專利名稱：表征、調(diào)節(jié)、診斷和治療癌癥的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明部分地根據(jù)國(guó)立衛(wèi)生研究所(National Institutes ofHealth)的授權(quán)號(hào)CA075136-06做出。政府擁有本發(fā)明的部分權(quán)利。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及表征、調(diào)節(jié)、診斷和治療癌癥的組合物和方法。例如，本發(fā)明提供了抑制某些類型的癌細(xì)胞(包括乳腺癌細(xì)胞)的腫瘤發(fā)生和預(yù)防轉(zhuǎn)移的組合物和方法。本發(fā)明還提供了鑒定調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的化合物的系統(tǒng)和方法。
背景 癌癥是主要死因之一并且轉(zhuǎn)移癌通常是不可治愈的6。盡管當(dāng)前的治療可以產(chǎn)生腫瘤消退，但是它們很少治愈常見(jiàn)腫瘤，如轉(zhuǎn)移的乳腺癌6。實(shí)體瘤由癌細(xì)胞的異質(zhì)群體組成。像急性髓性白血病(AML)7一樣，最近已經(jīng)闡明在多數(shù)惡性人類乳腺腫瘤中，癌細(xì)胞的小的、特殊的群體富有在免疫缺陷小鼠中形成腫瘤的能力1。以前表明在研究的9種腫瘤的8種中，CD44+CD24-/low譜系-群體當(dāng)注射到免疫缺陷小鼠中時(shí)能夠形成腫瘤。少至200個(gè)的這些稱作“致瘤”細(xì)胞的細(xì)胞始終在小鼠中形成腫瘤。相反，腫瘤中多數(shù)癌細(xì)胞由具有可變表型的“非致瘤”細(xì)胞組成。甚至當(dāng)注射多達(dá)104個(gè)細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞也不能在NOD/SCID小鼠中形成腫瘤1。在一些腫瘤中，通過(guò)分離癌細(xì)胞的ESA+CD44+CD24-/low譜系-群體可以進(jìn)一步富集致瘤細(xì)胞。能夠有希望分離致瘤癌細(xì)胞使得可以研究代表這些細(xì)胞中的治療靶標(biāo)的關(guān)鍵生物學(xué)途徑。本領(lǐng)域需要表征、調(diào)節(jié)、診斷和治療癌癥的額外系統(tǒng)和方法。
附圖描述

圖1顯示了乳腺癌細(xì)胞中的Notch信號(hào)傳導(dǎo)。圖1A顯示了可溶性Delta促進(jìn)集落形成。分選ESA+CD44+CD24-/low譜系-T1致瘤乳腺癌細(xì)胞，并在膠原包被的平板上在僅組織培養(yǎng)基(對(duì)照)、補(bǔ)加Fc對(duì)照片段11(Fc)的培養(yǎng)基或者補(bǔ)加Delta-Fc(Delta)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用可溶性Delta-Fc培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致比對(duì)照細(xì)胞或者僅用對(duì)照Fc片段11處理的細(xì)胞多5倍的集落。圖1B顯示了顯性失活腺病毒載體對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。用在Notch-反應(yīng)性HES-1啟動(dòng)子38的調(diào)節(jié)下的螢光素酶小基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。然后測(cè)量在含有Delta-Fc但沒(méi)有病毒(對(duì)照)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對(duì)照MCF-7細(xì)胞中或者用GFP僅腺病毒(Ad-GFP)或顯性失活腺病毒載體dnMAML1(Ad-GFP-dnMAML1)感染后48小時(shí)的螢光素酶活性。Ad-GFP-dnMAML1腺病毒，而不是Ad-GFP腺病毒，顯著降低了螢光素酶活性。圖1C顯示了Notch受體轉(zhuǎn)錄下調(diào)對(duì)原代腫瘤細(xì)胞的影響。ESA+CD44+CD24-/low譜系-癌細(xì)胞1(T1)或者來(lái)自不同患者的譜系-癌細(xì)胞1(T2-T5)在12孔的膠原包被的組織培養(yǎng)板中分選。細(xì)胞用所示的顯性失活的腺病毒構(gòu)建體或者對(duì)照GFP病毒感染。在感染后48小時(shí)用錐蟲(chóng)藍(lán)排除法來(lái)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。dnMAML1顯著減小T1、T2、T4和T5中的活細(xì)胞數(shù)，而對(duì)T3細(xì)胞具有較小的影響。
