專利名稱：用于進行核酸序列的擴增和檢測過程的診斷系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及核酸(NA)的提取，具體地，本發(fā)明涉及用于合并進行NA的提取和濃縮的集成的芯片實驗室(lab-on-a-chip)診斷系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可以用來對含有細胞的流體樣品進行NA序列的擴增和檢測過程。
背景技術：
開發(fā)以下用于檢測生物分子的簡化的分析系統(tǒng)是相當令人感興趣的，即，所述系統(tǒng)使不熟練的使用者可以進行復雜的分析程序而不會出現(xiàn)不當?shù)腻e誤。而且，開發(fā)完備的(contained)以下分析系統(tǒng)是非常令人感興趣的，即，該系統(tǒng)需要最少的液體試劑操作以及使分析程序自動進行而使用者的干預最少，并且還優(yōu)選進行了微型化從而提供用于護理地點檢測的便捷系統(tǒng)。這與保健領域特別是診斷學尤其相關，在這些領域中，越來越需要可以在醫(yī)生的診所、診療所、獸醫(yī)診所或者甚至在患者的家中或野外有效而安全地進行操作的生物分析系統(tǒng)。
微制造的“芯片實驗室”裝置是用于進行對使用者所要求的試劑操作最少的完備的生物反應的誘人選擇，并允許使用較小的樣品體積，這對需要昂貴試劑的生物反應是非常有利的。
為了同時實現(xiàn)純化和預濃縮，分析化學家們通常求助于某種提取程序。這些方法包括從樣品基質中分離感興趣的分析物，或者作為選擇，從樣品基質中除去所有其它物質而留下感興趣的分析物。提取過程可以包括將各物質從一個液相中轉移到另一個液相中，或者將各物質從液相中捕獲到固體表面上。在前者情況下，物質的預濃縮通常是難以實現(xiàn)的，除非將溶劑從含有該物質的相中有效除去。但是，在后者的情況下，如果(a)可獲得的結合面積大到在任何時候都足以結合多于與該表面接觸的溶液中所存在的分子，和(b)只用少量的洗脫劑就可以將該物質從固相上有效移去，那么就可以進行預濃縮。由于預濃縮是核酸樣品預處理程序的重要方面，因此固相提取已經得到應用。一種涉及在離液劑存在下將DNA結合到二氧化硅粒子上的核酸提取方法已經得到充分確立(見Boom等，J.Clin.Microbiol.1990，28，495-503)。本發(fā)明涉及將DNA固相提取法集成到微流體裝置中。
在本發(fā)明中，NA提取和濃縮可以合并進行。
本文使用的術語“微制造裝置或系統(tǒng)”是指以常用于而非專用于批量生產半導體微電子裝置和在近年用于生產半導體微機械裝置的方法而制造的任何裝置。所述微制造技術包括例如外延生長(例如汽相、液相、分子束、金屬有機化學汽相沉積)、平版印刷(例如光平版印刷、電子束平版印刷、x射線平版印刷、離子束平版印刷)、蝕刻(例如化學蝕刻、氣相蝕刻、等離子體蝕刻)、電沉積、濺射、擴散摻雜和離子注入。盡管可以使用諸如玻璃等非晶體材料，但是微制造裝置通常形成在諸如硅或砷化鎵等晶體半導體基材上，其優(yōu)點是通過使用常規(guī)的集成電路制造技術，可以將電子電路集成到所述系統(tǒng)中。將微制造組件與諸如玻璃板或輔助微制造元件等一個或多個其它元件進行組合是經常采用的，并意欲落在本文使用的術語“微制造(的)”的范圍中。落在術語“微制造(的)”的范圍中的還有由例如晶體半導體基材制得的聚合復制物。
從細菌細胞和病毒粒子中分離和純化DNA和/或RNA是諸如診斷學、環(huán)境監(jiān)測、法醫(yī)學和分子生物學研究等很多技術領域中的關鍵步驟。
微制造是制造用于進行期望使用極少量的樣品的生物過程(例如DNA序列的分析和檢測)的裝置的有吸引力的構造方法。
US 5,674,742公開了一種這樣的裝置，以進行聚合酶鏈式反應(PCR)然后進行檢測步驟。因為需要進行PCR過程并且在需要進行PCR過程時，蘭姆波泵被用來將DNA引物、聚合酶試劑和核苷酸試劑從3個分開的貯存室中運輸?shù)絾我坏姆磻抑?，反應室的溫度根據需要而循環(huán)。
Analytical Chemistry(1994，66，4127-4132)公開了另一種用于進行化學反應步驟然后進行電泳分離步驟的微制造裝置。在用玻璃板覆蓋的硅基材中的經蝕刻的結構提供反應室和與緩沖液、分析物、試劑和分析物廢料貯存部的連接，以及與廢料貯存部連接的電泳柱。
基于核酸序列的擴增(NASBA)是一種引物依賴性的技術，該技術可以用于在一個溫度對單一混合物中的核酸進行連續(xù)擴增(等溫核酸擴增法)，并且是所述基于第一RNA轉錄的擴增法之一。NASBA通常提供用于核酸擴增的PCR的一種簡單快速的替代方案，并且能夠在90分鐘內獲得十億倍的RNA擴增。對于諸如PCR技術等其它擴增系統(tǒng)，NASBA均一而等溫地擴增RNA分析物的能力使其應用范圍從病毒診斷延伸到諸如基因表達和細胞活力等生物活性的指示。在例如Nature(第350卷，第91和92頁)中有NASBA技術的討論。NASBA中的核酸擴增通過AMV反轉錄酶、Rnase H和T7 RNA聚合酶的協(xié)同的酶活性以及引物對來實現(xiàn)，從而使容易用來通過雜交方法進行檢測的主要單鏈RNA得到積累。NASBA的內標RNA的使用導致動力學范圍為4個對數(shù)(log)的定量核酸檢測法的產生，但是該方法在每次定量時需要6次擴增反應。通過應用以不同量加入的多倍的、可區(qū)別的內標RNA和通過電化學發(fā)光法(ECL)檢測技術可以使所述方法得到明顯改進。這種單管定量(Q)NASBA每次定量只需要單步驟的擴增過程，并能夠在核酸實際分離之前將內標加入到裂解緩沖液中的臨床樣品中。這一方法的優(yōu)點在于，核酸的分離效率對定量結果沒有影響，這與在野生型核酸與臨床樣品分離后將內標與所述野生型核酸混合的方法相反。在Nucleic Acid Research(1998，第26卷，第2150-2155)中有定量NASBA的討論。但是，NASBA后的產物檢測可能仍然是一個勞動密集型的過程，其通常涉及基于酶珠的檢測和電化學發(fā)光(ECL)檢測或與熒光有關的光譜測定。但是，由于這些方法技術具有非均質性或者它們需要對樣品進行一些處理或者需要目前沒有成本效率的自動機械裝置，因此相對來說它們幾乎不用于高通量應用中。通過產生靶特異信號而使產物檢測與靶擴增同時進行的均質程序將有利于大批量篩查和完全自動化。最近，介紹了一種基于只有與其靶雜交才產生熒光的探針(分子信標)的新的核酸檢測技術。
流體學是液體在例如管中流動的科學。對于微制造裝置，使用該裝置外面的諸如注射器、旋轉泵或者預加料(precharged)的真空或者壓力源等泵，通?？梢允沽黧w流過一組或多組微米級或納米級的反應室?；蛘撸梢詫⑽⑿捅没蛘哒婵帐一蛘咛m姆波泵送元件作為裝置本身的一部分提供?？梢允褂冒ū谩㈤y和預加料的真空和壓力室在內的流動控制元件的其它組合來控制流體穿過反應室的流動。其它用于在該系統(tǒng)中運輸流體的機制包括電滲透流。
