專利名稱：包括放大層的橢偏測量生物傳感器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測與生物有關的分子在表面處的吸附和結合過程的生物傳感器。
背景技術：
檢測與生物有關的分子的結合反應，如抗體-抗原反應，在如藥物篩選的許多生物技術應用中起著重要的作用。為監(jiān)視此類反應，通常使用熒光標簽來進行光度檢測，且該熒光標簽附著在涉及的各種分子中的至少一種分子上。
但是，除標記分子需要付出額外精力外，人們也懷疑此類標志的存在改變了反應的動態(tài)過程。因而，無標志檢測方案(在其中，不需要將諸如熒光標簽、毫微粒或放射標志等標志附著于所關心的分子)便顯得越來越重要。
已開發(fā)出幾種無標志檢測方案，這便允許直接檢測結合反應，或者更具體地，直接檢測分子在表面處的吸附或沉積?？梢蕴幚砩鲜霰砻?，使其具有特定的化學性質。在免疫反應的實例中，這可以通過將抗體固定在經過化學預處理的表面和隨后結合來自某溶液的抗原來實現(xiàn)，其中，用合適的檢測系統(tǒng)來探測該溶液?？梢酝ㄟ^讓檢測表面接觸溶液或在將溶液除去后讓上述表面接觸空氣來進行檢測。已知允許對吸附動態(tài)過程進行詳細監(jiān)視的儀器和二元檢測方案，在這些方案中，對特定分子種類的缺失或存在進行了探測。
特別地，光學檢測技術已得到了成功應用，因而可以進行遠程的、非接觸的檢測。許多這些技術的共同特征是當探測光在被檢表面發(fā)生反射或透射或二者兼有時，測量探測光的強度、相位或偏振態(tài)的變化。由于吸附層絕緣特性或其幾何厚度的變化或這兩種變化兼有的緣故，因而這種主要的物理效應是由吸附層的光學厚度的變化引起的。
橢偏測量術是一種眾所周知的技術，用于確定生長過程中光學層的厚度或其變化。當電磁輻射在樣本處發(fā)生反射或透射時，它靈敏地測量該電磁輻射的偏振態(tài)的變化。通過一種光源給出了這類設備的典型實施例，該光源發(fā)出準直光束，且該光束通過由線性偏振鏡(P)和四分之一波片形式的補償器(C)的組合給出的可變偏振控制器。偏振光束以已知的斜角入射到樣本(S)，在該樣本表面發(fā)生反射，并由第二線性偏振鏡(A)借助光檢測器來進行分析。在該PCSA橢偏儀配置中，可通過如下方式來進行測量更改元件P和A的方位角，同時C的光軸相對于入射平面的方位角保持不變(如45°)，直到光檢測器接收到最小強度的光為止?？墒褂迷、C和A的用于這種“調零”(nulling)條件的方位角來計算橢偏角Delta和Psi，當給定光的入射角和波長時，對樣本的光學參數而言，上述橢偏角是明確的。使用合適的光學模型和數值回歸，便可以以生長過程中光學層的厚度或其變化重新計算數量Delta和Psi。
除這種典型的調零橢偏儀外，還實現(xiàn)了許多其他形式的橢偏儀，其中一些橢偏儀僅測量上述兩個橢偏角之一，或是考慮了去偏振效應的系統(tǒng)。
將橢偏儀用于監(jiān)視生物分子的結合反應可追溯到1942年(A.Rothen，K.Landsteiner，J.Exp.Med 76，437(1942))。可以用數量Delta和Psi來重新計算結合反應中表面吸附的生物物質的數量。
現(xiàn)有技術中還有一種成像橢偏測量術(US 5,076,696)，它使用空間解像(spatially resolving)檢測器以及成像光學器件，以允許并行地測量大量橢偏數據(如Delat和/或Psi圖形式的數據)。然后將這些圖轉換成層厚度、折射率、被吸附物質的化學成分或數量的表面圖。通常將生物傳感器設計為點陣列或微孔形式，以允許同時對多種分子種類進行高吞吐率的篩選。由于其固有的并行檢測特性，因而將成像橢偏測量術作為用于那些所謂的生物芯片、微陣列(microarray)或微板(microplate)的檢測技術是有利的(A.Eing，M.Vaupel，ImagingEllipsometry in Biotechnology(生物技術中的成像橢偏測量術)，2002，ISBN 3-9807279-6-3)。
