活性。將T細(xì)胞用首次用于實(shí)驗(yàn)的自體PBMC以所指示的比率稀釋后以1∶1的比率加入HIV或者CMV(特異性對(duì)照)肽脈沖的T2靶細(xì)胞。僅靶或者沒(méi)有效應(yīng)細(xì)胞的首次用于實(shí)驗(yàn)的PBMC用作負(fù)對(duì)照。A.點(diǎn)圖顯示了當(dāng)高度稀釋的HIV gag肽-特異的T細(xì)胞與用HIV gag肽或者非特異CMV pp65肽脈沖的T2細(xì)胞溫育時(shí)的代表性結(jié)果。甚至在1∶199的稀度下也常規(guī)地檢測(cè)到天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶切割百分?jǐn)?shù)的顯著差異。B.條形圖，其顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，所述實(shí)驗(yàn)測(cè)試天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法以測(cè)量用如所示的首次用于實(shí)驗(yàn)的PBMC稀釋的HIV gag肽特異的T細(xì)胞系中的CTL活性。在每種情況中，將150,000個(gè)稀釋的效應(yīng)子與150,000個(gè)DDAO-SE-標(biāo)記的肽脈沖的靶進(jìn)行溫育。作為比較，將相同的T細(xì)胞用HLA-gag肽五聚體(ProImmune，Oxford，英國(guó))平行地染色(C)。CMV pp65肽特異的T細(xì)胞系用作特異性對(duì)照。為了比較五聚體測(cè)定法與天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法，為每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)收集150,000個(gè)門(mén)控的T細(xì)胞(向CTL測(cè)定中加入相同量的效應(yīng)細(xì)胞)。
詳述本發(fā)明涉及用于進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定的試劑和測(cè)定法。所述測(cè)定法適于檢測(cè)免疫效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞包括但不限于T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等等。所述測(cè)定法一般基于靶細(xì)胞中DNA斷裂和/或細(xì)胞凋亡相關(guān)的改變。例如，在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)到參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的酶的切割。在另一實(shí)施方案中，檢測(cè)到細(xì)胞凋亡過(guò)程期間DNA相關(guān)的蛋白質(zhì)的特征的改變。此類(lèi)改變適于用測(cè)量細(xì)胞熒光的裝置，如熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)或者流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于測(cè)量細(xì)胞凋亡過(guò)程期間一種或多種天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的切割的測(cè)定法。在細(xì)胞凋亡中起作用并且可以適于此處所示測(cè)定法中檢測(cè)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶包括但不限于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。在一個(gè)實(shí)施方案中，用本文描述的測(cè)定法檢測(cè)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3。已知在細(xì)胞凋亡過(guò)程中切割的另一種酶是多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，尤其天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3和PARP的切割是細(xì)胞凋亡期間的早期事件并且在CTL靶中觸發(fā)。除了天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶和PARP的切割，在細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)期間許多細(xì)胞內(nèi)底物被磷酸化。例如，在多種細(xì)胞譜系中組蛋白H2A.X被磷酸化。對(duì)切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶有特異結(jié)合能力的抗體，以及對(duì)磷酸化的組蛋白H2.AX特異的抗體可通過(guò)商業(yè)途徑獲得并且適于用于本發(fā)明的實(shí)踐中。
在某些實(shí)施方案中，在與效應(yīng)細(xì)胞接觸前用染料將靶細(xì)胞染色。適宜的染料包括Vial T、CFSE和DDAO-SE，每種都是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選的染料是DDAO-SE(Molecular Probes)。其他適宜的染料也是本領(lǐng)域已知的并且可用于實(shí)踐本發(fā)明。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)如下步驟進(jìn)行本發(fā)明提供的測(cè)定法1)制備效應(yīng)細(xì)胞(E)；2)制備靶細(xì)胞(T)，包括用可檢測(cè)的標(biāo)記，如熒光染料標(biāo)記細(xì)胞；3)將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞以足夠的E∶T比率混合；4)以足夠的時(shí)間段并在適于至少一些效應(yīng)細(xì)胞對(duì)至少一些靶細(xì)胞變得有細(xì)胞毒性的條件下對(duì)混合物進(jìn)行溫育；5)固定并透化混合的細(xì)胞；6)用可檢測(cè)的試劑對(duì)細(xì)胞染色，所述試劑能夠結(jié)合蛋白質(zhì)或者其片段，所述蛋白質(zhì)或其片段在細(xì)胞凋亡過(guò)程期間經(jīng)歷改變或者經(jīng)歷細(xì)胞凋亡過(guò)程導(dǎo)致的改變；和7)檢測(cè)所述可檢測(cè)的試劑。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)試劑中含有的熒光標(biāo)記或者部分或者通過(guò)檢測(cè)結(jié)合可檢測(cè)的試劑的第二種試劑可以檢測(cè)所述可檢測(cè)的試劑，其中所述第二種試劑可以通過(guò)該第二種試劑中含有的熒光標(biāo)記或者部分檢測(cè)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)的試劑和/或第二種試劑是抗體，其可以是熒光標(biāo)記的?？梢酝ㄟ^(guò)幾種公知方法的任一種檢測(cè)可檢測(cè)的試劑，所述方法包括但不限于FACS。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可檢測(cè)的試劑是抗-天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3抗體(如PE綴合的單克隆兔抗活性天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3抗體(PE ConjugatedMonoclonal Rabbit Anti-Active Caspase 3Antibody)，BD PharmingenCatalog No.550914)。其他適宜的試劑是本領(lǐng)域已知的。
