專利名稱：發(fā)光和不發(fā)光多重檢測(cè)的制作方法
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背景技術(shù)：
某些生物由于熒光素酶介導(dǎo)的氧化反應(yīng)而發(fā)光。各種各樣的大量不同物種的熒光素酶基因，具體地說是螢火蟲(Photinus pyralis)和北美螢火蟲(Photuris pennsylvanica)、牙買加叩頭蟲(Pyrophorusplagiophthalamus)、海腎(Renilla renformis)和幾種細(xì)菌(例如發(fā)光致病桿菌(Xenorhabdus luminescens)和弧菌(Vibrio spp))的熒光素酶基因，是極為普及的發(fā)光報(bào)告基因。螢火蟲熒光素酶也是測(cè)定ATP濃度的通用報(bào)告分子，其借此作用廣泛用于檢測(cè)生物質(zhì)。其它酶在與某些合成底物(例如堿性磷酸酶和磷酸金剛烷基二氧雜環(huán)丁烷或辣根過氧化物酶和魯米諾)混合時(shí)也發(fā)光。
由于發(fā)光檢測(cè)的非放射性性質(zhì)、敏感性和極為線性的范圍，熒光素酶基因廣泛用作基因報(bào)告分子。例如，可檢測(cè)少至10-20mol的螢火蟲熒光素酶。因此，實(shí)際上基因活性的熒光素酶檢測(cè)用于每個(gè)實(shí)驗(yàn)生物系統(tǒng)，包括原核和真核細(xì)胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物以及無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。同樣，用于測(cè)定ATP濃度的熒光素酶檢測(cè)是高度敏感性的，能檢測(cè)至10-16mol以下。
熒光素酶可通過氧化酶特異性底物(例如熒光素)而產(chǎn)生光。對(duì)于螢火蟲熒光素酶和所有其它甲蟲熒光素酶來說，在存在鎂離子、氧和ATP時(shí)出現(xiàn)光發(fā)生。對(duì)于珊瑚蟲熒光素酶(包括海腎熒光素酶)來說，僅需要氧以及底物腔腸素(Coelentrazine)。一般來說，在測(cè)定基因活性的發(fā)光檢測(cè)中，將反應(yīng)底物和其它激發(fā)發(fā)光的試劑導(dǎo)入到預(yù)期表達(dá)報(bào)告酶的生物系統(tǒng)中。如果有發(fā)光，則使用發(fā)光計(jì)或任何合適的輻射能檢測(cè)裝置檢測(cè)產(chǎn)生的發(fā)光。檢測(cè)非常快速和敏感，快速且容易地提供基因表達(dá)數(shù)據(jù)，不需要放射性試劑。
熒光素酶是眾多報(bào)告分子之一，例如螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、β-葡糖醛酸酶(GUS)和各種磷酸酶，例如已組合并用作基因活性共同報(bào)告分子的分泌性堿性磷酸酶(SEAP)和子宮運(yùn)鐵蛋白(Uf；酸性磷酸酶)。雙酶報(bào)告分子系統(tǒng)涉及使用、表達(dá)和檢測(cè)單個(gè)系統(tǒng)中的兩種獨(dú)立的報(bào)告分子酶。在基因報(bào)告時(shí)，雙報(bào)告分子檢測(cè)對(duì)在遺傳操作以在單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群(例如分散在培養(yǎng)物、分離組織或整個(gè)動(dòng)物中的細(xì)胞)中同時(shí)表達(dá)兩種不同報(bào)告基因的檢測(cè)特別有用。更時(shí)常發(fā)生是，一種基因活性報(bào)告特定實(shí)驗(yàn)條件的影響，而第二種報(bào)告基因的活性提供了通過其標(biāo)準(zhǔn)化全部實(shí)驗(yàn)值集的內(nèi)控。雙酶報(bào)告分子技術(shù)還可用于無細(xì)胞重組系統(tǒng)，例如得自編碼實(shí)驗(yàn)和對(duì)照?qǐng)?bào)告酶的獨(dú)立遺傳材料的同時(shí)翻譯或偶合其轉(zhuǎn)錄與翻譯的細(xì)胞裂解物。同樣，免疫檢測(cè)可設(shè)計(jì)用于單個(gè)樣品中的實(shí)驗(yàn)值和對(duì)照值二者的雙重報(bào)告。
任何雙酶報(bào)告分子檢測(cè)的性能都基于組成酶化學(xué)特征和關(guān)聯(lián)其各自產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集的能力。各種報(bào)告酶完全不同的酶動(dòng)力學(xué)、檢測(cè)化學(xué)和溫育要求可使兩種報(bào)告酶組合成一體化單管或單孔雙報(bào)告分子檢測(cè)形式復(fù)雜化。一種整合雙報(bào)告分子檢測(cè)的方法述于美國(guó)專利第5,744,320號(hào)，其具體公開了用于甲蟲和海腎熒光素酶檢測(cè)的一般性或特異性猝滅劑，并闡述了用于依次測(cè)定螢火蟲熒光素酶然后海腎熒光素酶發(fā)光的代表性雙報(bào)告分子檢測(cè)。類似地，美國(guó)專利第6,586,196號(hào)公開了幾種雙報(bào)告分子檢測(cè)系統(tǒng)。同公開于′320專利中的雙報(bào)告分子系統(tǒng)一樣，在′196專利中發(fā)光是兩個(gè)反應(yīng)中的每一個(gè)的可檢測(cè)產(chǎn)物。在Liu等(2000)和Qazi等(2002)中描述了多重化報(bào)告分子檢測(cè)的方法，該方法不僅加入了不同的底物，而且加入了不同的檢測(cè)技術(shù)。例如，Liu等報(bào)告了在同一生物中的熒光素酶和GFP活性，其中酶活性以分步方式分別經(jīng)發(fā)光和熒光檢測(cè)測(cè)定。
報(bào)告分子還可用于檢測(cè)細(xì)胞或上清液中分子的存在或活性。例如，蛋白酶構(gòu)成了大且重要的一類酶，其涉及各種不同的生理過程，例如在血液凝集、炎癥、生殖、纖維蛋白溶解和免疫反應(yīng)中的蛋白轉(zhuǎn)換。眾多病癥起因于或特征在于特定蛋白酶或其抑制劑的活性改變。在研究或臨床處置中檢測(cè)這些蛋白酶的能力對(duì)病癥的研究、治療和管理意義重大。例如，胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7是半胱氨酸天冬氨酰特異性蛋白酶(也稱為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶“ASCP”)家族的成員，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵效應(yīng)子作用(Thornberry等，1992；Nicholson等，1995；Tewari等，1995；和Fernandes-Alnemri等，1996)。
但是，蛋白酶用其天然底物不易檢測(cè)。而且，許多目前可得到的合成底物昂貴、不敏感且無選擇性。
業(yè)已使用眾多發(fā)色和熒光底物檢測(cè)蛋白酶(Monsees等，1994；Monsees等，1995)，修飾熒光素提供了對(duì)熒光指示劑的替代(美國(guó)專利第5,035,999和5,098,828號(hào))。Miska和Geiger(1989)首先描述了使用具有水解酶識(shí)別位點(diǎn)的修飾熒光素作為前底物(pro-substrate)的方法，其中通過將修飾熒光素與水解酶溫育特定的一段時(shí)間，然后將等份混合物轉(zhuǎn)移至含熒光素酶的溶液，進(jìn)行非均相檢測(cè)。Masuda-Nishimura等(2000)報(bào)道了使用β-半乳糖苷酶底物-修飾熒光素的單管(均相)檢測(cè)的應(yīng)用。
酶反應(yīng)的熒光或發(fā)光底物或產(chǎn)物業(yè)已用于蛋白檢測(cè)多重化。例如，使用具有多達(dá)15種不同細(xì)胞因子配體的熒光珠檢測(cè)兩種或更多種不同細(xì)胞因子(DeJager等，2003)，使用熒光素二磷酸和酪蛋白BODIPY-FL檢測(cè)堿性磷酸酶和某些蛋白酶(Nolkrantz等，2002)。
但是，需要的是改進(jìn)的檢測(cè)，例如均相檢測(cè)，以使用不同的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)兩種或更多種蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明提供不發(fā)光(例如熒光或比色)檢測(cè)和發(fā)光檢測(cè)的多重檢測(cè)(例如在同一孔中)，以檢測(cè)樣品中一種或多種成分的量(例如活性)和存在，這些成分包括用于酶反應(yīng)的輔因子，例如ATP；結(jié)合和/或改變分子構(gòu)象的蛋白(肽或多肽)，例如修飾或切割肽或多肽底物的蛋白；或蛋白結(jié)合和/或改變的分子。本文使用的“發(fā)光檢測(cè)”包括其中第一種分子(例如第一種酶的肽或多肽底物)、第一種分子和合適(第一種)蛋白之間的反應(yīng)產(chǎn)物和/或不同蛋白和第一種反應(yīng)產(chǎn)物之間的反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)光的反應(yīng)。因此，發(fā)光檢測(cè)可直接或間接檢測(cè)(例如測(cè)量)反應(yīng)輔因子、蛋白結(jié)合和/或改變的分子或該蛋白的量或存在。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可在發(fā)光檢測(cè)中使用甲蟲熒光素酶和合適的熒光素底物檢測(cè)ATP濃度，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在發(fā)光檢測(cè)中使用經(jīng)修飾含蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(例如經(jīng)共價(jià)鍵修飾)的熒光素酶底物檢測(cè)蛋白酶，即在存在熒光素酶時(shí)。發(fā)光檢測(cè)包括化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光檢測(cè)，其包括但不限于使用或檢測(cè)熒光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、β-內(nèi)酰胺酶、蛋白酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶和合適的對(duì)應(yīng)底物(例如修飾形式的熒光素、腔腸素、魯米諾、肽或多肽、二氧雜環(huán)丁烷、二氧雜環(huán)丁烷酮和相關(guān)吖啶酯)的檢測(cè)。本文使用的“發(fā)光檢測(cè)試劑”包括用于發(fā)光反應(yīng)的底物以及輔因子或其它分子，例如蛋白，如酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)光檢測(cè)試劑可為Z-DEVD-氨基熒光素、Z-LETD-氨基熒光素、Z-LEHD-氨基熒光素，或者可為連接至氨基熒光素、二氫熒光素、熒光素6′甲醚或熒光素6′氯乙醚的其它底物，例如肽或多肽底物。發(fā)光檢測(cè)是其中發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光比對(duì)應(yīng)的不發(fā)光檢測(cè)強(qiáng)至少1％(例如至少10％)的檢測(cè)。
“不發(fā)光檢測(cè)”包括其中第一種分子(例如蛋白(肽或多肽))、第一種分子和合適(第一種)蛋白(肽或多肽)之間的(第一種)反應(yīng)產(chǎn)物或不同蛋白和第一種產(chǎn)物之間的反應(yīng)產(chǎn)物不發(fā)光但可用其它方式檢測(cè)的反應(yīng)，例如使用直接或間接檢測(cè)反應(yīng)輔因子、分子或與該分子相互作用的蛋白的量或存在的熒光或比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)底物和/或產(chǎn)物。例如，可修飾酶底物以含熒光團(tuán)，該熒光團(tuán)僅在酶與底物反應(yīng)且熒光團(tuán)接觸(暴露于)一定波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍的光后發(fā)射一定波長(zhǎng)的光，例如(Z-DEVD)2-羅丹明-110是胱天蛋白酶的底物，通過羅丹明-110的熒光可監(jiān)測(cè)胱天蛋白酶切割底物。本文使用的“熒光檢測(cè)試劑”包括熒光反應(yīng)的底物以及輔因子或其它分子，例如蛋白。不發(fā)光檢測(cè)是其中不發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)為對(duì)應(yīng)發(fā)光反應(yīng)發(fā)光信號(hào)的約10％以下(例如約1％以下或更少)的檢測(cè)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明檢測(cè)的分子，例如蛋白結(jié)合和/或改變的分子，包括修飾以含報(bào)告分子的分子，即例如在一個(gè)或多個(gè)隨后反應(yīng)后可檢測(cè)或能夠檢測(cè)的分子。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明發(fā)光檢測(cè)的底物包括待檢測(cè)的酶底物，該底物共價(jià)連接至發(fā)光反應(yīng)底物，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于熒光檢測(cè)的底物可包括待檢測(cè)的酶底物，該底物共價(jià)連接至一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，蛋白結(jié)合和/或改變的分子不包含報(bào)告分子。
如本文所述，使用至少兩種不同的底物檢測(cè)樣品中一種以上蛋白酶的量或存在，一種底物具有發(fā)光示值讀數(shù)，一種或多種底物具有熒光示值讀數(shù)。例如，使用更敏感的發(fā)光方法，例如用底物Z-LETD-氨基熒光素檢測(cè)胱天蛋白酶-8，接著使用另一種底物檢測(cè)另一種蛋白酶(例如用(Z-DEVD)2-羅丹明-110檢測(cè)胱天蛋白酶-3)，實(shí)現(xiàn)低豐度細(xì)胞蛋白酶的檢測(cè)。因此，該檢測(cè)兼有熒光試劑的強(qiáng)度和熒光素酶介導(dǎo)的發(fā)光反應(yīng)的敏感性。而且，令人驚奇的是，熒光素(一種具有熒光特性并經(jīng)常以相對(duì)大量存在于發(fā)光檢測(cè)中的分子)的存在在組合的熒光/發(fā)光檢測(cè)中未產(chǎn)生明顯干擾。此外，令人驚奇的是，在同一反應(yīng)混合物中檢測(cè)兩種胱天蛋白酶和熒光素酶，混合物包含胱天蛋白酶-8底物(Z-LETD-氨基熒光素)和兩種胱天蛋白酶-3底物，即(Z-DEVD)2-羅丹明-110和Ac-DEVD-AMC。本發(fā)明因此為要用于多重檢測(cè)的分子提供了更大的靈活性，例如發(fā)光檢測(cè)底物與熒光檢測(cè)底物組合。而且，如果兩種酶介導(dǎo)的反應(yīng)具有相容的試劑條件，則檢測(cè)可為一步檢測(cè)。
因此，本發(fā)明的組合發(fā)光/不發(fā)光檢測(cè)形式允許多重檢測(cè)一種或多種肽或多肽(例如酶)、肽或多肽(例如各種酶的肽或多肽底物)結(jié)合和/或改變的一種或多種分子和/或各個(gè)檢測(cè)的一種或多種輔因子或其組合。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測(cè)第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的第一種分子的存在或量和第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的第二種分子的存在或量的方法。該方法包括使預(yù)期具有第一種和/或第二種分子的樣品與第一種和第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的反應(yīng)混合物(其沒有第一種和/或第二種分子)接觸。然后檢測(cè)第一種和第二種分子的存在或量。使用包含發(fā)光檢測(cè)的多重檢測(cè)為使用發(fā)光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的分子提供了增加的敏感性。在一個(gè)實(shí)施方案中，由第一種酶介導(dǎo)的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物，而由第二種酶介導(dǎo)的反應(yīng)產(chǎn)生不發(fā)光產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供組合的發(fā)光/熒光檢測(cè)，包括其中一種檢測(cè)提供內(nèi)控的檢測(cè)。本文描述的檢測(cè)可與其它檢測(cè)聯(lián)用，其他檢測(cè)包括報(bào)告分子檢測(cè)、基于核酸的檢測(cè)或基于免疫的檢測(cè)以及其它不相關(guān)酶檢測(cè)。
本發(fā)明還提供檢測(cè)樣品中至少一種分子的活性或存在的方法。該方法包括提供可包含酶介導(dǎo)反應(yīng)的至少一種分子的樣品，例如樣品可包含酶，使樣品和無該分子的酶介導(dǎo)反應(yīng)的反應(yīng)混合物(例如含酶底物的反應(yīng)混合物)接觸，以產(chǎn)生反應(yīng)混合物，其中分子的存在或量能通過發(fā)光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品和/或反應(yīng)混合物還與試劑接觸，以檢測(cè)第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的分子，其中第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的分子的存在或量能通過不發(fā)光檢測(cè)檢測(cè)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中第一種酶和/或該酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子的存在或量的方法。該方法包括使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，以產(chǎn)生反應(yīng)混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少第一種酶和第二種酶是不相同的，例如基本上不識(shí)別相同底物，即它們不結(jié)合相同底物，或者如果它們與相同底物結(jié)合或反應(yīng)，則其中一種酶與另一種酶底物的反應(yīng)達(dá)不到相同程度(效率)，即當(dāng)兩種酶的底物都存在時(shí)，其中一種酶基本上不與另一種酶底物反應(yīng)。本文使用的基本上不與第二種酶底物反應(yīng)的酶(第一種酶)包括這樣的酶在具有第二種酶和等量的第一種酶底物和第二種酶底物的反應(yīng)中，相對(duì)于第一種酶和第一種酶底物之間的反應(yīng)，其與第二種酶底物的交叉反應(yīng)不超過25％，例如交叉反應(yīng)15％、10％或5％或更低。第一種底物、第一種底物和第一種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物和/或第一種酶和第一種底物的產(chǎn)物與第三種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)光。第二種底物、第二種底物和第二種酶之間反應(yīng)的(第二種)產(chǎn)物和/或另一種酶和第二種產(chǎn)物之間的反應(yīng)產(chǎn)物不發(fā)光但可以其它方式檢測(cè)。檢測(cè)或測(cè)定第一種酶和/或輔因子的存在或量。在一個(gè)實(shí)施方案中，還檢測(cè)或測(cè)定第二種酶和/或第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子的存在或量。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少第一種酶和第二種酶不相同。待檢測(cè)的酶可為天然酶或重組酶，例如包括融合蛋白。加入到樣品中的任選酶也可為天然酶或重組酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中第一種酶和/或該酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子的存在或量的方法。該方法包括使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，以產(chǎn)生反應(yīng)混合物，其中任選至少第一種酶和第二種酶不相同。第一種底物、第一種底物和第一種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物和/或第一種酶和第一種底物的產(chǎn)物與第三種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物不發(fā)光但可以其它方式檢測(cè)。第二種底物、第二種底物和第二種酶之間反應(yīng)的第二種產(chǎn)物和/或另一種酶和第二種產(chǎn)物之間的反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)光。檢測(cè)或測(cè)定第一種酶和/或輔因子的存在或量。在一個(gè)實(shí)施方案中，還檢測(cè)或測(cè)定第二種酶的存在或量。在反應(yīng)混合物中待檢測(cè)或使用的酶可為天然酶或重組酶。