圖2顯示了致瘤乳腺癌細(xì)胞中的Notch4信號(hào)傳導(dǎo)。圖2A顯示了Notch途徑報(bào)道基因測(cè)定法的結(jié)果。在從用HES-1/螢光素酶報(bào)道基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞得到的提取物中測(cè)量螢光素酶活性，所述細(xì)胞已經(jīng)用對(duì)照Fc片段(Fc)、可溶性Delta-Fc(+Delta)、可溶性Delta-Fc和抗Notch4多克隆抗體(+N4Ab)或者用可溶性Delta-Fc、抗Notch4多克隆抗體以及制備多克隆抗體時(shí)所針對(duì)的阻斷肽(blockingpeptide)(+Block)溫育?？筃otch4抗體抑制螢光素酶活性，并且該抑制通過(guò)預(yù)溫育阻斷抗體和阻斷肽而部分地逆轉(zhuǎn)。圖2B顯示了乳腺癌細(xì)胞的Notch4表達(dá)。對(duì)在NOD/SCID小鼠中傳代一次的未分選的癌細(xì)胞和致瘤(CD44+CD24-/low譜系-)T1細(xì)胞通過(guò)RT-PCR分析Notch4的表達(dá)。還進(jìn)行RT-PCR來(lái)證實(shí)所用的MCF-7細(xì)胞表達(dá)Notch4 mRNA。圖2C顯示了集落形成。20,000個(gè)T1或者T4癌細(xì)胞在含有Delta-Fc(+Delta)或者僅Fc片段(+Fc)的所示組織培養(yǎng)基中生長(zhǎng)14天。用不補(bǔ)加抗體(+Delta)、補(bǔ)加多克隆抗Notch4抗體(+N4Ab)或者補(bǔ)加抗Notch4抗體加上阻斷肽(+N4Ab+Block)的所示培養(yǎng)基中進(jìn)行一式三份的培養(yǎng)。圖2D顯示了在每種條件下14天后形成的集落的代表性圖像(10倍物鏡)，表格指出了在每個(gè)孔中計(jì)數(shù)的集落數(shù)?？扇苄訢elta-Fc刺激集落形成(p＜0.001)，而多克隆抗Notch4抗體在Delta-Fc存在下抑制集落形成(p＜0.001)。當(dāng)抗體與用于產(chǎn)生抗Notch4抗體的肽預(yù)溫育時(shí)，抗體的抑制效果幾乎被完全逆轉(zhuǎn)(p＜0.001)。結(jié)果是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。圖2E顯示了從第一或者第二代T1腫瘤分離的ESA+CD44+CD24-/low譜系-致瘤細(xì)胞。200個(gè)細(xì)胞在對(duì)照緩沖液中或者與多克隆抗Notch4抗體溫育后注射到小鼠的乳房脂肪墊區(qū)域中。在5個(gè)月內(nèi)監(jiān)視腫瘤形成。結(jié)果來(lái)自2個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
圖3顯示了凋亡的機(jī)理。圖3A顯示了用抗Notch4抗體處理的癌細(xì)胞的生活力。ESA+CD44+CD24-/low譜系-致瘤性腫瘤1(T1)細(xì)胞或者M(jìn)CF-7細(xì)胞用抗Notch4抗體培養(yǎng)48小時(shí)。收獲細(xì)胞并用PI染色，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量生活力。圖3B顯示了抗Notch4抗體對(duì)胱天蛋白酶的激活。ESA+CD44+CD24-/low譜系-致瘤性腫瘤1(T1)細(xì)胞、H2K-腫瘤4(T4)或者腫瘤5(T5)細(xì)胞、或者M(jìn)CF-7細(xì)胞在對(duì)照培養(yǎng)基(-)或者含有抗Notch4抗體的培養(yǎng)基(+)中培養(yǎng)，36小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)使用熒光底物CaspoTagTM測(cè)量活性胱天蛋白酶3/7。暴露于抗Notch4抗體后，與對(duì)照細(xì)胞相比，在T1腫瘤起始性細(xì)胞、T5細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中表達(dá)活化的胱天蛋白酶3/7的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)顯著增加。T4細(xì)胞不顯示出高水平的胱天蛋白酶活化。圖3C和3D顯示出Notch轉(zhuǎn)錄反式激活對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用。野生型MCF-7細(xì)胞、用Bcl.-XL或者顯性失活FADD(dnFADD)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞用dnMAML1或者對(duì)照GFP腺病毒感染。48小時(shí)后，在圖3C中顯示了用dnMAML1 AD感染的活細(xì)胞相對(duì)于用對(duì)照腺病毒感染的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。圖3D顯示了用所示的對(duì)照GFP或者GFP-dnMAML1腺病毒感染的每種細(xì)胞類型的顯微照片(20倍物鏡)。圖3E顯示了MCF-7細(xì)胞系中dnFADD和BCL-XL的表達(dá)水平。