在一些實(shí)施方案中，有利地或者希望在對(duì)靶細(xì)胞染色和/或混合靶和效應(yīng)細(xì)胞前用效應(yīng)細(xì)胞可能應(yīng)答的肽接觸或者“脈沖”靶細(xì)胞。例如，可以用對(duì)應(yīng)于傳染物如HIV或者腫瘤抗原的氨基酸序列的肽脈沖靶細(xì)胞。其中，適宜的腫瘤抗原包括，例如，gp100(Cox等人，Science，264716-719(1994))、MART-1/Melan A(Kawakami等人，J.Exp.Med.，180347-352(1994))、gp75(TRP-1)(Wang等人，J.Exp.Med.，1861131-1140(1996))、酪氨酸酶(Wolfel等人，Eur.J.Immunol.，24759-764(1994))、NY-ESO-1(WO 98/14464；WO99/18206)、黑素瘤蛋白聚糖(Hellstrom等人，J.Immunol.，1301467-1472(1983))、MAGE家族抗原(即，MAGE-1、2、3、4、6和12；Van der Bruggen等人，Science，2541643-1647(1991)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,235,525)、BAGE家族抗原(Boel等人，Immunity，2167-175(1995))、GAGE家族抗原(即，GAGE-1，2；Van den Eynde等人，J.Exp.Med.，182689-698(1995)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,013,765)、RAGE家族抗原(即，RAGE-1；Gaugler等人，Immunogenetics，44323-330(1996)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,939,526)、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶-V(Guilloux等人，J.Exp.Med.，1831173-1183(1996))、p15(Robbins等人，J.Immunol.1545944-5950(1995))、β-連環(huán)蛋白(Robbins等人，J.Exp.Med.，1831185-1192(1996))、MUM-1(Coulie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927976-7980(1995))、依賴(lài)細(xì)胞周期蛋白的激酶-4(CDK4)(Wolfel等人，Science，2691281-1284(1995))、p21-ras(Fossum等人，Int.J.Cancer，5640-45(1994))、BCR-abl(Bocchia等人，Blood，852680-2684(1995))、p53(Theobald等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9211993-11997(1995))、p185 HER2/neu(erb-B1；Fisk等人，J.Exp.Med.，1812109-2117(1995))、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)(Harris等人，Breast Cancer Res.Treat，291-2(1994))、癌胚抗原(CEA)(Kwong等人，J.Natl.Cancer Inst.，85982-990(1995)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,756,103；5,274,087；5,571,710；6,071,716；5,698,530；6,045,802；EP 263933；EP 346710；和EP 784483)；癌相關(guān)的突變的粘蛋白(即，MUC-1基因產(chǎn)物；Jerome等人，J.Immunol.，1511654-1662(1993))；EBV的EBNA基因產(chǎn)物(即，EBNA-1；Rickinson等人，Cancer Surveys，1353-80(1992))；人乳頭瘤病毒的E7、E6蛋白(Ressing等人，J.Immunol，1545934-5943(1995))；前列腺特異抗原(PSA；Xue等人，The Prostate，3073-78(1997))；前列腺特異膜抗原(PSMA；Israeli，等人，Cancer Res.，541807-1811(1994))；獨(dú)特型表位或者抗原，例如，免疫球蛋白獨(dú)特型或者T細(xì)胞受體獨(dú)特型(Chen等人，J.Immunol.，1534775-4787(1994))；KSA(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,348,887)、驅(qū)動(dòng)蛋白2(Dietz，等人，Biochem Biophys Res Commun2000Sep 7；275(3)731-8)、HIP-55、TGF β-1抗細(xì)胞凋亡因子(Toomey，等人，Br J Biomed Sci 2001；58(3)177-83)、腫瘤蛋白質(zhì)D52(BryneJ.A.，等人，Genomics，35523-532(1996))、H1FT、NY-BR-1(WO01/47959)、NY-BR-62、NY-BR-75、NY-BR-85、NY-BR-87和NY-BR-96(Scanlan，M.Serologic and Bioinformatic Approches to theIdentification of Human Tumor Antigens，in Cancer Vaccines 2000，Cancer Research Institute，New York，NY)，包括其野生型、修飾的、突變的形式。
在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞溫育的時(shí)間可以改變。例如，可以希望在進(jìn)一步分析前將混合物溫育1、2、3、4、5、6小時(shí)或者更長(zhǎng)時(shí)間。