已通過將來自環(huán)境介質的、入射在待測表面上的光用于測量來說明成像橢偏測量術。其他測量配置基于如US 6,594,011中所述的內全反射。這里，對來自光源的光進行引導，使其通過內反射部件，以便將其從待測試樣反射出去。
因為被吸附物質的數量通常很小，僅相當于幾個納米或更少的厚度變化，且許多關心的物質(如蛋白質或DNA)在易于實現(xiàn)的UV-VIS-NIR波長范圍內并未表現(xiàn)出足夠高的光吸收度，因而通常光學檢測的信號響應不夠強，由此限制了檢測的靈敏度。
因此，一些成像橢偏儀使用表面等離子體諧振(SPR)技術，以增強光學檢測的信號響應。SPR使用金屬薄層，以允許激勵和傳播表面等離子體。該金屬層的一側與透明支撐結構接觸(通常將該側與棱鏡連接，以允許以某一斜角引入光)，而其另一側則暴露在環(huán)境介質中。并且，通過監(jiān)視入射角的變化來監(jiān)視由吸附層的形成造成的環(huán)境介質的折射率的變化，其中，上述入射角的變化產生了表面等離子體諧振，從而導致了反射光的強度的變化。
對基于SPR的傳感器而言，如US 5,999,148所述，已知可將金屬薄膜與被探測表面之間的中間電介質層作為進一步增加靈敏度的途徑。該專利說明了這種中間層(包括高折射率的氧化物)的使用，并指出了特定層厚度對于實現(xiàn)期望的性能的重要性。
本發(fā)明所要解決的現(xiàn)有技術的問題對薄膜應用(尤其是半導體領域)而言，橢偏測量術應用得非常成功。但是，如果待分析吸附層的折射率等于或接近下方基板的折射率，則橢偏檢測的靈敏度非常有限。這是因為，在這種情況下，吸附層并未形成至基板的有意義的光學界面，因而在此界面上將不發(fā)生光干涉或僅發(fā)生較弱的光干涉。因此，吸附層的厚度變化可以與下方基板的厚度變化相比，并僅導致了可檢測的相移效應。通常，玻璃或透明塑料材料是用于測量生物物質的優(yōu)選的基板材料。遺憾的是，諸如蛋白質或DNA的生物物質的折射率與玻璃或透明塑料材料的折射率較為接近，從而在這些有機物質吸附到此類基板的情況下，限制了橢偏檢測的靈敏度。
因此，本發(fā)明的目的在于公開那些在橢偏測量中改進了光學響應的基板樣本，且這些改進是由不同于表面等離子體諧振的效應造成的。在這種情況下，對吸附層的測量而言，所述改進意味著增加的靈敏度和/或更佳的線性度和/或增加的動態(tài)范圍。

發(fā)明內容
通過在基板上敷設包括至少一個電介質層的放大層系統(tǒng)，解決了上述問題，其中，該電介質層的折射率明顯的不同于待檢測的吸附層的折射率。結果，在吸附層和基板之間便建立了至少一個有意義的光學界面，且光干涉效應變得更為明顯。選擇該電介質層系統(tǒng)，以便使吸附層厚度的變化導致顯著的相移，從而在橢偏測量中導致了改進的光學響應。
為優(yōu)化該放大層系統(tǒng)的設計，必須計算作為吸附層厚度的函數的橢偏角響應。可借助一些眾所周知的方法，如R.M.A.Azzam和N.M.Bashara所著的“橢偏測量術與偏振光”(R.M.A.Azzam，andN.M.Bashara，Ellipsometry and Polarized Light，North Holland Press，Amsterdam 1977)中所述的方法來完成這種計算。為增加靈敏度，該優(yōu)化的目標是得到作為吸附層厚度的函數的、所測得的橢偏角(對非常薄的薄膜而言，Delta通常更為靈敏)的較大斜率。斜率越大，表明靈敏度越高。然而，與此同時，在測量過程中，檢測器處的信號響應也必須足夠強。在R.M.A.Azzam和N.M.Bashara所著的“橢偏測量術與偏振光”(R.M.A.Azzam，and N.M.Bashara，Ellipsometry andPolarized Light，North Holland Press，Amsterdam 1977)中也給出了橢偏儀的檢測器響應公式。