本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測(cè)酶介導(dǎo)發(fā)光反應(yīng)以檢測(cè)第一種酶或該酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子的方法。該方法包括使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，以產(chǎn)生反應(yīng)混合物，其中第一種酶和第二種酶不相同。第一種底物、第一種底物和第一種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物和/或第一種酶和第一種底物的產(chǎn)物與第三種酶的產(chǎn)物發(fā)光。第二種底物、第二種底物和第二種酶之間反應(yīng)的第二種產(chǎn)物和/或第二種產(chǎn)物和另一種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物不發(fā)光但可以其它方式檢測(cè)。然后檢測(cè)發(fā)光。該方法可進(jìn)一步包括檢測(cè)第二種酶的存在或量，例如通過檢測(cè)不發(fā)光底物或產(chǎn)物的存在或量。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種酶不與第一種底物結(jié)合或反應(yīng)，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一種酶不與第二種底物結(jié)合或反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少第一種酶和第二種酶不相同。在反應(yīng)混合物中待檢測(cè)或使用的酶可為天然酶或重組酶。
本發(fā)明還提供檢測(cè)酶介導(dǎo)發(fā)光反應(yīng)以檢測(cè)第一種酶或該酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子的方法。該方法包括使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及第三種酶接觸，以產(chǎn)生反應(yīng)混合物。第一種底物、第一種底物和第一種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物和/或第一種酶和第一種底物的產(chǎn)物與第三種酶的產(chǎn)物不發(fā)光但可以其它方式檢測(cè)。第二種底物、第二種底物和第二種酶之間反應(yīng)的第二種產(chǎn)物和/或第二種產(chǎn)物和另一種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)光。然后檢測(cè)發(fā)光。該方法可進(jìn)一步包括檢測(cè)第一種酶或第一種酶和第一種底物的產(chǎn)物的存在或量。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種酶基本上不與第一種底物結(jié)合或反應(yīng)，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一種酶基本上不與第二種底物結(jié)合或反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少第一種酶和第二種酶不相同。在反應(yīng)混合物中待檢測(cè)或使用的酶可為天然酶或重組酶，例如包括融合蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測(cè)樣品中至少兩種分子的存在或量的方法。該方法包括使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，以產(chǎn)生反應(yīng)混合物，其中至少第一種酶和第二種酶不相同。第一種酶和第一種底物之間的反應(yīng)或第一種底物和第一種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物與第三種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物。第二種底物、第二種底物和第二種酶之間反應(yīng)的第二種產(chǎn)物和/或第二種產(chǎn)物和不同酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物不發(fā)光。然后檢測(cè)第一種酶和第二種酶和/或輔因子的存在或量。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)光用于檢測(cè)第一種酶和/或輔因子，熒光或比色用于檢測(cè)至少一種其它酶和/或輔因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩種不同酶的底物同時(shí)與樣品組合，以產(chǎn)生反應(yīng)混合物。一種底物和一種酶之間的反應(yīng)直接或間接產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)，而另一種底物和酶之間的反應(yīng)直接或間接產(chǎn)生熒光信號(hào)。在溫育期后，使用熒光信號(hào)檢測(cè)一種酶和/或輔因子的存在或量，使用發(fā)光信號(hào)檢測(cè)另一種酶和/或輔因子的存在或量。具體緩沖條件可隨待檢測(cè)的酶和/或輔因子變化，可由體外檢測(cè)(例如酶檢測(cè))領(lǐng)域技術(shù)人員確定?；蛘撸瑱z測(cè)可為兩步檢測(cè)，在第一個(gè)和第二個(gè)檢測(cè)之間包含試劑調(diào)節(jié)。例如，試劑調(diào)節(jié)可包括加入第一種反應(yīng)的猝滅劑和/或第二種反應(yīng)的增強(qiáng)劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，為檢測(cè)第一種酶或第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子和第二種酶或第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子，使樣品與第一種底物和第二種底物同時(shí)接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品在接觸第一種底物前接觸第二種底物，或在接觸第二種底物前接觸第一種底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可與一種或多種底物一起、在一種或多種底物之前或在一種或多種底物之后加入第三種或不同的酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，為檢測(cè)第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的第一種底物或輔因子和第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的第二種底物或輔因子，使樣品與第一種酶和第二種酶同時(shí)接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品在接觸第一種酶前接觸第二種酶，或在接觸第二種酶前接觸第一種酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，為檢測(cè)第一種酶或第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子和第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的第二種底物或輔因子，使樣品與第一種底物和第二種酶同時(shí)接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品在接觸第一種底物前接觸第二種酶，或在接觸第二種酶前接觸第一種底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，為檢測(cè)第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的第一種底物或輔因子和第二種酶或第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子，使樣品與第一種酶和第二種底物同時(shí)接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品在接觸第一種酶前接觸第二種底物，或在接觸第二種底物前接觸第一種酶。
用于本發(fā)明方法的樣品可為細(xì)胞裂解物、體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)物、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、生理液樣品(例如血液、血漿、血清、腦脊髓液、淚液或尿液樣品)，并可包括完整細(xì)胞。細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或上清液可得自原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
本發(fā)明還提供同時(shí)或依次檢測(cè)第一種和第二種蛋白(例如酶)或其中至少一種蛋白介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子的存在或量，例如提供同時(shí)反應(yīng)或依次反應(yīng)，任選沒有猝滅其中一種反應(yīng)或增強(qiáng)/加速其中一種反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一種和第二種底物同時(shí)加入到樣品中，并檢測(cè)第一種酶和/或輔因子的量或存在，然后檢測(cè)第二種酶和/或輔因子的量或存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將第一種和第二種底物同時(shí)加入到樣品中，并檢測(cè)第二種酶和/或輔因子的量或存在，然后檢測(cè)第一種酶和/或輔因子的量或存在?；蛘?，將第一種和第二種底物同時(shí)加入到樣品中，并同時(shí)檢測(cè)第一種和第二種酶和/或輔因子的存在或量。優(yōu)選在單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)酶和/或輔因子的存在或量，例如所有反應(yīng)都在單個(gè)容器(例如孔)中進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測(cè)酶介導(dǎo)反應(yīng)分子的存在或量的方法，其中所述酶介導(dǎo)反應(yīng)伴有熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白)表達(dá)。例如，可通過熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白或可在細(xì)胞中被標(biāo)記而發(fā)熒光的蛋白(例如脫鹵素酶)的細(xì)胞中熒光蛋白的存在或量，以及通過發(fā)光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)至少一種另外的分子，例如酶、底物或該酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子，該分子存在于細(xì)胞中或由細(xì)胞分泌。在一個(gè)實(shí)施方案中，還例如在不發(fā)光實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)或測(cè)定不同分子的存在或量。然后可使用由熒光蛋白產(chǎn)生的數(shù)據(jù)對(duì)該分子的存在或量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
因此，本發(fā)明提供檢測(cè)第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的分子的存在或量的方法。該方法包括使含熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞的樣品與沒有該分子的第一種酶的反應(yīng)混合物和任選的第二種酶接觸。第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物。然后檢測(cè)分子的存在或量和熒光蛋白的存在或量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于產(chǎn)生具有不同特征(例如不同顏色)的產(chǎn)物的發(fā)光和/或熒光檢測(cè)，可使用進(jìn)一步的多重檢測(cè)(即用其它底物)。例如，進(jìn)一步的多重檢測(cè)可包括使用由基于不同熒光素酶的反應(yīng)或底物散發(fā)的不同顏色或具有不同激發(fā)/發(fā)射光譜的熒光檢測(cè)。
本發(fā)明還提供測(cè)定細(xì)胞群(例如細(xì)胞培養(yǎng)群)中活細(xì)胞和/或死細(xì)胞的存在或數(shù)目的方法。該方法基于與細(xì)胞膜穿透性和完整性相關(guān)的差異性蛋白水解活性。該方法的優(yōu)勢(shì)包括用于下游多重應(yīng)用和群響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)示值讀數(shù)的敏感性、簡(jiǎn)單性、靈活性。基于一種蛋白酶底物的相對(duì)不可滲入性和細(xì)胞環(huán)境釋放的蛋白酶的對(duì)另一種蛋白酶底物的較差酶活性，預(yù)測(cè)存活力的差異化檢測(cè)。用于該實(shí)施方案的底物包括外切或內(nèi)切蛋白酶的底物，包括在N-末端或C-末端被封閉的底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用至少兩種不同的熒光底物(熒光檢測(cè)試劑)，其中一種底物基本上不能滲入細(xì)胞，并對(duì)在胞外環(huán)境中有活性的蛋白酶(例如遍在化、保守、釋放性蛋白酶)是特異性的。另一種底物基本上可滲入細(xì)胞，并對(duì)在活細(xì)胞中有活性但在存在于胞外環(huán)境中時(shí)基本無活性的胞內(nèi)蛋白酶是特異性的?；旧喜荒軡B入細(xì)胞的蛋白酶底物是這樣的底物在死細(xì)胞檢測(cè)中一般用于測(cè)定終點(diǎn)的時(shí)間段內(nèi)，例如蛋白酶底物加入樣品后少于5、4、3、2或1.5小時(shí)的時(shí)間，在活細(xì)胞中不可檢出的底物?；旧峡蓾B入細(xì)胞的蛋白酶底物是這樣的底物在活細(xì)胞檢測(cè)中一般用于檢測(cè)終點(diǎn)的時(shí)間段內(nèi)，例如底物加入樣品后5、15、30、60或120分鐘以上或更長(zhǎng)的時(shí)間，進(jìn)入活細(xì)胞的底物。在某些條件下基本無活性的蛋白酶是活性在該蛋白酶最佳活性約10％以下的蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，基本上不能滲入細(xì)胞的熒光底物包括三肽或四肽底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，基本上可滲入細(xì)胞的熒光底物包括氨基酸或二肽或三肽底物。使樣品與兩種底物接觸，任選用一種或多種測(cè)試條件或物質(zhì)以不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解或產(chǎn)生細(xì)胞裂解物的量(一般來說“非破壞性的”)處理該樣品。兩種熒光底物中的熒光團(tuán)具有不同光譜，由與熒光底物接觸的樣品獲得的相對(duì)熒光單位(RFLU)使得可以檢測(cè)樣品中的活細(xì)胞和死細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用熒光蛋白酶底物和發(fā)光蛋白酶底物檢測(cè)或測(cè)定樣品中活細(xì)胞和死細(xì)胞的存在或量。一種底物基本上不能滲入細(xì)胞，并對(duì)在胞外環(huán)境中有活性的蛋白酶是特異性的，另一種底物基本上可滲入細(xì)胞，并對(duì)在活細(xì)胞中有活性但在存在于胞外環(huán)境中時(shí)基本無活性的胞內(nèi)蛋白酶是特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，基本上不能滲入細(xì)胞的蛋白酶底物包括三肽或四肽底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，基本上可滲入細(xì)胞的蛋白酶底物包括氨基酸或二肽或三肽底物。例如在不存在導(dǎo)致細(xì)胞裂解的條件下使樣品與兩種底物接觸，檢測(cè)由蛋白酶切割產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物和發(fā)光產(chǎn)物(RFLU和RLU)，這使得可以測(cè)定樣品中的活細(xì)胞和死細(xì)胞。例如，可將不引起細(xì)胞裂解的熒光素酶檢測(cè)試劑加入到孔中，與發(fā)光底物接觸。
例如可使用熒光計(jì)或熒光計(jì)/發(fā)光計(jì)設(shè)備檢測(cè)釋放和保留的蛋白酶活性在光譜上不同的信號(hào)。這樣的檢測(cè)是成反比的，因而是互補(bǔ)的(complimentary)。存活力和細(xì)胞毒性檢測(cè)可用于標(biāo)準(zhǔn)化、控制和改進(jìn)數(shù)據(jù)。
如本文所述，將Ala-Ala-Phe-AMC(釋放性蛋白酶底物)和Gly-Phe-AFC(活細(xì)胞保留蛋白酶)與活細(xì)胞和細(xì)胞裂解物的一定百分比混合物合并。通過凍/融循環(huán)、變性劑處理以及誘導(dǎo)凋亡的物質(zhì)(例如星形孢菌素、rTRAIL和抗-Fas mAb)處理，損害細(xì)胞存活力。而且，細(xì)胞存活力的這些檢測(cè)還與其它細(xì)胞存活力檢測(cè)(CellTiter-GloTM、CellTiter-BlueTM或CytoTox-ONETM)或凋亡細(xì)胞毒性的特異性檢測(cè)(胱天蛋白酶-GloTM3/7、-8、-9或Apo-ONETM)復(fù)合。另如本文所述，其它底物，例如其它熒光底物(如含羅丹明110的熒光底物)或發(fā)光底物(如氨基熒光素型底物)，可用于蛋白酶釋放和/或蛋白酶保留檢測(cè)。
因此，本文描述的活細(xì)胞和/或死細(xì)胞檢測(cè)的使用提供細(xì)胞健康的反向和互補(bǔ)檢測(cè)，并可用于檢測(cè)條件改變(例如化合物處理)的作用，而不需要裂解步驟。而且，因?yàn)榈孜锞哂锌珊雎曰蚍枪逃械念伾栽诔蓪?duì)終點(diǎn)檢測(cè)中沒有可觀測(cè)的信號(hào)猝滅作用。此外，蛋白酶釋放和保留活性組分都具有實(shí)用敏感性(檢測(cè)10,000細(xì)胞/孔的存活力差異小于2-5％)，此敏感性可在少至15分鐘內(nèi)達(dá)到。另外，底物可混合入細(xì)胞孔中，而沒有急劇改變孔容量，這增加了下一步終點(diǎn)化學(xué)的靈活性。例如，使用偶聯(lián)dsDNA嵌入劑或其它合適終點(diǎn)的活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)，可用于檢測(cè)或測(cè)定死細(xì)胞相對(duì)對(duì)照的百分率、活細(xì)胞相對(duì)對(duì)照的百分率、相對(duì)于對(duì)照的總細(xì)胞數(shù)和/或細(xì)胞死亡機(jī)制(胱天蛋白酶活化)或其它終點(diǎn)報(bào)告分子檢測(cè)測(cè)定。