本發(fā)明的其他方面包括用于實(shí)施本文描述的測(cè)定法的試劑盒。試劑盒可以包括用于制備效應(yīng)細(xì)胞的材料、適宜數(shù)目的效應(yīng)細(xì)胞、用于染色靶細(xì)胞的熒光染料、裝置(如96孔板，在該裝置中靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞可以混合并溫育)、固定和透化細(xì)胞所需的材料、可檢測(cè)的試劑和/或第二種試劑。此類(lèi)材料的不同組合可以組織為試劑盒以便幫助技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明的測(cè)定法。
根據(jù)下面用于闡明的實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明和其許多優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法A.試劑和細(xì)胞培養(yǎng)基抗-切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(對(duì)人和小鼠蛋白質(zhì)都反應(yīng))用藻紅蛋白(PE)標(biāo)記并且購(gòu)自BD Biosciences(Mississauga，ON)?？?磷酸-組蛋白H2A.X-FITC購(gòu)自Upstate Cell SignalingSolutions(Lake Placid，NY)。細(xì)胞示蹤染料DDAO-SE購(gòu)自MolecularProbes(Eugene，OR)。所有細(xì)胞培養(yǎng)基都購(gòu)自InVitrogen(Mississauga，ON)。細(xì)胞因子(IL-2、IL-2、IL-12和IL-6)購(gòu)自R&D Systems(Minneapolis，MN)。用于人和小鼠IFN-γELISPOT分析的抗-IFN-γ抗體對(duì)分別購(gòu)自MabTech(Amsterdam，NL)和BD Biosciences(Mississauga，ON)。51Cr(51鉻酸鈉)來(lái)自Amersham(Toronto，Ontario)。實(shí)驗(yàn)中使用下面的HLA-A2.1-結(jié)合性的和鼠H-2Kb-結(jié)合性的肽ILKEPVHGV(HIV rev)、SLYNTVATL(HIV gag)、YLSGANLNL(CEA腫瘤抗原CAP1表位)、IMDQVPVSV、YLEPGPVTV、KTWGQYWQV(gap100黑素瘤表位)、NLVPMVATV(CMV pp65表位)、DAPIYTNV(β-半乳糖苷酶H-2Kb表位)、TPHPARIGL((β-半乳糖苷酶H-2Ld)和TLDSQVMSL(TRP-2黑素瘤表位)。在396Multiple Biomolecular Synthesizer(AdvancedChemtech，Louisville，KY)中合成肽并通過(guò)HPLC純化。在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中增殖ALVAC-gal和ALVAC-gp100并在蔗糖墊(cushion)上通過(guò)離心從裂解的細(xì)胞進(jìn)行純化，如前所述(Ferrari等人，1997)。如前所述(Santra等人，2002)，在CEF中測(cè)定病毒效價(jià)，其以蝕斑形成單位(pfu)表示。
B.小鼠Balb/c和C57BL/6小鼠購(gòu)自Charles River(Montreal，QC)。如所描述的產(chǎn)生HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠(Borenstein等人，2000)。所有小鼠都在Aventis Pasteur(Sunnybrook Campus，Toronto，ON)的動(dòng)物資源部(Animal Resources Department)于無(wú)特殊病原體(SPF)條件下在微型隔離器(micro-isolator)籠中按照Canadian Council on AnimalCare(CACC)的準(zhǔn)則喂養(yǎng)。
C.人PBMC制劑用Ficoll-Hypaque梯度離心(Sigma，St.Louis，MO)從白細(xì)胞提取法(leukopherisis)供體得到人PBMC。在Sunnybrook和婦女健康科學(xué)中心(Women′s Health Sciences Center)(Toronto，ON)根據(jù)規(guī)定的IRB準(zhǔn)則在得到完全供體同意的情況下收集所有血液產(chǎn)品。用DNA測(cè)序?qū)w預(yù)篩選HLA-A*0201并且僅將陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行白細(xì)胞提取法采集。
D.鼠MLR和效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的制備在小鼠細(xì)胞培養(yǎng)基(α-MEM，10％FCS，50μM巰基乙醇、1mMGlutamax，青霉素-鏈霉素)從C57BL/6或Balb/c小鼠收獲脾臟并用細(xì)菌分離器(Stomacher 80Biomaster，英國(guó))制備細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞懸浮液通過(guò)70μm孔徑的濾過(guò)器(BD Biosciences)過(guò)濾。洗滌細(xì)胞并將其重懸浮在培養(yǎng)基中。將刺激細(xì)胞以2000拉德(Gammacell1000Elite，MDS Nordion)輻射并用培養(yǎng)基洗滌一次并以10×106個(gè)細(xì)胞/ml重懸浮在培養(yǎng)基中。將應(yīng)答細(xì)胞(20×106個(gè)細(xì)胞)和輻射的刺激細(xì)胞(20×106個(gè)細(xì)胞)置于垂直的T-25瓶，總計(jì)20ml。將培養(yǎng)物溫育5天并在Lympholyte-M(Cedarlane Labs，加拿大)上以100×g離心20分鐘來(lái)收獲活細(xì)胞。用培養(yǎng)基以1.5×106個(gè)/ml洗滌細(xì)胞。
E.小鼠免疫研究和體外T-細(xì)胞再刺激用連接來(lái)自人Period 1基因的胞轉(zhuǎn)肽的結(jié)合黑素瘤H-2b的TRP-2腫瘤抗原肽進(jìn)行肽免疫。該序列誘導(dǎo)APC中TRP-2序列的攝入并且誘導(dǎo)強(qiáng)的抗肽CTL應(yīng)答。將C57BL/6小鼠用50μg TRP-2肽皮下免疫并在3周后加強(qiáng)。加強(qiáng)后3周收獲脾臟并用TRP-2肽再刺激脾細(xì)胞5天，然后用51Cr釋放測(cè)定法或者用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3-切割測(cè)定法進(jìn)行CTL測(cè)定。在HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠中皮下用金絲雀痘病毒載體(ALVAC-gp100)進(jìn)行免疫(Borenstein等人，2000)。用2×107pfu ALVAC-gp100免疫小鼠然后在2周后用相同劑量加強(qiáng)。加強(qiáng)后5周和7周收獲脾細(xì)胞并用顯性HLA-A2.1-結(jié)合性gp100肽庫(kù)(IMDQVPVSV、YLEPGPVTV和KTWGQYWQV)以0.2μg/ml/肽再次刺激(5×106個(gè)細(xì)胞/ml，24孔板中)5天。收獲細(xì)胞并用IFN-γELISPOT或者天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3-切割測(cè)定法進(jìn)行分析。用100,000個(gè)再活化的脾細(xì)胞與10,000個(gè)gp100肽脈沖的(2μg/ml)、用HLA-A2/Kb表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的P815(P815-A2/Kb細(xì)胞系)混合進(jìn)行ELISPOT分析。