通過平衡信號響應和Delta斜率，可以為根據本發(fā)明的中間層的特定設計找出實際測量的最優(yōu)靈敏度。
如果上述目標是在吸附層的特定厚度范圍內實現(xiàn)生物傳感器的線性響應，則可以根據上述方法對放大層系統(tǒng)的布置(layout)進行建模，并修改優(yōu)化目標，以優(yōu)先選用提供了線性光學響應的設計方案。
在本發(fā)明的一個實施例中，放大層系統(tǒng)僅包括一個電介質層。該層的折射率高于或低于吸附層的折射率。但是在本發(fā)明的另一個實施例中，該中間層系統(tǒng)由多層材料組成，且這些材料具有交替的折射率。
根據中間層系統(tǒng)的光學設計，傳感器在不同的入射角度情況下工作，包括但不一定是TIR條件。
放大層系統(tǒng)可具有形成期望的表面化學特性所需的連接體化學成分和/或接觸層和/或激活層和/或其他附加的中間層。
具體實施例方式
由于放大層系統(tǒng)的最優(yōu)布置取決于生物傳感器的工作條件，因而我們將說明使用PCSA橢偏儀(用于對結合動態(tài)過程進行測量)的測量配置實例。這種設備包括發(fā)出準直光束的光源，該光束通過由第一線性偏振鏡(P)與四分之一波片形式的補償器(C)的組合給出的可變偏振控制器。該偏振光束以已知斜角入射到樣本基板(S)，在該樣本基板的檢測表面發(fā)生反射，并由第二線性偏振鏡(A)(借助光檢測器)進行分析。
對這樣的測量而言，檢測表面必須與包含各種分子的溶液接觸，以吸附或結合上述分子。優(yōu)選地，上述檢測表面處于流動池(可在該表面上形成受控的分析物流體)或微板的孔中。該檢測表面構成了上述流動池的底部或微板內的微孔，且光束穿過基板的底層傳播到檢測表面，并在檢測表面處發(fā)生反射。
在我們的實例中，如

圖1所示，在測量期間，光束1進入耦合棱鏡2，并透過光學接觸層3到達基板4和吸附層7。
為使光束以超過內全反射的臨界角的入射角通過基板4來照射檢測表面，使用了耦合棱鏡2。因為橢偏測量術的靈敏度在很大程度上取決于入射角，因而通過使用耦合棱鏡2來獲得更大的內角(internalangle)是有利的。
然而，對一些應用而言，通過使用適合的放大層，無需棱鏡或其他耦合裝置的、導致較小內角的直接照射仍可以達到足夠的靈敏度，在這種情況下，上述方案是優(yōu)選的解決方案。在我們的實例中，耦合棱鏡2由BK7制成，然而，也可以使用任何其他類型的透射玻璃或塑料。在一些情況下，使用具有低應力雙折射特性的玻璃來避免去偏振效應是有利的。
用光學接觸層3來避免在耦合棱鏡2與基板4之間的界面處發(fā)生另外的反射。光學接觸層3可以是折射率匹配流體，如折射率匹配油。
如圖1所示，在基板4的上表面上設置了根據本發(fā)明的放大層系統(tǒng)5。在我們的實例中，該放大層系統(tǒng)5包括由沉積在玻璃基板上的高折射率材料制成的單個電介質層。該層的厚度使得能對有機吸附層進行高度靈敏的和線性的測量。該單個電介質層的厚度對于其用作放大層至關重要，并且是由上述的光學建模得出的。