因此，本發(fā)明提供基于單一非破壞性熒光或非破壞性發(fā)光蛋白酶的檢測(cè)，或基于非破壞性熒光和/或非破壞性發(fā)光蛋白酶的活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)的多重檢測(cè)，或基于非破壞性熒光蛋白酶的檢測(cè)與其它檢測(cè)的組合(例如在同一孔中)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)中待檢測(cè)或測(cè)定的蛋白酶不相同，例如基本上不識(shí)別相同底物，即它們不結(jié)合相同底物，或者如果它們與相同底物結(jié)合或反應(yīng)，則其中一種蛋白酶與另一種蛋白酶底物的反應(yīng)達(dá)不到相同程度(效率)，即當(dāng)兩種蛋白酶的底物都存在時(shí)，其中一種蛋白酶基本上不與另一種蛋白酶的底物反應(yīng)。
本發(fā)明因此提供檢測(cè)樣品中的活細(xì)胞和/或死細(xì)胞的方法。該方法包括使樣品與第一種蛋白酶的底物和第二種蛋白酶的底物接觸。由一種蛋白酶介導(dǎo)的與一種底物的反應(yīng)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，由另一種蛋白酶介導(dǎo)的與另一種底物的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光或熒光產(chǎn)物。一種底物基本上可滲入細(xì)胞，另一種底物基本上不可滲入細(xì)胞。然后檢測(cè)和測(cè)定樣品中的熒光和/或發(fā)光，其再檢測(cè)或測(cè)定樣品中活細(xì)胞和/或死細(xì)胞的數(shù)目或存在。
在一個(gè)實(shí)施方案中，兩種不同蛋白酶的底物同時(shí)與樣品混合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品在接觸第一種底物前接觸第二種底物，或在接觸第二種底物前接觸第一種底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)可為兩步檢測(cè)，任選在第一個(gè)和第二個(gè)檢測(cè)之間具有試劑調(diào)節(jié)。本發(fā)明還提供第一種和第二種蛋白酶的存在或量的同時(shí)或依次檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一種和第二種底物同時(shí)加入到樣品中，并檢測(cè)一種蛋白酶的量或存在，然后檢測(cè)另一種蛋白酶的量或存在?；蛘?，將第一種和第二種底物同時(shí)加入到樣品中，并同時(shí)檢測(cè)第一種和第二種蛋白酶的存在或量。優(yōu)選在單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)蛋白酶的存在或量，例如所有反應(yīng)都在單個(gè)容器(例如孔)中進(jìn)行。
本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中活細(xì)胞的方法。該方法包括使樣品與基本上可滲入細(xì)胞的熒光底物接觸，該底物為結(jié)合蛋白酶體的蛋白酶、氨肽酶或組織蛋白酶的底物，檢測(cè)或測(cè)定樣品中的熒光，由此檢測(cè)或測(cè)定樣品中活細(xì)胞的數(shù)目或存在。
本發(fā)明還提供檢測(cè)樣品中死細(xì)胞的方法。該方法包括使樣品與基本上不能滲入細(xì)胞的熒光或發(fā)光底物接觸，該底物為三肽基肽酶、鈣蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的底物，檢測(cè)或測(cè)定樣品中的熒光或發(fā)光，由此檢測(cè)或測(cè)定樣品中死細(xì)胞的數(shù)目或存在。
本發(fā)明還提供含一種或多種用于本發(fā)明檢測(cè)的試劑的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)樣品中活細(xì)胞和/或死細(xì)胞的試劑盒。例如，本發(fā)明提供包含組合物和說明書的試劑盒，該組合物具有第一種蛋白酶的基本上不能滲入細(xì)胞的第一種熒光或發(fā)光底物，以及第二種蛋白酶的基本上可滲入細(xì)胞的第二種熒光底物；該說明書用于指導(dǎo)用戶使用該組合物檢測(cè)樣品中的活細(xì)胞和/或死細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物為溶液，例如其中底物以0.005至約1.0M(例如0.05至約0.2M)存在于溶劑(例如有機(jī)溶劑)中的溶液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含組合物的試劑盒，該組合物包含Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC或其任意組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物為溶液，例如其中底物以0.005至約1.0M(例如0.05至約0.2M)存在的溶液。
本發(fā)明的檢測(cè)還具有作為藥物開發(fā)工具的用途。許多藥物測(cè)試化合物具有可干擾熒光/發(fā)光多重檢測(cè)的熒光特性。本發(fā)明提供檢測(cè)假結(jié)果的檢測(cè)。如本文所述，將胱天蛋白酶-3的相同共有底物序列連接至具有不同光譜示值讀數(shù)的不同報(bào)告分子，例如具有熒光示值讀數(shù)的兩種分子和具有發(fā)光示值讀數(shù)的一種分子。在有和沒有胱天蛋白酶-3抑制劑或熒光素酶抑制劑的情況下檢測(cè)胱天蛋白酶-3和熒光素酶。數(shù)據(jù)表明，三種報(bào)告分子之間的干擾非常小，熒光素酶可用于控制假結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。
因此，可使用本發(fā)明的多重檢測(cè)，例如組合的熒光/發(fā)光檢測(cè)，檢測(cè)酶調(diào)節(jié)劑(例如抑制劑)的存在或量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括提供含第一種酶的不發(fā)光底物、第一種酶的第二種底物、用于發(fā)光檢測(cè)的第二種酶和測(cè)試劑的反應(yīng)混合物。不發(fā)光底物和第一種酶而不是第二種底物和第一種酶的反應(yīng)產(chǎn)生不發(fā)光產(chǎn)物，第二種底物和第一種酶反應(yīng)產(chǎn)生第二種酶的底物，例如熒光素酶底物。第二種酶的底物和第二種酶反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物。比較測(cè)試和對(duì)比反應(yīng)中發(fā)光產(chǎn)物和不發(fā)光產(chǎn)物的存在或量。兩個(gè)結(jié)果的對(duì)比表明調(diào)節(jié)劑對(duì)用于發(fā)光檢測(cè)的酶的作用，這可排除假結(jié)果。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-B。在發(fā)光和熒光檢測(cè)試劑二者存在下檢測(cè)胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8酶活性的多重檢測(cè)。A)相對(duì)光單位(RLU)對(duì)時(shí)間。B)相對(duì)熒光單位(RFU對(duì)時(shí)間。
圖2A-C。胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8的多重檢測(cè)。A)AMC的信號(hào)對(duì)背景熒光。B)羅丹明-110的信號(hào)對(duì)背景熒光。C)信號(hào)對(duì)背景發(fā)光。
圖3A-C。檢測(cè)胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8和胰蛋白酶活性的三重檢測(cè)。A)羅丹明-110的RFU；B)AMC的RFU；C)RLU。
圖4A-D。檢測(cè)蛋白酶(胱天蛋白酶-3)和非蛋白酶(β-半乳糖苷酶)的多重檢測(cè)。A)和C)分別為1/2小時(shí)和18小時(shí)的RLU。B)和D)分別為2小時(shí)和18小時(shí)的RFU。
圖5A-C。熒光素(A)、氨基熒光素(B)和Z-LETD-氨基熒光素(C)的激發(fā)和發(fā)射光譜。
圖6。在胱天蛋白酶-3檢測(cè)中三個(gè)通道-羅丹明-110、AMC和發(fā)光的信號(hào)對(duì)背景比率。
圖7A-D。檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)活性和腺苷三磷酸(ATP)的多重?zé)晒夂桶l(fā)光檢測(cè)。A)和C)RLU對(duì)ATP濃度。B)和D)RFU對(duì)LDH稀釋度。
圖8A-D。檢測(cè)LDH和胱天蛋白酶-3的多重?zé)晒夂桶l(fā)光檢測(cè)。A)和C)RLU對(duì)胱天蛋白酶-3濃度。B)和D)RFU對(duì)LDH稀釋度。
圖9A-D。檢測(cè)蛋白激酶A(PKA)和胱天蛋白酶-3的多重?zé)晒夂桶l(fā)光檢測(cè)。A)和C)RLU對(duì)胱天蛋白酶-3濃度。B)和D)RFU對(duì)PKA濃度。
圖10。檢測(cè)胱天蛋白酶-3和海腎熒光素酶(luc)的多重?zé)晒夂桶l(fā)光檢測(cè)。A)和C)RLU對(duì)星形孢菌素濃度。B)和D)RFU對(duì)胱天蛋白酶-3濃度。
圖11A。RFLU對(duì)用變性劑或載體和蛋白酶釋放檢測(cè)試劑處理的HL-60細(xì)胞數(shù)的作圖。
圖11B。熒光(AMC)蛋白酶釋放檢測(cè)的敏感性。
圖12A。RFLU對(duì)用蛋白酶釋放檢測(cè)試劑處理的Jurkat細(xì)胞存活百分率的作圖。
圖12B。熒光((Ala-Ala-Phe)2-R110)蛋白酶釋放檢測(cè)的敏感性。
圖13A。發(fā)光對(duì)用發(fā)光蛋白酶釋放檢測(cè)試劑處理的Jurkat細(xì)胞存活百分率的作圖。
圖13B。信噪比對(duì)用發(fā)光蛋白酶釋放檢測(cè)試劑處理的Jurkat細(xì)胞存活百分率的作圖。
圖14A。在有或沒有超聲情況下，RLU對(duì)用不同蛋白酶釋放檢測(cè)試劑處理的HL-60細(xì)胞數(shù)的作圖。
圖14B。用不同底物進(jìn)行的發(fā)光蛋白酶釋放檢測(cè)的敏感性。
圖15A。在蛋白酶釋放(細(xì)胞死亡)檢測(cè)(AN32504)和CytoTox-ONETM檢測(cè)中，信號(hào)-背景比率對(duì)星形孢菌素接觸時(shí)間的作圖。
圖15B。RFLU對(duì)星形孢菌素接觸時(shí)間、對(duì)LDH釋放的作圖。
圖16。在有或沒有裂解和不同pH情況下，RFLU對(duì)用蛋白酶釋放檢測(cè)試劑處理的HL-60細(xì)胞數(shù)的作圖。
圖17。與Ala-Ala-Phe-氨基熒光素接觸，并經(jīng)受不同裂解處理的HL-60細(xì)胞釋放的蛋白酶。
圖18。ATP發(fā)光和蛋白酶保留檢測(cè)試劑的RFLU對(duì)rTRAIL濃度的作圖。
圖19A。RFLU對(duì)用三種不同蛋白酶保留檢測(cè)試劑處理的Jurkat細(xì)胞數(shù)的作圖。
圖19B。三種不同底物在蛋白酶保留檢測(cè)中的敏感性。
圖20。皂苷處理后釋放的蛋白酶的蛋白酶活性的半壽期。
圖21A。基于蛋白酶的活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)。
圖21B。在具有活細(xì)胞、死細(xì)胞或活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)的依次多重應(yīng)用中的ATP存活力檢測(cè)。
圖21C。熒光活細(xì)胞或死細(xì)胞檢測(cè)和發(fā)光ATP檢測(cè)的依次多重檢測(cè)。
圖22A?；罴?xì)胞RFLU和胱天蛋白酶3/7活性的RFLU對(duì)SK-MEL-28細(xì)胞中離子霉素或星形孢菌素逐漸增加的濃度。
圖22B。活細(xì)胞RFLU和胱天蛋白酶3/7活性的RFLU對(duì)ACHN細(xì)胞中星形孢菌素逐漸增加的濃度。
圖23。死HeLa細(xì)胞發(fā)光和活HeLa細(xì)胞熒光對(duì)他莫昔芬處理小時(shí)數(shù)的作圖。
圖24A。用他莫昔芬處理和用PicoGreenTM染色的HeLa細(xì)胞的基于蛋白酶的活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)。
圖24B。用離子霉素處理和用PicoGreenTM染色的Hep2G細(xì)胞的基于蛋白酶的活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種多重檢測(cè)方法，其中在反應(yīng)混合物中同時(shí)或依次提供至少兩種蛋白(例如肽或多肽)結(jié)合和/或改變的不同分子，以檢測(cè)一種或多種成分，包括蛋白(肽或多肽)，例如酶或底物或反應(yīng)的輔因子。例如，在有效將至少一種酶底物轉(zhuǎn)變成底物和酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物的條件下，進(jìn)行一種或多種酶介導(dǎo)的反應(yīng)。優(yōu)選反應(yīng)混合物中的每種分子(例如底物)或反應(yīng)產(chǎn)物都具有與其它分子或產(chǎn)物不同的特征，在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種分子包括能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)告分子。產(chǎn)生的信號(hào)與待檢測(cè)分子的存在或量相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在有效將各種底物轉(zhuǎn)變成對(duì)應(yīng)產(chǎn)物的條件下，在至少兩種不同酶底物存在下，進(jìn)行兩種或更多種酶反應(yīng)，其中至少底物或每個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物和/或一種產(chǎn)物和第三種(例如不同的)酶之間反應(yīng)的產(chǎn)物具有與其它底物和/或產(chǎn)物不同的可檢測(cè)特征，例如不同的光學(xué)特征。在進(jìn)行反應(yīng)后，同時(shí)或依次檢測(cè)或測(cè)定一種或多種底物或一種或多種反應(yīng)產(chǎn)物的存在或量。由此可測(cè)定對(duì)應(yīng)酶和/或輔因子的存在或量。
因此，設(shè)想了兩種通用類型的多重檢測(cè)。首先，檢測(cè)同一反應(yīng)混合物中的多種成分，例如一種或多種酶、一種或多種底物和/或酶介導(dǎo)反應(yīng)的一種或多種輔因子。每種酶都能將至少一種底物轉(zhuǎn)變成對(duì)應(yīng)產(chǎn)物，其中底物和/或?qū)?yīng)產(chǎn)物或一種對(duì)應(yīng)產(chǎn)物和另一種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物具有不同的可檢測(cè)特征，使底物和/或產(chǎn)物在存在于同一反應(yīng)混合物中時(shí)可單獨(dú)被檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)中加入分子的順序可改變。因此，可同時(shí)或依次啟動(dòng)和/或進(jìn)行各個(gè)反應(yīng)。如果依次啟動(dòng)和進(jìn)行，不同的可檢測(cè)特征可能需要不同的檢測(cè)方法，和/或可進(jìn)行反應(yīng)條件調(diào)節(jié)(例如試劑濃度、溫度或另外的試劑)。例如，可在反應(yīng)間加入猝滅劑或增強(qiáng)劑(參見例如美國(guó)專利第5,774,320和6,586,196號(hào)，其公開內(nèi)容通過引用明確地結(jié)合到本文中)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在單一反應(yīng)混合物中同時(shí)進(jìn)行兩種或更多種反應(yīng)，其中每種酶都有效將反應(yīng)混合物中的一種底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物。該實(shí)施方案例如可用于測(cè)定細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或細(xì)胞上清液中至少兩種不同的酶和/或輔因子的存在或量。另外，反應(yīng)可包含一種或多種測(cè)試劑，例如酶抑制劑或活化劑，和/或不同濃度的抑制劑、活化劑或底物。
任選該檢測(cè)作為均相檢測(cè)使用，例如混合一種或多種底物和其它組分，然后將混合物加入到樣品中?？稍跊]有另外試劑轉(zhuǎn)移的情況下讀出結(jié)果。
在第二種檢測(cè)類型中，串聯(lián)進(jìn)行兩種或更多種酶介導(dǎo)的反應(yīng)?？赏瑫r(shí)或于不同時(shí)間進(jìn)行單獨(dú)的反應(yīng)。反應(yīng)可包含一種或多種相同或不同的酶、一種或多種相同或不同的測(cè)試劑(例如酶抑制劑或活化劑)和/或不同濃度的抑制劑、活化劑或底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，每種反應(yīng)混合物都包含至少兩種能夠轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的底物，其中底物和/或?qū)?yīng)產(chǎn)物和/或一種酶/底物對(duì)的產(chǎn)物和不同酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物具有不同的可檢測(cè)特征。