F.產(chǎn)生人肽特異的T細(xì)胞用人T細(xì)胞培養(yǎng)基(HTC-CM)中的肽脈沖的自體成熟樹(shù)突細(xì)胞(DC)刺激T-細(xì)胞富集的PBMC(PBMC的塑料粘附的陰性級(jí)分)，所述培養(yǎng)基組成為Iscove氏修飾的Dulbecco氏培養(yǎng)基、1mM Glutamax、1mM丙酮酸(Invitrogen，Mississauga，ON)、5％人AB血清、50μM2-巰基乙醇，20μg/ml慶大霉素。用含有2％人AB血清、1,000U/mlGM-CSF、1,000U/ml IL-4、4ng/ml TNF-α和100U IFN-α的HTC-CM，以一步方案在6天內(nèi)從貼壁單核細(xì)胞產(chǎn)生成熟DC。收獲DC，洗滌并用10μg/ml肽脈沖。下面的HLA-A2.1-結(jié)合性的九聚體肽用于T-細(xì)胞產(chǎn)生HIV rev肽(ILKEPVHGV)、HIV gag肽(SLYNTVATL)和來(lái)自CEA腫瘤抗原的CAP1表位(YLSGANLNL)。以前已經(jīng)證明這些肽結(jié)合HLA-A2.1并引起HLA-A2.1-限制的CD8+T-細(xì)胞應(yīng)答(Stuber等人，1992；Herr等人，1996；Zaremba等人，1997)。洗滌脈沖的DC并將其用于刺激24孔板中的富含T-細(xì)胞的自體PBMC(T細(xì)胞)，其中使用0.6×106個(gè)脈沖的DC與6×106個(gè)T細(xì)胞的比率。培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)加入IL-2(10U/ml)、IL-7(5ng/ml)、IL-6(1,000U/ml)和IL-12(10ng/ml)并且4天后用IL-2(額外的10U/ml)喂飼細(xì)胞。用以前描述的(Schultze等人，1997)產(chǎn)生的肽脈沖的CD40配體活化的自體B淋巴細(xì)胞再次刺激2到3輪后，進(jìn)行10到12天的初次活化。第三或第四輪刺激后5天進(jìn)行效應(yīng)細(xì)胞測(cè)定(天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3-切割、IFN-γELISPOT、使用膜聯(lián)蛋白-V/7-AAD的CTL測(cè)定和HLA五聚體染色)。在一些情況中，測(cè)定前，按照說(shuō)明用首次用于實(shí)驗(yàn)的自體PBMC稀釋活化的T細(xì)胞。
G.天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3-切割測(cè)定法和染色方法1.靶細(xì)胞標(biāo)記和肽脈沖將收獲的靶細(xì)胞(P815，EL4，T2淋巴瘤細(xì)胞)用D-PBS洗滌一次。將細(xì)胞以5×106個(gè)/ml重懸浮在含有溶于D-PBS中的0.6μMDDAO-SE(Molecular Probes，Eugene，OR)的標(biāo)記緩沖液中并在37℃下溫育15分鐘。在培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞并將其以2×106個(gè)細(xì)胞/ml重懸浮在培養(yǎng)基中并用1-3μg/ml的所示的肽脈沖1小時(shí)。在培養(yǎng)基中洗滌經(jīng)脈沖的靶一次并以1×106個(gè)細(xì)胞/ml重懸浮。
2.CTL測(cè)定法設(shè)置和抗體染色將用肽脈沖的DDAO-SE-標(biāo)記的靶細(xì)胞(O.1ml)與O.1ml效應(yīng)細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞/ml)在錐形聚丙烯Costar cluster管(Costar，Coming，NY)中混合。低速(200rpm)離心細(xì)胞混合物1分鐘。將混合物在37℃，5％CO2下在濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中溫育所示的時(shí)間段(0.5到5小時(shí))。將細(xì)胞用D-PBS，1％BSA在室溫(RT)下洗滌，并立即用Fix/Perm溶液(BDBiosciences，Mississauga，ON)在室溫下固定并透化處理20分鐘，或者在1％多聚甲醛中室溫下固定20，然后在4℃下保存最長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)。離心固定并保存的細(xì)胞并將其在室溫下重懸浮在Fix/Perm緩沖液中20分鐘。然后用染色緩沖液(D-PBS，1％BSA，0.1％皂甙)洗滌細(xì)胞兩次并將其重懸浮在0.1ml染色緩沖液中。在冰上用15μl生物素標(biāo)記的抗切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3單克隆抗體(BDBiosciences，Mississauga，ON)對(duì)細(xì)胞染色60分鐘。在染色緩沖液中洗滌細(xì)胞并在冰上用鏈霉抗生物素蛋白-PE(Sigma，St.Louis，MO)復(fù)染30分鐘。在染色緩沖液中洗滌細(xì)胞兩次并重懸浮在D-PBS，1％BSA中用于在流式細(xì)胞儀上分析。
3.流式細(xì)胞術(shù)分析在FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，Mississauga，ON)上分析染色的細(xì)胞。對(duì)每個(gè)樣品收集3萬(wàn)到5萬(wàn)個(gè)事件。用前向散射和側(cè)向散射參數(shù)門(mén)控活細(xì)胞和靶細(xì)胞，然后門(mén)控FL4道(channel)上DDAO-SE-標(biāo)記的靶細(xì)胞群體(也參見(jiàn)圖1B)。然后用DDAO-SE門(mén)控的靶細(xì)胞在FL4對(duì)FL2點(diǎn)圖中確定切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3表達(dá)(FL2道)。