進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡以確定親代MCF-7細(xì)胞(MCF-7wt)、用表達(dá)顯性失活FADD的小基因轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞(MCF-7dnFADD)或者用BCL-XL轉(zhuǎn)染的兩種不同克隆(MCF-7-BCL-XL-c1和MCF-7-BCL-XL-c2)對(duì)所示蛋白質(zhì)的表達(dá)。用FLAG-標(biāo)記的BCL-XL轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞用作BCL-XL表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照。dnMAML1顯著減小親代MCF-7細(xì)胞系以及MCF-7/dnFADD細(xì)胞系中的活細(xì)胞數(shù)，而對(duì)兩種MCF-7/BCL-XL細(xì)胞系僅有最小的影響。
圖4顯示了致瘤和非致瘤癌細(xì)胞的分離。用流式細(xì)胞術(shù)分離以前在NOD/SCID小鼠中測(cè)試致瘤性的腫瘤1(a，b，c)或者腫瘤4(d，e，f)的亞群1。用抗ESA、CD44、CD24、譜系標(biāo)記、小鼠-H2K(對(duì)于從小鼠得到的傳代腫瘤)和7AAD的抗體染色細(xì)胞。從所有分析中除去死細(xì)胞(7AAD+)、小鼠細(xì)胞(H2K+)和正常細(xì)胞。每張圖描繪了活的人譜系-癌細(xì)胞的ESA CD24染色圖1。顯示了分選的致瘤(c，f)和非致瘤(b，e)細(xì)胞群體的再次分析?；诳蓹z測(cè)的CD44表達(dá)分離致瘤細(xì)胞(未顯示門(gate))。T4細(xì)胞的ESA-CD24-/lowCD44+譜系-群體具有減小的但是仍存在的致瘤潛力1。
圖5顯示了Notch信號(hào)傳導(dǎo)的腺病毒抑制，顯示了Ad-GFP-dnMAML1病毒構(gòu)建體的描繪。將人MAML1的氨基酸1-302的編碼區(qū)在IRES-GFP基因的上游克隆到MSCVneoEB載體中。然后將dnMAML1-IRES-GFP片段克隆到腺病毒穿梭載體pACCMV2的EcoRI和BamHI位點(diǎn)中。
圖6顯示了證明γ-分泌酶抑制劑對(duì)MCF-7細(xì)胞生活力和Notch受體活化的影響的圖。通過(guò)將顯示出表達(dá)Notch的20,000個(gè)MCF-7細(xì)胞一式三份地在6孔板中培育來(lái)測(cè)定細(xì)胞生活力。48小時(shí)后，向細(xì)胞中加入不同量的γ-分泌酶抑制劑。24小時(shí)后計(jì)數(shù)總的細(xì)胞和錐蟲(chóng)藍(lán)陰性(活)的細(xì)胞并確定％細(xì)胞生活力。用處于HES-1啟動(dòng)子控制下的螢光素酶報(bào)道基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞與如上所述的不同濃度的γ-分泌酶抑制劑在6孔板中共培養(yǎng)。用標(biāo)準(zhǔn)螢光素酶測(cè)定法監(jiān)視HES1啟動(dòng)子的反式激活或者抑制。γ-分泌酶抑制劑明顯抑制Notch受體的表達(dá)并且顯著減小細(xì)胞的生活力。這些結(jié)果證明γ-分泌酶抑制劑可以用于抑制致瘤癌細(xì)胞中的Notch。
圖7顯示了用或者不用γ-分泌酶抑制劑處理的培養(yǎng)的癌細(xì)胞的活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的圖。
定義 為了方便理解本發(fā)明，下面定義許多術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ) 本文所用術(shù)語(yǔ)“抗癌劑”、“常規(guī)抗癌劑”、或者“癌癥治療藥物”是指用于癌癥治療(例如，哺乳動(dòng)物中)的任何治療劑(例如，化學(xué)治療化合物和/和分子治療化合物)、放射療法或者外科手術(shù)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“藥物”和“化學(xué)治療劑”是指用于診斷、治療或者預(yù)防生理系統(tǒng)(例如，受試者，或者體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織和器官)中疾病或者生理狀況的藥理學(xué)活性分子。藥物通過(guò)改變已經(jīng)施用該藥物的活生物體、組織、細(xì)胞或者體外系統(tǒng)的生理發(fā)揮作用。希望術(shù)語(yǔ)“藥物”和“化學(xué)治療劑”包括抗超增殖和抗腫瘤化合物以及其他生物學(xué)治療化合物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“前體藥物”是指親本“藥物”分子的藥學(xué)無(wú)活性衍生物，其需要在目標(biāo)生理系統(tǒng)中生物轉(zhuǎn)化(例如，自發(fā)或者酶促的)以釋放，或者將“前體藥物”轉(zhuǎn)化(例如，酶促地、機(jī)械地、電磁地等等)成活性“藥物”。