專利名稱：熒光偏振分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用熒光偏振的方法和系統(tǒng)來鑒定具有調(diào)節(jié)高級糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)能力的化合物。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)或脂質(zhì)與醛糖的溫育導(dǎo)致了非酶促的蛋白質(zhì)上氨基基團的糖化和氧化從而形成了阿馬杜里加合物(Amadori adducts)。隨著時間的流逝，該加合物歷經(jīng)了額外的重排，脫水，以及與其它蛋白質(zhì)的交聯(lián)從而形成了稱為高級糖化終產(chǎn)物(AGEs)的復(fù)合物。那些促進AGEs形成的因素包括延遲的蛋白轉(zhuǎn)換(例如，在淀粉樣變(amyloidoses)中的情況)，具有較高賴氨酸含量的大分子的積累，以及較高的血糖水平(例如，在糖尿病中的情況)(Hori et al，J.Biol.Chem.27025752-761，(1995))。AGEs與多種失調(diào)相關(guān)，包括與糖尿病和自然老化相關(guān)的并發(fā)癥。
AGEs表現(xiàn)出與單核細胞，巨噬細胞，微脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞，mesengial細胞，和神經(jīng)元的細胞表面受體具有特異性和飽和性結(jié)合。高級糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)是細胞表面分子的一個免疫球蛋白超家族的成員。RAGE的細胞外結(jié)構(gòu)域(N-末端)包括三個免疫球蛋白類型的區(qū)域一個V(可變)型結(jié)構(gòu)域緊接兩個C-型(恒定)結(jié)構(gòu)域(Neeper et al，J.Biol.Chem.，26714998-15004(1992)；Schmidt et al，Circ.(Suppl.)96#194(1997))。單個跨膜結(jié)構(gòu)域和較短的，高度荷電的細胞質(zhì)溶質(zhì)尾部緊隨細胞外結(jié)構(gòu)域?？赏ㄟ^RAGE的蛋白質(zhì)水解或分子生物學(xué)方法分離N-末端的細胞外結(jié)構(gòu)域，從而生成包括V結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域的可溶性RAGE(sRAGE)。
RAGE在大多數(shù)組織中都有表達，尤其是在胚胎形成過程中的皮質(zhì)神經(jīng)元中有發(fā)現(xiàn)(Hori et al.，J.Biol.Chem.，27025752-761(1995))。在衰老的組織(Schleicher et al，J.Clin.Invest，99(3)457-468(1997))，糖尿病患者的視網(wǎng)膜，脈管系統(tǒng)和腎臟中也發(fā)現(xiàn)有RAGE的水平有所升高(Schmidt et al，Nature Med.，11002-1004(1995))。在不同組織和器官中RAGE的活化產(chǎn)生了眾多的病理生理性后果。RAGE與眾多疾病有關(guān)，包括急性和慢性炎癥(Hofmann et al.，Cell(Hofmann etal，Cell 97889-901(1999))，諸如血管通透性升高的糖尿病患者晚期并發(fā)癥的發(fā)展(Wautier et al，J.Clin.Invest，97238-243(1995))，(Wautieret al，J.Clin.Invest，97238-243(1995)，腎病(Teillet et al，J.Am.Soc.Nephrol，111488-1497(2000))，動脈粥樣硬化(Vlassara et al，TheFinnish Medical Society DUODECIM，Ann.Med.，28419-426(1996))，和視網(wǎng)膜病(Hammes et al，Diabetologia，42603-607(1999))。RAGE還與阿爾茨海默病(Yan et al，Nature，382685-691(1996))，Yan et al，Nature，382685-691(1996)，勃起功能障礙和腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移(Taguchi etal，Nature，405354-357(2000))相關(guān)。
除了AGEs之外，還有其它的化合物可以結(jié)合于RAGE并對其進行調(diào)節(jié)。在正常發(fā)育過程中，RAGE與amphoterin相互作用，其是在培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)元中介導(dǎo)軸突生長出來的多肽(Hori et al，1995)。RAGE還表現(xiàn)出與羧甲基賴氨酸(CML)，類鈣粒蛋白配體和β-淀粉樣蛋白相互作用(Yan et al，Nature，389589-595，(1997)；Yan et al，Nature，382685-691(1996)；Yan et al，Proc.Natl.Acad.ScL，945296-5301(1997。
已經(jīng)顯示，對于RAGE的結(jié)合配體，例如AGEs，s100b/鈣粒蛋白，β-淀粉樣蛋白，CML(Nε-羧甲基賴氨酸)，和amphoterin都可以對多種基因的表達進行修飾。例如，在許多細胞類型中，RAGE和其配體之間的相互作用產(chǎn)生了氧化脅迫，從而導(dǎo)致自由基敏感的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化，以及諸如細胞因子IL-1β，TNF-α等NF-κB調(diào)節(jié)基因的活化。此外，還發(fā)現(xiàn)那些包括p21ras，MAP激酶，ERK1和ERK2的若干其它調(diào)節(jié)途徑可由AGEs和其他配體與RAGE的結(jié)合得到活化。實際上，RAGE本身的轉(zhuǎn)錄也至少由NF-κBκB部分調(diào)節(jié)的。因此，由配體結(jié)合啟動的陽性反饋循環(huán)刺激了逐漸增加并且通常是有害的螺旋上升(spiral)。
生理性配體與RAGE結(jié)合的拮抗可以是由過量濃度的AGEs和其他RAGE配體所引起的病理生理性變化下調(diào)的邏輯目的。通過降低內(nèi)源配體對RAGE的結(jié)合，可以減輕與RAGE介導(dǎo)的疾病相關(guān)的癥狀。因此，亟需發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)生理性配體與RAGE受體結(jié)合的化合物的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的實施方案提供了使用了熒光偏振的方法和系統(tǒng)來鑒定具有調(diào)節(jié)高級糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)能力的化合物。本發(fā)明可以包括發(fā)現(xiàn)能調(diào)節(jié)生理性配體與RAGE結(jié)合的化合物的分析方法與和/或系統(tǒng)。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括檢測RAGE調(diào)節(jié)物的方法，包括提供(i)含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽，(ii)熒光RAGE配體，和(iii)目的化合物。所述方法可以還包括向所述RAGE多肽中加入所述目的化合物和熒光RAGE配體，并測定所述熒光RAGE配體的偏振。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括檢測RAGE調(diào)節(jié)物的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可以包括如下成分的單獨包裝的容器(a)熒光RAGE配體；(b)包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽；和(c)在目的化合物存在條件下用于稀釋(a)和(b)的至少一種分析試劑，因此可以對所述熒光RAGE配體與含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合進行定量。在一個實施方案中，所述系統(tǒng)可以還包括作為陽性對照的對RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有充分結(jié)合親和性的未標記的RAGE配體。
有眾多的優(yōu)點與本發(fā)明的特殊實施方案有關(guān)。例如，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以測定生理性配體與RAGE的結(jié)合以及對這種結(jié)合的修飾。同樣，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以允許對所述目的化合物與RAGE的結(jié)合能力，或所述目的化合物對生理性配體與RAGE結(jié)合的調(diào)節(jié)能力進行定量。
通過去除眾多與傳統(tǒng)結(jié)合分析相關(guān)的洗滌步驟，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可提供適于多種化合物的高通量，自動化篩選。因此，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可提供適于潛在RAGE調(diào)節(jié)物的快速分析。
同樣，因為所述方法和系統(tǒng)包括表現(xiàn)出高親合性，可定量結(jié)合于RAGE的分析試劑，所以該分析可提供敏感和高度特異性的分析系統(tǒng)來檢測具有結(jié)合于RAGE，和/或?qū)ζ溥M行調(diào)節(jié)的潛在的化合物。
同樣，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以提供一種安全和可靠的分析系統(tǒng)，其不會受到許多通常使用放射性標記試劑的系統(tǒng)安全和處置方面考慮的限制。所述分析使用的是對實驗室人員或環(huán)境沒有威脅的非放射性標記試劑。
所述方法可以利用全長RAGE蛋白，或含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽，作為敏感的體外試劑來對大量的潛在RAGE調(diào)節(jié)物進行篩選，從而鑒定出那些可以在體內(nèi)調(diào)節(jié)由RAGE介導(dǎo)的生物活性的分子。通過改變所用熒光配體的性質(zhì)，有可能鑒定出在結(jié)構(gòu)和生理效果上有別的調(diào)節(jié)物。
當(dāng)然，在下文中會對本發(fā)明的其他特征進行描述。應(yīng)該理解本發(fā)明的應(yīng)用并不局限于下述權(quán)利要求，說明內(nèi)容和附圖所示的細節(jié)。本發(fā)明還能夠具有其它的實施方案并且可以多種方式實現(xiàn)或?qū)嵤?br>