H.IFN-γELISPOT測(cè)定法ELISPOT測(cè)定法使用Miilipore MultiScreen-HA 96-孔濾板(Millipore目錄號(hào)MAHAS4510)。將板用溶于pH9.5的碳酸鹽緩沖液中的5μg/ml抗-IFN-γmAb(Sigma，St.Louis，MO)在4℃涂覆過(guò)夜并用D-PBS，2％BSA封閉。如所示的加入人或者鼠T細(xì)胞(100,000/孔)并與相關(guān)或者不相關(guān)的肽過(guò)夜溫育。洗滌該板然后與生物素標(biāo)記的抗-IFN-γmAb在室溫溫育1小時(shí)。洗滌該板，然后用1∶5,000稀度的Extravidin-堿性磷酸酶(Sigma)在室溫處理1小時(shí)。用BCIP/NBT底物(Sigma)將板顯色直到所有點(diǎn)都清晰可見(jiàn)。干燥顯色的板并在AID3.1.1版ELISPOT讀出器(Cell Technologies，美國(guó))上計(jì)數(shù)。用PMA和離子霉素(Sigma)處理的細(xì)胞用作所有實(shí)驗(yàn)中的正對(duì)照。
I.51Cr-釋放測(cè)定法在含有10％FCS的細(xì)胞培養(yǎng)基中用100μCi Na251CrO4在37℃標(biāo)記靶細(xì)胞(P815，P815-A2/Kb，EL4，和T2細(xì)胞)45分鐘。在培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞并且如果方案需要，用特異或者非特異對(duì)照肽(1到3μg/ml)脈沖細(xì)胞1小時(shí)。經(jīng)脈沖的細(xì)胞在培養(yǎng)基中洗滌一次并以30,000個(gè)細(xì)胞/ml重懸浮。以如結(jié)果中指出的不同的E∶T比率加入效應(yīng)細(xì)胞(鼠MLR，肽再刺激的脾細(xì)胞，或者肽活化的人T細(xì)胞系)。在一些實(shí)驗(yàn)中，在以各種E∶T比率向51Cr-釋放測(cè)定法中添加前用首次用于實(shí)驗(yàn)的淋巴細(xì)胞稀釋效應(yīng)細(xì)胞。溫育4小時(shí)后，將25μl測(cè)定上清液置于96孔Lumaplate(Packard)中。干燥平板并用TopCount NXT v2.12閃爍計(jì)數(shù)器(Packard)計(jì)數(shù)放射性。結(jié)果表示為以(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放/總釋放-自發(fā)釋放)×100計(jì)算的特異裂解％。
J.HLA-五聚體染色用PE-綴合的重組HLA-肽五聚體(ProImmune，Oxford，英國(guó))對(duì)HIV gag肽特異的和CEA CAP1肽特異的HLA-A*0201人T細(xì)胞系染色。將含有來(lái)自HIV gag(ProImmune code 010)的SLYNTVATL序列的HLA-A*0201五聚體用于染色HIV-特異的細(xì)胞系，而將含有來(lái)自CEA(ProImmune code 075)的YLSGANLNL肽的HLA-A*0201五聚體用于染色CAP1肽特異的細(xì)胞系。在兩種情況中，將由相似百分?jǐn)?shù)的CD8+T-細(xì)胞組成的HLA-A*0201限制的T-細(xì)胞系用作非特異的五聚體染色對(duì)照。洗滌T細(xì)胞并將其以2×106個(gè)細(xì)胞/ml重懸浮在五聚體染色緩沖液(PBS)中，該緩沖液由D-PBS、0.1％NaN3、0.1％BSA組成。在室溫下用10μl Pro5TM染色細(xì)胞20分鐘，洗滌，然后在PSB中用5μl抗-人CD8-FITC(BD Biosciences)在室溫染色20分鐘。在PSB中洗滌細(xì)胞并在D-PBS，1％多聚甲醛中固定并進(jìn)行FACScalibur流式細(xì)胞術(shù)分析儀分析。檢測(cè)五聚體陽(yáng)性細(xì)胞并定量，這通過(guò)首先用前向散射和側(cè)向散射辨別器門(mén)控活細(xì)胞，然后在兩色圖中分析來(lái)進(jìn)行，所述兩色圖在x軸上顯示CD8+熒光，且在y軸上顯示五聚體+熒光。結(jié)果表示為每種培養(yǎng)物的五聚體+細(xì)胞％。
實(shí)施例2A.測(cè)定步驟和靶細(xì)胞示蹤染料的選擇我們解決的第一個(gè)問(wèn)題是發(fā)現(xiàn)在FACS分析期間不干擾天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3信號(hào)的有效的靶細(xì)胞示蹤染料的問(wèn)題。為了使靈敏性最大，我們希望使用生物素標(biāo)記的第一抗-切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3，然后為在FL2道中發(fā)出明亮熒光的鏈霉抗生物素蛋白-PE復(fù)染劑。結(jié)果，我們尋找無(wú)毒性的細(xì)胞示蹤染料，其將在遠(yuǎn)紅外(FL4)道中發(fā)熒光并且不需要FL2道的任何補(bǔ)償。我們發(fā)現(xiàn)DDAO-SE(Molecular Probes)滿(mǎn)足這些要求。如圖1A中所示，發(fā)現(xiàn)DDAO-SE可再現(xiàn)地并且穩(wěn)定地染色多種鼠和人細(xì)胞系最長(zhǎng)達(dá)15小時(shí)，包括P815、EL-4、B16F10黑素瘤、4T1乳腺癌、人T2胸腺瘤和COS細(xì)胞，而不誘導(dǎo)非特異的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割。
使用DDAO-SE染色的靶細(xì)胞，我們首先測(cè)試了天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法來(lái)測(cè)量鼠同基因T細(xì)胞應(yīng)答中的CTL活性。培養(yǎng)5天后，與51Cr釋放比較測(cè)試C57BL/6抗-Balb/c和Balb/c抗-C57BL/6脾細(xì)胞的混合的淋巴細(xì)胞應(yīng)答。將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞(P815或者EL-4細(xì)胞)以不同比率混合并溫育不同的時(shí)間間隔并固定和用抗-切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3染色。圖1B顯示了用于計(jì)數(shù)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割的靶細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的門(mén)控策略。將該方法用于所有實(shí)驗(yàn)中。用前向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)圖分離如所示的活的DDAO-SE+(FL4道)靶細(xì)胞的群體(R2和R3)。將R2和R3門(mén)控物組合并用于確定DDAO-SE+、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割的(FL2道)靶的百分?jǐn)?shù)。該門(mén)控策略確保僅考慮活的靶。