公開號為WO 02/22265的國際專利申請涉及一種微制造反應室系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以用在進行NASBA的方法中。國際專利申請PCT/GB02/005945涉及微制造反應室系統(tǒng)和流體運輸?shù)姆椒?。該系統(tǒng)也可以用在進行NASBA的方法中。國際專利申請PCT/GB03/004768涉及用于使核酸片段化的微流體裝置。該裝置可以在用于進行NASBA的微制造反應室系統(tǒng)中使用，或者用來與該微制造反應室系統(tǒng)進行組合。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供用于對含有細胞和/或粒子的流體樣品進行樣品制備過程的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括(a)流體樣品入口；(b)裂解單元，所述裂解單元用于裂解包含在所述流體樣品中的細胞和/或粒子；(c)核酸提取單元，所述核酸提取單元用于從所述流體樣品所包含的細胞和/或粒子中提取核酸；(d)盛裝裂解流體的貯存部；(e)盛裝洗脫劑的貯存部，所述洗脫劑用于移去在核酸提取單元中收集的核酸；其中，樣品入口與裂解單元流體連接，為控制樣品入口與裂解單元之間的流體的流動而選擇性地存在閥門；其中裂解單元與核酸提取單元流體連接，為控制裂解單元與核酸提取單元之間的流體的流動而選擇性地存在閥門；其中盛裝裂解流體的貯存部與裂解單元流體連接，為控制盛裝裂解流體的貯存部與裂解單元之間的流體的流動而選擇性地存在閥門；和其中盛裝洗脫劑的貯存部與核酸提取單元流體連接，為控制盛裝洗脫劑的貯存部與核酸提取單元之間的流體的流動而選擇性地存在閥門。
所述系統(tǒng)可以用于常規(guī)診斷所用的毫升級體積的樣品。該系統(tǒng)依賴于預裝載的某些試劑。
在本發(fā)明中，可以對核酸的提取和濃縮進行組合。因此，本發(fā)明提供集成的芯片實驗室診斷系統(tǒng)以進行樣品制備過程。該系統(tǒng)可以用于進行NASBA的微制造反應室系統(tǒng)，或者與該系統(tǒng)相結合。
優(yōu)選所述系統(tǒng)的至少一些組件是微制造的。優(yōu)選地，裂解單元、核酸提取單元、裂解流體貯存部和洗脫劑貯存部是微制造和集成例如形成在普通基材上的。
優(yōu)選盛裝裂解流體的貯存部與所述入口是流體連接的，為控制盛裝裂解流體的貯存部與所述入口之間的流體的流動而選擇性地存在閥門。
優(yōu)選盛裝洗脫劑的貯存部與所述入口是流體連接的，為控制盛裝洗脫劑的貯存部與所述入口之間的流體的流動而選擇性地存在閥門。
本發(fā)明所述的系統(tǒng)通常進一步包括(g)核酸反應單元，其中核酸提取單元與核酸反應單元是流體連接的，為控制核酸提取單元與核酸反應單元之間的流體的流動，可選擇性地存在閥門。優(yōu)選地，核酸反應單元是微制造的，并且優(yōu)選與其它組件集成。在所述反應單元中可以進行任何常規(guī)反應。優(yōu)選地，所述反應可以對特異性靶序列進行檢測和/或定量分析。核酸反應單元通常包括核酸序列擴增和檢測單元，該單元通過核酸擴增反應而能夠檢測特異性序列。其例子包括PCR和諸如NASBA等等溫擴增技術。最優(yōu)選的是使用分子信標的實時NASBA。因此，在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明提供集成的芯片實驗室診斷系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于對包含細胞和/或粒子的流體樣品進行樣品的制備、核酸序列的擴增和檢測過程，更優(yōu)選的是用于實時NASBA。公開號為WO 02/22265的國際專利申請描述了用于進行NASBA的微制造反應室系統(tǒng)。
本發(fā)明所述的系統(tǒng)優(yōu)選包括例如受感染的上皮細胞的濃縮、mRNA的裂解和提取以及實時擴增和檢測。
該系統(tǒng)可以用于例如宮頸癌的篩查。
本發(fā)明所述的系統(tǒng)通常還進一步包括(h)廢料單元，其中所述廢料單元與裂解單元是流體連接的，為控制廢料單元與裂解單元之間的流體的流動而選擇性地存在閥門。優(yōu)選地，所述廢料單元是微制造的，并且優(yōu)選與其它組件集成。
所述系統(tǒng)通常還進一步包括(i)盛裝洗滌溶劑的貯存部，該貯存部與核酸提取單元是流體連接的，為控制盛裝洗滌溶劑的貯存部與核酸提取單元之間的流體的流動而選擇性地存在閥門。優(yōu)選地，所述盛裝洗滌溶劑的貯存部是微制造的，并且優(yōu)選與其它組件集成。洗滌溶劑可以選自任意適當?shù)娜軇莾?yōu)選的是諸如乙醇等易于蒸發(fā)的溶劑。
所述系統(tǒng)通常還進一步包括(j)盛裝洗滌溶劑的貯存部，該貯存部與核酸提取單元是流體連接的，為控制盛裝洗滌溶劑的貯存部與核酸提取單元之間的流體的流動而選擇性地存在閥門。優(yōu)選地，所述盛裝洗滌溶劑的貯存部是微制造的，并且優(yōu)選與其它組件集成。洗滌溶劑可以選自任意適當?shù)娜軇?，但是?yōu)選的是諸如異丙醇等易于蒸發(fā)的溶劑。
所述盛裝洗脫劑的貯存部與盛裝第一洗滌溶劑(例如乙醇)的貯存部和/或盛裝第二洗滌溶劑(例如異丙醇)的貯存部流體連接是有利的。
更有利的是，所述洗脫劑、第一洗滌溶劑(例如乙醇)和/或第二洗滌溶劑(例如異丙醇)盛裝在共同的貯存部中。這可以通過使用諸如空氣等流體使所述洗脫劑、第一洗滌溶劑和/或第二洗滌溶劑于所述共同的貯存部中相互分隔來實現(xiàn)。但是可以使用其它“分隔”流體(液體或氣體)，只要它們與所述洗脫劑、第一洗滌溶劑和/或第二洗滌溶劑不互溶或者至少基本上不互溶即可。
在一個優(yōu)選的實施方式中，所述洗脫劑、乙醇和/或異丙醇盛裝在導管或通道中，所述導管或通道與所述入口和裂解單元是流體連接的。所述洗脫劑、乙醇和/或異丙醇被例如流體間隔(例如空氣間隔)所分隔。
所述系統(tǒng)通常還進一步包括(k)用于將流體樣品和/或空氣導入所述入口中的部件。所述部件優(yōu)選包括泵或注射器。或者，所述部件可以包括一個或多個與所述入口部連接的體積可變室，其中改變所述體積可變室的體積會影響和/或限制流體樣品流入和/或流出所述入口的流動。體積可變室通常包括覆蓋在下層基材中的空凹處上的柔性膜。國際專利申請PCT/GB02/005945描述了一種優(yōu)選的流體運輸系統(tǒng)。
所述系統(tǒng)由單泵送系統(tǒng)驅動是有利的。
所述裂解單元可以具有任意適當?shù)男螤詈蜆嬙欤窃搯卧ǔ橥ǖ阑蚴业男问?。該裂解單元?yōu)選用于裂解包含在流體樣品中的真核的和原核的細胞和粒子。
如果需要，所述系統(tǒng)可以進一步包括過濾單元，該單元與所述裂解單元是流體連接的。該過濾單元可以包括例如交叉流過濾器或者中空過濾器?；蛘?，裂解單元本身可以進一步包括過濾流體樣品的部件。所述部件可以包括例如交叉流過濾器或者中空過濾器，這些過濾器可以與裂解單元集成。