本發(fā)明的檢測(cè)因此允許檢測(cè)樣品中的多種酶或輔因子，所述樣品例如為含真核細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于人、猿、鼠、犬、牛、馬、貓、綿羊、山羊或豬細(xì)胞)、或原核細(xì)胞、或兩種或更多種不同生物的細(xì)胞、或其細(xì)胞裂解物或上清液的樣品。細(xì)胞可未通過重組技術(shù)進(jìn)行遺傳修飾(非重組細(xì)胞)，或可為重組細(xì)胞，其用重組DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和/或其基因組用重組DNA穩(wěn)定增加或其基因組已被修飾以破壞基因，例如破壞了啟動(dòng)子、內(nèi)含子或讀框，或一個(gè)DNA片段被另一個(gè)置換。重組DNA或置換DNA片段可編碼通過本發(fā)明方法檢測(cè)的分子、改變待檢測(cè)分子的水平或活性的成分和/或與分子或改變分子的水平或活性的成分不相關(guān)的基因產(chǎn)物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法提供同時(shí)或依次檢測(cè)單個(gè)樣品(例如等份細(xì)胞或其裂解物)中的多種成分(包括酶)的快速高敏感性方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在發(fā)光檢測(cè)中定量第一種酶、底物或輔因子的存在或量(活性)，在不發(fā)光檢測(cè)(例如熒光檢測(cè))中定量第二種酶、底物或輔因子的存在或量。在一個(gè)實(shí)施方案中，可一起或依次加入每個(gè)反應(yīng)的試劑，例如底物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在熒光檢測(cè)中定量第一種酶、底物或輔因子的存在或量，在發(fā)光檢測(cè)中定量第二種酶、底物或輔因子的存在或量。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在發(fā)光檢測(cè)中定量輔因子的存在或量，在不發(fā)光檢測(cè)中定量不同的分子。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在不發(fā)光檢測(cè)中定量輔因子的存在或量，在發(fā)光檢測(cè)中定量不同的分子。發(fā)光或不發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度是相應(yīng)分子的存在或量的函數(shù)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供單重或多重檢測(cè)方法，其中為樣品(例如未經(jīng)歷細(xì)胞裂解的樣品)提供一種或多種外切和/或內(nèi)切蛋白酶的一種或多種底物，這些底物用于檢測(cè)或測(cè)定樣品中活細(xì)胞和/或死細(xì)胞的數(shù)目或存在。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)單等份細(xì)胞或其裂解物中一種或多種酶的存在或量的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種酶是內(nèi)切酶。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供監(jiān)測(cè)含蛋白酶和其它酶的制品中至少一種蛋白酶和任選另一種酶的活性的改進(jìn)型敏感方法，所述制品包括得自原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的純化制品、細(xì)胞(例如培養(yǎng)的真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的細(xì)胞裂解物或上清液。對(duì)于在不同細(xì)胞區(qū)域中存在的酶，例如分泌性蛋白酶和胞內(nèi)蛋白酶，可將每種酶的底物加入到含完整細(xì)胞的孔中。可在檢測(cè)分泌性蛋白酶的存在或量之后檢測(cè)胞內(nèi)蛋白酶，例如在細(xì)胞裂解后，例如胞內(nèi)蛋白酶檢測(cè)可與分泌性蛋白酶檢測(cè)在同一容器(例如相同孔)中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，將胞內(nèi)蛋白酶的非細(xì)胞滲入性底物和分泌性或釋放性蛋白酶的底物加入到含細(xì)胞的樣品中，然后任選裂解細(xì)胞?？稍诩?xì)胞裂解前或細(xì)胞裂解后檢測(cè)分泌性或釋放性蛋白酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將胞內(nèi)蛋白酶或分泌性或釋放性蛋白酶的非細(xì)胞滲入性底物和第二種胞內(nèi)酶的細(xì)胞滲入性底物加入到含細(xì)胞的樣品中?？稍诓涣呀獾那闆r下，檢測(cè)第二種胞內(nèi)酶和分泌性或釋放性蛋白酶的存在。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行三重檢測(cè)，以檢測(cè)分泌性或釋放性蛋白酶、胞內(nèi)酶(使用細(xì)胞滲入性底物或非細(xì)胞滲入性底物)和另一種分子(例如DNA或ATP)或第二種酶(例如胞內(nèi)酶(使用細(xì)胞滲入性底物或非細(xì)胞滲入性底物))。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用熒光、發(fā)光或分光光度法檢測(cè)分泌性或釋放性蛋白。
本發(fā)明方法可用于檢測(cè)任何分子，包括任意酶或任意酶組?？捎扇我饷附M合(包括重組酶和內(nèi)源(天然)酶)中選擇用于該方法的酶，該酶是待檢測(cè)的酶或者是用于檢測(cè)底物或輔因子的酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所有待檢測(cè)的酶都是內(nèi)源酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩種待檢測(cè)的酶是內(nèi)源酶，另一種酶是重組酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種酶是內(nèi)源酶，另一種酶是重組酶。其它組合對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，可用于本文教導(dǎo)的本發(fā)明檢測(cè)和方法。所述酶包括但不限于蛋白酶、磷酸酶、過氧化物酶、磷酸酯酶、肽酶和糖苷酶。所述酶可基于催化反應(yīng)性質(zhì)來自不同組別，這些組別包括但不限于水解酶、氧化還原酶、裂解酶、轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶、連接酶或合成酶，或者它們可來自相同組別，只要至少一種酶相對(duì)與至少一種其它酶具有部分重疊或優(yōu)選基本不同的底物特異性。特別令人感興趣的是具有生理意義的酶類別。這些酶包括蛋白激酶、肽酶、酯酶、蛋白磷酸酶、異構(gòu)酶、糖基化酶、合成酶、蛋白酶、脫氫酶、氧化酶、還原酶、甲基化酶等。目的酶包括參與形成或水解酯(有機(jī)酯和無機(jī)酯)、糖基化和水解酰胺的酶。在任一種類型中都可進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)分，如對(duì)于激酶，激酶可特異性磷酸化肽或蛋白中的絲氨酸、蘇氨酸和/或酪氨酸殘基。因此，所述酶可為例如不同激酶功能組別的激酶，包括受環(huán)狀核苷酸調(diào)節(jié)的蛋白激酶、蛋白激酶C、受Ca2+/CaM調(diào)節(jié)的激酶、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、ERK/MAP激酶和蛋白-酪氨酸激酶。激酶可為在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有效磷酸化寡肽底物的激酶，例如ERK激酶、S6激酶、IR激酶、P38激酶和AbI激酶。對(duì)于這些激酶，底物可包括寡肽底物。其它目的激酶可包括例如Src激酶、JNK、MAP激酶、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、P53激酶、血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體、表皮生長(zhǎng)因子受體和MEK。
具體地說，用于本發(fā)明的酶包括任何具有酶活性的蛋白，例如脂酶、磷脂酶、硫酸酯酶、脲酶、肽酶、蛋白酶和酯酶，包括酸性磷酸酶、葡糖苷酶、葡糖醛酸酶、半乳糖苷酶、羧酸酯酶和熒光素酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種酶是水解酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩種酶是水解酶。水解酶的實(shí)例包括堿性和酸性磷酸酶、酯酶、脫羧酶、磷脂酶D、P-木糖苷酶、β-D-巖藻糖苷酶、硫葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、α-D-葡糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-葡糖苷酸酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-呋喃果糖苷酶和β-D-葡糖苷酸酶。
任何特定酶介導(dǎo)反應(yīng)的底物或輔因子都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。表1列出了某些蛋白酶的代表性切割位點(diǎn)。
表1
X是一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
對(duì)于堿性磷酸酶，優(yōu)選底物包括含磷酸的二氧雜環(huán)丁烷，例如3-(2′-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷二鈉鹽，或3-(4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′(5′-氯)-三環(huán)-[3.3.1.13，7]癸]-4-基]苯基磷酸二鈉，或2-氯-5-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-(5′-氯)-三環(huán){3.3.13，7]癸}-4-基)-1-苯基磷酸二鈉或2-氯-5-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-三環(huán)[3.3.1.13，7]癸}-4-基)-1-苯基磷酸二鈉(分別為AMPPD、CSPD、CDP-Star和ADP-StarTM)。
對(duì)于半乳糖苷酶，底物優(yōu)選包括含半乳糖苷酶可切割基團(tuán)或吡喃半乳糖苷基團(tuán)的二氧雜環(huán)丁烷。檢測(cè)中的發(fā)光由酶切割二氧雜環(huán)丁烷底物的糖部分產(chǎn)生。這種底物的實(shí)例包括3-(2′-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3″-β-D-吡喃半乳糖)苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷(AMPGD)、3-(4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-(5′-氯)三環(huán)[3.3.1.13，7]-癸]-4-基-苯基-β-D-吡喃半乳糖(Galacton)、5-氯-3-(甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-(5′-氯)三環(huán)[3.3.13，7]癸-4-基-苯基-β-D-吡喃半乳糖(Galacton-Plus)和2-氯-5-(4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′(5′-氯)-三環(huán)-[3.3.1.13，7]癸]-4-基)-苯基-β-D-吡喃半乳糖(Galacton-Star)。
在β-葡糖醛酸酶和β-葡糖苷酶檢測(cè)中，底物包括含β-葡糖醛酸酶可切割基團(tuán)(例如葡糖苷酸)的二氧雜環(huán)丁烷，例如3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-(5′-氯)-三環(huán)[3.3.1.13，7]癸}-4-基)苯基-β-D-葡糖醛酸鈉(GlucuronTM)。在羧酸酯酶檢測(cè)中，底物包含結(jié)合至二氧雜環(huán)丁烷的合適酯基。在蛋白酶和磷脂酶檢測(cè)中，底物包含結(jié)合至二氧雜環(huán)丁烷的合適酶可切割基團(tuán)。
優(yōu)選檢測(cè)中每種酶的底物都不同。對(duì)于包括一種含二氧雜環(huán)丁烷底物的檢測(cè)，底物任選包含取代或未取代的金剛烷基、可取代或未取代的Y基團(tuán)和酶可切割基團(tuán)。二氧雜環(huán)丁烷的優(yōu)選實(shí)例包括上文提及的二氧雜環(huán)丁烷，例如稱為Galacton、Galacton-Plus、CDP-Star、GlucuronTM、AMPPD、Galacton-Star和ADP-StarTM的二氧雜環(huán)丁烷，以及3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-(5′-氯)-三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-4-基)苯基-β-D-吡喃葡糖苷(GluconTM)、CSPD、3-氯-5-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-(5′-氯)-三環(huán)[3.3.1.13，7]癸-4-基)-1-苯基磷酸二鈉(CDP)。
優(yōu)選將至少一種待檢測(cè)酶的底物修飾以含報(bào)告分子。報(bào)告分子是任何這樣的分子其允許連接至該分子的底物、酶和該底物之間反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物或該產(chǎn)物和另一種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物差異化檢測(cè)，優(yōu)選定量檢測(cè)。報(bào)告分子包括但不限于光學(xué)分子(例如熒光團(tuán))、吸收性有色顆?；蛉玖稀⒎派湫詷?biāo)記、酶(例如在合適反應(yīng)組分存在下有效催化可檢測(cè)反應(yīng)的催化部分)、當(dāng)與其它亞單位或片段結(jié)合時(shí)有功能的酶的亞單位或片段，或后續(xù)反應(yīng)的底物，例如其中該反應(yīng)產(chǎn)物可檢測(cè)的底物。本文使用的“熒光團(tuán)”包括能在某個(gè)波長(zhǎng)范圍吸收能量并能在該吸收范圍以外的波長(zhǎng)范圍釋放能量的分子。術(shù)語“激發(fā)波長(zhǎng)”指熒光團(tuán)吸收能量的波長(zhǎng)范圍。術(shù)語“發(fā)射波長(zhǎng)”指熒光團(tuán)釋放能量或熒光的波長(zhǎng)范圍。
在一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)告分子發(fā)熒光。熒光劑的一個(gè)基團(tuán)是呫噸染料，其包含熒光素、Rosamine和羅丹明?？墒惺郢@得在苯基上具有取代基的這些化合物，其可用作鍵合位點(diǎn)或鍵合官能團(tuán)。例如，可獲得氨基和異硫氰酸酯取代的熒光素化合物。
另一組熒光化合物是在α或β位(通常在α位)具有氨基的萘胺。在萘胺化合物中包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽和2-對(duì)-甲苯胺基-6-萘磺酸鹽。某些萘化合物被發(fā)現(xiàn)具有一些非特異性蛋白結(jié)合，致使其應(yīng)用需要使用其中蛋白量最小化的檢測(cè)介質(zhì)。其它熒光劑是多齒配位體，包括含氮大環(huán)，其具有帶π電子的共軛環(huán)系統(tǒng)。這些大環(huán)任選被取代，包括橋碳或氮上的取代。合適的大環(huán)包括卟啉、氮雜卟啉、咕啉、Sapphyrin和葉琳烯(porphycene)以及其它類似大環(huán)的衍生物，其包含廣泛離域的電子。氮雜卟啉衍生物包括酞菁、苯并三氮雜卟啉和萘菁及其衍生物。
在某些情況下，可使用熒光融合蛋白，例如融合至多肽底物的綠色、紅色或藍(lán)色熒光蛋白或其它熒光蛋白。在其它實(shí)施方案中，熒光蛋白自身可為水解酶的底物。“熒光蛋白”是全長(zhǎng)熒光蛋白或其熒光片段。
表2顯示了用于本發(fā)明的化學(xué)熒光團(tuán)的非限制性清單以及其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。激發(fā)和發(fā)射值可根據(jù)反應(yīng)條件(例如pH、緩沖體系或溶劑)改變。
表2
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用含氨基修飾熒光素或其羧基受保護(hù)衍生物的底物檢測(cè)其中一種酶，該修飾包括酶底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾是含蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，底物通過肽鍵共價(jià)連接至氨基熒光素或其羧基修飾衍生物的氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如使用氨基末端保護(hù)基修飾肽或蛋白底物的N-端，以防止被氨肽酶降解。在沒有合適酶或輔因子時(shí)，由于存在極少量氨基熒光素，含此底物和熒光素酶的混合物產(chǎn)生極少量光。在存在合適酶時(shí)，該酶可切割連接底物和氨基熒光素的鍵，產(chǎn)生熒光素酶底物氨基熒光素。因此，在存在熒光素酶(例如天然、重組或突變熒光素酶)和任何輔因子和合適反應(yīng)條件時(shí)，產(chǎn)生光，其與酶的存在或活性成比例。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用含熒光團(tuán)的底物檢測(cè)其中一種酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，底物包括一個(gè)或多個(gè)含蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，底物共價(jià)連接至一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)。在沒有合適酶或輔因子時(shí)，由于例如通過鄰近的猝滅基團(tuán)猝滅熒光團(tuán)的熒光特性，使得底物-熒光團(tuán)綴合物的特性被改變，導(dǎo)致綴合物的熒光特性相對(duì)于單獨(dú)的熒光團(tuán)被改變(例如降低)，含此底物的混合物于發(fā)射波長(zhǎng)產(chǎn)生極少量光。在存在合適酶時(shí)，綴合物的切割產(chǎn)生熒光團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在切割前，綴合物發(fā)熒光，但在酶切割后，產(chǎn)物具有改變的光譜。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)反應(yīng)的條件相容。例如，至少2種酶的條件，優(yōu)選3種酶或更多種酶(例如4種酶或更多種酶)的條件相容。一組相似酶一般具有相容的反應(yīng)條件，例如pH和離子強(qiáng)度，但是，涉及具有相對(duì)低質(zhì)量濃度的檢測(cè)組分(例如輔因子)的輔因子要求、金屬離子要求等，不需要相同。相同條件包括在反應(yīng)過程中使每種酶提供可檢測(cè)速率的條件，一般是每種酶具有其特定底物最大轉(zhuǎn)換率的至少約10％，通常至少約20％，優(yōu)選至少約50％，不受加入的用于其它酶的組分的明顯干擾。
或者，一個(gè)反應(yīng)的條件可與另一個(gè)反應(yīng)不相容，盡管兩個(gè)反應(yīng)的底物都存在。在這樣的實(shí)施方案中，一種酶有活性，但不能與其底物反應(yīng)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)兩個(gè)反應(yīng)的條件不相容時(shí)，依次和/或在單獨(dú)的反應(yīng)混合物中進(jìn)行各個(gè)酶檢測(cè)反應(yīng)。在酶檢測(cè)后，反應(yīng)混合物(或其部分)可與另一個(gè)反應(yīng)組合。各單獨(dú)的反應(yīng)混合物可包含一種或多種酶和一種或多種底物。就其最簡(jiǎn)單形式而言，各反應(yīng)混合物中有一種待檢測(cè)的酶和該酶的一種底物。反應(yīng)中使用的底物組具有和在單反應(yīng)多重檢測(cè)中所要求特性相同的一般特性。即，每種底物和/或?qū)?yīng)產(chǎn)物具有獨(dú)特特性，使其彼此之間可被區(qū)分。
反應(yīng)中分子的檢測(cè)順序可以改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，不論反應(yīng)是否同時(shí)開始，都檢測(cè)通過發(fā)光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的分子，然后檢測(cè)通過不發(fā)光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的分子。或者，不論反應(yīng)是否同時(shí)開始，都檢測(cè)通過不發(fā)光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的分子，然后檢測(cè)通過發(fā)光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的分子。在其它實(shí)施方案中，基本上同時(shí)檢測(cè)兩種或更多種分子的存在或量。在一個(gè)實(shí)施方案中，顯著降低待檢測(cè)的一種分子的存在或活性，然后檢測(cè)第二種分子的存在或量，例如通過等待直至第一種信號(hào)消失，例如消失至少50％，或通過加入第一種反應(yīng)的猝滅劑。因此，在某些實(shí)施方案中，例如通過在檢測(cè)前抑制反應(yīng)中的酶，終止一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)。優(yōu)選一個(gè)檢測(cè)產(chǎn)生的信號(hào)基本上不干擾至少一個(gè)其它檢測(cè)產(chǎn)生的信號(hào)的量。
本發(fā)明還提供檢測(cè)樣品(例如含完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物如至少部分純化的裂解物或細(xì)胞上清液的樣品)中一種或多種肽或蛋白、肽或蛋白結(jié)合和/或改變的分子或輔因子的存在或活性的試劑盒。這樣的試劑盒包括至少一種試劑，用于定量至少一種肽和/或蛋白、肽和/或蛋白結(jié)合和/或改變的分子或輔因子，例如至少一種酶的底物。