參考以下附圖，本發(fā)明的許多特征，方面和優(yōu)點會變得更加顯而易見。
圖1所示為使用熒光偏振測定RAGE-配體相互作用的示意圖，其中圖(A)所示為熒光配體(三角形)與RAGE的結(jié)合導(dǎo)致了所述熒光配體的較高的微偏振(mP)值，而圖(B)所示為根據(jù)本發(fā)明其他實施方案，由未標記RAGE配體(矩形)伴隨的微偏振(mP)值的降低所引起的熒光配體(三角形)與sRAGE結(jié)合的降低。
圖2所示(A)SEQ ID NO1，GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫中報道的，登錄號為XM004205的人類RAGE的氨基酸序列；(B)SEQ ID NO2，人類sRAGE的氨基酸序列；(C)SEQ ID NO3，人類RAGE的V-結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(D)SEQ ID NO4，人類RAGE的V-結(jié)構(gòu)域的N-末端片段；和(E)SEQ ID NO7，根據(jù)本發(fā)明的其他實施方案，人類sRAGE的其他的氨基酸序列。
圖3所示為SEQ ID NO5，人淀粉樣蛋白-β(1-40)的氨基酸序列；和SEQ ID NO6，人淀粉樣蛋白β(1-42)的氨基酸序列。
圖4所示為根據(jù)本發(fā)明的其他實施方案，可與熒光淀粉樣蛋白β(F1-淀粉樣蛋白β)競爭結(jié)合sRAGE的多種RAGE配體。
圖5所示為根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，DMSO對熒光淀粉樣蛋白β與sRAGE結(jié)合的影響。
圖6所示為含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽(例如，sRAGE)和抗-RAGE抗體(例如，Ab)復(fù)合作為使游離熒光配體(三角形)的微偏振變化大于受體結(jié)合熒光配體的一種手段的示意圖。
圖7所示為根據(jù)本發(fā)明的其他實施方案，對RAGE和熒光淀粉樣蛋白β(1-40)之間的相互作用進行抑制有機小分子拮抗劑的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及使用高通量分析來發(fā)現(xiàn)可調(diào)節(jié)RAGE活性的化合物。在大體上保持RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的生理和結(jié)構(gòu)完整性的條件下，所述方法的實施方式測定了目的化合物調(diào)節(jié)熒光RAGE配體與RAGE蛋白的結(jié)合能力，或與包括配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE片段的結(jié)合能力。隨后可以對這些能夠調(diào)節(jié)配體與RAGE結(jié)合的化合物的生理活性進行分析。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括測定能夠調(diào)節(jié)RAGE配體與RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的化合物的方法。所述方法包括如下步驟(a)提供(i)含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽，(ii)熒光RAGE配體，和(iii)目的化合物；(b)向所述RAGE多肽中加入目的化合物和熒光RAGE配體；和(c)測定所述熒光RAGE配體的偏振。
所述方法還包括將所述熒光RAGE配體的偏振水平與結(jié)合于所述RAGE多肽的熒光RAGE配體的量進行相關(guān)分析。在一個實施方案中，當(dāng)所述熒光RAGE配體結(jié)合于所述含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽時，所述熒光RAGE配體的偏振會增強。因此，溶液中游離熒光配體的微偏振值可以低于結(jié)合于第二分子(例如，RAGE多肽)的相同熒光配體的微偏振值。如果未標記的目的化合物能夠有效地競爭與RAGE多肽的結(jié)合，那么就可以將所述熒光RAGE配體從RAGE多肽中置換出來，由此降低偏振的測定水平。在目的化合物完全置換了熒光RAGE配體的情況下，偏振可降低到游離(即，未結(jié)合)熒光RAGE配體的可見水平。
所述分析可提供結(jié)合親合性的定量測定。例如，所述分析可以在存在變量目的化合物的前提下，測定結(jié)合于RAGE多肽的熒光RAGE配體的量。在一個實施方案中，可在將熒光RAGE配體與RAGE多肽的結(jié)合降低到預(yù)定量所需要的目的化合物的量的基礎(chǔ)上，測定所述目的化合物對于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和性的值。因此，所述系統(tǒng)可包括在不同量目的化合物存在的前提下，對結(jié)合于RAGE多肽的熒光RAGE配體量進行比較的步驟。如果目的化合物競爭性地從RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域替換了熒光RAGE配體，那么偏振水平就會隨著未標記的目的化合物的增加而降低。
可以將所述目的化合物與對RAGE或含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽具有不同親和性的其他化合物進行比較。因此，在一個實施方案中，可以將所述目的化合物降低熒光RAGE配體與RAGE多肽結(jié)合的能力與第二化合物降低熒光RAGE配體與RAGE多肽結(jié)合的能力進行比較。在一個實施方案中，第二化合物并未充分結(jié)合于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此第二化合物可用作測定與RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的陰性對照。
例如，本發(fā)明的方法可包括將目的化合物與熒光RAGE配體競爭結(jié)合于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的能力與不結(jié)合于具有生理特異性的RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二化合物的競爭能力進行比較。以這樣的方式，可以對所述目的化合物的效果進行解釋。因此，當(dāng)所述目的化合物從RAGE多肽中置換出熒光配體時，卻需要類似于陰性對照化合物的置換的濃度，這有可能是所述目的化合物并未以較高親和性與RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。在其他實施方案中，陰性對照可以是與RAGE結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)大于1mM，或者大于100μm，或者大于50μM，或者大于20μM，或者大于10μM，或者大于5μM的分子。
或者，第二化合物可具有對RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的充分結(jié)合親和性，因此第二化合物可作為測定與RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的陽性對照。以這種形式，可以分析與陽性對照相比所述目的化合物對RAGE結(jié)合的相對親和性。因此，在類似于陽性對照化合物的替換濃度的條件下，當(dāng)所述目的化合物從RAGE多肽中替換出了熒光配體時，目的化合物可以較高親和性結(jié)合于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述陽性對照可以包括以充分結(jié)合親和性結(jié)合于RAGE的小分子RAGE拮抗劑。在其他實施方案，陽性對照可以是與RAGE結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)小于1μM，或小于200nM，或小于50nM，或小于10nM的分子。
在一個實施方案中，第二化合物可以包括所述目的化合物的化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)變體的實驗分子。通過比較目的化合物與該目的化合物化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)變體的第二化合物的相對親和性，可以確定特定的化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)變體對與RAGE多肽的結(jié)合親和性的影響。以這種方式，所述分析可用來定義RAGE配體的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)。
本發(fā)明還可包括對具有調(diào)節(jié)配體與RAGE結(jié)合和/或RAGE活性能力的化合物進行檢測的系統(tǒng)。在一個實施方案中，本發(fā)明包括對調(diào)節(jié)配體與RAGE的結(jié)合的化合物進行檢測的系統(tǒng)，其包括如下成分的單獨包裝的容器(a)熒光RAGE配體；(b)包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽；和(c)在目的化合物存在條件下用于稀釋(a)和(b)的至少一種分析試劑，因此可以對所述熒光RAGE配體與含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合進行定量。
所述系統(tǒng)允許對配體與RAGE的結(jié)合進行定量分析。因此，在一個實施方案中，所述系統(tǒng)包括測定所述熒光配體偏振的裝置。
使用本發(fā)明的系統(tǒng)，可以對目的化合物與對RAGE或含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽具有不同親和性的化合物進行比較。因此，在一個實施方案中，可以將所述目的化合物降低熒光配體與RAGE多肽結(jié)合的能力與對RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有預(yù)定結(jié)合親和力的化合物降低所述熒光配體與RAGE多肽結(jié)合的能力進行比較。在一個實施方案中，具有對RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域預(yù)定結(jié)合親和性的化合物并未成分結(jié)合于RAGE結(jié)合結(jié)域，因此第二化合物可作為陰性對照來對RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合進行測定。或者，第二化合物可以具有對RAGE結(jié)合結(jié)構(gòu)域的預(yù)定結(jié)合親和性，因此第二化合物可作為陽性對照來測定對RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。在一個實施方案中，所述陽性對照可以包括具有充分結(jié)合親和性的結(jié)合于RAGE的小分子RAGE拮抗劑。