如果需要，所述系統(tǒng)可以進一步包括片段化單元，該單元與所述裂解單元是流體連接的?；蛘?，裂解單元本身進一步包括對流體樣品進行片段化的部件。作為樣品預處理步驟，對DNA或RNA進行隨機片段化通常是必要的。片段化可以使用限制酶通過生化方法來實現(xiàn)，或者通過采用物理力來使分子斷裂(例如見P.N.Hengen，Trends in Biochem.Sci.第22卷，第273-274頁，1997和P.F.Davison，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，第45卷，第1560-1568頁，1959)。通過剪切對DNA進行片段化通常涉及使樣品通過短壓縮件(constriction)。在一個優(yōu)選的實施方式中，DNA和/或RNA在泵過狹窄的孔口時由于對分子的快速牽拉而在機械力下斷裂。壓力驅動流可以產生剪切力，這導致核酸的片段化。國際專利申請PCT/GB03/004768描述了一種用于核酸片段化的微流體裝置。
裂解單元本身可以進一步包括對流體樣品進行過濾的部件和對流體樣品進行片段化的部件。
所述系統(tǒng)可以進一步包括對裂解單元和/或核酸提取單元的內容物進行加熱的部件。所述部件可以包括例如一個或多個位于裂解單元和/或核酸提取單元中或與裂解單元和/或核酸提取單元相鄰的珀爾帖元件。
所述核酸提取單元可以具有任意適當?shù)男螤詈蜆嬙?，但是該單元通常為通道或室的形式。該核酸提取單元?yōu)選用于對包含在流體樣品中的真核的和原核的細胞和粒子進行提取。
所述核酸提取單元可以至少部分地填充有二氧化硅珠子或粒子。可以在二氧化硅珠子或粒子附近提供用于收集和/或預濃縮經洗脫的核酸的一組或多組電極。所述一組或多組電極可以包括例如鉑電極。因此，可以提供用于對所述電極施加電勢差的部件。提取小室(extraction cell)優(yōu)選由聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)形成或者包含聚(二甲基硅氧烷)。該單元通常包括基材和上層覆蓋物，提取單元由基材表面的凹陷處和所述覆蓋物的相鄰表面所限定?；膬?yōu)選由硅聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)形成。NA在離液劑存在下結合到二氧化硅表面上。
電極(例如鉑電極)的集成可有利地用來可逆地收集和預濃縮經洗脫的芯片上的NA(NA on-chip)。因此，本發(fā)明可以使核酸的提取和富集實現(xiàn)組合。
在一個優(yōu)選的實施方式中，所述核酸提取單元包括二氧化硅珠子填充的聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)通道。
所述系統(tǒng)或者至少其主要變化形式通常由半導體材料形成，或者包括半導體材料，但是也可以使用絕緣體(例如玻璃、熔融二氧化硅、石英、聚合物材料和陶瓷材料)和/或金屬材料。半導體材料的例子包括一種或多種第IV族元素(即，硅和鍺)；第III～V族化合物(例如砷化鎵、磷化鎵、銻化鎵、磷化銦、砷化銦、砷化鋁和銻化鋁)；第II～VI族化合物(例如硫化鎘、硒化鎘、硫化鋅、硒化鋅)；和第IV～VI族化合物(例如硫化鉛、硒化鉛、碲化鉛、碲化錫)。硅和砷化鎵是優(yōu)選的半導體材料。所述系統(tǒng)使用傳統(tǒng)上與半導體微電子裝置的批量生產以及近年來的半導體微機械裝置的生產有關的常規(guī)過程來制造。所述微制造技術包括例如外延生長(例如汽相、液相、分子束、金屬有機化學汽相沉積)、平版印刷(例如光平版印刷、電子束平版印刷、x射線平版印刷、離子束平版印刷)、蝕刻(例如化學蝕刻、氣相蝕刻、等離子體蝕刻)、電沉積、濺射、擴散摻雜、離子注入和微機械加工。也可以使用諸如玻璃等非晶體材料和聚合物材料。
聚合物材料的例子包括PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、COC(環(huán)烯烴共聚物)、聚乙烯、聚丙烯、PL(聚交酯)、PBT(聚對苯二甲酸丁二醇酯)和PSU(聚砜)，還包括兩種或兩種以上所述物質的混合物。優(yōu)選的聚合物是PDMS或COC。
所述裝置/系統(tǒng)通常通過集成形成。該裝置/系統(tǒng)可以在諸如本文所述的半導體材料等普通的基材材料上進行微制造。但是，也可以使用諸如玻璃或陶瓷材料等絕緣體基材材料。然而，優(yōu)選的普通基材材料是塑料或聚合物材料，并且適當?shù)睦尤缟辖o出。所述系統(tǒng)優(yōu)選通過例如硅母版的復制而形成。
以塑料代替硅玻璃用于微型結構的優(yōu)點有很多，至少在生物學應用上是這樣。一個最大的優(yōu)點是減少了采用例如微注射模制、熱壓印和鑄塑等方法進行大量生產的成本。系數(shù)為100或更多對于復合結構不是不可能的。復制用于多層模具嵌入物的結構的可能性使得在設計自由度上具有巨大靈活性。由于有了將常用的標準部分組合的選擇余地，因此在很多情況下微觀世界和宏觀世界的相互連系更為容易。組裝技術可以采用不同的手段，例如由微結構支持的US-焊接、激光焊接、膠粘和層壓。其它有利的特征是表面改性。對于專用于生物分析的微型化結構，重要的是表面是生物相容的。通過利用等離子體處理和等離子體聚合，分配的靈活性和變化性可以應用于涂層中。塑料在抗酸和堿的化學耐性上要遠遠優(yōu)于容易被腐蝕掉的硅基材。生物技術領域中的大部分檢測方法都涉及光學檢測。因此，相對于不透明的硅基材，塑料的透明性是一個重要的特征。聚合物微流體技術目前在芯片實驗室市場中是已經確立但正在成長中的領域。
本文所述的微制造系統(tǒng)也意欲包括納米制造裝置。
對于硅母版或半導體母版，可以在具有精確微尺度尺寸的硅基材上由例如蝕刻或者微機械加工確定一個或多個體積可變室、微流體通道、反應室和流體互相連接。然后由硅母版制造塑料復制物。在這種方式中，可以通過任何適當?shù)姆椒?例如，使用粘合劑或通過加熱)，將具有蝕刻微結構或機械加工微結構的塑料基材結合到覆蓋物上。
在所述系統(tǒng)中所使用的選擇性閥門可以采用任何方便的形式。例如，閥門可以簡單地調節(jié)沿著連接兩個單元的導管或通道的流動?？梢蕴峁┩ㄟ^栓裝置的作用而在導管或通道的孔中升降的活塞樣組件。
所述系統(tǒng)的使用包括以下示例性的可能步驟
選擇方案1(i)樣品收集和裂解(ii)mRNA的提取(手動程序或自動程序)(iii)實時擴增和檢測(優(yōu)選為多重)選擇方案2(iv)片段化單元可以同時包括樣品的裂解和樣品的制備(v)實時擴增(NASBA)和檢測(優(yōu)選為多重)本發(fā)明還提供制造本文所述的集成的芯片實驗室診斷系統(tǒng)的方法，該方法包括A.提供在其表面具有入口凹陷處、裂解單元凹陷處、核酸提取單元凹陷處、裂解流體貯存部凹陷處和洗脫劑貯存部凹陷處的基材；B.提供覆蓋物；和C.將所述覆蓋物結合到所述基材上，以形成各自由基材的所述表面的相應凹陷處和所述覆蓋物的相鄰表面所限定的(a)入口、(b)裂解單元、(c)核酸提取單元、(d)裂解流體貯存部和(e)洗脫劑貯存部。
本文使用的術語“凹陷處”還意欲涵蓋各種特征，包括例如槽、縫、孔、溝和通道，包括它們的一部分。
所述方法可以進一步包括在將所述覆蓋物結合到所述基材上之前或之后將裂解流體導入裂解流體貯存部中的步驟。
所述方法可以進一步包括在將所述覆蓋物結合到所述基材上之前或之后將洗脫劑導入洗脫劑貯存部中的步驟。
