專利名稱：Cjd朊病毒的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動物研究對象中傳播性海綿狀腦病(TSE)的檢驗(yàn)方法及其方法的改進(jìn)。
海綿狀腦病是一組變性性神經(jīng)疾病。在許多種哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該病的實(shí)例，包括羊(稱為瘙癢病)、牛(BSE)和人類(克-雅病CJD、新型克-雅病變種(nvCJD)和庫魯病(kuru))。已經(jīng)有關(guān)于在實(shí)驗(yàn)室條件下，TSE可以從一種哺乳動物傳播到另一種哺乳動物的報道。這種傳染性物質(zhì)對不同物種之間壁壘的跨越，引起了人們對人類能夠通過攝取來自被感染的動物性食品的物質(zhì)，尤其是牛源性物質(zhì)，而被感染的廣泛擔(dān)心。
TSE的特征是在漫長的潛伏期后，出現(xiàn)表現(xiàn)為精神狀態(tài)進(jìn)行性退化的臨床癥狀，包括攻擊性和缺乏協(xié)調(diào)性。驗(yàn)尸顯示腦組織空泡化的特征模式，這是由于神經(jīng)細(xì)胞被破壞和異常蛋白質(zhì)纖維沉淀所致。
雖然在羊中發(fā)現(xiàn)海綿狀腦病形式已知許多年了，但是隨著牛的BSE和人類的nvCJD的出現(xiàn)，該病變得更為突出。
人們認(rèn)為TSE的致病物質(zhì)是所謂“朊病毒”，一種只包含蛋白質(zhì)而沒有核酸的傳染性物質(zhì)。在TSE中，一種特殊蛋白質(zhì)(稱為朊病毒蛋白，PrP)被確定為傳染性物質(zhì)。PrP是一種天然存在的細(xì)胞蛋白質(zhì)，它以兩種同功型存在，這兩種同功型的差異在于其三級結(jié)構(gòu)的不同，這樣可以通過它們對酶降解(如，蛋白酶K)的不同反應(yīng)來區(qū)別它們。結(jié)果是，非傳染性同功型niPrP完全被蛋白酶K消化，而傳染性同功型iPrP被降解為可以檢測到的多肽殘基PrP27-30。
許多哺乳動物的PrP的氨基酸序列是已知的，并可以從例如SwissProt得到。殘基PrP27-30的氨基酸序列也同樣已知。不同哺乳動物的PrP序列之間有很高的同源性。
幾家公司已經(jīng)研發(fā)了一些用于尸檢診斷TSE的檢驗(yàn)方法，這些方法通常基于與來自蛋白水解消化的腦組織樣品之PrP27-30結(jié)合的抗體的使用。
從愛爾蘭都柏林的Enfer可以得到一個這類檢驗(yàn)方法，它使用EP-B-616613中所描述的技術(shù)。更特別的是，Enfer檢測方法使用兩種多克隆抗體，所述抗體針對的免疫原性綴合物之多肽序列對應(yīng)于(i)PrP27-30的節(jié)段和(ii)PrP27-30部分以外的PrP節(jié)段。這些節(jié)段在EP-B-616613中分別被稱為Vc和Va。
雖然商業(yè)性檢驗(yàn)方法取得一些成功，始終仍需要對TSE檢驗(yàn)方法不斷改進(jìn)，尤其是用于臨死前或者不需要腦組織樣品的檢驗(yàn)方法。
本發(fā)明恰恰提供了這樣的改進(jìn)了的檢驗(yàn)方法。
因此，從一方面看，本發(fā)明提供了從哺乳動物研究對象樣品中檢測傳染性朊病毒蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)方法。所述方法包括從所述研究對象中獲得含有朊病毒蛋白質(zhì)的樣品；用所述樣品與可以消化非傳染性朊病毒蛋白質(zhì)和部分地消化傳染性朊病毒蛋白質(zhì)的物質(zhì)接觸，以產(chǎn)生朊病毒蛋白質(zhì)多肽殘基；用消化后的樣品接觸抗體，該抗體可以與具有如下氨基酸序列Vc的多肽結(jié)合，(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Gly-Gly-R1-R2-His-R3-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-R4-Lys-Pro-Lys-Thr-R5-R6-Lys(-His-R7-Ala-Gly)(Vc)(其中R1是甘氨酸或者缺失；R2是蘇氨酸或者絲氨酸；R3是選自甘氨酸、絲氨酸和天冬酰胺缺失