第二化合物可包括所述目的化合物的化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)變體的實驗分子。通過比較目的化合物與該目的化合物化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)變體的第二化合物的相對親和性，可以確定特定的化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)變體對于RAGE多肽的結(jié)合親和性的作用。以這種方式，所述分析可用來定義RAGE配體的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)。在一個實施方案中，所述系統(tǒng)可以包括計算機系統(tǒng)和/或軟件來分析多種目的化合物的SAR結(jié)果。
在一個實施方案中，含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO1的多肽，或與SEQ ID NO1具有90％同一性的序列，或SEQ ID NO1的片段。在一個實施方案中，與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的序列可包括第一個氨基酸是甲硫氨酸(M)而不是甘氨酸(G)。
RAGE的片段可包括公知的以較高親和性結(jié)合于RAGE配體的多肽。SEQ ID NO1的片段可包括如氨基酸序列SEQ ID NO2定義的人類sRAGE，或與SEQ ID NO2具有90％同一性的序列，或SEQ IDNO2的片段。在一個實施方案中，與SEQ ID NO2具有至少90％同一性的序列可以包括以甲硫氨酸(M)而不是甘氨酸(G)作為第一個氨基酸的重組sRAGE(例如，SEQ ID NO7)。
或者，SEQ ID NO1的片段可包括如氨基酸序列SEQ ID NO3，或與SEQ ID NO3具有90％同一性的序列，或SEQ ID NO3的片段序列定義的人類RAGE的V結(jié)構(gòu)域。所述V結(jié)構(gòu)域被鑒定為sRAGE和RAGE的配體結(jié)合區(qū)域(參見，例如WO99/18987)。
或者，可以使用V-結(jié)構(gòu)域的片段。在一個示例實施方案中，SEQ IDNO1的片段可以包括如氨基酸序列SEQ ID NO4，或與SEQ ID NO4具有90％同一性的序列所定義的人類RAGE的V結(jié)構(gòu)域?；蛘?，SEQID NO4的片段可用作RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的方法和系統(tǒng)都可以包括多種熒光配體。在一個實施方案中，所述熒光RAGE配體可以包括淀粉樣β多肽。例如，在其他實施方案中，所述熒光RAGE配體可以包括具有氨基酸序列SEQ ID NO5的人淀粉樣蛋白β(1-40)，或包括具有氨基酸序列SEQ ID NO6的人淀粉樣蛋白β(1-42)。在一個實施方案中，所述熒光團可附著于所述淀粉樣β多肽的氨基末端從而產(chǎn)生熒光配體。或者，所述熒光團可附著于所述淀粉樣β多肽的羧基末端從而產(chǎn)生熒光配體。在其他實施方案中，所述熒光團可附著于沿著所述多肽鏈長度的其它殘基上。
在另一個實施方案中，所述熒光RAGE配體可以包括高級糖化終產(chǎn)物。例如，所述熒光RAGE配體可以包括熒光羧甲基賴氨酸或者熒光羧甲基賴氨酸修飾的AGE?；蛘?，所述熒光RAGE配體可包括熒光基團或熒光S-100b標記的鈣粒蛋白?；蛘?，所述熒光RAGE配體可以包括amphoterin或者含有分子量低于1000道爾頓的有機小分子。
只要所述熒光團不能顯著干擾配體與RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，就可使用多種熒光團來標記目的RAGE配體。在一個實施方案中，可使用熒光素標記RAGE配體。或者，還可以使用其他的熒光團，例如，但不限于，熒光黃，曙紅，碘化丙啶(propidium iodide)，若丹明(即，四甲基若丹明或者麗絲胺若丹明B)，花青苷3(Cy3)，花青苷5(Cy5)，德克薩斯紅(Texas Red)，或者別藻藍素(allophycocyanin)。所述熒光團的優(yōu)選激發(fā)/發(fā)射最大值依賴于個體熒光團和所述熒光團與RAGE配體偶聯(lián)的性質(zhì)。
可使用本領(lǐng)域公知的方法使用熒光團來標記RAGE配體。例如，標記核酸和肽的試劑盒都是商業(yè)可獲得的(例如，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR；EMP Biotech，GmbH)?？赏ㄟ^將熒光團和RAGE配體的化學(xué)偶聯(lián)將所述熒光團整合在內(nèi)。例如，在一個實施方案中，為了制備淀粉樣蛋白β，使用5-羧基-熒光素在其N末端對所述多肽進行標記。熒光淀粉樣β肽是商業(yè)可獲得的(例如，rPeptide，Athens，GA；Biosource，Camarillo，CA)。
在本發(fā)明的方法或系統(tǒng)的選定實施方案中，包括RAGE結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可連接于第二種非RAGE多肽，或可以與第二種非RAGE多肽復(fù)合。第二種多肽可包括免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可以與識別和結(jié)合于含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的抗體復(fù)合。所述抗體可包括多克隆抗體。或者，所述抗體可以包括單克隆抗體。通過允許包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽與抗RAGE的抗體復(fù)合，含有RAGE結(jié)合位點的構(gòu)建體的尺寸會增加，由此導(dǎo)致熒光配體與RAGE多肽結(jié)合后偏振極大地增加。
在一個實施方案中，可以使用針對sRAGE的抗體。例如，sRAGE可用作含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，而抗-sRAGE抗體可允許與sRAGE復(fù)合。
含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可以在與熒光配體和/或目的化合物結(jié)合之前與抗RAGE抗體復(fù)合。或者，含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可以在與熒光配體和/或目的化合物結(jié)合的同時與抗RAGE抗體復(fù)合。在又一個實施方案中，含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可以在RAGE多肽與熒光RAGE配體和/或目的化合物結(jié)合之后與抗RAGE抗體復(fù)合。
本發(fā)明涉及使用生理性相關(guān)結(jié)合分析來發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)RAGE活性能力的化合物。因此，在另一實施方案中，本發(fā)明包括由本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的具有調(diào)節(jié)熒光配體與RAGE結(jié)合能力的化合物。在一個實施方案中，具有調(diào)節(jié)熒光配體和RAGE結(jié)合能力的通過本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可以結(jié)合于RAGE的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域?；蛘?，具有調(diào)節(jié)熒光配體和RAGE結(jié)合能力的通過本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可以與RAGE相互作用而不結(jié)合于配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。同時，具有調(diào)節(jié)熒光配體和RAGE結(jié)合能力的通過本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可以用作RAGE激動劑?；蛘?，具有調(diào)節(jié)熒光配體和RAGE結(jié)合能力的通過本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可以用作RAGE拮抗劑。
在一個實施方案中，目的化合物可以包括有機小分子。例如，所述化合物可以包括有機小分子RAGE拮抗劑。在一個實施方案中，所述有機小分子的分子量低于1000道爾頓子。在其他實施方案，所述有機小分子的分子量范圍可從約400至900道爾頓，或者從約500至約800道爾頓。
使用本發(fā)明的方法和/或系統(tǒng)可對其他類型的潛在RAGE調(diào)節(jié)物進行鑒定。因此，目的化合物和潛在的RAGE調(diào)節(jié)物可以包括多肽?；蛘?，目的化合物和潛在的RAGE調(diào)節(jié)物可以包括肽模擬物(peptidomimetic)。或者，目的化合物和潛在的RAGE調(diào)節(jié)物可以包括無機化合物。同樣，目的化合物和潛在的RAGE調(diào)節(jié)物可以包括脂質(zhì)。在其他實施方案中，目的化合物和潛在的RAGE調(diào)節(jié)物可以包括碳水化合物。同樣，目的化合物和潛在的RAGE調(diào)節(jié)物可以包括核酸。
使用本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可配制成組合物對處于患有RAGE介導(dǎo)的疾病或綜合癥的危險中或者患有該疾病活綜合癥的患者進行給藥。如本文所述，公知RAGE參與多種可介導(dǎo)各種疾病狀態(tài)的細胞過程。經(jīng)過與RAGE相互作用，并且對AGEs進行加工，使用本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可用作治療劑。
例如，使用本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可用來治療淀粉樣變(amyloidoses)。在一個實施方案中，使用本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可用來治療阿爾茨海默病?；蛘?，使用本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可用來治療糖尿病和/或糖尿病晚期并發(fā)癥的癥狀。在另一個實施方案中，使用本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可用來治療癌癥。又或者，使用本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可用來治療炎癥。在另一個實施方案中，使用本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可用來治療腎衰竭?；蛘撸褂帽景l(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可用來治療系統(tǒng)性狼瘡腎炎或者炎癥性的狼瘡腎炎。同樣，使用本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可用來治療能勃起機能障礙。在又一個實施方案中，使用本發(fā)明方法和系統(tǒng)鑒定的化合物可用來治療中風(fēng)或者心臟病發(fā)作。