所述方法可以進一步包括在將所述覆蓋物結合到所述基材上之前或之后將乙醇導入洗脫劑貯存部中的步驟。
所述方法可以進一步包括在將所述覆蓋物結合到所述基材上之前或之后將異丙醇導入洗脫劑貯存部中的步驟。
洗脫劑和/或乙醇和/或異丙醇優(yōu)選通過流體而互相分隔，所述流體優(yōu)選為空氣，但可以使用任何不互溶的流體(液體或氣體)。
在一個優(yōu)選的實施方式中，所述方法包括在將所述覆蓋物結合到所述基材上之后，將洗脫劑導入洗脫劑貯存部中；將第一體積的空氣導入洗脫劑貯存部中；將乙醇導入洗脫劑貯存部中，借此使該乙醇與洗脫劑被所述第一體積的空氣所分隔；將第二體積的空氣導入洗脫劑貯存部中；將異丙醇導入洗脫劑貯存部中，借此使該異丙醇與乙醇被所述第二體積的空氣所分隔。
基材可以由例如硅形成，而上層覆蓋物可以由例如玻璃形成。在這種情況中，玻璃覆蓋物優(yōu)選陽極結合到硅基材上，所述陽極結合可以選擇性地通過形成在基材表面上的中間二氧化硅層進行。硅中的凹陷處可以采用反應性離子蝕刻形成。諸如聚合物材料等其它材料也可以用作基材和/和覆蓋物。所述材料可以使用例如硅復制物來制造。或者，所述裝置可以采用研磨和放電加工(EDM)構造模具嵌入物，然后對芯片部分進行注射制模，然后采用例如鉆孔、研磨、去毛刺(debarring)等對聚合物部分進行機械性后加工而制造。隨后，可以接著進行過濾器的插入、溶劑結合和流體連接的安裝。
聚合物材料的例子包括PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、COC(環(huán)烯烴共聚物)、聚乙烯、聚丙烯、PL(聚交酯)、PBT(聚對苯二甲酸丁二醇酯)和PSU(聚砜)，還包括兩種或兩種以上所述物質的混合物。優(yōu)選的是COC。
優(yōu)選地，尤其是如果需要對小室中的內容物進行光學觀測，則上層覆蓋物由諸如玻璃、Pyrex或COC等透光物質或材料制成。
微制造組件與一種或多種諸如玻璃板或輔助微制造元件等其它元件的組合是經常使用的，并且意欲落在本文所使用的術語“微制造(的)”的范圍之內。
部分或全部的基材基底可以提供有涂層，該涂層的厚度通常至多為1μm，優(yōu)選小于0.5μm。該涂層優(yōu)選由包含以下物質的組中的一種或多種物質形成聚乙二醇(PEG)、牛血清白蛋白(BSA)、吐溫(tween)和葡聚糖。優(yōu)選的葡聚糖是分子量為9,000～200,000的葡聚糖，特別優(yōu)選的是分子量為20,000～100,000，尤其是25,000～75,000(例如35,000～65,000)的葡聚糖。吐溫(或聚氧乙烯脫水山梨糖醇)可以是來自Sigma AldrichCompany的任意可獲得的吐溫。PEG優(yōu)選單獨地或組合地作為涂層部件。PEG包括純的聚乙二醇，即，式HO-(CH2CH2O)n-H，其中n是使PEG通常具有200～10,000，尤其是PEG 1,000～5,000的分子量的整數(shù)；或者是化學改性的PEG，其中，一種或多種乙二醇低聚體通過同種雙官能團(例如磷酸部分或芳香族間隔物)連接。特別優(yōu)選是稱為FK108的聚乙二醇(一個聚乙二醇鏈通過磷酸與另一個聚乙二醇鏈相連)；和Sigma AldrichCompany作為產品P2263銷售的PEG。施用于所述小室/室、入口、出口和/或通道的表面的上述涂層可以改善流體流過所述系統(tǒng)的流動。特別地，已發(fā)現(xiàn)樣品不大容易附著或粘結到所述表面上。PEG涂層是優(yōu)選的。
對于硅母版或半導體母版，可以在具有精確微尺度尺寸的硅基材上由例如蝕刻或者微機械加工限定一個或多個體積可變室、微流體通道、反應室和流體互相連接(深層反應性離子蝕刻(DRIE)是優(yōu)選的技術)。然后由硅母版可制造塑料復制物。在這種方式中，可以通過任何適當?shù)姆椒?例如，使用粘合劑或通過加熱)，將具有蝕刻微結構或機械加工微結構的塑料基材結合到覆蓋物上，從而形成密閉的片段化小室、入口、出口和連接通道。
所述裝置包括在其上表面形成有所期望的微結構的基材。該基材可以例如是硅，或者是通過硅母版復制而形成的塑料基材。該基材的上表面與覆蓋物結合，從而限定了一系列的單元/小室、入口、出口和/或通道。所述覆蓋物可以由例如塑料或玻璃形成。該覆蓋物優(yōu)選是透明的，這允許對流體進行觀測。通常，所述裝置優(yōu)選通過硅的深層反應性離子蝕刻(DRIE)制造以進行高深寬比壓縮，然后進行玻璃覆蓋物的陽極結合?；蛘?，所述裝置可以采用研磨和放電加工(EDM)通過構造模具嵌入物，然后對芯片部分進行注入模制、接著采用例如鉆孔、研磨、去毛刺等對聚合物部分進行機械性后加工而制造。隨后，可以接著進行過濾器的插入、溶劑的結合和流體連接的安裝。
核酸樣品可以是或者來自例如生物流體、乳制品、環(huán)境流體和/或飲用水。其例子包括血液、血清、唾液、尿、奶、飲用水、海水和池水。對于許多復雜的生物樣品，例如，血液和奶，應該理解，在可將樣品中的DNA和/或RNA與細菌細胞和病毒粒子分離和純化之前，首先需要將樣品中的病毒粒子和細菌細胞與其它粒子分開。而且也應該理解，為了濃縮細菌細胞和病毒粒子，即減少原料的體積，在進一步對細菌細胞壁或者病毒蛋白被膜進行破壞和對核酸進行分離過程之前，需要進行另外的樣品制備步驟。這在原料由大體積的例如含有相對較少的細菌細胞或病毒粒子的水溶液組成時是非常重要的。這種類型的原料通常是在諸如飲用水中細菌污染的例行監(jiān)測等環(huán)境檢測應用中碰到。
所述系統(tǒng)優(yōu)選針對適合體積為10ml～100ml的樣品而設計。
本發(fā)明還提供用于分析生物樣品和/或環(huán)境樣品的設備，該設備包括本文所述的系統(tǒng)。該設備可以是一次性設備。
本發(fā)明還提供用于分析生物樣品和/或環(huán)境樣品的分析試劑盒，該試劑盒包括本文所述的系統(tǒng)和用于將樣品與所述系統(tǒng)接觸的部件。該分析試劑盒可以是一次性試劑盒。
現(xiàn)在通過舉例的方式并參照附圖對本發(fā)明進行描述。


圖1是用于將平面膜集成到本發(fā)明所用的一次性聚合物芯片裝置中的夾層布局的示意圖。
圖2是用于本發(fā)明所述系統(tǒng)的閥門設計的示意圖。
圖3a～3d是用于本發(fā)明所述系統(tǒng)的閥門設計的示意圖。
圖4是本發(fā)明所述的珠子室的可能布局的示意圖。
圖5是顯示填充有裂解緩沖液(圖5a)和提取流體(圖5b)的本發(fā)明所述系統(tǒng)設計的示意圖。
圖6是根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式的芯片布局的示意圖。
圖7是根據本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式的系統(tǒng)設計的示意圖。
圖8涉及實施例。
圖9涉及實施例。
具體實施例方式