的氨基酸殘基；R4和R5彼此獨(dú)立，是天冬酰胺或者絲氨酸；R6是選自甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的氨基酸殘基；R7是纈氨酸或者甲硫氨酸；并且其中括號內(nèi)的一個或者更多殘基可以存在或者不存在，條件是如果它們存在的話它們與序列中肽的剩余部分相連接)；以及檢測所述抗體和所述朊病毒蛋白質(zhì)多肽殘基的綴合物；本方法的特征在于對所述綴合物的檢測包括對可檢測物的化學(xué)、生物或生物化學(xué)擴(kuò)增，尤其優(yōu)選生物化學(xué)或生物學(xué)擴(kuò)增，以及對所擴(kuò)增物的檢測。
能夠結(jié)合Vc的抗體優(yōu)選是針對氨基酸序列Vc的合成多肽的免疫原性綴合物(或者更優(yōu)選如以下描述的Vc’)產(chǎn)生的抗體，例如通過使用上述免疫原性綴合物免疫接種哺乳動物并收集血清或者Vc-結(jié)合IgG。
在本發(fā)明的方法中所使用的含朊病毒蛋白質(zhì)的樣品可以是含朊病毒蛋白質(zhì)的任何身體組織、液體或物質(zhì)的樣品，如，肌肉、扁桃體、腦、血液、尿液、糞便，等等。所述樣品也可以是來自血庫的血液、血清或者血漿、血液產(chǎn)物(如，凝集因子)、組織產(chǎn)物、含有哺乳動物產(chǎn)物的培養(yǎng)基(如BSA)、來自哺乳動物的藥物組分(如肝素)等。對于驗(yàn)尸檢驗(yàn)，理想地是使用腦組織，這是由于腦組織中朊病毒含量高。對于臨死前檢驗(yàn)，樣品優(yōu)選是活檢組織樣品、血液、尿液或者糞便。樣品優(yōu)選進(jìn)行預(yù)處理以裂解其中的細(xì)胞，例如，通過勻漿或其它組織破碎方法。
然后用朊病毒蛋白質(zhì)消化物質(zhì)(如，蛋白酶K)，在一定條件下接觸該樣品足夠長時間，來消化非傳染性朊病毒蛋白質(zhì)。這些處理方法、處理?xiàng)l件和持續(xù)時間為本領(lǐng)域公知。
如果需要的話，可以在消化前和/或消化后處理樣品(例如，通過離心、層析等)以分離出除了未消化的或部分消化的朊病毒蛋白質(zhì)以外的樣品組分和/或消化產(chǎn)物。
消化之后，用Vc-結(jié)合抗體接觸樣品。這步可以按EP-B-616613中描述的制備。特別優(yōu)選地，用帶有一個免疫原性載體(如，破傷風(fēng)類毒素、卵白蛋白等)的具有GQGGSHSQWNKPSKPKTNMKHVGC(Vc′)序列的多肽綴合物來制備該抗體?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)的連接物質(zhì)，例如，間馬來酰亞胺-苯甲?；?N-羥基硫基琥珀酰亞胺酯(SMBS)等來實(shí)現(xiàn)綴合。該抗體優(yōu)選為多克隆抗體?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的抗體制備技術(shù)。
用常規(guī)蛋白質(zhì)固定技術(shù)，可以把Vc-結(jié)合抗體固定在基質(zhì)上(如平的表面、選擇性地，超順磁性珠、棒、網(wǎng)孔、管等)。
作為選擇，可以使用非固定化的Vc-結(jié)合抗體。
檢驗(yàn)方法的檢測階段中的一系列精確步驟取決于使用的是固定化還是非固定化的Vc-結(jié)合抗體，以及對化學(xué)、生物或生物化學(xué)擴(kuò)增技術(shù)的選擇。
進(jìn)行化學(xué)擴(kuò)增意味著使用非生物化學(xué)的化學(xué)反應(yīng)(如，用通常在生物學(xué)環(huán)境中找不到的化學(xué)物質(zhì)來催化反應(yīng))來產(chǎn)生可檢測物，可檢測物存在與否是抗體朊病毒蛋白質(zhì)多肽殘基綴合物存在的指征。
進(jìn)行生物學(xué)擴(kuò)增意味著使用微生物來產(chǎn)生可檢測物(如，化學(xué)物質(zhì)、微生物等)?？蓹z測物的存在與否是抗體朊病毒蛋白質(zhì)多肽殘基綴合物存在的指征。
進(jìn)行生物化學(xué)擴(kuò)增意味著使用生物化學(xué)反應(yīng)(如，酶促反應(yīng)或核酸擴(kuò)增，如，PCR)來產(chǎn)生可檢測物(如，化學(xué)物質(zhì))?？蓹z測物存在與否是抗體朊病毒蛋白質(zhì)多肽殘基綴合物存在的指征。