在一些實施方案中，用來治療RAGE介導(dǎo)病癥的組合物可包括至少一種其他的治療劑。例如可以使用含有至少一種烷化劑，抗代謝物，植物堿，抗生素，激素，生物反應(yīng)修飾劑，止痛劑，NSAID，DMARD，糖皮質(zhì)激素，磺酰脲類，縮二胍，胰島素，膽堿酯酶抑制劑，安定藥，抗抑郁藥，或者抗驚厥劑的其他治療劑。
定義以下定義可以用來幫助理解對本文的描述。除非另有指出，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本領(lǐng)域所屬普通技術(shù)人員通常理解的意思相同。
除非在文中另有所指，在此使用的術(shù)語“a”或者“an”都是指超過一個的對象。除非在文中另有所指，在此使用的術(shù)語“或者”和“和/或”是可以相互替換的。
“配體”是結(jié)合于受體形成復(fù)合物的分子。
“調(diào)節(jié)物”是可與第二分子和/或分子復(fù)合物物理性相互作用，從而引起第二分子或復(fù)合物的至少一個特征發(fā)生變化的分子。所述改變可包括第二分子和/或復(fù)合物的化學(xué)改變(例如，化學(xué)鍵的形成；凈電荷的改變)，物理改變(例如，三維結(jié)構(gòu)的改變)，和/或生物活性改變(例如，催化活性的改變)。
“激動劑”包括與受體結(jié)合形成引發(fā)針對所涉及的受體的特異性藥理學(xué)反應(yīng)的復(fù)合物的化合物。
“拮抗劑”包括與激動劑或受體結(jié)合形成不能引起顯著的藥理學(xué)反應(yīng)但是能夠抑制由激動劑誘導(dǎo)的生物應(yīng)答的復(fù)合物的化合物。
因此RAGE激動劑可以結(jié)合RAGE并刺激RAGE介導(dǎo)的細胞加工，并且RAGE拮抗劑可以抑制RAGE介導(dǎo)的有RAGE激動劑刺激的加工。例如，由RAGE刺激的細胞加工可以包括TNF-α基因轉(zhuǎn)錄或者NF-κB基因轉(zhuǎn)錄或者其他細胞加工的活化。
“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中是可以相互替換的，從而對包括部分或全長蛋白的蛋白質(zhì)分子進行描述。
正如在本文中所使用的，“有機小分子”是分子量低于2,000道爾頓含有至少一個碳原子的分子。
“多肽結(jié)構(gòu)域”包括具有獨立單位的沿著多肽的結(jié)構(gòu)域?？梢允褂媒Y(jié)構(gòu)，序列和/或生物活性的術(shù)語對結(jié)構(gòu)域進行定義。在一個實施方案中，多肽結(jié)構(gòu)域可以包括以顯著獨立于所述蛋白其他部分的方式進行折疊的蛋白結(jié)構(gòu)域。可以使用例如，但不限于PFAM，PRODOM，PROSITE，BLOCK，PRINTS，SBASE，ISREC PROFILE，SAMRT，和PROCLASS的結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫對結(jié)構(gòu)域進行鑒定。“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是結(jié)合于配體的多肽結(jié)構(gòu)域。
“免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”是與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)同源，或同一的氨基酸序列。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列長度可以是任意長度。在一個實施方案中，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可以小于250個氨基酸。在一個示例實施方案中，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的長度可以是約80-150氨基酸。
術(shù)語“多克隆抗體”是指于使用目的抗原免疫動物血清得到的抗體分子的異源群?？梢允褂弥T如弗氏(完全和不完全)佐劑，多肽，油乳劑，溶血卵磷脂，多元醇，聚聚陰離子等來增強免疫反應(yīng)。例如，可以使用本領(lǐng)域公知的方法將添加有佐劑的sRAGE注射兔子來制備針對sRAGE的多克隆抗體(例如，Schmidt et al，J.Biol.Chem.，2Schmidt et al，J.Biol.Chem.，26714987-14997(1992))。
“單克隆抗體”是指針對特定抗原的同源抗體群，其通常是由提供培養(yǎng)中的連續(xù)細胞系產(chǎn)生抗體的任一技術(shù)得到的(參見，例如美國專利第4,873,313號)。例如，使用本領(lǐng)域公知的方法可使用sRAGE蛋白生產(chǎn)單克隆抗體(Zymed Laboratories，San Francisco，CA)。
“核酸”是例如脫氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)的多核苷酸。該術(shù)語包括單鏈核酸，雙鏈核酸，以及從核苷酸或核苷酸類似物制備的DNA和RNA。
那術(shù)語“載體“是指可用來將第二核酸分子轉(zhuǎn)入細胞的核酸分子。在一個實施方案中，載體允許對插入所述載體的DNA序列進行復(fù)制。載體可包括至少在某些宿主細胞中增強核酸分子表達的啟動子。載體可以自主復(fù)制(染色體外)或者可以整合入宿主細胞的染色體中。在一個實施方案中，載體可包括表達載體，其能夠從插入所述載體的至少部分核酸序列產(chǎn)生蛋白。
術(shù)語“百分比同一性”是指兩個氨基酸序列或兩個核酸序列之間的序列同一性。百分比同一性可以通過對兩條序列進行比對進行確定并且是指所比較的序列相同位置上相同殘基(即，氨基酸或核苷酸)的數(shù)量?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中的標準算法(例如，Smith and Waterman，Adv.Appl Math.2482(1981)；Needleman and Wunsch，J.MoI.Biol.48443(1970)；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，852444(1988))，或公眾可獲得的諸如BLAST和FASTA的這些算法的計算機軟件(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，WIWisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 ScienceDrive，Madison，WI)進行序列比對和比較。同樣，從National Institutes ofHealth，Bethesda MD獲得的ENTREZ也可以用來進行序列比較。在一個實施方案中，可使用缺口權(quán)重(gap weight)為1的GCG測定兩條序列的百分比同一性，因此每一個氨基酸缺口被加權(quán)，就像兩條序列中單個氨基酸或核苷酸的錯配。
正如在本領(lǐng)域技術(shù)中公知的那樣，可以從低到高的嚴謹程度對核酸序列相互雜交的條件進行描述。一般地，高嚴謹雜交條件是指在低鹽緩沖液在高溫條件下對雜交物進行洗滌的條件。可以使用本領(lǐng)域中的標準雜交液，例如0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，在65℃，并且在0.25M NaHPO4，3.5％SDS中洗滌之后，再根據(jù)探針的長度在從室溫至68℃的溫度范圍使用0.1×SSC/0.1％SDS進行洗滌，過濾所結(jié)合的DNA來進行雜交(參見，例如，Ausubel，F(xiàn).M.et al，Short Protocolsin Molecular Biology，4thEd.，Chapter 2，John Wiley & Sons，N.Y)。例如，高嚴謹?shù)南礈彀ㄔ?x SSC/0.05％焦磷酸鈉中在37℃對14堿基的寡核苷酸探針，或在48℃對17堿基的寡核苷酸探針，或在55℃對20堿基的寡核苷酸探針，或在60℃對25堿基的寡核苷酸探針，或在65℃對長度約為250核苷酸長度的寡核苷酸探針進行洗滌?？梢酝ㄟ^使用例如[γ-32p]ATP末端標記的放射性核苷酸，或通過隨機引物標記將諸如[α-32P]dCTP的放射性標記的核苷酸摻入來對核酸探針進行標記。或者，可通過生物素?；驘晒馑貥擞浀暮塑账岬恼蠈μ结樳M行標記，并使用鏈霉親和素或者抗熒光素抗體對所述探針進行檢測。
正如在本文中所使用的，術(shù)語“EC50”定義為達到50％預(yù)期效果的制劑濃度。例如，具有可測定生物效果的治療劑的EC50可包括所述制劑表現(xiàn)出50％生物效果的值。
正如在本文中所使用的，術(shù)語“IC50”定義為達到測定效果50％抑制的制劑濃度。例如，RAGE結(jié)合拮抗劑的IC50可包括所述拮抗劑將配體與RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合降低50％的值。
正如在本文中所使用的，目的化合物的“化學(xué)變體”包括在所述目的化合物中至少取代了一個原子團的分子。正如在本文中所使用的，目的化合物的“結(jié)構(gòu)變體”與所述目的化合物具有相同的經(jīng)驗式，但卻具有不同三維構(gòu)象的分子。
使用熒光偏振來鑒定調(diào)節(jié)RAGE配體相互作用的化合物因此，本發(fā)明包括使用含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽對具有調(diào)節(jié)生理配體和RAGE結(jié)合能力的化合物進行檢測的方法和系統(tǒng)。含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可以包括RAGE蛋白，或RAGE的片段。在一個實施方案中，所述方法可以包括測定由目的化合物引起的從含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽置換熒光RAGE配體。如果所述目的化合物具有置換熒光配體的能力，那么所述目的化合物可包括潛在的RAGE，和/或RAGE介導(dǎo)生物活性的調(diào)節(jié)物。
本發(fā)明方法和/或系統(tǒng)的示意圖如圖1所示。熒光偏振測定方法允許對受體/配體相互作用的程度進行定量。允許對結(jié)合進行熒光偏振檢測的物理方法是基于在溶液中越小的分子比越大的分子旋轉(zhuǎn)得越快這一原理。在相同的溶液相中，與較大的分子相比，越小分子的越快轉(zhuǎn)動產(chǎn)生了越小的熒光偏振。因此，當(dāng)與結(jié)合于其關(guān)聯(lián)(cognate)受體(例如，sRAGE，圖1A)的熒光配體的微偏振值相比時，相對較小的配體，例如在圖1中由三角形結(jié)構(gòu)示意的淀粉樣蛋白β1-40的熒光衍生物當(dāng)在溶液中是游離時，會具有較低的微偏振(mP)值。在一個實施方案中，偏振的程度可以作為配體和受體之間結(jié)合程度的函數(shù)，以基本上線性的關(guān)系增加(Allen et al.，J.Biomol Screen，263-69(2000))。