根據本發(fā)明的一個塑料芯片設計優(yōu)選合并有供應通道、反應室和微流體驅動系統(tǒng)，并優(yōu)選通過環(huán)烯烴共聚物(COC)的注射模制進行加工。例如用于具有12個通道的芯片的模具嵌入物可以使用高度精確研磨來制造。檢測體積通常為約80nL(400μm×2000μm×100μm)。塑料芯片優(yōu)選首先進行氧等離子體激活，然后用5％的聚乙二醇(PEG)溶液(SigmaChemical Co，St.Louis，MO)涂布。涂布后，可以用約75μmCOC膜通過使用例如雙環(huán)己烷(bicyclohexcyl)的溶劑焊接對芯片進行密封。優(yōu)選在芯片的背面沉積薄的金層(約25nm)，以阻擋來自珀耳帖元件頂部上的熱墊的背景熒光。
如果需要，珀耳帖元件可以集成到對塑料芯片提供熱控制的樣品支架中?？梢詫X塊置于珀耳帖元件的頂部，以確保用于芯片的熱均勻分布。優(yōu)選將熱墊裝在鋁塊上，以使芯片和熱源實現(xiàn)熱接觸。通常將熱電偶置于樣品支架上，來測定空氣溫度并對珀耳帖元件具有反饋電路?？梢栽诒憬菔诫娔X上對溫度調節(jié)進行外部控制。
如上所述，NASBA是專門設計用于擴增任何單鏈RNA序列的等溫(約41℃)擴增方法。NASBA反應的應用范圍很大，例如檢測特異性病毒RNA、其它感染性媒介或病原性媒介的RNA或者某些細胞RNA的存在。三種酶，即AMV反轉錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶的同時活性構成了擴增反應的核心技術。兩個寡聚核苷酸引物確定了反應的特異性和對靶RNA特異的熒光分子信標探針的特異性。在約90分鐘內，可以將感興趣的核酸序列擴增到大于109拷貝。光學檢測單元優(yōu)選設計成在約494nm在反應室中激發(fā)熒光并在約525nm處檢測發(fā)射的熒光。可以在通過透鏡對光進行校準之前，用帶寬濾波器(465nm～500nm)對激發(fā)光進行過濾?？梢杂孟嗤姆颇哥R來聚焦熒光的照明和收集?？梢杂昧硗獾耐哥R將熒光聚焦在檢測器(例如光電倍增管)的表面上。檢測信號的數(shù)據收集和準備可以用MATLAB 6.0.088 Release 12(The Math Works Inc.，Natick，MA)于便捷式電腦上進行處理。
在微技術分析系統(tǒng)的范圍內，有效的樣品預處理是重要因素。特別地，為了能夠檢測數(shù)目低的特異性粒子(例如生物樣品中存在的細胞細菌或病毒)，濃縮裝置是需要的。在本領域中已知的各種濃縮方法包括例如過濾技術(例如使用不同過濾介質(微結構通道、多孔性中空纖維或膜)的死端式過濾和交叉流過濾)、重力沉降器、離心機、聲池(acoustic cell)過濾器、光阱、介電電泳(DEP)、電泳、流式細胞計數(shù)和基于吸附的方法。
一種優(yōu)選的濃縮方法涉及死端式過濾。這是相對簡單而經濟的方法，該方法可以容易地被集成到一次性聚合物芯片中。而且，使用平面膜可以確保在應用領域方面的高度靈活性，這是因為可以獲得各種膜，并且可以例如容易地進行諸如PEG或Tween20涂布等表面處理。
可以使用如在圖1中所示意性顯示的夾層結構來將平面膜集成到一次性的聚合物芯片中。該芯片包括覆蓋膜40、流體通道41和濾膜44。芯片的頂部和底部分別顯示為42和43。
優(yōu)選地，為了能夠在芯片上對流動進行控制，可以將一個或多個閥門集成到該裝置中。適當?shù)拈y門設計如圖2和3所示。對于圖2，可以使用預成型膜或平面膜。芯片45包括流體通道46和預成型膜47。垂直箭頭表示開口位置。
對于圖3a～3d，其顯示了具有主體的芯片，該主體包括頂部主體部分50、主要主體部分52和插入到兩者之間的膜51。在鄰近膜51處提供微流體通道57。在主要主體部分52中的適當凹陷處提供活塞54和閥門55。流體/液體存在于活塞54上面的體積53中(見圖3a)。在閥門55以干涉配合安裝在上部位置(見圖3a)。在這一位置，可以密封微流體通道57，使流體不能通過。錐形栓56b可以用于將閥門55降低到開口位置(見圖3b、3c和3d)。特別地，當將栓56b向上推動時，栓56b通過摩擦配合緊閉在閥門55中相應的凹陷處。類似地，在涉及活塞54時，當將錐形栓56a向上推動時，錐形栓56a通過摩擦配合緊閉在活塞54中相應的凹陷處。為了運輸體積53中的液體，將栓56a和56b分別推入活塞54和閥門55的相應凹陷處，從而使液體被推出體積53(見圖3c和3d)。在使用完芯片時，錐形栓56a和56b分別從活塞54和閥門55中退出。
本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)，二氧化硅珠子非常適合于RNA的提取和純化。對于提取，通?？梢允褂?.3mg～0.4mg的直徑為15μm～35μm的珠子，不過也可以使用更大的二氧化硅珠子(直徑至多為約200μm)。珠子室的可能布局如圖4所示。在芯片到芯片結合前，用預濕的二氧化硅珠子61裝載珠子室60。結合后，用100μm的瓶頸保持珠子包裝。即使珠子室60沒有完全填充，但是珠子室的形狀和流體連接62(入口)和63(出口)的布置也可以確保所施加的液體通過二氧化硅珠子61。珠子室60的體積為約6.5μL，適合于對通常為10μL～50μL的樣品進行提取。
在整個預處理過程中，優(yōu)選使用4種液體裂解緩沖液(通常為約100μL)、異丙醇(通常為約40μL)、乙醇(通常為約40μL)和洗脫緩沖液(通常為約5μL～20μL)。后三種液體是提取所需要的。本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)，在頂部芯片70a(見圖5a)上的通道(通常為彎曲通道)中儲存裂解緩沖液，而在底部部分70b(見圖5b)上的兩個W形和一個U形貯存部中儲存提取液是有利的。
所有的儲存性貯存部可以簡單地通過小的(0.5mm×0.5mm)側通道方式來填充，該側通道在圖5中顯示為注射器75a～75d略圖的針位置。填充以后，側通道可以用諸如膠水或膠帶等適當?shù)氖侄芜M行密封。
有利的是，為了獲得操作相對簡單的系統(tǒng)，優(yōu)選使用單個(注射器)泵來驅動所有的液體。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式的芯片布局如圖6所示。
使用常規(guī)的注射器(針直徑為0.4mm)依次填充4個液體貯存部(裂解緩沖液、異丙醇、乙醇和洗脫緩沖液)，并將填充通道密封。
首先，通過注射器泵的方式將細胞懸浮液施加到過濾單元。除了粒子物懸浮液，注射器還裝有約200μL～300μL用于驅動芯片上的液體的空氣(應該理解，根據應用，可以使用其它不互溶的液體)。
其次，將空氣泵入裂解緩沖液貯存部中，并將所置換的緩沖液施加到保存在過濾器中的細胞。推動細胞裂解物通過過濾器并導入珠子室。由于所述額外的過濾步驟，珠子室中發(fā)生堵塞的可能性得以降低。
第三，在關閉與過濾室和裂解緩沖液貯存部連接的同時，驅動泵(注射器)與提取液貯存部連接。提取液儲存在由空氣塞分隔的單個貯存部中。在對貯存部的一側施加壓力時，液體得到平行置換并依次導過珠子室。
以下參照圖6對包括閥門操作在內的操作程序進行總結。閥門沒有以關閉狀態(tài)列出，而是將所列出的閥門打開以用于相應的操作。