例如，我們已對某一系統(tǒng)進行建模，該系統(tǒng)包括折射率為1.52的玻璃基板4(如BK7)，具有折射率為2.2的單個電介質層(如Ta2O5)且厚度可在0-150nm范圍內變化的放大層系統(tǒng)。在該放大層上設置了光學折射率為1.46的、厚度為10nm的SiO2層，以便為吸附層提供接觸層(下文給出了關于為什么敷設該接觸層的更詳細解釋)。該吸附層的折射率為1.5。假設環(huán)境介質是折射率為1.333的水，光的波長為632.8nm，且其在玻璃基板內的入射角是60度，需要棱鏡或其他光學耦合器。
表1給出了通過光學建模仿真得出的、具有放大層和不具有放大層的動力學傳感器的橢偏測量性能的比較。該比較基于考慮了上述PCSA調零橢偏儀的測量和數據分析過程的品質因數(FOM)。將不具有放大層的傳感器的FOM定義為1。如表1所示，放大層厚度為90nm時，可實現(xiàn)約為30的最大FOM，與之對應，檢測吸附物分子薄層的靈敏度有30倍的增加。因此，該實例的放大層的最優(yōu)厚度為90nm，然而70nm至100nm的層厚度也顯示了良好的性能。
下面，我們論述了一些細節(jié)和備選方案a)放大層系統(tǒng)在上述實例中，我們用Ta2O5薄層作為放大層系統(tǒng)。然而，也可以使用Nb2O5、TiO2、HfO2或ZrO2等其他材料。在光波長為紅外波長時，還可使用Si3N4等氮化物，甚至使用硅。原則上，可使用折射率高于或低于吸附層折射率的任何其他典型的薄膜材料。低折射率材料的一個實例是MgF2。
此外，也可以優(yōu)化光學多層系統(tǒng)，并將其作為放大層系統(tǒng)。這種多層系統(tǒng)可包括交替的高和低的折射率層。為了對這種系統(tǒng)建模，可使用公知的轉移矩陣方法。為優(yōu)化這種系統(tǒng)，可采用公知的優(yōu)化技術，如遺傳算法或模擬退火方法。由于參數數目(層的厚度)的增加，因而，用于優(yōu)化期望的光學響應的自由度較高。例如，在上述實例中，我們對增加SiO2層的厚度的效果進行了建模，此時，該層不僅作為接觸層，也在實際上成為了放大層結構的一部分?，F(xiàn)在，以厚度為90nm的Ta2O5的最優(yōu)單一放大層開始，我們在10nm至280nm的范圍內改變之前的SiO2接觸層的厚度。在表2中給出了按照以上方式定義的品質因數結果。該表表明，在SiO2層的厚度為250nm時，雙放大層結構將吸附層的結合反應的檢測理論靈敏度進一步增加為原來的3倍。
應當注意，總反射是所有涉及的光學界面處的反射分量的相干和非相干疊加。為簡明起見，在圖1中省略了其中一些反射分量。
b)接觸層在上述的第一個實例中，我們在放大層上敷設了厚度為10nm的SiO2層。敷設接觸層6有利于進一步設置化學性質明確的檢測層?？梢钥偸菍⒃摻佑|層6敷設在放大層系統(tǒng)5上，只要它至少部分透明，且它的光學效應處于傳感器的動態(tài)范圍內。在優(yōu)選形式中，該接觸層包括幾個納米的SiO2薄層，然后是基于硅烷的連接體化學成分和/或其他中間層，最后是化學敏感層，如固定的抗體。
另一方面，可以將這樣的接觸層作為放大層系統(tǒng)的一部分。然后，根據本發(fā)明的優(yōu)化來考慮該接觸層的光學效應。如上所述，除優(yōu)化參數外，有時可以使用接觸層本身的厚度。
c)照射裝置在我們的實例中，我們用棱鏡來提供超過內全反射的臨界角的照射。如果不使用棱鏡，則可使用玻璃基板4的底部的光柵耦合器。
d)成像橢偏測量術將該傳感器連接到與橢偏儀結合的流動池，可以測量由分析物的溶液形成的吸附層7的厚度或表面覆蓋度。通過應用成像橢偏測量術，該生物傳感器能以并行方式同時監(jiān)視多個結合部位或點。