如圖1B所示，所述分析可允許對非標記目的化合物(例如，矩形)對RAGE配體結(jié)合位點的熒光配體(三角形)進行替換的能力進行評估。由于熒光配體的替換，微偏振(mP)值也會隨著含有熒光標記的結(jié)構(gòu)的平均尺寸的降低而降低，因為越小的未結(jié)合的熒光配體會比結(jié)合于RAGE多肽(例如，sRAGE)的熒光配體旋轉(zhuǎn)得越快。
在一個實施方案中，為了進行分析需要進行最小限度的過濾，洗滌或轉(zhuǎn)移步驟。例如，為了進行所述分析，可以向微孔板的小孔中加入試劑(即，熒光RAGE配體；RAGE多肽；目的化合物；以及分析緩沖液)。在完成溫育步驟之后，可使用熒光偏振讀數(shù)器測定熒光。因此，該簡單的方法學(xué)可為高通量的藥物篩選提供有用的方式。
如本文所述，全長RAGE蛋白或全長RAGE蛋白的片段都可包括可用于所述分析的RAGE多肽。因此，含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE蛋白或多肽可以是如SEQ ID NO1(圖2A)所示的氨基酸序列或該氨基酸序列的一部分(Neeper et al，J.Biol.Chem.26714998-15004，(1992。RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括生理特異性結(jié)合于配體的蛋白區(qū)域。正如在本文中所使用的，全長RAGE蛋白的片段為至少5個氨基酸長度，并可以大于30個氨基酸的長度，但短于該全長氨基酸序列。在一個實施方案中，所述RAGE多肽包括sRAGE(SEQ ID NO2；圖2B)，或其片段，其中sRAGE是游離于細胞膜之外的RAGE蛋白(Park et al，Nature Med.，41025-1031(1998))。在一個實施方案中，可以使用與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的具有至少90％同一性的序列。例如，所述RAGE多肽可包括第一個氨基酸為甲硫氨酸(M)而不是甘氨酸(G)的SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。例如，可以使用含有第一個殘基為甲硫氨酸(M)(例如，SEQ ID NO7；圖2E)的sRAGE的重組形式。在另一個實施方案中，所述RAGE蛋白包括V結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO3；圖2C)(Neeper et al，J.Biol.Chem.26714998-15004(1992))，或其片段(例如，SEQ ID NO4，圖2D)。在另一個的實施方案中，所述RAGE多肽是合成肽。
可對所述分析進行設(shè)計從而允許對含有與熒光配體結(jié)合的RAGE的線性區(qū)域的RAGE多肽的量進行選擇。例如，如果使用了太低濃度的RAGE多肽，就會由于低信號水平難以檢測結(jié)合。如果使用了過量的RAGE多肽，那么，目的化合物與熒光配體競爭的能力就會由于結(jié)合于配體和目的化合物的過量RAGE多肽而減少。在其他實施方案中，含有RAGE配體結(jié)合位點的多肽可以從約0.001nM至約50μM，或從約0.01nM至約5μM終分析濃度(FAC)，或從約0.1nM至約500nM FAC，或從1nM至約100nM FAC。對每一個和每一種在此所述的范圍，包括于所述范圍內(nèi)的任意范圍都可以使用。因此，包括1nM至約100nM的范圍包括了諸如，但不限于2nM至約99nM，或3nM至約98nM以及每個和每一種范圍之間的范圍。
同樣在一個實施方案中，所述分析設(shè)計為允許對熒光配體進行優(yōu)化。因此，在一個實施方案中，可對所使用的熒光配體的量進行滴定從而允許最大信號，但并未高至含有較高水平的背景結(jié)合。更優(yōu)選地，允許最大信號的熒光配體的量具有與競爭化合物濃度無關(guān)的類似范圍。在其他實施方案中，熒光配體(例如，熒光淀粉樣蛋白β)的最終分析濃度可從約1pM至約50μM，或從約0.005nM至約5μM，或從約0.05nM至約500nM，或從約0.5nM至約50nM。再一次地，對每一個和每一種在此所述的范圍，只要包括于所述范圍內(nèi)的任意范圍都可以使用。
在一個實施方案中，所述熒光配體可以包括淀粉樣β多肽。例如，在其他實施方案中，所述熒光配體可以包括含有SEQ ID NO5的氨基酸序列的淀粉樣蛋白β(1-40)或者含有SEQ ID NO6序列的淀粉樣蛋白β(1-42)(圖3)。在一個實施方案中，所述熒光素可以附著于淀粉樣β多肽的氨基末端。當(dāng)?shù)矸蹣拥鞍爪卤挥米鳂擞浀呐潴w時，有必要在向所述分析加入配體之前對熒光淀粉樣蛋白β進行預(yù)溫育，因為這樣的預(yù)溫育可以允許淀粉樣蛋白β自我聚集成折疊片層形式。在一個實施方案中，淀粉樣蛋白β可優(yōu)選地以折疊的形式結(jié)合于RAGE。
可對所述分析進行優(yōu)化從而對超出濃度范圍的目的化合物進行測定。在其他實施方案中，第二化合物可以從約1pM至約500μM，或從約0.010nM至約200μM，或從約0.1nM至約50μM，或從約1nM至約40μM，或從約10nM至約30μM的濃度存在于所述分析中。
可對本發(fā)明的方法和系統(tǒng)進行設(shè)計來最大化分析靈敏度。例如，當(dāng)sRAGE在40nM的終分析濃度被用作含有RAGE結(jié)合位點的多肽，且所述熒光配體是淀粉樣蛋白β(1-40)時，幾乎所有的最大信號都可以用50nM的淀粉樣蛋白β(1-40)看到。在競爭性分析的實施方案中，在每個結(jié)合反應(yīng)小孔(40μl分析體積)中濃度介于10nM至30μM的未標記配體(即，目的化合物)可包括所述熒光配體對sRAGE結(jié)合的線性降低。
所述分析可用來對多種潛在RAGE調(diào)節(jié)物對RAGE結(jié)合結(jié)構(gòu)域的熒光素化的配體(fluroceinated ligand)的置換能力進行檢測和定量。如圖4所示，未標記的RAGE配體可與生理范圍內(nèi)有效濃度(EC50)的未標記配體競爭與sRAGE的結(jié)合。例如，未標記的淀粉樣蛋白β(1-40)可以約62nM的EC50值與熒光素化的淀粉樣蛋白β(1-40)競爭與sRAGE的結(jié)合。同樣，未標記的s100b可以約43nM的EC50值與熒光素化的淀粉樣蛋白β(1-40)競爭與sRAGE的結(jié)合。同樣，未標記的CML(羧甲基賴氨酸)可與約79nM的EC50值與熒光素化的淀粉樣蛋白β(1-40)競爭與sRAGE的結(jié)合。對圖4的數(shù)據(jù)而言，EC50值是在從導(dǎo)致最大偏振(“底部”)的濃度到導(dǎo)致最低偏振(“頂部”)的過程中，導(dǎo)致一半熒光配體置換的未標記配體的濃度。
所述分析的優(yōu)化與需要溶解待測化合物的任意溶劑無關(guān)。例如，在某些情況下，可使用諸如二甲基亞砜(DMSO)的有機溶劑來溶解作為RAGE潛在調(diào)節(jié)物的待測有機化合物。例如，在一般分析中用來溶解目的有機化合物的1.5％DMSO的終分析濃度(FAC)的DMSO濃度時，所述分析通常提供最大信號(圖5)。甚至在高達10％DMSO的濃度時，所述分析都能為檢測熒光素化淀粉樣蛋白β(1-40)與sRAGE的結(jié)合，以及由目的化合物引起的對這些結(jié)合的置換提供足夠的窗口(window)。
因此，所述分析允許對各個成分進行優(yōu)化，因此使得由于任一實驗的變化的分析結(jié)果的變異最小化。一旦對特異性的熒光配體和RAGE多肽進行了優(yōu)化，所述分析就可以提供樣本結(jié)合親和性的可靠分析，而不管被測試的特異性的競爭性目的化合物(即，推測性的調(diào)節(jié)物)如何。同樣，在一個實施方案中，所述分析包括重復(fù)性和準確的高通量分析。在一個實施方案中，所述分析包括低于20％的差異。在其他實施方案中，所述分析可以包括低于10％或低于5％的差異。
可對本發(fā)明的方法和系統(tǒng)進行設(shè)計，由此使得RAGE多肽與熒光配體的結(jié)合反映體內(nèi)RAGE與配體結(jié)合的本質(zhì)。例如，所述熒光配體可與RAGE多肽以特異和飽和的方式結(jié)合。在一個實施方案中，可對所述分析進行設(shè)計，從而使得濃度范圍從約0.1nM至約500nM的sRAGE多肽可以飽和的方式結(jié)合于熒光淀粉樣蛋白β(1-40)?？蓪Ρ景l(fā)明的方法和系統(tǒng)進行設(shè)計，從而檢測在較低和較高親和性結(jié)合位點拮抗的化合物。例如，使用含有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽，其中所述RAGE多肽的濃度范圍從約0.1nM至約10nM，可以為使用未標記淀粉樣蛋白β(1-40)作為競爭性配體的Kd低于10nM的高親和性結(jié)合位點進行表征。同樣，在從約20nM至約500nM的濃度使用含有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽可以為較低親和性結(jié)合位點進行表征。通過轉(zhuǎn)化方式對數(shù)據(jù)進行的分析可以用來顯示高親和性和低親和性位點(Hofmann et ah，Cell，97889-901(1999)；Hori et al，J.Biol.Chem.，27025752-25761(1995))。
所述分析的前提是較小的分子旋轉(zhuǎn)得比較大的分子快，而且分子的尺寸是由熒光偏振的水平反映的(即，mP值)。通過增加含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物的尺寸，偏振會有較大的改變，因為所述熒光配體從溶液中的自由旋轉(zhuǎn)狀態(tài)變成了所述熒光配體結(jié)合于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的狀態(tài)。因此，在一個實施方案中，含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可與第二多肽或蛋白復(fù)合成為增加受體尺寸的方式。例如，雖然熒光RAGE配體與sRAGE的結(jié)合可以增加微偏振(mP)值(例如，從330-430)，所述熒光RAGE配體與和第二多肽復(fù)合的sRAGE的結(jié)合可以使偏振值增加更大。
如圖6所示，含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可與抗RAGE抗體復(fù)合。例如，sRAGE可用作含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，而抗sRAGE抗體可與所述sRAGE復(fù)合?？捎糜跈z測sRAGE的抗體包括商業(yè)可獲得的抗RAGE多克隆抗體(山羊抗RAGE多克隆抗體，Cat.No.ab7714，Novus Biologicals，Littleton，CO；山羊抗人RAGE多克隆抗體，Cat.No.ST1025，CalBiochem，San Diego，CA)和單克隆抗體(抗人RAGE單克隆抗體，Cat.No.R1031，United States Biological，Swampscott，MA)。同樣，也可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)生產(chǎn)客戶定制的抗RAGE抗體。