過濾閥門5、7細胞懸浮液進入，濾出物→左出口裂解閥門2、3、7空氣進入，所置換的流體→左出口閥門2、3、6空氣進入，裂解物→珠子包裝，右出口純化閥門1、4、6空氣進入，異丙醇→珠子包裝空氣進入，乙醇→珠子包裝空氣進入，洗脫緩沖液→珠子包裝現(xiàn)在轉到圖7，該圖顯示本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式。以上描述也適用于本實施方式。系統(tǒng)1包括流體樣品用入口5、裂解/過濾單元10、核酸提取單元15、盛裝裂解流體的通道20、盛裝洗脫劑、乙醇和異丙醇的通道25、核酸序列擴增和檢測單元30和廢料單元35。
通道11將樣品入口5連接至裂解/過濾單元10。提供閥門12來控制樣品入口5和裂解/過濾單元10之間流體的流動。
通道16將裂解/過濾單元10連接至核酸提取單元15。提供閥門17來控制裂解/過濾單元10和核酸提取單元15之間流體的流動。
盛裝裂解流體的通道20連接到裂解/過濾單元10和樣品入口5。提供閥門22和23來控制流體的流動。
盛裝洗脫劑、乙醇和異丙醇的通道25連接到核酸提取單元15和樣品入口5。提供閥門27和28來控制流體的流動。
通道31將核酸提取單元15連接至核酸序列擴增和檢測單元30。提供閥門32來控制核酸提取單元15和核酸序列擴增和檢測單元30之間流體的流動。
通道36將裂解/過濾單元10連接至廢料單元35。提供閥門37來控制裂解/過濾單元10和廢料單元35之間流體的流動。
通道25盛裝洗脫劑和諸如乙醇和異丙醇等洗滌溶劑。所述洗脫劑和洗滌溶劑被預裝載到利用空氣間隔的通道中以使液體相互分隔。
適當?shù)牧呀饩彌_液流體的例子為100mM的Tris/HCl、8M GuSCN(pH6.4)。
適當?shù)南疵撊芤旱睦訛?0mM Tris/HCl、1mM EDTA Na2(pH8)+1mM YOYO-1。
核酸的定量可以使用熒光顯微鏡和像素-密度分析程序(Lispix)來實現(xiàn)。
核酸提取單元包含二氧化硅珠子，例如0.3mg的尺寸為15μm～30μm的二氧化硅珠子。還可以在填充床緊下面提供用于電動收集帶負電的洗脫核酸的鉑電極(未示出)。
操作程序總結如下。
過濾關閉除了閥門12和37之外的所有閥門。將裝有流體樣品(該樣品含有待分析的細胞)的注射器連接到樣品入口5，并在壓力下將樣品注入到過濾/裂解單元10中。采用這種方式使細胞保持在單元10中，然后將該流體的殘留部分傳遞到廢料單元35中。
裂解關閉除了閥門22、23和37之外的所有閥門。在第一步驟(可選)中，將包含在注射器中的空氣注入樣品入口5中。這使裝在通道20的裂解流體向過濾/裂解單元10移動。但是，在裂解流體進入到過濾/裂解單元10之前，裂解流體之前的空氣，即，閥門23和單元10之間的通道20的區(qū)域中的空氣，使單元10中的任何殘留流體得到置換并流到廢料單元35中。接著，在第二步驟中，關閉閥門37并打開閥門17。隨著裝在注射器中的空氣繼續(xù)注入到樣品入口5中，裝在通道20中的裂解流體在壓力下流入過濾/裂解單元10中。結果，其中保留的細胞被裂解，并且裂解物流到核酸提取單元15中。
純化/提取關閉除了閥門27、28和32之外的所有閥門。在第一步驟中，將裝在注射器中的空氣注入樣品入口5中。這使裝在通道25中的流體(異丙醇、空氣間隔、乙醇、空氣間隔、洗脫緩沖液)作為液體柱向核酸提取單元15移動。一旦所有的異丙醇(即，流體柱的第一部分)已經傳遞到核酸提取單元15中，即停止這一過程。經過短暫的時期(和選擇性地對單元15的內容物進行加熱)，繼續(xù)該過程，并且異丙醇被異丙醇和乙醇之間的空氣間隔所置換。使異丙醇蒸發(fā)和/或將其廢棄。然后使乙醇在壓力下流入核酸提取單元15中。一旦所有乙醇全部進入單元15，再一次停止這一過程。經過短暫的時期(和選擇性地對單元15的內容物進行加熱)，繼續(xù)這一過程，并且乙醇被乙醇和洗脫緩沖液之間的空氣間隔所置換。使乙醇蒸發(fā)和/或將其廢棄。然后使洗脫緩沖液在壓力下流入核酸提取單元15中，并洗脫從二氧化硅珠子表面上釋放的核酸。然后將經洗脫的核酸傳遞到核酸序列擴增和檢測單元30。
本發(fā)明提供用于核酸(NA)提取和分析的設備和方法。已經成功地從諸如人細胞裂解物等生物樣品中進行提取，其中在前15mL的洗脫物中收集NA。
已經在集成有供應通道和平行反應室的環(huán)烯烴共聚物(COC)塑料微芯片中對實時的基于核酸序列的擴增(NASBA)進行過測定。已經成功地對人工人乳頭瘤病毒(HPV)16的序列、整合有HPV 16的SiHa細胞系以及檢測為HPV 16陽性的患者樣品進行了檢測。施加到芯片的樣品材料被分入11個平行反應室中，在這些反應室中以80nL的檢測體積同時進行檢測。
現(xiàn)在將參照以下非限定性實施例對本發(fā)明進行進一步的描述。
實施例樣品材料從American Type Culture Collection(USA)(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)獲得宮頸癌細胞系SiHa(鱗狀細胞癌)。將SiHa細胞系保存在Dulbecco改進的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)上，該培養(yǎng)基添加有10％的胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和25μg/ml的慶大霉素。將該細胞培養(yǎng)在37℃和5％CO2的氣氛中。用胰蛋白酶對細胞進行處理、在Bürkers室中計數(shù)并在NASBA裂解緩沖液(bioMérieux，荷蘭，含有5M硫氰酸胍)中裂解。在NucliSense Extractor上使用Boom氏法(Boom，R.，Sol.J.A.，Salimans，M.M.M.，Jansen，C.L.，Wertheimvandillen P.M.E.，Vandernoordaa，J.J.of Clinical Microbiol.，1990，28，(3)，495-503)對核酸進行分離和提取。SiHa細胞中每一個細胞含有1～2拷貝的所整合的HPV 16 DNA(Syrjanen，S.，Partanen，P.，Mantyjarvi，R.和Syrjanen，K.，J Virol Methods，1988，19，225-238)。檢測SiHa細胞系提取物的10倍系列稀釋物。此外，使用來自HPV Proofer試劑盒(NorChip AS，挪威)的人工HPV 16型序列作為靶序列。對系列稀釋物進行檢測，以確定系統(tǒng)的檢測極限。
NASBA根據制造商的說明書，混合PreTectHPV-Proofer試劑盒中的試劑(NorChip AS，挪威)。在該試劑盒中可以得到所有的引物和探針。另外，以0.05％的終濃度將BSA加到該混合物中作為動態(tài)包被。來自試劑盒的試劑溶液(26μL)和13μL的樣品材料(SiHa細胞系樣品和來自該試劑盒的HPV 16型序列樣品)，混合并加熱到65℃，在該溫度加熱2分鐘。然后將該混合物冷卻到41℃，在該溫度冷卻2分鐘，然后添加酶(13μL)。切開各反應室通道的一個驅動室后，將該混合物加到聚合物微芯片中。該芯片中的各反應通道因毛細管力而填充有所述混合物。將殘留的混合物抽到供應通道末端的廢料室中。然后在光學系統(tǒng)下移動芯片支架，在此挨個對通道進行檢測。每30秒測定一次。用LED(發(fā)光二極管)只照射2×2mm2的區(qū)域，這一區(qū)域對應于80nL的檢測面積。為了與微芯片檢測進行比較，另外還用常規(guī)儀器對HPV 16序列和SiHa細胞系的10倍系列稀釋物進行檢測。所有的試驗均進行2.5小時。