用C57BL/6抗-Balb/c MLR效應(yīng)細(xì)胞與P815靶(1∶1的E∶T比率)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割對(duì)于H-2dP815靶是特異的并且在H-2bEL4靶中沒(méi)有檢測(cè)到顯著切割(圖2A)。圖2A和2B中顯示的時(shí)程也表明在該情況中溫育1小時(shí)后天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割信號(hào)是最大的。當(dāng)測(cè)試Balb/c抗-C57BL/6MLR效應(yīng)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)果(圖2B)?？傊跍y(cè)量MLR中異特異性的(allo-specific)CTL活性時(shí)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法顯示了與使用4小時(shí)的51Cr釋放測(cè)定法時(shí)相同的特異性(數(shù)據(jù)未示出)。
為了證實(shí)靶細(xì)胞中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的切割依賴(lài)于CTL分泌的細(xì)胞毒性顆粒，我們將C57BL/6抗-Balb/c MLR效應(yīng)細(xì)胞與刀球骯霉素A(用作CTL測(cè)定中的CTL脫粒抑制劑)溫育后與靶混合。刀球骯霉素A抑制P815靶細(xì)胞中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割的出現(xiàn)(圖2C)。用對(duì)來(lái)自CEA腫瘤抗原的CAP1肽反應(yīng)的人CTL細(xì)胞系進(jìn)行的測(cè)定得到了相似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑Z-DEVD-FMK或者一般的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3活性的抑制不能防止C57BL/6抗-Balb/cMLR的P815靶中切割的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的出現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果一起表明靶細(xì)胞中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割依賴(lài)于CTL分泌的粒酶并且不由內(nèi)源活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3或者殺死過(guò)程中靶中其他切割天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶觸發(fā)。
在兩種不同的測(cè)定系統(tǒng)鼠C57B1/6抗-Balb/c MLR系統(tǒng)和在HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠中肽接種應(yīng)答中比較了天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法和51Cr釋放測(cè)定法(圖3)。在MLR模型中，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法表現(xiàn)出與51Cr釋放測(cè)定法相同的特異性和可靠性。然而，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法明顯更靈敏，其能夠在低于0.5∶1的E∶T比率下檢測(cè)CTL活性(圖3A)。還測(cè)試了來(lái)自用人TRP2黑素瘤抗原肽接種的小鼠的脾細(xì)胞對(duì)于肽脈沖的P815-A2/Kb靶細(xì)胞的CTL活性(圖3B)。當(dāng)在40∶1和10∶1 E∶T下測(cè)試肽再刺激的脾細(xì)胞時(shí)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法產(chǎn)生了與51Cr釋放測(cè)定法相似的結(jié)果。再次，和前面一樣，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法顯示出更高程度的靈敏性，其在10∶1的E∶T比率下檢測(cè)到更高比率的的特異CTL活性。
B.使用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法監(jiān)控對(duì)病毒載體疫苗的CTL應(yīng)答比較天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法和IFN-γELISPOT測(cè)定法以測(cè)量用2×107pfu ALVAC-gp100免疫HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠后gp100肽特異的CD8+回憶應(yīng)答。將小鼠接觸抗原并加強(qiáng)，并用0.2μg/ml結(jié)合HLA-A2.1的gap100肽庫(kù)再刺激脾細(xì)胞然后進(jìn)行效應(yīng)細(xì)胞測(cè)定，該測(cè)定使用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割或者IFN-γELISPOT。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法使用用HLA-A2.1/Kb質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DDAO-SE-標(biāo)記的gap100或者對(duì)照肽脈沖的P815細(xì)胞。在ELISPOT測(cè)定中使用相似方法，只是P815-A2/Kb不用DDAO-SE標(biāo)記(見(jiàn)方法章節(jié))。每種測(cè)定法中使用5只重復(fù)抽樣小鼠來(lái)測(cè)試當(dāng)將天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法用作讀出時(shí)個(gè)體動(dòng)物之間的結(jié)果的精確性。圖4顯示了兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)比較了對(duì)于gp100肽特異的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割讀數(shù)對(duì)ELISPOT的讀數(shù)。兩種測(cè)定法產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，其中在用空ALVAC對(duì)照載體免疫的小鼠中沒(méi)有非特異反應(yīng)性。個(gè)體動(dòng)物之間的分散是低的，表明用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割監(jiān)控CTL靶中的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答可以準(zhǔn)確地以高精確性測(cè)量接種后抗原特異的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