本發(fā)明將通過以下的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述。對(duì)于所有實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員都容易設(shè)計(jì)合適的對(duì)照反應(yīng)。
實(shí)施例I熒光/發(fā)光多重檢測(cè)A.在單孔多重實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8評(píng)價(jià)胱天蛋白酶-GloTM8試劑(胱天蛋白酶-GloTM8檢測(cè)系統(tǒng)，Promega，Corp.)允許多重化均相發(fā)光胱天蛋白酶-8酶檢測(cè)和不發(fā)光胱天蛋白酶-3酶檢測(cè)的能力。胱天蛋白酶-GloTM8試劑由胱天蛋白酶-GloTM8緩沖液和發(fā)光底物Z-LETD-氨基熒光素組成。對(duì)于圖1A中的發(fā)光檢測(cè)，使用胱天蛋白酶-GloTM8試劑(菱形)或還含有50-胱天蛋白酶-3熒光底物(Z-DEVD)2-羅丹明-110的胱天蛋白酶-GloTM8試劑(方形)，表明多重發(fā)光和不發(fā)光檢測(cè)的靈活性。對(duì)于圖1B中的熒光檢測(cè)，使用含50μM(Z-DEVD)2-羅丹明-110和10mM DTT(菱形)或50μM(Z-DEVD)2-羅丹明-110和Z-LETD-氨基熒光素(方形)的胱天蛋白酶-GloTM8緩沖液。
在RPMI 1640(Sigma Corporation)中制備終濃度為100單位/ml的胱天蛋白酶-8酶、胱天蛋白酶-3酶和組合的胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3酶(Biomol Research Laboratories)的稀釋液。將100μl胱天蛋白酶-8稀釋液、胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3稀釋液的混合物或胱天蛋白酶-3稀釋液加入到96孔板的各個(gè)孔中。加入100μl有或沒有50μM(Z-DEVD)2-羅丹明-110的胱天蛋白酶-GloTM8試劑(圖1A)或100μl有或沒有Z-LETD-氨基熒光素、補(bǔ)加(Z-DEVD)2-羅丹明110和DTT的胱天蛋白酶-GloTM8緩沖液(圖1B)，至終體積為200μl/孔。反應(yīng)板在板振蕩器上于室溫溫育至少10分鐘。
在溫育后，使用DYNEX Laboratories MLXTM板發(fā)光計(jì)測(cè)定相對(duì)發(fā)光，使用配備485EX/530EM濾光片組的CytoFluor II熒光板讀數(shù)器檢測(cè)相對(duì)熒光。
結(jié)果圖1A顯示了單個(gè)孔中兩種蛋白酶熒光和發(fā)光的同時(shí)檢測(cè)。由圖1A可見，在胱天蛋白酶-8發(fā)光檢測(cè)(方形)中存在胱天蛋白酶-3及其熒光底物(Z-DEVD)2-羅丹明-110沒有很大地改變發(fā)光反應(yīng)。同樣，由圖1B可見，在胱天蛋白酶-3熒光檢測(cè)(方形)中存在胱天蛋白酶-8及其發(fā)光底物Z-LETD-氨基熒光素未影響胱天蛋白酶-3熒光檢測(cè)。
B.胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8多重檢測(cè)的背景測(cè)定混合各種濃度的發(fā)光和不發(fā)光試劑(包括胱天蛋白酶酶及其底物)和緩沖組分，以確定各種成分對(duì)熒光和/或發(fā)光的影響。熒光底物(Z-DEVD)2-羅丹明-110在羅丹明通道(485EX/520EM)報(bào)告胱天蛋白酶-3活性，熒光底物Ac-DEVD-AMC在AMC通道(360EX/460EM)報(bào)告胱天蛋白酶-3活性，而底物Z-LETD-氨基熒光素在發(fā)光檢測(cè)中報(bào)告胱天蛋白酶-8活性。表III描述了用于12種不同反應(yīng)條件的各種組分的量(μl)，獲得總體積約500μl的總混合物，或每種反應(yīng)條件100μl的總混合物/反應(yīng)(n＝4)。對(duì)于‘加入的胱天蛋白酶’行，該行中的數(shù)字規(guī)定了過多加入的胱天蛋白酶的類型，沒有描述體積。
表3
1.胱天蛋白酶-8luc對(duì)照2.胱天蛋白酶-3羅丹明-110對(duì)照3.胱天蛋白酶-3 AMC對(duì)照4.多重對(duì)照和羅丹明-1105.多重對(duì)照和羅丹明-110+抑制劑6.多重對(duì)照和AMC7.胱天蛋白酶-3和氨基熒光素混合物8.胱天蛋白酶-3和氨基熒光素混合物+抑制劑9.胱天蛋白酶-8和羅丹明-11010.胱天蛋白酶-3和氨基熒光素混合物11.胱天蛋白酶-8和氨基熒光素混合物+抑制劑12.胱天蛋白酶-3和羅丹明-110，沒有氨基熒光素混合物將表III的組分加入至雙份孔中，于室溫溫育反應(yīng)物2小時(shí)。使用的緩沖液得自胱天蛋白酶-GloTM8檢測(cè)系統(tǒng)。DMSO得自Sigma-Aldrich，DTT得自Amersco。底物和抑制劑得自Promega Corp。
使用DYNEX Laboratories MLXTM板發(fā)光計(jì)測(cè)定相對(duì)發(fā)光。使用CytoFluor II熒光板讀數(shù)器，配備485EX/530EM濾光片組用于羅丹明-110，接著配備360EX/460EM濾光片組用于AMC通道，檢測(cè)相對(duì)熒光。
結(jié)果對(duì)于圖2A、B和C，所有的carat都代表在該情況下預(yù)期熒光或發(fā)光指示酶活性。圖2A顯示了每個(gè)反應(yīng)的AMC熒光信號(hào)。僅在存在Ac-DEVD-AMC和胱天蛋白酶-3的合適底物/酶組合(反應(yīng)條件3和6)時(shí)，才出現(xiàn)背景之上的熒光。圖2B顯示了每個(gè)反應(yīng)的羅丹明-110熒光信號(hào)。除了存在胱天蛋白酶-3抑制劑(反應(yīng)條件5)以外，當(dāng)存在(Z-DEVD)2-羅丹明-110/胱天蛋白酶-3的底物/酶組合(反應(yīng)條件2、4、10和12)時(shí)，出現(xiàn)背景之上的熒光。對(duì)于背景以上的發(fā)光信號(hào)(圖2C)，具有Z-LETD-氨基熒光素/胱天蛋白酶-8的合適底物/酶組合的反應(yīng)表現(xiàn)出背景以上的信號(hào)(反應(yīng)條件1、4、6、7、9和10)，例外是存在胱天蛋白酶抑制劑的反應(yīng)條件(反應(yīng)條件5、8和11)。因此，數(shù)據(jù)表明，在這些條件下，反應(yīng)組分對(duì)背景熒光和發(fā)光檢測(cè)的影響可忽略不計(jì)。
C.在單孔三重實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8和胰蛋白酶在Dulbecco磷酸緩沖鹽水(Sigma Corp.)中制備可檢測(cè)水平的胱天蛋白酶-8(150單位/ml，Biomol Research Laboratories)、胱天蛋白酶-3(Pharmingen Corp.)、胰蛋白酶(Sigma Corp.)以及全部三種酶組合的稀釋液。將100μl各種酶稀釋液加入到96孔板的孔中，適當(dāng)時(shí)將100μl各種底物單獨(dú)或組合加入到對(duì)應(yīng)孔中胱天蛋白酶-3底物(Z-DEVD)2-羅丹明-110、胰蛋白酶底物Z-PRNK-AMC(如美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)09/955,639所述為β-類胰蛋白酶底物，但具有公認(rèn)較小的胰蛋白酶效用，其通過引用整體結(jié)合到本文中)、胱天蛋白酶-8底物Z-LETD-氨基熒光素。當(dāng)胱天蛋白酶-GloTM8緩沖液和底物一起用于熒光檢測(cè)時(shí)，包含10mM DTT。板在板振蕩器上于室溫溫育至少10分鐘。
在溫育后，使用BMG Fluorostar(BMG Labtechnologies Ltd.)檢測(cè)胱天蛋白酶-8活性的相對(duì)發(fā)光。使用Labsystems Fluoroskan Ascen板讀數(shù)器測(cè)定相對(duì)熒光。對(duì)于胱天蛋白酶-3活性，使用485EX/527EM濾光片組。對(duì)于胰蛋白酶活性，使用360EX/460EM濾光片組。
結(jié)果如圖3A所示，在采用混合的三種不同底物和對(duì)應(yīng)酶的反應(yīng)(三重檢測(cè))中，用于檢測(cè)胱天蛋白酶-3的條件產(chǎn)生相對(duì)比對(duì)照條件高的熒光。當(dāng)對(duì)比三重檢測(cè)(所有底物和所有酶)中的胱天蛋白酶-3活性和單獨(dú)的胱天蛋白酶-3活性時(shí)，胱天蛋白酶-3活性高于胱天蛋白酶-3處于和其它三重酶反應(yīng)相同反應(yīng)中時(shí)的背景。對(duì)胰蛋白酶(圖3B)和胱天蛋白酶-8(圖3C)觀察到相似的結(jié)果，雖然與胱天蛋白酶-3的程度不同。
D.以單孔多重形式檢測(cè)胱天蛋白酶-3和β-半乳糖苷酶通過用Beta-Glo緩沖液(Beta-Glo檢測(cè)系統(tǒng)，Promega Corp.)重構(gòu)Beta-Glo凍干底物，或向Beta-Glo緩沖液中加入(Z-DEVD)2-羅丹明-110(50μM)，或用Beta-Glo緩沖液重構(gòu)Beta-Glo凍干底物并加入(Z-DEVD)2-羅丹明-110(50μM，制備試劑。用RPMI 1640稀釋胱天蛋白酶-3(2μl/ml，Pharmingen Corp)或β-半乳糖苷酶(0.1μl/ml)或胱天蛋白酶-3和β-半乳糖苷酶，并向96孔白板孔中加入100μl。向96孔板孔中加入100μl合適試劑，將板于室溫溫育。在30分鐘時(shí)使用DYNEX Laboratories MLXTM板發(fā)光計(jì)檢測(cè)發(fā)光。在溫育后2小時(shí)，用具有485EX/530EM濾光片組的CytoFluor II熒光板讀數(shù)器測(cè)定熒光。所有的測(cè)定都在18小時(shí)時(shí)在CytoFluor II熒光計(jì)上以不同的增益調(diào)整重復(fù)1次，以補(bǔ)償增加的熒光。
結(jié)果圖4A和C表明，在存在檢測(cè)胱天蛋白酶-3的熒光試劑時(shí)，β-半乳糖苷酶發(fā)光檢測(cè)是可用的。圖4B和D表明，在檢測(cè)β-半乳糖苷酶的發(fā)光試劑存在時(shí)，檢測(cè)胱天蛋白酶-3的的熒光檢測(cè)是可用的。由圖4B和4D可見，發(fā)光試劑組分對(duì)背景熒光具有較小的影響。但是，熒光試劑組分對(duì)發(fā)光的影響幾乎沒有(圖4A和4C)。
E.發(fā)光檢測(cè)底物的光譜掃描用含0.1M Tris pH7.3、2mM EDTA和10mM MgSO4的緩沖液，將熒光素、氨基熒光素和Z-LETD-氨基熒光素稀釋至約2μM。在配備1.25mm激發(fā)和發(fā)射狹縫濾光片的情況下，用SPEX Fluorolog-2分光發(fā)光計(jì)以1mm波長(zhǎng)間隔和0.2秒積分時(shí)間掃描樣品。所有的掃描都使用石英比色皿進(jìn)行。
結(jié)果對(duì)于熒光素和氨基熒光素，于325mn激發(fā)，并捕獲375-750nm的發(fā)射，捕獲280-550nm的激發(fā)，于600nm檢測(cè)發(fā)射(圖5A和5B)。對(duì)于Z-LETD-氨基熒光素，于325mn激發(fā)，并捕獲375-750nm的發(fā)射，捕獲280-550nm的激發(fā)，于525nm檢測(cè)發(fā)射(圖5C)。令人感興趣的是，當(dāng)肽綴合至氨基熒光素時(shí)(圖5C)，綴合物的發(fā)射峰藍(lán)移至較短的波長(zhǎng)。這令人意外，因此可進(jìn)行雙重發(fā)光/熒光檢測(cè)，具體地說是使用的熒光團(tuán)以與氨基熒光素發(fā)射相同的波長(zhǎng)范圍發(fā)射時(shí)。
實(shí)施例II檢測(cè)假結(jié)果的方法方法在胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-3抑制劑(Ac-DEVD-CHO，10μM)或熒光素酶抑制劑(白藜蘆醇(Resveratol)，5μM)存在下，將含Z-DEVD-氨基熒光素的胱天蛋白酶-GloTM3/7試劑(胱天蛋白酶-GloTM3/7檢測(cè)，Promega，Corp.)與(Z-DEVD)2-羅丹明-110或Ac-DEVD-AMC組合。在30分鐘時(shí)對(duì)胱天蛋白酶-3切割Z-DEVD-氨基熒光素的發(fā)光信號(hào)讀數(shù)，而在2小時(shí)時(shí)使用合適的AMC或羅丹明110濾光片組對(duì)胱天蛋白酶-3切割活性的熒光信號(hào)讀數(shù)。
結(jié)果發(fā)光獲得最大的信號(hào)對(duì)背景比率，接著是羅丹明-110，然后是AMC(圖6)。加入已知的胱天蛋白酶-3抑制劑一致且負(fù)面地影響用于檢測(cè)胱天蛋白酶-3的全部三種底物。這提示可組合發(fā)光和熒光試劑，例如用于控制進(jìn)行任一種檢測(cè)時(shí)潛在的假結(jié)果干擾。因此，如果一種物質(zhì)是特定酶的真正抑制劑，則多重信號(hào)可用于測(cè)定。
實(shí)施例III另外的代表性多重檢測(cè)A.單孔形式的乳酸脫氫酶(LDH)和腺苷三磷酸(ATP)多重檢測(cè)制備以下檢測(cè)試劑1)使用LDH試劑(30mM HEPES，pH7.4、10mM NaCl、20mM MgSO4、250μM刃天青(Aldrich))重構(gòu)CytoTox-ONETM均相膜完整性檢測(cè)(Promega Corp，技術(shù)公告306)的凍干底物組分；2)使用ATP試劑(30mM HEPES，pH7.4、10mM NaCl、20mMMgSO4)重構(gòu)CellTiter-GloTM發(fā)光細(xì)胞存活力檢測(cè)(Promega Corp，技術(shù)公報(bào)288)的凍干底物；3)使用LDH/ATP組合試劑(30mM HEPES，pH7.4、10mM NaCl、20mM MgSO4、250μM刃天青(Aldrich))重構(gòu)CytoTox-ONETM的凍干底物組分，其再用于重構(gòu)CellTiter-GloTM的凍干底物。
用10mM HEPES，pH7.5、0.1％Prionex(PentaPharma Corp)溶液制備LDH(0、1∶8000、1∶4000、1∶2000，菱形)、ATP(0、1.25、2.5和5μM，方形)和LDH/ATP組合(分別為0/0μM、1∶8000/1.25μM、1∶4000/2.5μM和1∶2000/5μM，三角形)的樣品稀釋液，向96孔白板孔中加入100μl稀釋液(n＝4)。向樣品中加入合適的檢測(cè)試劑(100μl)，保護(hù)板避光，混合30秒，于室溫溫育。在8分鐘溫育后，用具有560EX/590Em濾光片組的Labsystems Fluoroskan Ascent板讀數(shù)器檢測(cè)熒光。在溫育后30分鐘，使用Dynex MLX板發(fā)光計(jì)記錄發(fā)光。
結(jié)果和對(duì)照反應(yīng)(圖7C)相比，LDH及其熒光檢測(cè)試劑對(duì)ATP發(fā)光檢測(cè)(圖7A)具有較小影響；但是，ATP檢測(cè)仍是有可能的。向LDH熒光檢測(cè)中加入發(fā)光檢測(cè)試劑不影響背景熒光(圖7B)，盡管和對(duì)照反應(yīng)(圖7D)相比總熒光下降，但LDH活性仍可檢測(cè)。
B.單孔形式的LDH和胱天蛋白酶-3多重檢測(cè)制備以下試劑1)LDH試劑-使用補(bǔ)加238-刃天青的胱天蛋白酶-GloTM3/7緩沖液重構(gòu)CytoTox-ONETM凍干底物；2)胱天蛋白酶-3試劑-按照Promega技術(shù)公告323使用胱天蛋白酶-GloTM3/7緩沖液重構(gòu)胱天蛋白酶-GloTM3/7凍干底物；3)LDH/胱天蛋白酶-3組合試劑-使用LDH試劑(如上制備)重構(gòu)凍干胱天蛋白酶-GloTM3/7底物。LDH/胱天蛋白酶-3組合試劑的LDH檢測(cè)試劑化合物不穩(wěn)定，原因是在胱天蛋白酶-GloTM3/7凍干底物中存在DTT，所以該試劑在加入樣品前立即制備。
用10mM HEPES pH7.5、0.1％Prionex(PentaPharma Corp)溶液制備樣品稀釋液LDH的0、1∶8000、1∶4000、1∶2000稀釋液(菱形)；0、5、10和20U/ml胱天蛋白酶-3(BIOMOL Laboratories，方形)和LDH/胱天蛋白酶-3組合(分別為0/0U/ml、1∶8000/5U/ml、1∶4000/10U/ml和1∶2000/20U/ml，三角形)。向96孔白板中加入100μl稀釋液(n＝4)。向樣品中加入合適的檢測(cè)試劑(100μl)，保護(hù)板避光，混合30秒，于室溫溫育。在于室溫溫育6分鐘后，用具有560EX/590Em濾光片組的Labsystems Fluoroskan Ascent板讀數(shù)器檢測(cè)熒光。在溫育后45分鐘，使用Dynex MLX板發(fā)光計(jì)記錄發(fā)光。
結(jié)果和對(duì)照反應(yīng)相比，向多重反應(yīng)中加入熒光LDH檢測(cè)試劑降低了發(fā)光(分別為圖8A和8C)。盡管在圖8A中總發(fā)光信號(hào)下降，但存在熒光LDH檢測(cè)試劑時(shí)發(fā)光胱天蛋白酶-3檢測(cè)是可用的。圖8B表明，和對(duì)照相比，當(dāng)將發(fā)光胱天蛋白酶-3檢測(cè)試劑加入到多重反應(yīng)中時(shí)，熒光背景增加(圖8D)；但是，圖8A表明，在存在胱天蛋白酶-3發(fā)光檢測(cè)試劑時(shí)，LDH熒光檢測(cè)是可用的。LDH對(duì)背景發(fā)光沒有影響(圖8C)，胱天蛋白酶-3對(duì)背景熒光沒有影響(圖8D)。
C.單孔形式的胱天蛋白酶-3和蛋白激酶A(PKA)多重檢測(cè)制備以下的檢測(cè)試劑1)PKA試劑-制備含100mM Tris pH7.3、100mM MgCl2、1∶1000稀釋度的PKA羅丹明-110底物(ProFluorTMPKA檢測(cè)，Promega Corporation，技術(shù)公告315)和400μMATP的1X反應(yīng)緩沖液；2)胱天蛋白酶-3試劑-制備含100mM Tris pH7.3、100mM MgCl2、150μg/ml重組熱穩(wěn)定熒光素酶、80-Z-DEVD-氨基熒光素(Promega Corp)、400μM ATP、100μM DTT(Promega Corp)、2.5mM CaCl2(Fisher)、40mM MgS04(Fisher)和0.2％Tergitol NP-9(Sigma)的1X反應(yīng)緩沖液；3)激酶/胱天蛋白酶-3組合試劑-制備含100mM Tris(pH7.3)、100mM MgCl2、1∶1000稀釋度的PKA羅丹明-110底物、150μg/ml重組熱穩(wěn)定熒光素酶、80μMZ-DEVD-氨基熒光素、400μM ATP、100μM DTT、2.5mM CaCl2、40mM MgSO4和0.2％Tergitol NP-9的1X反應(yīng)緩沖液；4)蛋白激酶終止試劑-制備含100mM Tris pH7.3、100mM MgCl2、1∶50稀釋度的蛋白酶試劑(ProFluorTMPKA實(shí)驗(yàn))、30μM星形孢菌素(BIOMOL Laboratories)的1X終止試劑。
制備樣品在10mM HEPES pH7.5、0.1％Prionex(PentaPharmaCorp)溶液中的稀釋液0、1、2和4U/ml PKA(菱形)；0、5、10和20U/ml胱天蛋白酶-3(方形)和PKA與胱天蛋白酶-3組合(分別為0/0U/ml、1/5U/ml、2/10U/ml和4/20U/ml，三角形)，將40μl稀釋液(n＝4)加入到96孔白板中。向樣品中加入合適的檢測(cè)試劑(40μl)，保護(hù)板避光，混合30秒，于室溫溫育20分鐘。在溫育后，將40μl蛋白激酶終止試劑加入到含單獨(dú)的激酶試劑或組合激酶/胱天蛋白酶-3試劑的孔中。再將板混合30秒，保護(hù)避光，于室溫溫育30分鐘以上。用具有485EX/527Em濾光片組的Labsystems Fluoroskan Ascent板讀數(shù)器檢測(cè)熒光。使用Dynex MLX板發(fā)光計(jì)記錄發(fā)光。
結(jié)果和存在PKA但沒有全部PKA檢測(cè)試劑的對(duì)照反應(yīng)(圖9C)相比，加入熒光PKA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑引起發(fā)光背景增加(圖9A)。但是，胱天蛋白酶-3活性產(chǎn)生的反應(yīng)發(fā)光成比例增加，條件似乎沒有影響發(fā)光胱天蛋白酶-3反應(yīng)自身。和存在胱天蛋白酶-3但沒有全部胱天蛋白酶-3檢測(cè)試劑的熒光對(duì)照反應(yīng)(圖9D)相比，向PKA熒光檢測(cè)中加入胱天蛋白酶-3檢測(cè)試劑(圖9B)降低總熒光超過50％。使用這些多重條件可檢測(cè)背景以上的胱天蛋白酶-3和PKA活性。