計算使用PreTect Data Analyzer(PDA)(NorChip AS)對所有結果進行計算。微芯片設計有12個反應室，但是由于測定的系統(tǒng)誤差，在計算中去掉了每一側的兩個反應通道。根據多項式回歸法進行計算。比例被定義為反應結束時的熒光水平與反應起始時的熒光水平的差異。比例等于或大于1.7的所有樣品都被確定為陽性。出現(xiàn)陽性的時間(time-to-positivity)或起點設定在曲線開始呈指數(shù)上升處。使用自起點起熒光水平上升10％的值和熒光水平上升80％的值來計算平均斜率(average slop)。該聚合物微芯片的檢測極限設定為所有10個反應通道經檢測均呈陽性時的所檢測的最低濃度。
結果在檢測體積為80nL的聚合物微芯片中成功地采用實時NASBA對HPV 16病毒進行了鑒定。圖8和圖9顯示了分別對SiHa細胞系和HPV 16寡聚序列進行的一個試驗的結果。圖中顯示了明顯為陽性的曲線圖，該曲線圖具有與使用常規(guī)20μL體積和常規(guī)讀數(shù)器進行檢測的樣品相同的曲率(未顯示)。表1顯示了使用聚合物微芯片獲得的人工HPV 16序列和SiHa細胞系的系列稀釋物的結果。為了表征擴增反應，評價了數(shù)個不同參數(shù)熒光比例、出現(xiàn)陽性的時間、曲線線性部分的平均斜率、陽性擴增的數(shù)目和所檢測的聚合物微芯片的數(shù)目。表中的值表示經檢測呈陽性的樣品的平均值和標準差。對于在微芯片上檢測的HPV 16序列和SiHa細胞系，所述比例或多或少是恒定的。在與相同樣品材料的常規(guī)檢測(表2)的比較中，表明比例隨濃度的下降而下降。另一方面，對于微芯片和常規(guī)方法，其它參數(shù)對應得非常好。出現(xiàn)陽性的時間隨濃度下降而上升。而平均斜率值隨濃度的下降而下降。對于人工HPV 16序列，對100aM～100nM的10倍系列稀釋物進行了檢測，而對于SiHa細胞系，檢測的是0.02個細胞/μL～2000個細胞/μL。為用戶定制的光學檢測系統(tǒng)對人工HPV 16序列和SiHa細胞系材料分別具有1pM和20個細胞/μL的檢測極限。這些檢測極限與由常規(guī)Biotek讀數(shù)器獲得的檢測極限相同。在這兩種系統(tǒng)上都可以對更低的濃度進行檢測，但是結果不一致。該結果還表明，當輸入靶的樣品濃度下降時，標準差上升。比較HPV 16寡聚序列和SiHa細胞系的NASBA結果表明，除了擴增反應的起點處與終點處之間的熒光水平的比例以外，所有參數(shù)對于微系統(tǒng)和常規(guī)方法都具有相同的趨勢。在小反應室時的背景噪音比目視熒光(macroscopic fluorescence)法的明顯。通過在聚合物微芯片的背面施加薄的金層，可以從分析中除掉部分的背景熒光。COC本身就具有自動熒光性，總會產生一些背景熒光。產生噪音檢測的另一個因素是由于聚合物表面不完美而產生的光散射。對于較低的濃度，由于基材使用更長的時間去尋找基材并與基材相互作用，因此如所預期的那樣，出現(xiàn)陽性的時間下降。對于試驗中的最大濃度，尤其是對于試驗中的人工HPV 16的最大濃度，出現(xiàn)陽性的時間增長。非常高的樣品濃度還可能會抑制反應，因此會使用比理想的反應混合物更長的時間。平均斜率以相同的方式下降。當在反應混合物中以較少量的靶開始時，將產生較少的擴增子，其斜率將低于較高濃度的斜率。NASBA反應的檢測極限取決于感興趣的靶、引物和探針的設計。在這些試驗中，我們在兩種檢測系統(tǒng)中均可以檢測低至1pM和20個細胞/μL的濃度。因此，本實施例表明，采用實時NASBA，在聚合物微芯片中可以檢測低至1pM濃度的人工HPV 16序列。對于細胞系樣品，檢測極限為20個細胞/μL。這些檢測極限與在常規(guī)Biotek讀數(shù)器中進行的試驗所得到的檢測極限相同。
表1在微芯片上進行NASBA來檢測HPV 16寡聚序列和SiHa細胞系的系列稀釋物。結果為試驗中得到的所有值的平均值和標準差。

表2對HPV 16寡聚序列和SiHa細胞系進行的常規(guī)NASBA檢測。結果為試驗中得到的所有值的平均值和標準差。

權利要求
1.一種用于對含有細胞和/或粒子的流體樣品進行樣品制備過程的集成的芯片實驗室診斷系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括(a)流體樣品入口；(b)裂解單元，所述裂解單元用于裂解所述流體樣品中所包含的細胞和/或粒子；(c)核酸提取單元，所述核酸提取單元用于從所述流體樣品中所包含的細胞和/或粒子中提取核酸；(d)盛裝裂解流體的貯存部；(e)盛裝洗脫劑的貯存部，所述洗脫劑用于移去在所述核酸提取單元中收集的核酸；其中所述樣品入口與所述裂解單元是流體連接的，為控制所述樣品入口與所述裂解單元之間流體的流動而選擇性地存在閥門；其中所述裂解單元與所述核酸提取單元是流體連接的，為控制所述裂解單元與所述核酸提取單元之間流體的流動而選擇性地存在閥門；其中所述盛裝裂解流體的貯存部與所述裂解單元是流體連接的，為控制所述盛裝裂解流體的貯存部與所述裂解單元之間的流體的流動而選擇性地存在閥門；和其中所述盛裝洗脫劑的貯存部與所述核酸提取單元是流體連接的，為控制所述盛裝洗脫劑的貯存部與所述核酸提取單元之間流體的流動而選擇性地存在閥門。
2.如權利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述盛裝裂解流體的貯存部與所述入口是流體連接的，為控制所述盛裝裂解流體的貯存部與所述入口之間流體的流動而選擇性地存在閥門。
3.如權利要求1或2所述的系統(tǒng)，其中所述盛裝洗脫劑的貯存部與所述入口是流體連接的，為控制所述盛裝洗脫劑的貯存部與所述入口之間流體的流動而選擇性地存在閥門。
4.如權利要求1～3任一項所述的系統(tǒng)，該系統(tǒng)進一步包括(g)核酸反應單元，該單元優(yōu)選為核酸序列擴增和檢測單元，其中所述核酸提取單元與所述核酸反應單元是流體連接的，為控制所述核酸提取單元與所述核酸反應單元之間流體的流動而選擇性地存在閥門。
5.如權利要求1～4任一項所述的系統(tǒng)，該系統(tǒng)進一步包括(h)廢料單元，其中所述廢料單元與所述裂解單元是流體連接的，為控制所述廢料單元與所述裂解單元之間流體的流動而選擇性地存在閥門。
6.如權利要求1～5任一項所述的系統(tǒng)，該系統(tǒng)進一步包括(i)盛裝洗滌溶劑的貯存部，所述洗滌溶劑優(yōu)選為乙醇，所述盛裝洗滌溶劑的貯存部與所述核酸提取單元是流體連接的，為控制所述盛裝洗滌溶劑的貯存部與所述核酸提取單元之間流體的流動而選擇性地存在閥門。