用來在含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽和抗體之間形成復(fù)合物的方法可隨著所使用的抗體的不同而不同。優(yōu)選的抗體不會對熒光RAGE配體與RAGE結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合進行干擾或修飾。
分析緩沖液可包括降低第二多肽(例如，sRAGE抗體)與所述小孔背景結(jié)合的成分。例如，可使用包括BSA(例如，0.5％-0.5％)，和/或TWEEN20(例如，0.01-0.1％)的緩沖液制備所述分析成分?；蛘?，可用封閉緩沖液(例如，50mM咪唑，pH7.2，1-5％牛血清白蛋白(BSA)，0.01-0.1％TWEEN 20)對分析小孔進行處理從而降低抗體與分析小孔的背景結(jié)合。隨后可將封閉緩沖液從小孔中吸出，并洗滌分析小孔。例如，在用封閉緩沖液對分析小孔進行處理后，可使用洗滌緩沖液(例如，20mM咪唑，pH7.2，150mM NaCl)以400μl/孔洗滌分析小孔三次，在每次洗滌之間用洗滌緩沖液進行任選的浸泡。
為了進行所述分析，可將單獨的成分(例如，5-10μl溶解于DMSO的目的化合物)，sRAGE(例如，10μlsRAGE，40nM FAC)，熒光配體(例如，5-10μl熒光淀粉樣蛋白β，50nM FAC)和抗體(例如，10μl針對sRAGE的單克隆抗體)同時加入每個小孔中，在37℃進行溫育1小時?；蛘?，在將其加入分析小孔之前，允許將抗體和RAGE多肽溫育形成復(fù)合物。所述復(fù)合物可在4℃-37℃從30分鐘至24小時之間得以形成。一般而言，較溫暖的溫育溫度只需較短的溫育時間。在另一個的實施方案中，在允許RAGE多肽與熒光RAGE配體和/或目的化合物結(jié)合之后，含有RAGE結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可與抗RAGE抗體復(fù)合。當(dāng)希望使由熒光配體和目的化合物與RAGE多肽結(jié)合的抗體的任意潛在的干擾最小化時，本方法是優(yōu)選地。
可對所述分析進行設(shè)計來優(yōu)化所用的抗RAGE抗體的量。因此，在一個實施方案中，可對所用熒光配體的量進行滴定從而允許最大信號，但并未高至產(chǎn)生較高水平的背景結(jié)合。抗體的優(yōu)選量是基于用于分析的RAGE多肽的量和抗體對于RAGE的親和性。在一個實施方案中，允許獲得最大信號的抗體量可具有類似的范圍，而不管目的化合物或熒光RAGE配體的濃度如何。
可以使用重組技術(shù)制備含有RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。如本領(lǐng)域中所公知的，用于本發(fā)明方法和系統(tǒng)中用來表達RAGE多肽的核酸構(gòu)建體，可以通過突變，例如，通過對含有目的突變的引物對核酸模板進行PCR擴增來進行修飾。以這種方式，可以設(shè)計含有對RAGE具有不同親和性的多肽。在一個實施方案中，所突變的序列可以與起始DNA具有90％或更高的同一性。或者，所突變的序列可以與起始DNA具有80％，或70％或更高的同一性。因此，變體可包括在嚴謹條件(例如，相當(dāng)于在1摩爾鹽中，比DNA雙鏈的溶解溫度(TM)低20-27℃)下雜交的核苷酸序列。
可以對用于本發(fā)明方法和系統(tǒng)中的RAGE多肽和蛋白進一步修飾以增加效率。因此，可通過翻譯后加工或通過化學(xué)修飾對用于本發(fā)明方法和系統(tǒng)中的RAGE多肽進行修飾。例如可對RAGE多肽合成制備從而包括L-，D-，或非天然氨基酸，α-雙取代的氨基酸，或N-烷基氨基酸?；蛘?，可通過乙酰化，?；?，ADP-核糖化，酰胺化，例如磷脂酰肌醇的脂質(zhì)的結(jié)合，二硫鍵的形成等等對RAGE多肽進行修飾。
本發(fā)明的方法和系統(tǒng)提供了結(jié)合分析從而對在生理結(jié)合條件下與RAGE相互作用的化合物進行鑒定。在這一方面，生理結(jié)合條件包括了那些產(chǎn)生與在體內(nèi)所看到的結(jié)合親和性相類似的條件。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明包括由本發(fā)明的方法和/或系統(tǒng)鑒定的，具有調(diào)節(jié)配體與RAGE結(jié)合能力的化合物。由本發(fā)明的方法和/或系統(tǒng)鑒定的化合物可包括若干不同的化學(xué)類型。例如，在一個實施方案中，RAGE調(diào)節(jié)化合物可包括多肽。在另一個實施方案中，RAGE調(diào)節(jié)化合物可包括肽模擬物。在另一個實施方案中，RAGE調(diào)節(jié)化合物可包括有機分子。在又一個實施方案中，RAGE調(diào)節(jié)化合物可包括無機分子。在一些情況中，可對RAGE調(diào)節(jié)化合物進行衍生從而增加其半衰期。
如上所述，有調(diào)節(jié)RAGE能力的所鑒定的化合物可包括肽模擬物。在一個實施方案中，所述肽模擬物至少部分是非天然的。優(yōu)選地，可對目的化合物進行修飾，從而增加其穩(wěn)定性，效率，效力和生物利用率。例如，在一個實施方案中，可被合成地制備所述化合物從而包括L-，D-，或非天然氨基酸，α-二取代的氨基酸，N-烷基氨基酸或乳酸。在一個實施方案中，所述化合物可包括具有多肽骨架或被適當(dāng)模擬物取代的氨基酸的肽模擬物。
同樣，具有調(diào)節(jié)RAGE能力的所鑒定的化合物可包括有機小分子。在一個實施方案中，所述有機分子包括低于1000道爾頓的分子量的分子。例如，如圖7所示，TTP-A，TTP-B，TTP-C，TTP-D和TTP-E表現(xiàn)出對sRAGE與熒光淀粉樣蛋白β(1-40)結(jié)合抑制的IC50值分別為約259nM，376nM，367nM，749nM和2.04μM。諸如且包括TTP-A，TTP-B，TTP-C，TTP-D和TTP-E的目的有機小分子化合物的結(jié)構(gòu)由共有的公開號為2002/0006957，2003/0032663，2002/0193432和2004/0082542的美國專利所提供，在此將每一個專利全文引用作為參考。
在一個實施方案中，由于其具有調(diào)節(jié)RAGE生物活性的能力，可對由結(jié)合分析鑒定的化合物進一步進行測定。例如，可對所述化合物能夠在基因表達或其他細胞過程中調(diào)節(jié)RAGE-誘導(dǎo)的升高的能力進行測定。因此，在一個實施方案中，由結(jié)合分析鑒定的化合物可用來調(diào)節(jié)NF-κBκB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的RAGE活化?？墒褂肗F-κB啟動子的下游的報道基因?qū)撛谡{(diào)節(jié)化合物對NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的RAGE活化進行調(diào)節(jié)的能力進行分析?；蛘撸山Y(jié)合分析鑒定的化合物可用來調(diào)節(jié)TNF-α介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的RAGE活化，其中可以使用TNF-α啟動子的下游的報道基因?qū)撛谡{(diào)節(jié)化合物對TNF-α介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的RAGE活化進行調(diào)節(jié)的能力進行分析。在一個實施方案中，由于RAGE對其他細胞過程的調(diào)節(jié)，可將調(diào)節(jié)配體與RAGE結(jié)合的化合物鑒定出來。
實施例在以下實施例中對本發(fā)明所包括的創(chuàng)造性的特點和優(yōu)點進行進一步說明。
實施例1熒光偏振分析方法簡言之，本方法涉及將10μL的重組人sRAGE(終濃度40nM具有氨基酸序列SEQ ID NO7)加入10μL磷酸緩沖鹽水pH7.4(Sigma，St.Louis，MO)中，然后在存在10μL的RAGE拮抗劑(終分析濃度為10nM-30μM)的情況下，再加入10μL(終分析濃度50nM)的熒光淀粉樣蛋白β(1-40)肽(Biosource，Camarillo，CA)。有必要對熒光淀粉樣蛋白β配體進行預(yù)溫育，使得所述淀粉樣蛋白β形成折疊的片層結(jié)構(gòu)，因為不是折疊片層結(jié)構(gòu)的淀粉樣蛋白β不能以較高的親和性與sRAGE結(jié)合。為了形成折疊片層結(jié)構(gòu)，可在用于分析之前，將淀粉樣蛋白β溫育至少24小時。為了預(yù)溫育淀粉樣蛋白β，以6mg/ml的濃度將冷凍干燥的肽溶解于高壓液相色譜(HPLC)級水中。一旦溶解之后，用磷酸緩沖鹽水(不含鈣的)將所述肽稀釋成1mg/ml的濃度，并在37℃溫育24-48小時。
在37℃對復(fù)合物溫育1小時，然后使用Envision平板讀數(shù)器(Perkin Elmer)對微偏振(mP)數(shù)據(jù)進行讀取。在某些情況下，根據(jù)人sRAGE的純度，可以向磷酸緩沖鹽水中加入0.1％牛血清白蛋白(BSA)或0.05％去污劑TWEEN-20，從而降低sRAGE與分析小孔的背景結(jié)合。
實施例2分析條件的優(yōu)化進行了對分析條件進行優(yōu)化的實驗。例如，在終分析濃度40nM使用重組sRAGE，可以發(fā)現(xiàn)濃度介于4-400ng每毫升每40μL反應(yīng)體積的所述熒光淀粉樣蛋白β導(dǎo)致了sRAGE結(jié)合的線性增加。
接下來，對在不同sRAGE濃度的分析優(yōu)化進行了評估。使用的是50nM熒光標記的淀粉樣蛋白β(1-40)，發(fā)現(xiàn)在0.6-600ng每毫升sRAGE每40μL分析體積中，sRAGE的結(jié)合呈線性增加，可見的最大信號約為40nM sRAGE。
圖4所示為顯示DMSO濃度增加對熒光素化淀粉樣蛋白β1-40配體與sRAGE相互作用的微偏振(mP)值的影響的代表性實驗。高至2％終體積的DMSO濃度對所得的微偏振值沒有顯著性影響。盡管在DMSO濃度高于2％FAC(終分析濃度)的情況下對微偏振值有一些影響，但由于mP值(熒光素化淀粉樣蛋白β1-40配體，無sRAGE存在)的基線為約470±5mP用高于2％的DMSO的濃度實現(xiàn)了該范圍，給出了充分的測定范圍。每一個橫杠代表具有計算出的標準離差的四次測定的平均值。
一般地，所述分析使用0.5nM-50nM熒光淀粉樣蛋白β和1-100nMsRAGE。目的化合物的范圍從1nM-30μM。
還進行了多次實驗來對分析的變異性進行定量。發(fā)現(xiàn)一般的分析變異性低于10％。
實施例3配體與sRAGE結(jié)合的檢測圖3所示為說明RAGE特異性配體與熒光素化的淀粉樣蛋白β1-40競爭與sRAGE結(jié)合的代表性實驗。所述競爭以劑量依賴的方式產(chǎn)生，其中增加替換熒光淀粉樣蛋白β1-40配體的未標記配體的量導(dǎo)致較低的微偏振(mP)值。