D.單孔形式的海腎熒光素酶和胱天蛋白酶-3多重檢測(cè)制備以下的檢測(cè)試劑1)將海腎熒光素酶的細(xì)胞滲入性修飾腔腸素底物EnduRenTM(Promega Corp.)在補(bǔ)加10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸鹽的F-12組織培養(yǎng)基中稀釋至600μM；2)胱天蛋白酶-3底物將(Z-DEVD)2-羅丹明-110(Promega Corp.)在補(bǔ)加10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸鹽的F-12組織培養(yǎng)基中稀釋至250μM；3)熒光素酶/胱天蛋白酶-3組合底物用補(bǔ)加10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸鹽的F-12組織培養(yǎng)基稀釋EnduRenTM(600μM)和(Z-DEVD)2-羅丹明-110(250μM)。
將穩(wěn)定表達(dá)海腎熒光素酶的CHO-K1細(xì)胞(ATCC)(CHO-K1hRL25)保持在10％胎牛血清和500μg/ml G-418硫酸鹽中，用于基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。利用這些細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)條件包括1)歸因于星形孢菌素加入的熒光素酶活性水平變化，2)歸因于星形孢菌素和胱天蛋白酶-3酶加入的熒光素酶活性水平變化，和3)未加星形孢菌素但加入胱天蛋白酶-3酶的熒光素酶活性。
收獲CHO-K1 hRL25細(xì)胞，并以20,000細(xì)胞/孔的密度平板接種入96孔透明底、白壁組織培養(yǎng)板中，于37℃在5％CO2中溫育過夜。將星形孢菌素以終濃度0、0.5、1、2μM(10μl/孔)加入到合適的孔中，以啟動(dòng)細(xì)胞死亡，由此改變熒光素酶活性。再于37℃在5％CO2中溫育細(xì)胞3.5小時(shí)。在組織培養(yǎng)基(10μl/孔)中以0、5、10和20U/ml將各種濃度的胱天蛋白酶-3(BIOMOL Laboratories)加入到合適的孔中。因此，數(shù)據(jù)點(diǎn)的組合星形孢菌素/胱天蛋白酶-3濃度分別為0μM/0U/ml、0.5μM/5U/ml、1μM/10U/ml和2μM/20U/ml。在加入胱天蛋白酶-3酶后立即將10μl/孔的熒光素酶底物、胱天蛋白酶-3底物或熒光素酶/胱天蛋白酶-3底物加入到合適孔中。在加入檢測(cè)試劑后，簡(jiǎn)短地混合平板，于37℃在5％CO2中溫育2小時(shí)。用具有485EX/527Em濾光片組的Labsystems Fluoroskan Ascent板讀數(shù)器檢測(cè)熒光。使用Dynex MLX板發(fā)光計(jì)記錄發(fā)光。
結(jié)果海腎熒光素酶活性在這些檢測(cè)中用作細(xì)胞死亡的內(nèi)控。因此，隨著星形孢菌素濃度增加，熒光素酶活性應(yīng)下降。圖10A表明，和對(duì)照反應(yīng)(圖10C)相比，加入胱天蛋白酶-3底物沒有負(fù)面影響熒光素酶反應(yīng)。圖10B表明，加入熒光素酶底物對(duì)背景熒光沒有作用，盡管和圖10D相比總熒光稍微增加。在存在胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-3底物時(shí)海腎熒光素酶的發(fā)光檢測(cè)是完全可用的，在存在海腎熒光素酶或海腎熒光素酶底物時(shí)，胱天蛋白酶-3的熒光檢測(cè)僅稍微受影響，但完全可用。
實(shí)施例IV蛋白酶保留和釋放細(xì)胞存活力多重檢測(cè)活細(xì)胞和死細(xì)胞檢測(cè)廣泛用于監(jiān)測(cè)響應(yīng)特定化學(xué)、生物或物理處理的細(xì)胞存活力改變。存活力和細(xì)胞毒性檢測(cè)一般是相反的，檢測(cè)不同的生物標(biāo)記。從歷史上講，通過細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)細(xì)胞存活力一般變化的方法與外膜滲透性變化相關(guān)。檢測(cè)受損膜結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法包括錐蟲藍(lán)排除、核酸染色和乳酸脫氫酶釋放(Riss等，2004；Myers等，1998)。評(píng)價(jià)細(xì)胞功能或增殖的檢測(cè)包括氚化胸苷摻入、ATP含量、四唑染料轉(zhuǎn)變或二乙酸熒光素(Cook等，1989)。假定完整細(xì)胞膜不允許大的帶電分子或肽由胞外空間進(jìn)入胞質(zhì)。相反，受損的膜允許染料或化合物自由滲透入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)容物滲出細(xì)胞外。這種滲透性現(xiàn)象是染料標(biāo)記(“生命”染料、DNA嵌入劑或酯酶修飾的熒光素)和LDH釋放檢測(cè)二者的基礎(chǔ)。然而，雖然測(cè)定細(xì)胞存活力的現(xiàn)有技術(shù)仍然是有用和成本有效的應(yīng)用，它們具有許多技術(shù)或?qū)嵅偃毕荩@限制了其在高含量、多重化或高通量形式中的應(yīng)用。例如，目前通過LDH釋放(CytoTox-ONETM)或染料還原能力(CellTiter-BlueTM)檢測(cè)細(xì)胞膜完整性不能被配對(duì)(標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的一種方法)，原因是共用刃天青底物和Ex/Em光譜重疊。而且，用于兩種檢測(cè)的有色刃天青底物限制了采用其它終點(diǎn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)(顏色猝滅)的第二檢測(cè)信號(hào)窗強(qiáng)度(和敏感性)，濃度和形式對(duì)第二檢測(cè)試劑對(duì)不是最佳的(例如限制體積)。
現(xiàn)有的活細(xì)胞/死細(xì)胞形式使用羧基熒光素和溴化乙錠同二聚體，后者是已知的有效誘變劑。該形式需要清洗和置換細(xì)胞培養(yǎng)基。而且，羧基熒光素在水溶液中表現(xiàn)出自發(fā)水解，而染色DNA的溴化乙錠同二聚體插入可干擾下游數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。
培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含富蛋白酶、酯酶、脂酶和核酸酶的環(huán)境。例如，以4種一般類型的蛋白酶(天冬氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和金屬依賴性)為代表，其與內(nèi)穩(wěn)態(tài)保持的特殊功能相關(guān)。這些胞質(zhì)、溶酶體和跨膜結(jié)合蛋白酶參與胞內(nèi)蛋白降解、產(chǎn)生免疫原性肽、翻譯后修飾和細(xì)胞分裂(Tran等，2002，Constam等，1995，Vinitsky等，1997)。這些酶的活性受各種機(jī)制調(diào)節(jié)，包括特異性區(qū)室化(Bond等，1987)。響應(yīng)極端壓力、環(huán)境惡化或凋亡程序的持續(xù)進(jìn)展(committedprogression of the apoptotic program)，觀察到區(qū)室化和膜完整性同等程度的損失(Syntichaki等，2003，Haunstetter等，1998)。因此，在體外細(xì)胞模型中將穩(wěn)定的蛋白水解介導(dǎo)物釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中代表了細(xì)胞死亡的潛在替代。相反，保留的蛋白水解酶的細(xì)胞酶學(xué)染色與細(xì)胞健康的表型觀察結(jié)果相對(duì)應(yīng)?？傊?，這樣的蛋白水解活性可能有助于確定細(xì)胞培養(yǎng)群中存活或受損細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目，例如“活/死”檢測(cè)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)基于蛋白酶的活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)，一種底物(用于死細(xì)胞)是相對(duì)大量、有活性和保守蛋白酶的底物，其在胞質(zhì)pH(例如7.0-7.2)穩(wěn)定且有活性，并具有不同光譜讀數(shù)示值(R/O)的標(biāo)志。優(yōu)選該底物的切割動(dòng)力學(xué)與LDH釋放平行，活性條件不包括毒性或膜改變物質(zhì)，例如鹽或硫醇，獲得快速的檢測(cè)時(shí)間。另一種底物(用于活細(xì)胞)是相對(duì)大量和保守蛋白酶的底物，其對(duì)于活細(xì)胞是可滲入細(xì)胞的，蛋白酶在活細(xì)胞胞質(zhì)環(huán)境中有活性，但在胞外環(huán)境中不穩(wěn)定。該底物具有不同光譜R/O的標(biāo)志，進(jìn)行切割反應(yīng)，以獲得快速的檢測(cè)時(shí)間。在非破壞性檢測(cè)中使用兩種底物可檢測(cè)不需要的增殖事件，由于使用了處于不同光譜的互補(bǔ)和獨(dú)立性替代，所以可減少錯(cuò)誤結(jié)論和減少由于細(xì)胞聚集或移液產(chǎn)生的錯(cuò)誤，因?yàn)榇婊盍?duì)細(xì)胞毒性比率與該孔中的存活細(xì)胞數(shù)無關(guān)。
A.采用AMC或R110熒光報(bào)告分子或氨基熒光素發(fā)光報(bào)告分子的蛋白酶釋放檢測(cè)形式2倍連續(xù)稀釋HL-60細(xì)胞，然后通過加入Triton X至最終0.2％裂解或通過加入載體保持。將1/10體積的200μM Ala-Ala-Phe-AMC底物在100mM乙酸鈉pH 4.5中的溶液加入到裂解物或細(xì)胞中，并于37℃再溫育1小時(shí)。然后使用CytoFluor II于Ex.360 Em.460檢測(cè)與裂解或活細(xì)胞有關(guān)的熒光。
通過錐蟲藍(lán)排除計(jì)數(shù)進(jìn)行活躍倍增的Jurkat細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)95％以上存活。以RPMI 1640+10％FBS將細(xì)胞調(diào)節(jié)至100,000細(xì)胞/ml，并分成兩等份。使用裝備有微探頭的Misonix 3000以30％功率、3×5秒脈沖對(duì)1等份超聲。另一部分在超聲過程(總共約5分鐘)中于37℃水浴中溫育。然后通過代表0-100％存活度的比率混合將細(xì)胞懸浮液和裂解物組分混合成各種存活度。然后將混合的細(xì)胞樣品以100μl體積加入到白壁、透明底96孔板(Costar)中。用RPMI-1640將(Ala-Ala-Phe)2-R110稀釋至1000μM，并以1/10體積加入到板中。將板溫育30分鐘，然后使用CytoFluor II于Ex 485 Em 530檢測(cè)熒光。
通過錐蟲藍(lán)排除計(jì)數(shù)進(jìn)行活躍倍增的Jurkat細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)95％以上存活。用RPMI 1640+10％FBS將細(xì)胞調(diào)節(jié)至100,000細(xì)胞/ml，并分成兩等份。使用裝備有微探頭的Misonix 3000以30％功率、3×5秒脈沖對(duì)1等份超聲。另一部分在超聲過程(總共約5分鐘)中于37℃水浴中溫育。然后通過代表0-100％存活度的比率混合將細(xì)胞懸浮液和裂解物組分混合成各種存活度。然后將混合的細(xì)胞樣品以100μl體積加入到白壁、透明底96孔板(Costar)中。通過用10ml 10mM Hepes(pH7.5)再水合熒光素檢測(cè)試劑塊(Promega V859A)，并補(bǔ)加Ala-Ala-Phe-氨基熒光素至100μM終濃度，制備發(fā)光蛋白酶釋放檢測(cè)試劑。將100μl發(fā)光蛋白酶釋放檢測(cè)試劑加入到板的孔中，使用BMGFLUOstar Optima以動(dòng)力學(xué)模式檢測(cè)發(fā)光。
計(jì)算AMC熒光形式的實(shí)際敏感性約為240個(gè)細(xì)胞(圖11)，這是和CytoTox-ONETM相當(dāng)?shù)拿舾行灾?。R110形式(圖12)的檢測(cè)敏感性相似，提供了再另一個(gè)用于多重檢測(cè)應(yīng)用的熒光團(tuán)。值得注意的是，這些檢測(cè)的敏感性在沒有熒光猝滅的情況下獲得，熒光猝滅是CytoTox-ONETM或其它基于刃天青的檢測(cè)用于下游多重應(yīng)用的主要障礙。發(fā)光形式的精確直線性和范圍(圖13)使得可統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)9800個(gè)活細(xì)胞的群中少至200個(gè)細(xì)胞。非裂解發(fā)光形式提供了對(duì)細(xì)胞毒性檢測(cè)的另一種替代。
B.具有不同酶靶的蛋白酶釋放檢測(cè)形式將活躍倍增的HL-60細(xì)胞調(diào)節(jié)至100,000細(xì)胞/ml，并分成兩等份。使用微探頭Misonix 3000以30％功率、3次5秒脈沖對(duì)1等份超聲。另一等份保持于37℃。然后用RPMI 1640+10％FBS將細(xì)胞懸浮液和裂解物連續(xù)2倍稀釋至100μl體積。單獨(dú)的培養(yǎng)基用作無細(xì)胞對(duì)照。將熒光素檢測(cè)試劑塊(Promega V859A)重懸浮在2.0ml 10mMHepes pH7.5中。然后將熒光素檢測(cè)試劑分開，與Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基熒光素或Ala-Ala-Phe-氨基熒光素一起制成1mM。將每種試劑以1/10體積加入板的獨(dú)立雙份孔中，并使其在Me′Cour熱夾套水浴儲(chǔ)存器中于37℃溫育15分鐘，然后使用BMG FLUOstar Optima進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)。
盡管進(jìn)行Z-LLVY-氨基熒光素檢測(cè)沒有AAF-氨基熒光素序列適宜，但其表明，其它蛋白酶可用作受損完整性的替代(圖14)。在此情況下，LLVY活性可歸因于蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶活性。
C.蛋白酶釋放時(shí)程在透明底、白壁96孔板(Costar)中，在37℃、5％CO2下，在7小時(shí)時(shí)程內(nèi)，用10μM星形孢菌素或匹配的DMSO載體對(duì)照處理HL-60細(xì)胞(25,000/孔)。制作200μM Ala-Ala-Phe-AMC底物在100mM乙酸鈉(pH4.5)中的溶液。將10μl體積的底物(樣品的1/10體積)加入到孔中，并再溫育1小時(shí)。在CytoFluor II上以Ex.360 Em.460檢測(cè)“蛋白酶釋放”活性。在平行組孔中，CytoTox-ONETM試劑起膜完整性檢測(cè)對(duì)照的作用。在于Ex.560 Em.580檢測(cè)熒光前10分鐘加入試劑。
細(xì)胞滲透性的動(dòng)力學(xué)，即LDH和蛋白酶釋放，彼此映襯，與細(xì)胞群中繼發(fā)性壞死的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致(圖15)。在酸性乙酸鈉制備物中提供氨肽酶底物(樣品的終pH約為6.5)，以適應(yīng)潛在的溶酶體蛋白酶活性。
D.蛋白酶釋放活性pH要求使用調(diào)節(jié)至pH2.5、3.5和4.5的100mM乙酸鈉研究蛋白酶釋放活性的pH要求，并對(duì)比未調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(水載體)。在這些緩沖液中加入Ala-Ala-Phe-AMC至200μM。將1/10體積的溶液加入到板中，并通過回轉(zhuǎn)振蕩簡(jiǎn)短混合。將板于37℃溫育40分鐘，然后使用CytoFluor II于Ex.360 Em.460檢測(cè)熒光。
加入1/10體積的乙酸鈉(pH4.5)將培養(yǎng)基最終pH降低至約6.5。沒有測(cè)試其它降低pH的溶液/培養(yǎng)基組合的最終pH，但先前的實(shí)驗(yàn)提示，加入1/10體積的乙酸鈉(pH2.5)將細(xì)胞培養(yǎng)基pH降低至約5.5。發(fā)現(xiàn)未調(diào)節(jié)pH的載體被證實(shí)對(duì)蛋白酶釋放活性最有利(圖16)。該活性與胞質(zhì)氨肽酶一致，可能不是溶酶體蛋白酶(組織蛋白酶等)。這是有意義的，因?yàn)闄z測(cè)蛋白酶釋放活性不需要有害或潛在細(xì)胞毒性的添加劑。這使溫育時(shí)限更靈活，更經(jīng)得起可能的發(fā)光型檢測(cè)的檢驗(yàn)。
E.蛋白酶釋放酶亞細(xì)胞定位將HL-60細(xì)胞調(diào)節(jié)至100,000細(xì)胞/ml，并分成兩等份。使用微探頭Misonix 3000以30％功率、3次5秒脈沖對(duì)1等份超聲。將100μl該裂解物(形態(tài)學(xué)證實(shí))加入到透明底96孔板的多個(gè)孔中，以RPMI1640+10％FBS連續(xù)2倍稀釋。同樣，加入100μl未超聲的細(xì)胞懸浮液，在板的多個(gè)孔中連續(xù)稀釋。分別以0.2％和30μg/ml終濃度向單獨(dú)的孔中加入NP-9和洋地黃皂甙。未處理的對(duì)照由活細(xì)胞和匹配體積的水載體組成。用2ml 10mM Hepes(pH7.5)再水合熒光素檢測(cè)塊(Promega V859A)，與Ala-Ala-Phe-氨基熒光素(Promega)一起制成500μM。將20μl此促發(fā)光蛋白酶釋放溶液加入到所有孔中，在于37℃溫育15分鐘后使用BMG FLUOstar Optima檢測(cè)發(fā)光。
已知具有以上參數(shù)和濃度的超聲和NP-9不僅破壞外膜，而且破壞溶酶體內(nèi)容物(據(jù)組織蛋白酶釋放檢測(cè))(圖17)。洋地黃皂甙的選擇性破壞使得可進(jìn)行錐蟲藍(lán)染色，沒有溶酶體破裂的證據(jù)。因此，因?yàn)槌暬虿煌冃詣┝呀庵g的活性是相似的，在和pH優(yōu)化合在一起考慮時(shí)，人們可猜測(cè)在蛋白酶釋放檢測(cè)中檢測(cè)的蛋白酶可能在胞質(zhì)中，在完整細(xì)胞器外。
F.蛋白酶釋放或保留酶底物選擇性由Promega獲得Ala-Ala-Phe-AMC。Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基熒光素、Z-Leu-Arg-氨基熒光素、Z-Phe-Arg-氨基熒光素、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、(Ala-Ala-Phe)2-R110和(Gly-Phe)2-R110由PromegaBiosciences合成。Suc-Ala-Ala-Phe-AMC、H-Phe-AMC、H-Tyr-AMC、Glutyl-Ala-Ala-Phe-AMC、H-Gly-Phe-AMC、Z-Gly-Ala-Met-AMC、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC、D-Ala-Leu-Lys-AMC、H-Gly-Ala-AMC、H-Gly-Gly-AMC、Suc-Ala-Ala-Phe-AMC、Z-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC、Z-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC和Ac-Ala-Ala-Tyr-AMC來源于Bachem。Gly-Phe-AFC、Pro-Phe-Arg-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC和Ser-Tyr-AFC得自Calbiochem。Z-Phe-Arg-AMC和Suc-Arg-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC購(gòu)自Sigma。