e)其他橢偏儀配置和應用該傳感器的其他形式包括將其作為底板集成到微板之中，其中每個微孔形成了單個的封閉式生物傳感器，或包括用于空氣中的微陣列(如用于高吞吐率篩選的微陣列)的倒置設計(inverted design)，其中，根據圖2，光束1來自空氣側。再次地，通過光學建模來優(yōu)化放大層系統(tǒng)5的厚度。通過犧牲最大性能，也可以設計用于液體和空氣環(huán)境的傳感器基板。
f)多個子區(qū)域另一種修改是，通過犧牲動態(tài)范圍或線性度，將單個結合部位劃分成多個子區(qū)域，其中，對特定的吸附層厚度或表面覆蓋度而言，每個子區(qū)域均具有最大靈敏度?？赏ㄟ^在放大層上形成圖案和局部地優(yōu)化其厚度來實現(xiàn)這一點。在另一種修改中，可以包括允許進行內部校準或用作參考通道(以補償不明確(non-specific)結合的效應或橢偏測量信號的溫度漂移)的子區(qū)域。
為用于微板或其他要求較大區(qū)域(具有多個待分析的檢測部位)的應用場合，一種可能的修改使用局部光柵結構、微棱鏡或經過壓花的表面浮雕結構來為每個微孔或檢測部位引入光束。
g)與熒光方法的結合另一種修改結合了光柵與基于導模熒光的檢測(如WO 95/33197與US 2002/135780所述)。如果以非諧振模式進行檢測，則光柵結構不會形成干擾。
表1

表2

權利要求
1.一種用于分析基板上的有機吸附層的方法，所述方法包括如下步驟-提供具有表面的基板，所述基板的折射率等于或接近于所述待分析有機吸附物的折射率；-在所述基板的表面上敷設層系統(tǒng)，所述層系統(tǒng)包括至少一個層，所述層的折射率明顯不同于所述生物物質的折射率；-在所述層系統(tǒng)的頂面上敷設所述有機吸附層；-將偏振光作用在所述基板上；-在反射和/或透射中檢測作用在所述基板上的光的偏振特性的變化。
2.如權利要求1所述的方法，包括如下步驟檢測作用在所述基板上的光的反射和/或透射幅值。
3.如前述權利要求之一所述的方法，包括如下步驟從玻璃和塑料材料的組中選擇所述基板材料。
4.如前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，所述至少一個層從包括Ta2O5、Nb2O5、TiO2、HfO2、ZrO2、MgF2的組中選出。
5.如前述權利要求之一所述的方法，包括如下步驟優(yōu)化所述層系統(tǒng)的層厚度分布，以提供允許相對于所述待分析吸附層的變化來實現(xiàn)期望的、最好是最大的靈敏度的光學響應。
6.如前述權利要求之一所述的方法，包括如下步驟將SiO2選為形成至接觸層和/或所述待分析吸附層的界面的頂層。
7.如前述權利要求之一所述的方法，包括如下步驟敷設結構化的層系統(tǒng)，從而為不同吸附層特性建立具有最大靈敏度的多個子區(qū)域。
8.一種執(zhí)行成像橢偏測量術的方法，它包括如前述權利要求之一所述的方法之一中的步驟。
全文摘要
一種用于分析基板(4)上的有機吸附層(7)的方法包括如下步驟提供基板(4)，該基板表面的折射率等于或接近待分析有機吸附物的折射率。在基板(4)的表面上，敷設了層系統(tǒng)(5、6)，該系統(tǒng)具有至少一個層(5)和有機吸附層(7)，其中，層(5)具有生物物質的折射率，而層(7)位于上述層系統(tǒng)的最上方。當將偏振光施加到該基板時，檢測了當光發(fā)生反射和/或透射時偏振特性的變化。
文檔編號G01N21/21GK1930463SQ200580007284
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月7日 優(yōu)先權日2004年3月8日
發(fā)明者A·艾恩, M·維基, J·埃德林格, D·赫尼希 申請人:Oc歐瑞康巴爾斯公司