這些結(jié)果表明鼠系統(tǒng)中CTL靶細(xì)胞中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割的測(cè)量是51Cr釋放的可行的備選測(cè)定法，并且具有相同程度的特異性，但是比51Cr釋放明顯更靈敏。此外，通過(guò)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)量CTL活性可以用作IFN-γELISPOT的支持性功能測(cè)定法或者當(dāng)可以得到表達(dá)靶抗原或者肽的靶細(xì)胞時(shí)作為ELISPOT的替代測(cè)定法。
C.天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割CTL測(cè)定法用于監(jiān)控抗原特異的人T細(xì)胞應(yīng)答在第一組研究中，針對(duì)9-聚體HIV rev肽、HIV gag肽，或者針對(duì)從腫瘤相關(guān)抗原CEA得到的CAP1肽從HLA-A*0201+供體產(chǎn)生人T細(xì)胞系。通過(guò)如方法中概述的肽刺激和用IL-2和IL-7增殖的重復(fù)循環(huán)從正常的、非HIV感染的和非癌性供體產(chǎn)生所有T細(xì)胞系。3或者4個(gè)刺激循環(huán)后，我們常規(guī)地獲得由＞85％TCR αβ+、CD8+、CD16-、CD56-增殖性T細(xì)胞組成的T細(xì)胞系。通過(guò)監(jiān)控天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)試這些T細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞活性。IFN-γELISPOT分析證實(shí)第三和第四輪刺激后存在肽特異的T細(xì)胞。對(duì)于HIV肽特異的和CEA肽特異的細(xì)胞系，這些的范圍為1∶100到1∶250(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖5A顯示了使用對(duì)來(lái)自HIV rev的肽特異的HLA-A2.1-限制的T細(xì)胞系，監(jiān)控活化的人T細(xì)胞特異活性的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法的一般結(jié)果。將活化的T細(xì)胞與脈沖的T2靶以5∶1或者1∶1的E∶T比率混合(圖5A)。證明對(duì)于用來(lái)自pp65CMV抗原的非特異HLA-A*0201-結(jié)合性肽脈沖的T2靶中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割，該測(cè)定法僅具有最低水平的特異性。在圖5B中，我們比較了天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法與另一種基于FACS的CTL測(cè)定法的結(jié)果，該基于FACS的CTL測(cè)定法使用膜聯(lián)蛋白-V和7-AAD染色(Fischer等人，2002)用試劑盒(BDBisciences)，使用對(duì)CEA的CAP1HLA-A2.1表位特異的T細(xì)胞系檢測(cè)靶中的細(xì)胞凋亡。將T細(xì)胞系(第4次刺激)用來(lái)自供體的首次用于實(shí)驗(yàn)的自體PBMC以所指出的比率稀釋并與相等數(shù)目(100,000)的肽脈沖的T2靶細(xì)胞混合。兩種測(cè)定法產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，具有相似水平的靈敏性(圖5B)。然而，我們注意到許多實(shí)驗(yàn)中膜聯(lián)蛋白-V+7-AAD測(cè)定法具有明顯更高的非特異背景。此外，我們發(fā)現(xiàn)樣品之間膜聯(lián)蛋白-V熒光水平有很相當(dāng)大變化(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)合磷脂酰絲氨酸的膜聯(lián)蛋白V是Ca2+敏感的并且Ca2+濃度的輕微改變就可以改變膜聯(lián)蛋白-V結(jié)合平衡。當(dāng)對(duì)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割染色時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)染色熒光的該變化。
除了較低背景，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法還顯示出在示蹤C(jī)TL活性中的很大程度的靈敏性，如通過(guò)在1∶7稀度的效應(yīng)細(xì)胞下檢測(cè)到特異CTL活性所示的(圖5B；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割)。我們還測(cè)定了用于圖5B與IFN-γELISPOT測(cè)定法(未顯示)的T細(xì)胞系中CAP1-特異的T細(xì)胞的頻率并且發(fā)現(xiàn)了1∶237的頻率。根據(jù)這些結(jié)果，我們估計(jì)圖5B中1∶3和1∶7稀度的CAP1-特異的T細(xì)胞的頻率分別為1∶711(0.14％)和1∶1659(0.06％)。這提示該測(cè)定法是靈敏的并且能夠檢測(cè)稀有抗原特異的CD8+T細(xì)胞，特別是對(duì)于其中CTL頻率相當(dāng)?shù)偷腡AA。
D.基于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割的CTL測(cè)定法的靈敏性為進(jìn)一步測(cè)試該測(cè)定法的靈敏度極限，用小鼠MLR效應(yīng)細(xì)胞和活化的肽-特異的人T細(xì)胞系進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，其中將效應(yīng)細(xì)胞分別用首次用于實(shí)驗(yàn)的同基因脾細(xì)胞或者用首次用于實(shí)驗(yàn)的自體PBMC稀釋到最高達(dá)1∶199。