被擴(kuò)增物或引發(fā)擴(kuò)增物質(zhì)可以與所述Vc-結(jié)合抗體或另一個能夠結(jié)合抗體殘基綴合物的物質(zhì)(如，第二抗體)綴合。在該物質(zhì)與所述Vc-結(jié)合抗體綴合時，其行使功能的能力可能不會受到與PrP27-30綴合的影響，或者它可以被這種綴合活化或失活。其結(jié)果是，沒有反應(yīng)的抗體可以或不必從抗體殘基綴合物中分離出去。這在免疫檢測過程中是常規(guī)的，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會很容易理解應(yīng)該采用的所述步驟。當(dāng)被擴(kuò)增或引起擴(kuò)增的物質(zhì)從Vc-結(jié)合抗體中分離后，一般需要從所述抗體殘基綴合物中分離出未綴合的抗體。在免疫檢測過程序中這也是常規(guī)的，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將很容易理解應(yīng)該采用的所述步驟。
所述被擴(kuò)增或者引發(fā)擴(kuò)增物可以包含一種以上組分。在這種情況下，組分之一可以與所述Vc-結(jié)合抗體綴合，另一種組分可以與能夠結(jié)合所述抗體殘基綴合物的單獨(dú)物質(zhì)相綴合。同樣，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員清楚是否需要從抗體殘基綴合物中分離沒有綴合的Vc-結(jié)合抗體。當(dāng)使用這種兩個或更多組分系統(tǒng)時，優(yōu)選的情況是不同組分一起引起一個不同于單一組分自己引起的擴(kuò)增效應(yīng)，如，它們可以是催化多步反應(yīng)的不同步驟的催化劑(如，酶)或者可以是對相同或不同目標(biāo)微生物有不同效應(yīng)的病毒物質(zhì)。
當(dāng)本發(fā)明的檢驗(yàn)方法中使用第二種結(jié)合物質(zhì)時，它優(yōu)選地也是抗體。然而，如果需要的話，可以使用其它結(jié)合物質(zhì)。
除非另有說明，如這里所使用的，術(shù)語抗體可以是這樣的抗體或者其功能性片段(例如Fab片段)、單鏈抗體或寡聚體抗體構(gòu)建體。這些物質(zhì)可以按常規(guī)工藝制備。
為了避免不必要的假陰性，本發(fā)明的檢驗(yàn)方法也優(yōu)選包括檢測原始樣品的一部分之PrP含量。這可以便利的做到，例如，象所述的BSE商業(yè)檢測方法使用PrP結(jié)合抗體。
在這種情況下，所述PrP結(jié)合抗體應(yīng)該能夠結(jié)合于iPrP和/或niPrP或其通過變性或部分消化所暴露出的片段。在文獻(xiàn)中有關(guān)于這類抗體的描述。
然而在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對非PK消化的樣品(即與Vc-結(jié)合抗體類似，省略了niPrP的消化步驟)，使用Va-結(jié)合抗體，。特別優(yōu)選地，使用的抗體是如下文所定義的Va結(jié)合抗體。尤其優(yōu)選地，這種抗體是針對氨基酸序列Va的合成多肽的免疫原性綴合物(或者更優(yōu)選如以下描述的Va’)的抗體，例如，通過使用上述免疫原性綴合物免疫接種哺乳動物并收集血清或者Va-結(jié)合IgG。
Va-結(jié)合抗體是指能夠結(jié)合如下序列多肽的抗體(Pro-Gly-Gly-R8)-Trp-Asn-Thr-Gly-Gly-Ser-Arg-Tyr-Pro-Gly-Gln-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Asn-Arg-Tyr-Pro-Pro-Gln-Gly-(Gly-R9-R10-Trp)(Va)。
其中R8和R9彼此獨(dú)立，是甘氨酸或缺失；R10是甘氨酸或蘇氨酸；并且其中括號內(nèi)的一個或者更多殘基可以存在或者不存在，條件是如果它們存在的話它們與序列中肽的剩余部分相連接。