根據(jù)固有溶解性，將所有底物以10-100mM溶解在DMSO中。以10mM Hepes pH7.5或匹配培養(yǎng)基細(xì)胞+10％血清將熒光底物稀釋至100μM-1mM，并以1/10體積加入至白壁、透明底96孔板中的裂解(冷凍破碎、超聲或變性劑)或未處理活細(xì)胞中。HL-60或Jurkat由于其易于操作的懸浮表型而在實(shí)驗(yàn)中可互換使用。板于37℃溫育15-30分鐘，然后利用CytoFluor II檢測(cè)熒光。
將發(fā)光底物加入到熒光素檢測(cè)塊(Promega V859A)中，該檢測(cè)塊在2ml 10mM Hepes pH7.5中重懸至500μM。將1/5體積的促發(fā)光反應(yīng)混合物加入到白壁、透明底96孔板中的裂解(冷凍破碎、超聲或變性劑)或未處理活細(xì)胞中。此外，HL-60或Jurkat在實(shí)驗(yàn)中可互換使用。板在由Caron 2050W交換器控制的MeCour循環(huán)加熱組合單元中于37℃溫育。檢測(cè)15-30分鐘之間的發(fā)光(信號(hào)穩(wěn)態(tài))。
檢驗(yàn)了廣泛的蛋白水解底物，以致力于表征潛在底物對(duì)在受損或活細(xì)胞中的蛋白酶釋放或保留的偏好(參見表4)。選擇氨基末端封閉的底物(Z、Suc-或Ac-)，以闡述是內(nèi)切肽酶活性還是外切肽酶活性占優(yōu)勢(shì)。檢驗(yàn)未封閉的底物(H-等)，以納入氨肽酶活性的貢獻(xiàn)。由此名單可見，至少呈現(xiàn)出3種蛋白水解模式優(yōu)選未封閉Ala-Ala-Phe三肽的氨肽酶樣活性，依據(jù)封閉Leu-Leu-Val-Tyr肽的釋放檢測(cè)的蛋白酶體(胰凝乳蛋白酶樣)活性，以及Gly-Phe、Gly-Ala、Phe-、Tyr-或Gly-Gly-Leu底物的非常不穩(wěn)定活性。后面的活性僅在活的完整細(xì)胞中才能檢測(cè)到。更有意義的是幾個(gè)熒光團(tuán)或促發(fā)光標(biāo)記可用于檢測(cè)這些活性，最終允許增強(qiáng)下游多重檢測(cè)的靈活性。
表4
無代表沒有高于對(duì)照群的統(tǒng)計(jì)學(xué)活性。
(+)至(+++++)代表對(duì)照群以上的活性范圍，由中到強(qiáng)。
G.蛋白酶保留活性和活細(xì)胞要求將Jurkat細(xì)胞以20,000細(xì)胞/孔密度、50μl體積接種入白壁、透明底96孔板中。以RPMI 1640+10％FBS制備凋亡誘導(dǎo)劑rTRAIL(BioMol)的連續(xù)稀釋液，由500ng/ml開始，并以50μl體積雙份平行加入到細(xì)胞中。加入50μl培養(yǎng)基用作載體對(duì)照。將板于37℃在5％CO2中溫育4小時(shí)。用RPMI 1640將Gly-Phe-AFC稀釋至1mM，并以10μl體積加入到所有孔中。接著將板置于MeCour循環(huán)加熱組合單元上30分鐘，然后用CytoFluor II于Ex.405 Em.530檢測(cè)熒光。接下來，向孔中加入等體積的CellTiter-GloTM試劑，利用FLUOstar Optima通過發(fā)光檢測(cè)檢查細(xì)胞中剩余的ATP含量。
相對(duì)ATP水平和蛋白酶保留活性實(shí)際上是可疊加的，提示最佳保留酶活性對(duì)細(xì)胞存活力或原狀細(xì)胞膜的要求(圖18)。因?yàn)槠茐哪ね暾詫?duì)保留活性有害，所以該活性可與釋放活性偶聯(lián)，用于檢測(cè)群存活力的“活/死”形式。
H.使用不同肽序列和報(bào)告分子的蛋白酶保留檢測(cè)形式在白壁、透明底96孔板中，以100μl體積的RPMI 1640+10％FBS將活躍倍增的Jurkat細(xì)胞由37,500細(xì)胞/孔開始連續(xù)稀釋。加入TritonX至0.2％終濃度，裂解一半板中的細(xì)胞。另一半板孔接受匹配體積(5μl)的水載體。將Tyr-AMC、Phe-AMC和Gly-Phe-AFC在DMSO中全部再水合至100mM，然后以RPMI 1640稀釋至1mM。將1/10體積的稀釋底物加入到孔中，通過回轉(zhuǎn)振蕩簡(jiǎn)短混合，然后于37℃在5％CO2中溫育達(dá)1.5小時(shí)。在30和90分鐘于Ex.360 Em.460和Ex.405 Em.500檢測(cè)產(chǎn)生的熒光。
良好區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞(活細(xì)胞靶向和利用)的肽序列是未封閉的單肽或二肽底物，推測(cè)其可自由進(jìn)入活細(xì)胞的胞質(zhì)(圖19)。侯選底物(Gly-Phe)2-R110明顯不能有效地穿過細(xì)胞膜，或不能被侯選蛋白酶有效切割。
I.蛋白酶釋放活性半壽期將Jurkat細(xì)胞以20,000細(xì)胞/孔密度、100μl體積接種入白壁、透明底96孔板中。在8小時(shí)時(shí)程中，每小時(shí)向雙份平行孔中加入皂苷(Sigma)至0.2％終濃度(加入5μl)，并通過回轉(zhuǎn)振蕩簡(jiǎn)短混合。在此相同時(shí)限內(nèi)，向?qū)φ湛字屑尤氲润w積的RPMI 1640+10％FBS。用RPMI 1640+10％FBS將Ala-Ala-Phe-AMC稀釋至500μM，并以10μl體積加入到孔中，通過回轉(zhuǎn)振蕩簡(jiǎn)短混合，然后于37℃在5％CO2中溫育1小時(shí)。用CytoFluor II檢測(cè)產(chǎn)生的熒光。
當(dāng)外推至活性衰減(圖20)時(shí)，釋放的蛋白酶活性半壽期接近10小時(shí)。有利的是，在細(xì)胞培養(yǎng)物裂解物中這種延長(zhǎng)的活性與估計(jì)半壽期約為9小時(shí)的乳酸脫氫酶(LDH)不相上下。就此蛋白酶活性作為處理群中細(xì)胞死亡的替代而言，此觀察結(jié)果是有意義的。簡(jiǎn)單地說，信號(hào)半壽期越長(zhǎng)，檢測(cè)在以通常的體外方案報(bào)告細(xì)胞死亡(而不降低活性，低估反應(yīng))方面的應(yīng)用性就越大。
J.蛋白酶保留和釋放活性抑制/強(qiáng)化模式嘌呤霉素、E-64、苯基甲磺酰氟(PMSF)、腺苷5′-三磷酸(ATP)、N-(α-鼠李吡喃糖基氧羥基膦?；?-Leu-Trp二鈉鹽(膦酰二肽(phosphoramidon))、鹽酸N-[(2S，3R)-3-氨基-2-羥基-4-苯基丁酰基-L-亮氨酸(倍司他汀)、1，10-菲咯啉、3，4-二異香豆素、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、1，4-二硫-DL-蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸二鈉二水合物(EDTA)、異戊酰-L-纈氨酰-L-纈氨酰-[(3S，4S)-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酰基]-L-丙氨酰[93S，4S]-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸(抑胃肽酶A)、氯化鈉、抑肽酶、N-乙酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酸半硫酸鹽(亮抑酶肽)均購(gòu)自Sigma。將抑制劑懸浮在DMSO中，以將母液濃度改變?yōu)樵谟?無Mg++或Ca++的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS)中200μM或200μg/ml的高靶濃度，用于加入裂解物或活細(xì)胞群中。DTT、NaCl、EDTA和ATP也稀釋在DPBS中。全部化合物都與受損細(xì)胞或活細(xì)胞于37℃溫育至少30分鐘的一段時(shí)間(最多60分鐘)，然后評(píng)價(jià)活性。
如前所述，使用100μM終濃度的Gly-Phe-AFC對(duì)超聲、皂苷裂解或活HL-60和/或U937進(jìn)行蛋白酶保留實(shí)驗(yàn)抑制劑/添加劑檢測(cè)。使用Ala-Ala-Phe-AMC或(Ala-Ala-Phe)2-羅丹明110對(duì)超聲、皂苷裂解或活HL-60、SK-MEL-28和/或U937進(jìn)行蛋白酶釋放實(shí)驗(yàn)抑制劑/添加劑檢測(cè)。
在各種類型的抑制劑或添加劑存在下的蛋白酶保留活性模式表明，觀測(cè)到的大部分活性涉及氨肽酶(嘌呤霉素、EDTA和倍司他汀敏感性)(參見表5和6)。該活性是ATP和DTT非依賴性的(活性未恢復(fù))，對(duì)鹵化物(Cl-)不敏感。該活性確實(shí)表現(xiàn)出與半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶類酶相關(guān)。
蛋白酶釋放活性模式似乎對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制劑敏感，但對(duì)具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶樣活性選擇性的酶抑制劑不敏感。對(duì)硫醇沒有明顯要求(強(qiáng)烈表明為半胱氨酸類)，天冬氨酸和金屬蛋白酶的特異性抑制劑在控制活性方面無效。
負(fù)責(zé)蛋白酶保留活性的酶需要活細(xì)胞，不能在受損細(xì)胞外檢測(cè)。相反，加強(qiáng)蛋白酶釋放反應(yīng)不需要混合添加劑。這使得可以組合無毒、非裂解形式的檢測(cè)，以根據(jù)其不同蛋白酶活性檢測(cè)活細(xì)胞和死細(xì)胞。
表5采用Gly-Phe-AFC和HL-60和/或U937的保留檢測(cè)
表6用Ala-Ala-Phe-AMC和HL-60、SK-MEL-28、U937的釋放檢測(cè)
K.多重蛋白酶釋放和保留檢測(cè)1.Jurkat劑量反應(yīng)將活躍倍增的Jurkat細(xì)胞以20,000細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度、50μl體積接種入96孔板中。用RPMI 1640連續(xù)稀釋凋亡誘導(dǎo)配體rTRAIL，以另外的50μl體積將其以250ng-244pg/ml終濃度加入雙份平行孔中。單獨(dú)的RPMI用作未誘導(dǎo)對(duì)照。將板于37℃在5％CO2中溫育4小時(shí)。用RPMI將Gly-Phe-AFC和Ala-Ala-Phe-AMC同時(shí)稀釋至1mM，并以1/10體積加入到板中，再于37℃溫育30分鐘。用CytoFluor II于Ex 360 Em 460和Ex 405 Em 530檢測(cè)產(chǎn)生的熒光。在完成熒光檢測(cè)后，向孔中等量加入CellTiter-Glo，用BMGFLUOstar Optima檢測(cè)發(fā)光。
以微量滴定板形式多重化細(xì)胞健康的兩種獨(dú)立非破壞性替代檢測(cè)方法(蛋白酶釋放和保留)，以報(bào)告群體存活力(圖21)。獲得的數(shù)據(jù)與細(xì)胞群健康檢測(cè)相反。這種關(guān)系使得可使用對(duì)照，并提供標(biāo)準(zhǔn)化水平。而且，可以依次多重檢測(cè)形式加入第三種存活力檢測(cè)(ATP含量)，沒有干擾或猝滅，以進(jìn)一步增強(qiáng)數(shù)據(jù)解釋的置信度。
2.SK-MEL-28和ACHN細(xì)胞將SK-MEL-28或ACHN細(xì)胞以10,000細(xì)胞/孔密度、100μl體積接種入白壁、透明底96孔板中，并使其于37℃在5％CO2中附著2小時(shí)。在附著后，小心去除50μl培養(yǎng)基，并代以在MEM+10％FBS中連續(xù)稀釋的離子霉素或星形孢菌素。單獨(dú)的培養(yǎng)基用作對(duì)照。將板再溫育5小時(shí)。在MEM中制備1mM Gly-Phe-AFC溶液，并以1/10體積加入到孔中。用CytoFluor II檢測(cè)產(chǎn)生的熒光。然后加入胱天蛋白酶-GloTM3/7試劑，用BMG FLUOstar Optima檢測(cè)發(fā)光。
蛋白酶保留底物報(bào)告了孔中的一般存活力，而胱天蛋白酶特異性試劑報(bào)告了細(xì)胞毒性的特異性通路(圖22)。就此而言，胱天蛋白酶活化(以及由此而來的凋亡誘導(dǎo))是星形孢菌素作用于SK-MEL-28的證據(jù)，而離子霉素啟動(dòng)了壞死型模式。用星形孢菌素處理的ACHN也觀察到凋亡模式。
3.HeLa細(xì)胞和他莫昔芬處理將HeLa細(xì)胞以10,000細(xì)胞/孔密度、100μl體積接種入白壁、透明底96孔板中，并使其于37℃在5％CO2中附著2小時(shí)。在附著后，在24、7、5、3、1和0小時(shí)的接觸時(shí)間小心去除50μl培養(yǎng)基，并代以50μM在MEM+10％FBS中的他莫昔芬。單獨(dú)的培養(yǎng)基用作對(duì)照。通過用2ml 10mM Hepes pH7.5再水合熒光素檢測(cè)試劑塊，制備蛋白酶保留和釋放試劑。然后與Ala-Ala-Phe-氨基熒光素和Gly-Phe-AFC一起制備500μM溶液。將1/5體積的溶液加入到所有孔中，并在Me′Cour熱處理單元中于37℃溫育15分鐘。用BMG FLUOstarOptima檢測(cè)發(fā)光，用CytoFluor II檢測(cè)熒光。
該實(shí)施例表明，在設(shè)定的蛋白酶保留和釋放檢測(cè)中，混合平臺(tái)(熒光和發(fā)光)是有可能的(圖23)。要注意的是，這些試劑是非裂解性的，并明顯無毒，這提示其適合于光譜不同的其它下游應(yīng)用，例如利用Apo-ONETM實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胱天蛋白酶-3/7。
4.采用DNA染色的活/死蛋白酶檢測(cè)的應(yīng)用將HeLa或HepG2細(xì)胞以10,000細(xì)胞/孔密度、100μl體積接種入白壁、透明底96孔板中，并使其于37℃在5％CO2中附著2小時(shí)。在附著后，小心去除50μl培養(yǎng)基，并代以在MEM+10％FBS中連續(xù)稀釋的他莫昔芬或離子霉素。單獨(dú)的培養(yǎng)基用作對(duì)照。再繼續(xù)與化合物溫育5小時(shí)。通過用2ml 10mM Hepes pH7.5再水合熒光素檢測(cè)試劑塊(Promega V859A)，制備蛋白酶保留和釋放試劑。然后與Ala-Ala-Phe-氨基熒光素和Gly-Phe-AFC一起制備500μM溶液。將1/5體積的溶液加入到所有孔中，并在Me′Cour熱處理單元中于37℃溫育15分鐘。用BMG FLUOstar Optima檢測(cè)發(fā)光，用CytoFluor II檢測(cè)熒光。接著，通過加入0.4％NP-9變性劑裂解剩余的活細(xì)胞。在回轉(zhuǎn)振蕩器上簡(jiǎn)短混合后，以另外的1/10體積加入1∶20稀釋度的PicoGreen(Molecular Probes)的MEM溶液。使用CytoFluor II于Ex.485 Em.530檢測(cè)與DNA/染料結(jié)合相關(guān)的熒光。
該實(shí)施例不僅擴(kuò)展基于蛋白酶的存活力測(cè)試至另外兩種粘附細(xì)胞型篩選偏好的應(yīng)用，而且將DNA染色并入“總”檢測(cè)(圖24)。因?yàn)楣庾V差異性和混合平臺(tái)讀數(shù)，所有的檢測(cè)都是無干擾和無猝滅的。
討論藥物開發(fā)和主要的研究努力都繼續(xù)利用逐漸成熟的細(xì)胞模型系統(tǒng)。已充分認(rèn)識(shí)到在實(shí)驗(yàn)操作后必須檢測(cè)這些體外系統(tǒng)中的細(xì)胞數(shù)和存活力。這種要求必須要確認(rèn)在復(fù)雜生物系統(tǒng)背景中檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)化這些反應(yīng)的有效性。
不幸的是，當(dāng)前確定細(xì)胞存活力和細(xì)胞毒性的化學(xué)方法還沒有跟上生物學(xué)研究的新方法和技術(shù)的步伐，因此限制了實(shí)驗(yàn)選擇。例如，多重檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，即在同一孔中組合檢測(cè)，必須要求匹配且光譜不同的檢測(cè)組合，同時(shí)對(duì)檢測(cè)效力沒有顯著降低。對(duì)細(xì)胞健康的一般尋常檢測(cè)和更特異性事件(例如胱天蛋白酶活化或報(bào)告基因調(diào)節(jié))組合而言，這種要求特別重要。
細(xì)胞存活力和/或細(xì)胞毒性報(bào)告分子檢測(cè)的前述方法與許多下游檢測(cè)應(yīng)用相容。這可利用具有各種激發(fā)和發(fā)射光譜的不同熒光團(tuán)或通過整合其它報(bào)告分子平臺(tái)(例如發(fā)光)來實(shí)現(xiàn)。值得注意的是，這可在非裂解和推定無毒環(huán)境中完成，允許終點(diǎn)測(cè)定的檢測(cè)窗靈活性。而且，該技術(shù)的敏感性和成本有效性足以適應(yīng)通量、小型化和自動(dòng)化。表7列出了各種檢測(cè)所提供的優(yōu)勢(shì)的對(duì)比。
表7
總之，迄今為止，權(quán)衡在哺乳動(dòng)物蛋白酶研究中所公開的成就，主要圍繞著容易純化、分泌或這二者的蛋白酶。而這些研究所提供的信息提供了蛋白水解機(jī)制、結(jié)構(gòu)和功能的了解，幾乎沒人知曉由蛋白質(zhì)組學(xué)預(yù)測(cè)所推測(cè)的蛋白酶以外的其它蛋白酶。簡(jiǎn)單地說，需要對(duì)胞內(nèi)蛋白酶的功能、調(diào)節(jié)、亞細(xì)胞分布、豐度和重要性進(jìn)行更多的工作。
越來越多的證據(jù)提示，許多胞質(zhì)蛋白酶參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)機(jī)制。盡管蛋白酶體明顯涉及胞質(zhì)肽的釋放，但若干發(fā)現(xiàn)提示了其它保守胞質(zhì)蛋白酶的作用(Vititsky等，1997；Constam等，1995)。
本文公開的各個(gè)蛋白酶檢測(cè)和基于蛋白酶的活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)由于光譜的獨(dú)特性而對(duì)于多重檢測(cè)更靈活，使得可進(jìn)行檢測(cè)互補(bǔ)或與其它終點(diǎn)檢測(cè)組合，例如AMC、AFC、R110、甲酚紫或發(fā)光，無染料猝滅，不限制體積，不后加工檢測(cè)化學(xué)物，溫育時(shí)間短，實(shí)際敏感性(在篩選環(huán)境中細(xì)胞存活力的變化百分率)相似或更好，不干擾下游DNA結(jié)合檢測(cè)，不需要清洗或離心，例如同相檢測(cè)。而且，當(dāng)以比率(細(xì)胞毒性指數(shù))使用時(shí)，基于蛋白酶的活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)的數(shù)據(jù)可標(biāo)準(zhǔn)化，與細(xì)胞數(shù)無關(guān)，可擴(kuò)展細(xì)胞化合物接觸窗，以記錄化合物作用動(dòng)力學(xué)差異，例如在與其它檢測(cè)(例如DNA嵌入)組合時(shí)(可鑒別原發(fā)性或繼發(fā)性壞死的潛在結(jié)果)，DNA嵌入和胱天蛋白酶活性可鑒別細(xì)胞周期藥物反應(yīng)性，例如在孔中的非均一群中。此外，蛋白酶底物可相對(duì)簡(jiǎn)單，例如為二或三肽，利用眾所周知的化學(xué)方法偶聯(lián)至熒光或發(fā)光底物，無毒和/或無誘變性，穩(wěn)定，可以各種形式提供，例如在DMSO中或?yàn)楦稍镄问健?br> 參考文獻(xiàn)Balow等，J.Biol.Chem.，2612409(1986)Bond等，Ann.Rev.Biochem.56333(1987)Bronstein等(載于Bioluminescence and ChemiluminescenceMolecular Reporting with Photons，451-457頁(yè)(1996)
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Vitnitsky等，J.Immunol..159554(1997)Yamamoto等，F(xiàn)orensic Science International 113143(2000)所有的出版物、專利和專利申請(qǐng)都通過引用結(jié)合到本文中。盡管在前述說明書中已就其某些優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，為描述目的提出了很多細(xì)節(jié)，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明容許其它實(shí)施方案，本文描述的某些細(xì)節(jié)可在在相當(dāng)程度上改變而不偏離本發(fā)明的基本原則。
序 列 表<110>Promega CorporationRiss，Terry L.
Niles，AndrewMoravec，Richard A.