對于未標記淀粉樣β(1-40)(正方形)的62nM，對于未標記S100b(三角形)的43nM，和對于未標記羧甲基賴氨酸(倒三角)的79nM的EC50值與結(jié)合于sRAGE的理論值相符(Yan et al，Nature，382685-691(1996)，Kislinger et al，J.Biol.Chem.27431740-31749(1999))。需要注意的是每一個點都代表具有計算的標準偏差的四次測定的平均值。
實施例4由有機小調(diào)節(jié)物抑制sRAGE結(jié)合圖7所示為說明較有機小分子能夠與熒光素化的淀粉樣β1-40競爭與sRAGE結(jié)合的代表性實驗。例如，TTP-A，TTP-B，TTP-C，TTP-D和TTP-E分別以約259nM，376nM，367nM，749nM和2.04μM的IC50值抑制sRAGE與熒光淀粉樣蛋白β(1-40)的結(jié)合。所述競爭以劑量依賴的方式產(chǎn)生，其中增加未標記配體的量替換熒光淀粉樣蛋白β1-40配體的量增加，導(dǎo)致較低的微偏振(mP)值。產(chǎn)生熒光淀粉樣蛋白β50％替換的未標記配體的濃度就是IC50值。該數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的分析方法可用來對具有RAGE拮抗劑活性的有機小分子進行篩選。在圖7中，每一個點都代表具有計算的標準偏差的四次測定的平均值。
參考以上描述，本發(fā)明各部分的最佳量綱關(guān)系(包括特定組分和使用方式的差異)對本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員而言是顯而易見的，所有在

和在說明書中描述的等價關(guān)系都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。以上內(nèi)容僅對本發(fā)明的原理進行了說明。因為本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以容易地進行多種修飾和改變，所以不應(yīng)將本發(fā)明局限于所描述和描述的具體實施方案之內(nèi)，在所附權(quán)利要求范圍之內(nèi)的所有適當(dāng)修飾和等價替換都被認為屬于本發(fā)明的概念之內(nèi)。
還應(yīng)該理解，在此使用的措辭和術(shù)語學(xué)是描述性而非是限制性的。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)該理解本公開內(nèi)容所基于的概念可容易地用作設(shè)計實施本發(fā)明若干目的的方法和系統(tǒng)的基礎(chǔ)。只要不偏離本發(fā)明的精神和范圍，可以認為權(quán)利也要求包括了這些等價的詮釋。
序列表<110> 特蘭斯泰克制藥公司(TransTech Pharma，Inc)<120> 熒光偏振分析(Fluorescence Polarization Assay)<130> SCT064291-66<150> 60/554，183<151> 2004-03-18<160> 7<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 404<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 1Gly Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Ara35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lvs Val Leu50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr LyS Ser Asn100 105 110Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160
Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu180 185 190Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys195 200 205Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro210 215 220Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu225 230 235 240Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr245 250 255Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met260 265 270Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu275 280 285Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr290 295 300His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ssr Ile Ser Ile305 310 315 320Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser325 330 335Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly340 345 350Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg355 360 365Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu370 375 380Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser385 390 395 400
Thr Gly Gly Pro<210> 2<211> 339<212> PRT<213> Homo Sapiens<400> 2Gly Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 110Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu180 185 190Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys195 200 205
Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro210 215 220Ile Gln Pro Arg Va1 Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu225 230 235 240Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Va1 Thr245 250 255Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met260 265 270Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu275 280 285Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr290 295 300His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile305 310 315 320Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser325 330 335Gly Leu Gly<210> 3<211> l12<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 3Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn20 25 30Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly35 40 45Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu50 55 60
Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met65 70 75 80Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr85 90 95Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr100 105 110<210> 4<211> 30<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 4Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys1 5 10 15Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys20 25 30<210> 5<211> 40<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 5Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val35 40<210> 6<211> 42<2l2> PRT<213> Homo sapiens<400> 6Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210> 7<211> 339<212> PRT<213> Artificial Sequence<220>
<223> Modified peptide sequence<400> 7Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 110Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu180 185 190
Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys195 200 205Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro210 215 220Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu225 230 235 240Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr245 250 255Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met260 265 270Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu275 280 285Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr290 295 300His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile305 310 315 320Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser325 330 335Gly Leu Gly