這個Va-結(jié)合抗體可以按EP-B-616613中描述的制備。特別優(yōu)選地，用多肽序列的綴合物制備抗體。這可以按EP-B-616613中描述的制備。特別優(yōu)選地，用帶有一個免疫原性載體(如，破傷風(fēng)類毒素、卵白蛋白等)、具有GGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGC(Va′)序列的多肽綴合物來制備抗體。可以用標(biāo)準(zhǔn)的連接物質(zhì)(例如，SMBS)來實(shí)現(xiàn)綴合。該抗體優(yōu)選為多克隆抗體?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的抗體制備技術(shù)。
如果臨死前TSE檢測結(jié)果是陽性的，優(yōu)選使用包含Vc-結(jié)合抗體的治療性物質(zhì)處理研究對象。這可以只是抗體或者是該抗體與一種物質(zhì)的綴合物，該物質(zhì)起阻礙niPrP向iPrP轉(zhuǎn)化或降解iPrP的作用。在人類TSE的情況下，該治療性抗體優(yōu)選是所選抗體(即，如上文定義的抗-Vc或抗-Va抗體)。給藥方式優(yōu)選為注射或灌注入，例如，進(jìn)入CSF。給藥劑量可以使用TSE感染的動物模型按常規(guī)確定。這種治療性使用形式是本發(fā)明的另一個方面。
從更進(jìn)一步方面看，本發(fā)明提供了用于本發(fā)明中所述檢驗(yàn)方法的試劑盒。所述試劑盒包括(i)Vc-結(jié)合抗體；(ii)任選地且優(yōu)選的Va-結(jié)合抗體；(iii)任選地且優(yōu)選的蛋白酶K；(iv)能夠進(jìn)行可檢測物化學(xué)、生物或生物化學(xué)擴(kuò)增、優(yōu)選生物或生物化學(xué)擴(kuò)增和檢測的物質(zhì)，或者能夠引起可檢測物化學(xué)、生物或生物化學(xué)擴(kuò)增、優(yōu)選生物或生物化學(xué)擴(kuò)增的物質(zhì)，所述物質(zhì)任選地與抗體(i)綴合；且(v)任選地且優(yōu)選地，用于進(jìn)行所述檢驗(yàn)方法的說明。
盡管該物質(zhì)(iv)可以是酶或其它催化劑，其優(yōu)選是在擴(kuò)增過程中自我復(fù)制的物質(zhì)。
參考以下非結(jié)合實(shí)施例，將進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1樣品制備用合適的方法打碎初始組織，如，使用杵和離心管在去垢劑緩沖液中勻漿，以得到粗的勻漿物，其可以通過離心使之澄清。用可以用于蛋白酶K消化的適宜緩沖液稀釋該組織勻漿樣品至工作濃度。
實(shí)施例2朊病毒蛋白質(zhì)消化為了將iPrP和niPrP區(qū)別開，該檢測系統(tǒng)依賴于iPrP對該蛋白酶K(PK)消化的相對耐受性(見Kretzschmar，Clin Lab Med.P109-128(2003)。PK處理的一般條件是將稀釋的勻漿樣品分為兩等份，向其中一等份中加入PK并進(jìn)行溫育(如，37℃，30分鐘)。
實(shí)施例3Vc-結(jié)合抗體添加從用Vc肽綴合物疫苗免疫的動物血液中制備血清或純化的IgG。然后，將這些血清稀釋到工作濃度，接觸上述PK消化的勻漿樣品并進(jìn)行溫育(如，20-25℃，1小時)。
實(shí)施例4信號擴(kuò)增和檢測信號擴(kuò)增一般需要應(yīng)用生物化學(xué)技術(shù)、分子或綴合第二抗體技術(shù)。綴合生物素分子的抗體溫育(如，20-25℃，1小時)是個例子。通過添加與馬的辣根過氧化物酶綴合的卵白素(生物素結(jié)合物質(zhì))而被擴(kuò)增(如，20-25℃，1小時)，并用生色底物檢測、在分光光度計上讀取特定吸收。
實(shí)施例5抗體效力分別用Vc’和Va’的抗原性綴合物免疫動物所制備的Vc-結(jié)合和Va-結(jié)合多克隆抗體，在存在或者不存在蛋白酶K消化的條件下，與如上文所述制備的來自CJD感染的和未感染的人腦勻漿物接觸。然后將該樣品進(jìn)行Western印跡分析，結(jié)果示于附

圖1和圖2。圖1和圖2分別是Va-結(jié)合抗體和Vc-結(jié)合抗體。在每個圖中，泳道1為未感染的勻漿物，泳道2為PK處理的未感染的勻漿物，泳道3是感染的勻漿物，泳道4是PK處理的感染的勻漿物。