<120>發(fā)光和不發(fā)光多重檢測(cè)<130>341.029WO1<140>PCT/US2005/002158<141>2005-01-24<150>10/762,836<151>2004-01-22<160>34<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>1Asp Glu Val Asp1<210>2<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>2Trp Glu His Asp1
<210>3<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>3Leu Glu His Asp1<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>4Val Glu Ile Asp1<210>5<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>5Val Glu Val Asp1<210>6<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>6
Val Glu His Asp1<210>7<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>7Ile Glu Thr Asp1<210>8<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>8Ala Glu Val Asp1<210>9<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>3<223>Xaa＝任意氨基酸<400>9Leu Glu Xaa Asp1<210>10
<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>3<223>Xaa＝任意氨基酸<400>10Val Glu Xaa Asp1<210>11<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>11Ile Glu His Asp1<210>12<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>12Pro Glu His Asp1<210>13<211>4<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成底物<400>13Glx Glu Val Asp1<210>14<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>14Leu Glu Thr Asp1<210>15<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>1<223>Xaa＝Z，Y，D，L，V，I，A，W或P<220>
<221>SITE<222>2<223>Xaa＝V或E<220>
<221>SITE<222>3<223>Xaa＝任意氨基酸<400>15Xaa Xaa Xaa Asp1
<210>16<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>16Ala Ala Phe Ala Ala Phe1 5<210>17<400>17000<210>18<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>18Leu Leu Val Tyr1<210>19<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>1<223>Xaa＝W或L<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝一個(gè)或多個(gè)氨基酸<400>19Xaa Glu His Asp Xaa1 5<210>20<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>3<223>Xaa＝一個(gè)或多個(gè)氨基酸<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝一個(gè)或多個(gè)氨基酸<400>20Asp Glu Xaa Asp Xaa1 5<210>21<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>1<223>Xaa＝L或V<220>
<221>SITE
<222>3<223>Xaa＝一個(gè)或多個(gè)氨基酸<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝一個(gè)或多個(gè)氨基酸<400>21Xaa Glu Xaa Asp Xaa1 5<210>22<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝一個(gè)或多個(gè)氨基酸<400>22Ile Glu Gly Arg Xaa1 5<210>23<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>3<223>Xaa＝一個(gè)或多個(gè)氨基酸<220>
<221>SITE<222>5
<223>Xaa＝一個(gè)或多個(gè)氨基酸<220>
<221>SITE<222>7<223>Xaa＝S或G<400>23Glu Asn Xaa Tyr Xaa Gln Xaa1 5<210>24<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝一個(gè)或多個(gè)氨基酸<400>24Pro Arg Asn Lys Xaa1 5<210>25<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<220>
<221>SITE<222>6<223>Xaa＝K或N<220>
<221>SITE<222>7<223>Xaa＝M或L<400>25
Glu Ile Ser Glu Val Xaa Xaa Asp Ala Glu Phe Arg His Asp1 5 10<210>26<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>26Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg1 5 10<210>27<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>27Pro Arg Asn Lys1<210>28<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>28Gly Phe Gly Phe1<210>29<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>29Arg Leu Arg Gly Gly1 5<210>30<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>30Leu Arg Gly Gly1<210>31<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>31Arg Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1 5<210>32<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>32Glu Ala Ala Phe1<210>33<400>33
000<210>34<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成底物<400>34Ser Arg Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1 權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)方法，所述方法檢測(cè)第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的第一種分子和第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的第二種分子的存在或量，所述方法包括a)使樣品與第一種反應(yīng)和第二種反應(yīng)的反應(yīng)混合物接觸，其中第一種酶介導(dǎo)的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物，其中第二種酶介導(dǎo)的反應(yīng)產(chǎn)生產(chǎn)生不發(fā)光產(chǎn)物；和b)檢測(cè)樣品中第一種和第二種分子的存在或量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中第一種分子是第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的底物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中第二種分子是第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的底物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中第一種分子是第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中第二種分子是第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的酶。
6.權(quán)利要求1的方法，其中第一種分子是第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子。
7.權(quán)利要求1的方法，其中第二種分子是第二種酶介導(dǎo)反應(yīng)的輔因子。
8.權(quán)利要求1的方法，其中發(fā)光用于檢測(cè)第一種分子。
9.權(quán)利要求1的方法，其中熒光用于檢測(cè)第二種分子。
10.權(quán)利要求1的方法，其中依次檢測(cè)第一種和第二種分子的存在或量。
11.權(quán)利要求1的方法，其中樣品為細(xì)胞裂解物。
12.權(quán)利要求1的方法，其中樣品在接觸第二種反應(yīng)的反應(yīng)混合物之前接觸第一種反應(yīng)的反應(yīng)混合物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中樣品在接觸第一種反應(yīng)的反應(yīng)混合物之前接觸第二種反應(yīng)的反應(yīng)混合物。
14.權(quán)利要求1的方法，其中樣品同時(shí)接觸第一種反應(yīng)和第二種反應(yīng)的反應(yīng)混合物。
15.一種檢測(cè)方法，所述方法檢測(cè)第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的第一種酶或輔因子的存在或量，其包括a)使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，其中第一種底物和第一種酶之間的反應(yīng)或第一種酶和第一種底物之間的反應(yīng)產(chǎn)物與第三種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物，其中第二種底物和/或第二種底物和第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物不發(fā)光；和b)檢測(cè)第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的第一種酶或輔因子的存在或量。
16.一種檢測(cè)方法，所述方法檢測(cè)酶介導(dǎo)的發(fā)光反應(yīng)，以檢測(cè)第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的酶或輔因子的存在或量，其包括a)使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，其中第一種底物和第一種酶之間的反應(yīng)或第一種酶和第一種底物之間的反應(yīng)產(chǎn)物與第三種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物，其中第二種底物和/或第二種底物和第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物不發(fā)光；和b)檢測(cè)發(fā)光。
17.權(quán)利要求15的方法，其中檢測(cè)發(fā)光。
18.權(quán)利要求15或16的方法，其中在第一種酶或輔因子存在下發(fā)光增加。
19.權(quán)利要求15或16的方法，其中在第一種酶或輔因子存在下發(fā)光降低。
20.權(quán)利要求15或16的方法，所述方法進(jìn)一步包含檢測(cè)第二種酶的存在或量。
21.權(quán)利要求20的方法，其中熒光用于檢測(cè)第二種酶的存在或量。
22.權(quán)利要求20的方法，其中依次檢測(cè)第一種酶或輔因子的存在或量和第二種酶的存在或量。
23.權(quán)利要求20的方法，其中同時(shí)檢測(cè)第一種酶或輔因子的存在或量和第二種酶的存在或量。
24.權(quán)利要求20的方法，其中以比色法檢測(cè)第二種酶的存在或量。
25.權(quán)利要求20的方法，其中通過使樣品與第四種酶和第三種底物接觸，檢測(cè)第二種酶的存在或量，第四種酶和第三種底物與第二種底物和第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。
26.權(quán)利要求15或16的方法，所述方法進(jìn)一步包括檢測(cè)不發(fā)光的第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的不發(fā)光產(chǎn)物的存在或量。
27.權(quán)利要求15或16的方法，其中第二種酶基本上不與第一種底物反應(yīng)。
28.權(quán)利要求15或16的方法，其中第一種酶基本上不與第二種底物反應(yīng)。
29.權(quán)利要求15或16的方法，其中第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)熒光。
30.權(quán)利要求29的方法，其中第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物包括溴化乙錠、熒光素、Cy3、BODIPY、對(duì)甲氨基酚、Rox、5-羧基熒光素、6-羧基熒光素、蒽、2-氨基-4-甲氧基萘、phenalenone、吖啶酮、氟化呫噸衍生物、α-萘酚、β-萘酚、1-羥基芘、香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)、Texas Red、四甲基羅丹明、羧基羅丹明或羅丹明、羥甲苯基、羅丹明-110或試鹵靈。
31.權(quán)利要求15或16的方法，其中一種酶是糖苷酶、磷酸酶、激酶、脫氫酶、過氧化物酶、硫酸酯酶、肽酶或水解酶。
32.權(quán)利要求15或16的方法，其中一種酶是蛋白酶。
33.權(quán)利要求32的方法，其中一種酶是胱天蛋白酶。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述胱天蛋白酶包括胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-7或胱天蛋白酶-8。
35.權(quán)利要求15或16的方法，其中一種底物包含DEVD、WEHD、LEHD、VEID、VEVD、VEHD、IETD、AEVD、LEXD、VEXD、IEHD、PEHD、ZEVD或LETD。
36.權(quán)利要求15或16的方法，其中一種底物包含X1-X2-X3-D，其中X1是Z、Y、D、L、V、I、A、W或P，X2是V或E，X3是任意氨基酸。
37.權(quán)利要求15或16的方法，其中一種底物是胰蛋白酶或類胰蛋白酶底物。
38.權(quán)利要求15或16的方法，其中一種酶切割含精氨酸或賴氨酸的底物。
39.權(quán)利要求15或16的方法，其中樣品是細(xì)胞裂解物。
40.權(quán)利要求39的方法，其中樣品是在裂解前用細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑處理的細(xì)胞樣品。
41.權(quán)利要求15或16的方法，其中樣品包含完整細(xì)胞。
42.權(quán)利要求15或16的方法，其中第三種酶是熒光素酶。
43.權(quán)利要求42的方法，其中熒光素酶是甲蟲熒光素酶。
44.權(quán)利要求15或16的方法，其中第二種底物是乳酸脫氫酶底物。
45.權(quán)利要求15或16的方法，其中樣品在接觸第二種底物前接觸第一種底物。
46.權(quán)利要求15或16的方法，其中樣品同時(shí)接觸第一種和第二種底物。
47.權(quán)利要求15或16的方法，其中樣品在接觸第一種底物前接觸第二種底物。
48.權(quán)利要求15或16的方法，其中通過使樣品與第一種酶接觸檢測(cè)輔因子的存在或量。
49.一種檢測(cè)樣品中至少兩種分子的存在或量的方法，所述方法包括a)使樣品與第一種酶的第一種底物、第二種酶的第二種底物以及任選的第三種酶接觸，其中第一種底物和第一種酶之間的反應(yīng)或第一種酶和第一種底物之間的反應(yīng)產(chǎn)物與第三種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物，其中第二種底物和/或第二種底物和第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物不發(fā)光，其中第一種酶和第二種酶不相同；和b)檢測(cè)由第一種或第二種酶介導(dǎo)的反應(yīng)的第一種和第二種酶或輔因子的存在或量。
50.權(quán)利要求49的方法，其中檢測(cè)發(fā)光。
51.權(quán)利要求49的方法，其中至少一種酶是蛋白酶。
52.權(quán)利要求49的方法，其中第二種酶與第一種底物基本不反應(yīng)。
53.權(quán)利要求49的方法，其中第一種酶與第二種底物基本不反應(yīng)。
54.權(quán)利要求49的方法，其中第二種底物或第二種底物與第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)熒光。
55.權(quán)利要求49的方法，其中熒光用于檢測(cè)第二種酶或輔因子的存在或量。
56.權(quán)利要求49的方法，其中至少一種酶是胱天蛋白酶。
57.權(quán)利要求49的方法，其中一種底物是胰蛋白酶或類胰蛋白酶底物。
58.權(quán)利要求49的方法，其中樣品為細(xì)胞裂解物。
59.權(quán)利要求58的方法，其中樣品為在裂解前用細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑處理的細(xì)胞樣品。
60.權(quán)利要求49的方法，其中樣品包含完整細(xì)胞。
61.權(quán)利要求49的方法，其中第三種酶是熒光素酶。
62.權(quán)利要求61的方法，其中熒光素酶是甲蟲熒光素酶。
63.權(quán)利要求62的方法，其中第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)熒光。
64.權(quán)利要求49的方法，其中樣品在接觸第二種底物前接觸第一種底物。
65.權(quán)利要求49的方法，其中樣品在接觸第一種底物前接觸第二種底物。
66.權(quán)利要求49的方法，其中樣品同時(shí)接觸第一種和第二種底物。
67.權(quán)利要求49的方法，其中在檢測(cè)第二種酶或第二種輔因子的存在或量之前檢測(cè)第一種酶或第一種輔因子的存在或量。
68.權(quán)利要求49的方法，其中在檢測(cè)第一種酶或第一種輔因子的存在或量之前檢測(cè)第二種酶或第二種輔因子的存在或量。
69.權(quán)利要求68的方法，其中第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)熒光。
70.權(quán)利要求69的方法，其中第二種底物或第二種底物和第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物包括溴化乙錠、熒光素、Cy3、BODIPY、對(duì)甲氨基酚、Rox、5-羧基熒光素、6-羧基熒光素、蒽、2-氨基-4-甲氧基萘、phenalenone、吖啶酮、氟化呫噸衍生物、α-萘酚、β-萘酚、1-羥基芘、香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)、Texas Red、四甲基羅丹明、羧基羅丹明或羅丹明、羥甲苯基、羅丹明-110或試鹵靈。
71.權(quán)利要求15、16或49的方法，其中所述輔因子是ATP。
72.權(quán)利要求49的方法，其中通過使樣品與第四種酶和第三種底物接觸，檢測(cè)第二種酶的存在或量，第四種酶和第三種底物與第二種底物和第二種酶之間的反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。
73.一種檢測(cè)第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的分子的存在或量的方法，所述方法包括A)使含熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞的樣品與第一種酶介導(dǎo)反應(yīng)的反應(yīng)混合物接觸，其中第一種酶介導(dǎo)的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物；和b)檢測(cè)樣品中分子的存在或量和熒光蛋白的存在或量。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述分子是底物。
75.權(quán)利要求73的方法，其中所述分子是輔因子。
76.權(quán)利要求73的方法，其中所述分子是酶。
77.一種試劑盒，所述試劑盒包含不發(fā)光底物；和發(fā)光底物。
78.權(quán)利要求77的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含能夠介導(dǎo)與發(fā)光底物的發(fā)光反應(yīng)的酶。
79.權(quán)利要求77的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含在單個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)和不發(fā)光反應(yīng)的說明書，所述容器包含不發(fā)光底物和發(fā)光底物。
80.一種試劑盒，所述試劑盒包含不發(fā)光底物；和能夠介導(dǎo)發(fā)光反應(yīng)的酶。
81.權(quán)利要求80的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含酶的發(fā)光底物。
82.權(quán)利要求77或80的試劑盒，其中不發(fā)光底物是熒光底物。
83.權(quán)利要求78或80的試劑盒，其中所述酶是熒光素酶。
84.權(quán)利要求80的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含在單個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)和不發(fā)光反應(yīng)的說明書，所述容器包含不發(fā)光底物和酶。
85.一種檢測(cè)樣品中活細(xì)胞和/或死細(xì)胞的方法，所述方法包括a)使樣品與第一種蛋白酶的底物和第二種蛋白酶的底物接觸，其中一種蛋白酶介導(dǎo)的與一種底物的反應(yīng)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，由另一種蛋白酶介導(dǎo)的與另一種底物的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光或熒光產(chǎn)物，其中一種底物基本上可滲入細(xì)胞，另一種底物基本上不可滲入細(xì)胞，其中如果兩個(gè)反應(yīng)都產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，則兩種底物上的熒光團(tuán)光譜不同；和b)檢測(cè)或測(cè)定樣品中的熒光和/或發(fā)光，由此檢測(cè)或測(cè)定樣品中活細(xì)胞和/或死細(xì)胞的數(shù)目或存在。
86.權(quán)利要求85的方法，其中每種蛋白酶介導(dǎo)的反應(yīng)都產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。
87.權(quán)利要求85的方法，其中一種蛋白酶介導(dǎo)的反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物，另一種蛋白酶介導(dǎo)的反應(yīng)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。
88.權(quán)利要求85的方法，其中基本上可滲入細(xì)胞的底物是與蛋白酶體結(jié)合的蛋白酶、氨肽酶或組織蛋白酶的底物。
89.權(quán)利要求85的方法，其中基本上不可滲入細(xì)胞的底物是三肽基肽酶、鈣蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的底物。
90.權(quán)利要求85的方法，其中所述樣品包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
91.權(quán)利要求85的方法，其中兩種底物在與樣品接觸前混合。
92.權(quán)利要求87的方法，其中依次檢測(cè)或測(cè)定熒光和發(fā)光。
93.權(quán)利要求86的方法，其中同時(shí)檢測(cè)或測(cè)定每種熒光產(chǎn)物的熒光。
94.權(quán)利要求85的方法，所述方法進(jìn)一步包括檢測(cè)或測(cè)定分子的存在或量。
95.權(quán)利要求94的方法，其中所述分子是DNA。
96.權(quán)利要求94的方法，其中所述分子是酶。
97.權(quán)利要求94的方法，其中所述分子是ATP。
98.權(quán)利要求85的方法，所述方法進(jìn)一步包括使樣品經(jīng)受裂解細(xì)胞的條件。
99.權(quán)利要求85的方法，所述方法進(jìn)一步包括使樣品在接觸底物前接觸一種或多種物質(zhì)。
100.一種檢測(cè)樣品中活細(xì)胞的方法，所述方法包括a)使樣品與基本上可滲入細(xì)胞的熒光底物接觸，所述熒光底物是和蛋白酶體結(jié)合的蛋白酶、氨肽酶或組織蛋白酶的熒光底物；和b)檢測(cè)或測(cè)定樣品中的熒光，由此檢測(cè)或測(cè)定樣品中活細(xì)胞的數(shù)目或存在。
101.權(quán)利要求100的方法，其中所述底物是Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC、Z-Gly-Gly-Leu-AMC、Phe-AMC或Tyr-AMC。
102.一種檢測(cè)樣品中死細(xì)胞的方法，所述方法包括a)使樣品與基本上不可滲入細(xì)胞的熒光或發(fā)光底物接觸，所述熒光或發(fā)光底物是三肽基肽酶、鈣蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的底物；和b)檢測(cè)或測(cè)定樣品中的熒光或發(fā)光，由此檢測(cè)或測(cè)定樣品中死細(xì)胞的數(shù)目或存在。
103.權(quán)利要求102的方法，其中所述底物是Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC或Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基熒光素。
104.一種試劑盒，所述試劑盒包含一種組合物，其含有第一種蛋白酶的第一種基本不可滲入細(xì)胞的熒光或發(fā)光底物，和第二種蛋白酶的第二種基本可滲入細(xì)胞的熒光底物；以及用于指導(dǎo)用戶使用組合物檢測(cè)樣品中活細(xì)胞和/或死細(xì)胞的說明書。
105.權(quán)利要求104的試劑盒，其中第一種底物是Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC或Z-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基熒光素。
106.權(quán)利要求104的試劑盒，其中第二種底物是Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC、Z-Gly-Gly-Leu-AMC、Phe-AMC或Tyr-AMC。
107.權(quán)利要求104的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步含有一種或多種用于發(fā)光反應(yīng)的試劑。
108.權(quán)利要求107的試劑盒，其中至少一種試劑被凍干。
109.權(quán)利要求104的試劑盒，其中所述組合物為其中所述底物在有機(jī)溶劑中的溶液。
110.權(quán)利要求109的試劑盒，其中所述組合物被凍干。
111.權(quán)利要求104的試劑盒，其中所述組合物為其中底物濃度為約0.005-1M的溶液。
112.一種含組合物的試劑盒，所述組合物包含Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC、Gly-Gly-Leu-AMC或其任意組合。
113.權(quán)利要求112的試劑盒，其中所述組合物包含溶劑。
114.權(quán)利要求113的試劑盒，其中Ala-Ala-Phe-AMC、(Ala-Ala-Phe)2-R110、Ala-Ala-Phe-氨基熒光素、Gly-Phe-AFC、Gly-Phe-AMC或Gly-Gly-Leu-AMC的濃度為約0.005-1M。
全文摘要
提供一種在多重發(fā)光/不發(fā)光實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)酶介導(dǎo)反應(yīng)中的至少一種分子的存在或量的方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101084437SQ200580008682
公開日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2005年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月22日
發(fā)明者T·L·里斯, A·尼爾斯, R·A·莫拉維克 申請(qǐng)人:普羅美加公司