收獲MLR后使用首次用于實(shí)驗(yàn)的同基因C57BL/6脾細(xì)胞將C57BL/6抗-Balb/c MLR效應(yīng)細(xì)胞以1∶0(無(wú)稀釋)到1∶199稀釋?zhuān)⒂盟鲂?yīng)細(xì)胞進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)(圖6)。將稀釋的效應(yīng)細(xì)胞與DDAO-SE-標(biāo)記的P815細(xì)胞以1∶1的比率溫育。僅靶細(xì)胞和首次用于實(shí)驗(yàn)的脾細(xì)胞用作CTL活性的負(fù)對(duì)照并且DDAO-SE-標(biāo)記的EL-4靶用作特異性對(duì)照。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割顯示出高度靈敏性，如甚至當(dāng)將MLR效應(yīng)細(xì)胞用首次用于實(shí)驗(yàn)的脾細(xì)胞以1∶199比率稀釋時(shí)也存在明顯天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割所證實(shí)的(圖6)。在非特異的EL4靶中在所有稀度下都見(jiàn)到可忽略水平的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割(圖6)。發(fā)現(xiàn)在一般的鼠MLR中異(allo)-反應(yīng)性CD8+脾細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)高達(dá)1∶10。從而，假定在MLR中存在該頻率的抗-Balb/c效應(yīng)細(xì)胞，在用首次用于實(shí)驗(yàn)的脾細(xì)胞以1∶199稀釋時(shí)，該測(cè)定法能夠在1∶2,000(0.05％)頻率的效應(yīng)細(xì)胞檢測(cè)CTL活性。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)至少3次，得到相似結(jié)果。
來(lái)自首次用于實(shí)驗(yàn)的PBMC庫(kù)的3到4輪刺激后，用HIV肽特異的人HLA-A*0201-限制的T細(xì)胞系進(jìn)行相似的稀釋實(shí)驗(yàn)(圖7)。在圖9中所示實(shí)驗(yàn)中，IFN-γELISPOT分析估計(jì)在3次刺激后，培養(yǎng)物中HIV-肽特異的T細(xì)胞的頻率為1∶156(0.64％)。將這些T細(xì)胞培養(yǎng)物用首次用于實(shí)驗(yàn)的自體PBMC以1∶0到1∶199的比率稀釋。如前面，僅DDAO-SE-標(biāo)記的T2淋巴瘤細(xì)胞靶和與HIV肽脈沖的T2靶溫育的首次用于實(shí)驗(yàn)的PBMC-活化的T細(xì)胞用作負(fù)對(duì)照，而用HLA-A*0201-結(jié)合性pp65CMV肽脈沖的T2細(xì)胞用作特異性對(duì)照。如圖7B和9B中所示，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割的測(cè)量非常靈敏，在低達(dá)1∶99和1∶199的效應(yīng)細(xì)胞稀度下也檢測(cè)到顯著活性。在HIV肽脈沖的T2細(xì)胞中，在1∶99和1∶199的稀度下天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割率分別為5.7％和6％，而在非特異的pp65CMV肽脈沖的靶中，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割率分別僅為2.1％和2.2％。使用CMV肽的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割的細(xì)胞的該低百分率不隨著效應(yīng)細(xì)胞稀度的減小而增加。靶-效應(yīng)細(xì)胞和首次用于實(shí)驗(yàn)的PBMC+靶細(xì)胞中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割百分?jǐn)?shù)小于2％(圖7B)。作為該測(cè)定法靈敏性的進(jìn)一步測(cè)試，我們還用直接染色抗原特異性T細(xì)胞的TCR的HLA-肽五聚體(ProImmune，Oxford，英國(guó))染色HIV gag-特異的T細(xì)胞系(圖7C)。圖7C顯示了用于圖7B中所示天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法中的相同T細(xì)胞上的五聚體染色結(jié)果。該分析揭示天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法與HLA五聚體染色有相當(dāng)水平的靈敏性。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割測(cè)定法(圖7B)中HIV gag-特異的T細(xì)胞的頻率(基于IFN-γELISPOT頻率)對(duì)于效應(yīng)細(xì)胞的1∶99和1∶199稀度分別為1∶15,444(0.007％)和1∶31,044(0.003％)。這代表了高水平的靈敏性，使得當(dāng)抗原特異的T細(xì)胞頻率相當(dāng)?shù)蜁r(shí)，該測(cè)定法可用于定量CTL活性。此外，與基于五聚體或者四聚體的方法不同，它測(cè)量T細(xì)胞功能而不僅僅測(cè)量T細(xì)胞頻率。
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權(quán)利要求
1.檢測(cè)免疫效應(yīng)細(xì)胞群體針對(duì)靶細(xì)胞群體的細(xì)胞毒性活性的方法，該方法包括如下步驟組合a)將免疫效應(yīng)細(xì)胞群體暴露于靶細(xì)胞群體；b)以足夠的時(shí)間段且在適于免疫效應(yīng)細(xì)胞影響靶細(xì)胞的條件下溫育細(xì)胞，從而使得靶細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡途徑被活化；c)固定和透化所混合的細(xì)胞群體；d)將混合的細(xì)胞群體暴露于可檢測(cè)的試劑，該試劑能夠結(jié)合在細(xì)胞凋亡過(guò)程中經(jīng)歷改變或者由細(xì)胞凋亡過(guò)程導(dǎo)致改變的蛋白質(zhì)或者其片段；和e)檢測(cè)所述可檢測(cè)的試劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫效應(yīng)細(xì)胞是T細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶細(xì)胞是病毒感染的細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)的蛋白質(zhì)是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測(cè)的試劑是抗體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測(cè)的試劑是熒光標(biāo)記的抗體。
8.權(quán)利要求1的方法，其中用流式細(xì)胞儀完成步驟e)的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞毒性相關(guān)酶的切割來(lái)檢測(cè)CTL活性的方法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101065669SQ200580002955
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月23日
發(fā)明者P·鄧, L·何, L·拉德萬(wàn)伊, D·薩爾哈 申請(qǐng)人:圣諾菲·帕斯圖爾公司