權(quán)利要求
1.用于檢測哺乳動物研究對象的樣品中傳染性朊病毒蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)方法，所述方法包括從所述研究對象中獲得含有朊病毒蛋白質(zhì)的樣品；將所述樣品與用于消化非傳染性朊病毒蛋白質(zhì)和用于部分消化傳染性朊病毒蛋白質(zhì)的物質(zhì)接觸，以產(chǎn)生朊病毒蛋白質(zhì)多肽殘基；用抗體與所述消化的樣品接觸，該抗體能夠結(jié)合帶有如下氨基酸序列Vc的多肽(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Gly-Gly-R1-R2-His-R3-Gln-TrpAsn-Lys-Pro-R4-Lys-Pro-Lys-Thr-R5-R6-Lys(-His-R7-Ala-Gly)(Vc)(其中R1是甘氨酸或者缺失；R2是蘇氨酸或者絲氨酸；R3是選自甘氨酸、絲氨酸和天冬酰胺的氨基酸殘基；R4和R5彼此獨(dú)立的是天冬酰胺或者絲氨酸；R6是選自甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的氨基酸殘基；R7是纈氨酸或者甲硫氨酸；并且其中括號內(nèi)的一個或者多個殘基可以存在或者不存在，條件是如果它們存在的話它們與序列中肽的剩余部分相連接)；以及檢測所述抗體和所述朊病毒蛋白質(zhì)多肽殘基的綴合物；特征在于對所述綴合物的檢測包括對可檢測物的化學(xué)、生物或生物化學(xué)擴(kuò)增，以及對該擴(kuò)增物的檢測。
2.如權(quán)利要求1中的方法，其中所述研究對象為人，優(yōu)選為有生命的。
3.如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2中任一項(xiàng)的方法，用于檢測與CJD，nvCJD或kuru相關(guān)的傳染性朊病毒蛋白質(zhì)。
4.用于權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)檢驗(yàn)方法的試劑盒，所述試劑盒包含(i)Vc-結(jié)合抗體；(ii)任選地Va-結(jié)合抗體；(iii)任選地蛋白酶K；(iv)能夠進(jìn)行可檢測物的化學(xué)、生物或生物化學(xué)擴(kuò)增和檢測、或能夠引起可檢測物化學(xué)、生物或生物化學(xué)擴(kuò)增的物質(zhì)，所述物質(zhì)任選地與抗體(i)綴合；且(v)任選地，用于進(jìn)行所述檢驗(yàn)方法的說明。
5.iPrP結(jié)合抗體在制備用于治療人類TSE的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測哺乳動物研究對象的樣品中傳染性朊病毒蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)方法。所述方法包括從所述研究對象中獲得含有朊病毒蛋白質(zhì)的樣品；將所述樣品與含有用于消化非傳染性朊病毒蛋白質(zhì)和用于部分消化傳染性朊病毒蛋白質(zhì)的物質(zhì)相接觸，以產(chǎn)生朊病毒蛋白質(zhì)多肽殘基；用抗體接觸消化后的樣品，該抗體可以與具有氨基酸序列Vc的多肽結(jié)合(Gly－Gly－Gly－Trp)－Gly－Gln－Gly－Gly－R1－R2－His－R3－Gln－Trp－Asn－Lys－Pro－R4－Lys－Pro－Lys－Thr－R5－R6－Lys(－His－R7－Ala－Gly)(Vc)，并檢測所述抗體和所述朊病毒蛋白質(zhì)多肽殘基的綴合物；本方法的特征在于對所述綴合物的檢測包括對可檢測物的化學(xué)、生物或生物化學(xué)擴(kuò)增，以及對擴(kuò)增物的檢測。
文檔編號G01N33/68GK1922491SQ200580005514
公開日2007年2月28日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日
發(fā)明者M·R·唐尼安姆, J·F·格洛弗, R·E·漢尼利 申請人:普羅塞瑞克斯分子設(shè)計有限公司