權(quán)利要求
1.檢測RAGE調(diào)節(jié)物的方法，包括(a)提供(i)包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽，(ii)熒光RAGE配體，和(iii)目的化合物；(b)向所述RAGE多肽中加入所述目的化合物和熒光RAGE配體；以及(c)測定所述熒光RAGE配體的偏振。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括步驟(d)將偏振水平與結(jié)合于所述RAGE多肽的熒光RAGE配體的量進行相關(guān)分析。
3.權(quán)利要求2的方法，還包括在存在不同量目的化合物的條件下測定結(jié)合于所述RAGE多肽的熒光RAGE配體的量。
4.權(quán)利要求3的方法，還包括基于熒光RAGE配體與RAGE多肽的結(jié)合降低到預(yù)定量所需的目的化合物的量確定測定所述目的化合物對RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和性。
5.權(quán)利要求4的方法，其中將目的化合物降低熒光RAGE配體與RAGE多肽結(jié)合的能力與第二化合物降低熒光RAGE配體與RAGE多肽結(jié)合的能力進行比較。
6.權(quán)利要求5的方法，其中第二化合物并未充分地結(jié)合于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此第二化合物可作為陰性對照來測定對于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。
7.權(quán)利要求5的方法，其中第二化合物具有對于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的充分的結(jié)合親和性，因此第二化合物可作為陽性對照來測定對于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。
8.權(quán)利要求5的方法，其中第二化合物包括至少一種所述目的化合物的結(jié)構(gòu)變體或化學(xué)變體。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光配體包括高級糖化終產(chǎn)物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光配體包括淀粉樣β多肽。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述淀粉樣β肽包括具有SEQ IDNO5的氨基酸序列的淀粉樣蛋白β(1-40)。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述淀粉樣β肽包括具有SEQ IDNO6氨基酸序列的淀粉樣蛋白β(1-42)。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述熒光素附著于淀粉樣β多肽的氨基末端。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光配體包括s100b。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光配體包括羧甲基賴氨酸(CML)。
16.權(quán)利要求1的方法，其中熒光配體包括amphoterin。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光配體包括鈣粒蛋白。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光配體包括分子量低于1000道爾頓的有機小分子。
19.權(quán)利要求1的方法，其中包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO4，或與其具有至少90％同一性的序列。
20.權(quán)利要求1的方法，其中包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO3，或與其具有至少90％的同一性的序列。
21.權(quán)利要求1的方法，其中包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或與其具有至少90％的同一性的序列。
22.權(quán)利要求1的方法，其中包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述多肽共價連接于第二多肽，或與第二多肽復(fù)合。
23.權(quán)利要求22的方法，其中包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述多肽可以與識別RAGE或其片段的抗體復(fù)合。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述目的化合物包括有機小分子。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述有機小分子的分子量低于1000道爾頓。
26.檢測調(diào)節(jié)配體與RAGE結(jié)合的化合物的系統(tǒng)，包括如下成分的單獨包裝的容器(a)熒光RAGE配體；(b)包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RAGE多肽；和(c)在存在目的化合物情況下的用于稀釋(a)和(b)的至少一種分析試劑，因此可以對熒光RAGE配體與包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合進行定量。
27.權(quán)利要求26的方法，還包括測定所述熒光配體的偏振的裝置。
28.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，還包括對RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有預(yù)定結(jié)合親和性的化合物。
29.權(quán)利要求28的系統(tǒng)，其中對RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有預(yù)定結(jié)合親和性的化合物并未充分結(jié)合于所述RAGE結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此第二化合物可作為陰性對照來測定對于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。
30.權(quán)利要求28的系統(tǒng)，其中第二化合物具有對于RAGE結(jié)合結(jié)構(gòu)域的充分結(jié)合親和性，因此第二化合物可作為陽性對照來測定對于RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。
31.權(quán)利要求28的系統(tǒng)，其中第二化合物包括至少一種所述目的化合物的結(jié)構(gòu)變體或化學(xué)變體。
32.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述熒光配體包括高級糖化終產(chǎn)物。
33.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中熒光配體包括淀粉樣β多肽。
34.權(quán)利要求33的系統(tǒng)，其中所述淀粉樣β肽包括具有SEQ IDNO5氨基酸序列的淀粉樣蛋白β(1-40)。
35.權(quán)利要求33的系統(tǒng)，其中所述淀粉樣β肽包括具有SEQ IDNO6氨基酸序列的淀粉樣蛋白β(1-42)。
36.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述熒光素附著于淀粉樣β多肽的氨基末端。
37.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述熒光配體包括s100b。
38.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述熒光配體包括羧甲基賴氨酸(CML)。
39.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述熒光配體包括amphoterin。
40.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述熒光配體包括鈣粒蛋白。
41.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述熒光配體包括分子量低于1000道爾頓的有機小分子。
42.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO4，或與其具有至少90％同一性的序列。
43.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO3，或與其具有至少90％同一性的序列。
44.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO7，或與其具有至少90％同一性的序列。
45.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述多肽連接于第二多肽，或與第二多肽復(fù)合。
46.權(quán)利要求45的系統(tǒng)，其中包括RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述多肽可以與識別RAGE或其片段的抗體復(fù)合。
47.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述目的化合物包括有機小分子。
48.權(quán)利要求47的系統(tǒng)，其中所述有機小分子的分子量低于1000道爾頓。
全文摘要
本發(fā)明公開了使用熒光偏振對具有結(jié)合高級糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)和/或調(diào)節(jié)其活性的能力的化合物進行鑒定的方法和系統(tǒng)。使用本發(fā)明方法和系統(tǒng)鑒定的化合物可包括有機小分子RAGE拮抗劑。使用本發(fā)明方法和系統(tǒng)鑒定的有機小分子RAGE拮抗劑可用來治療RAGE－介導(dǎo)的疾病，例如，包括但不限于糖尿病或阿爾茨海默病。
文檔編號G01N33/542GK1938591SQ200580008732
公開日2007年3月28日 申請日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月18日
發(fā)明者阿德南·M·M·米亞里, 杰弗里·C·韋布斯特 申請人:特蘭斯泰克制藥公司