7.如權利要求1～6任一項所述的系統(tǒng)，該系統(tǒng)進一步包括(j)盛裝另外的洗滌溶劑的貯存部，所述另外的洗滌溶劑優(yōu)選為異丙醇，所述盛裝另外的洗滌溶劑的貯存部與所述核酸提取單元是流體連接的，為控制所述盛裝另外的洗滌溶劑的貯存部與所述核酸提取單元之間流體的流動而選擇性地存在閥門。
8.如權利要求6或7所述的系統(tǒng)，其中所述盛裝洗脫劑的貯存部與盛裝第一洗滌溶劑的貯存部和/或盛裝第二洗滌溶劑的貯存部是流體連接的。
9.如權利要求8所述的系統(tǒng)，其中所述洗脫劑、第一洗滌溶劑和/或第二洗滌溶劑盛裝在共同的貯存部中。
10.如權利要求9所述的系統(tǒng)，其中所述洗脫劑、第一洗滌溶劑和/或第二洗滌溶劑在所述共同的貯存部中通過流體而相互分隔，所述流體優(yōu)選為空氣。
11.如權利要求9或10所述的系統(tǒng)，其中所述共同的貯存部包括與所述入口和所述裂解單元流體連接的導管。
12.如權利要求1～11任一項所述的系統(tǒng)，該系統(tǒng)進一步包括(k)用于將流體樣品和/或空氣導入所述入口的部件，所述部件優(yōu)選包括泵或注射器。
13.如權利要求1～11任一項所述的系統(tǒng)，該系統(tǒng)進一步包括過濾單元，該單元與所述裂解單元是流體連接的。
14.如權利要求13所述的系統(tǒng)，其中所述過濾單元包括死端過濾器、交叉流過濾器(例如微結構通道、多孔性中空纖維或膜)、重力沉降器、離心機、聲池過濾器、光阱、介電電泳(DEP)、電泳、流式細胞計數(shù)和基于吸附的方法中的一種或多種。
15.如權利要求1～11任一項所述的系統(tǒng)，其中所述裂解單元進一步包括對所述流體樣品進行過濾的部件。
16.如權利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述部件包括死端過濾器、交叉流過濾器(例如微結構通道、多孔性中空纖維或膜)、重力沉降器、離心機、聲池過濾器、光阱、介電電泳(DEP)、電泳、流式細胞計數(shù)和基于吸附的方法中的一種或多種。
17.如前述任一項權利要求所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)進一步包括用于對所述裂解單元和/或所述核酸提取單元的內容物進行加熱的部件。
18.如權利要求17所述的系統(tǒng)，其中所述部件包括一個或多個位于所述裂解單元和/或所述核酸提取單元中或與所述裂解單元和/或所述核酸提取單元相鄰的珀爾帖元件。
19.如前述任一項權利要求所述的系統(tǒng)，其中所述核酸提取單元至少部分地填充有二氧化硅珠子或粒子。
20.如權利要求19所述的系統(tǒng)，其中所述核酸提取單元進一步包括鄰近所述二氧化硅珠子或粒子的一組或多組電極來收集和/或預濃縮經洗脫的核酸。
21.如權利要求20所述的系統(tǒng)，其中所述一組或多組電極包括鉑電極。
22.如前述任一項權利要求所述的系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于提取生物流體中、乳制品中、環(huán)境流體中或飲用水中存在的核酸。
23.一種用于分析生物樣品和/或環(huán)境樣品的設備，該設備包括在前述任一項權利要求中所定義的系統(tǒng)。
24.一種用于分析生物樣品和/或環(huán)境樣品的分析試劑盒，該試劑盒包括在權利要求1～22任一項中所定義的系統(tǒng)和用于使樣品與所述系統(tǒng)接觸的部件。
25.如權利要求23所述的設備或者如權利要求24所述的分析試劑盒，所述設備和所述分析試劑盒是一次性的。
26.一種制造前述任一項權利要求所定義的集成的芯片實驗室診斷系統(tǒng)的方法，該方法包括A.提供在其表面具有入口凹陷處、裂解單元凹陷處、核酸提取單元凹陷處、裂解流體貯存部凹陷處和洗脫劑貯存部凹陷處的基材；B.提供覆蓋物；和C.將所述覆蓋物結合到所述基材上，以形成各自由基材的所述表面中的相應凹陷處和所述覆蓋物的相鄰表面所限定的(a)入口、(b)裂解單元、(c)核酸提取單元、(d)裂解流體貯存部和(e)洗脫劑貯存部。
27.如權利要求26所述的方法，該方法進一步包括在將所述覆蓋物結合到所述基材上之前或之后將裂解流體導入所述裂解流體貯存部中的步驟。
28.如權利要求26或27所述的方法，該方法進一步包括在將所述覆蓋物結合到所述基材之前或之后將洗脫劑導入所述洗脫劑貯存部中的步驟。
29.如權利要求26～28任一項所述的方法，該方法進一步包括在將所述覆蓋物結合到所述基材之前或之后將第一洗滌溶劑導入所述洗脫劑貯存部中的步驟，所述第一洗滌溶劑優(yōu)選為乙醇。
30.如權利要求26～29任一項所述的方法，該方法進一步包括在將所述覆蓋物結合到所述基材之前或之后將第二洗滌溶劑導入所述洗脫劑貯存部中的步驟，所述第二洗滌溶劑優(yōu)選為異丙醇。
31.如權利要求26～30任一項所述的方法，其中所述洗脫劑和/或第一洗滌溶劑和/或第二洗滌溶劑是通過流體而相互分隔的，所述流體優(yōu)選為空氣。
32.如權利要求26或27所述的方法，該方法進一步包括在將所述覆蓋物結合到所述基材之后，將洗脫劑導入所述洗脫劑貯存部中；將第一體積的不互溶的流體導入所述洗脫劑貯存部中，所述不互溶的流體優(yōu)選為空氣；將第一洗滌溶劑導入所述洗脫劑貯存部中，借此所述第一洗滌溶劑與所述洗脫劑被所述第一體積的不互溶的流體所分隔，所述第一洗滌溶劑優(yōu)選為乙醇；將第二體積的不互溶的流體導入所述洗脫劑貯存部中，所述不互溶的流體優(yōu)選為空氣；和將第二洗滌溶劑導入所述洗脫劑貯存部中，借此所述第二洗滌溶劑與所述第一洗滌溶劑被所述第二體積的不互溶的流體所分隔，所述第二洗滌溶劑優(yōu)選為異丙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供用于進行核酸序列的擴增和檢測過程的診斷系統(tǒng)，其可以是用于對含有細胞和/或粒子的流體樣品進行樣品制備過程的集成的芯片實驗室診斷系統(tǒng)，該芯片實驗室診斷系統(tǒng)包括(a)流體樣品入口；(b)裂解單元，所述裂解單元用于裂解所述流體樣品所包含的細胞和/或粒子；(c)核酸提取單元，所述核酸提取單元用于從所述流體樣品所包含的細胞和/或粒子提取核酸；(d)盛裝裂解流體的貯存部；(e)盛裝洗脫劑的貯存部，所述洗脫劑用于移去在核酸提取單元中收集的核酸；其中，所述樣品入口與所述裂解單元是流體連接的，為控制二者之間流體的流動而選擇性地存在閥門；其中所述裂解單元與所述核酸提取單元是流體連接的，為控制二者之間流體的流動而選擇性地存在閥門；其中所述盛裝裂解流體的貯存部與所述裂解單元是流體連接的，為控制二者之間流體的流動而選擇性地存在閥門；和其中所述盛裝洗脫劑的貯存部與所述核酸提取單元是流體連接的，為控制二者之間流體的流動而選擇性地存在閥門。
文檔編號G01N27/447GK1973197SQ200580006519
公開日2007年5月30日 申請日期2005年1月28日 優(yōu)先權日2004年1月28日
發(fā)明者弗里德黑爾姆·舍恩菲爾德, 弗里肖夫·馮格瑪, 弗蘭克·卡爾森, 讓·利希滕貝格, 薩貝什·韋普特 申請人:挪其普公司