設(shè)計(jì)“前體藥物”用來(lái)克服與穩(wěn)定性、毒性、缺少特異性或者受限的生物利用率有關(guān)的問(wèn)題。示例性“前體藥物”包括活性“藥物”分子自身和化學(xué)掩蔽基團(tuán)(例如，可逆抑制“藥物”的活性的基團(tuán))。一些優(yōu)選的“前體藥物”是化合物的變體或者衍生物，其具有在代謝條件下可切割的基團(tuán)。示例性“前體藥物”當(dāng)在生理?xiàng)l件下經(jīng)歷溶劑解離或者經(jīng)歷酶促降解或者其他生物化學(xué)轉(zhuǎn)化(例如，磷酸化、氫化、脫氫、糖基化等等)時(shí)，在體內(nèi)或者體外變成藥學(xué)活性的。前體藥物通常提供了在哺乳動(dòng)物生物體中溶解性、組織相容性或者延遲釋放的優(yōu)點(diǎn)(見(jiàn)，例如，Bundgard，Design of Prodrugs，pp.7-9，21-24，Elsevier，Amsterdam(1985)；和Silverman，TheOrganic Chemistry of Drug Design and Drug Action，pp.352-401，Academic Press，San Diego，CA(1992))。常見(jiàn)的“前體藥物”包括酸衍生物，如通過(guò)親本酸與合適的醇(例如，低級(jí)鏈烷醇)反應(yīng)制備的酸酯，通過(guò)親本酸化合物與胺(例如，如上述)制備的酰胺，或者與堿性基團(tuán)反應(yīng)形成酰化堿衍生物(例如，低級(jí)烷基酰胺)。
“有效量”是足夠?qū)崿F(xiàn)有益的或者所希望的結(jié)果的量?？梢栽谝淮位蛘叨啻问┯弥惺┯糜行Я俊?br> 本文所用的術(shù)語(yǔ)“施用”是指對(duì)生理系統(tǒng)(例如，受試者，或者體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織和器官)給予藥物、前體藥物或者其他藥劑或者治療性處理的動(dòng)作。對(duì)人體施用的示例性途徑可以通過(guò)眼(眼的)、嘴(口的)、皮膚(經(jīng)皮的)、鼻(鼻的)、肺(吸入的)、口粘膜(頰的)、耳，通過(guò)注射(例如，靜脈內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)等等)等等。
“共同施用”是指對(duì)生理系統(tǒng)(例如，受試者，或者體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織和器官)施用一種以上的化學(xué)劑或者治療性處理(例如，放射療法)。各個(gè)化學(xué)劑和治療性處理(例如，放射療法)的“共同施用”可以是同時(shí)的、或者以任何時(shí)間順序或者物理組合。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物利用率”是指對(duì)生理系統(tǒng)(例如，受試者，或者體內(nèi)、體外或離體細(xì)胞、組織和器官)施用后治療劑被吸收到生物靶標(biāo)流體(例如，血液、細(xì)胞質(zhì)、CNS液等等)、組織、細(xì)胞器或者細(xì)胞間隙中的能力的任何量度。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物分布”是指藥劑在施用于生理系統(tǒng)后在細(xì)胞器、細(xì)胞(體內(nèi)或體外)、組織、器官或者生物體中的定位。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“超增殖性疾病”是指任何這樣的狀況，即其中動(dòng)物中增殖細(xì)胞的局限性群體(localized population)不受通常正常生長(zhǎng)限制的控制。超增殖性病癥的實(shí)例包括腫瘤、贅生物、淋巴瘤等等。贅生物如果不經(jīng)歷侵入或者轉(zhuǎn)移就是良性的，如果經(jīng)歷侵入或者轉(zhuǎn)移就是惡性的?！稗D(zhuǎn)移的”細(xì)胞或者組織表示細(xì)胞可以侵入和破壞周圍的身體結(jié)構(gòu)。超常增生是一種形式的細(xì)胞增殖，其包括組織或者器官中細(xì)胞數(shù)增加而不顯著改變結(jié)構(gòu)或者功能。組織轉(zhuǎn)化是一種形式的受控的細(xì)胞生長(zhǎng)，其中一種類型的完全分化的細(xì)胞取代另一類型的分化的細(xì)胞。組織轉(zhuǎn)化可以在上皮或者結(jié)締組織細(xì)胞中發(fā)生。典型的組織轉(zhuǎn)化涉及有點(diǎn)無(wú)序地組織轉(zhuǎn)化的上皮。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤性疾病”是指良性(非癌性)或者惡性(癌性)的細(xì)胞或者組織的任何異常生長(zhǎng)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗腫瘤劑”指阻礙靶定的(例如，惡性)贅生物的增生、生長(zhǎng)或者擴(kuò)散的任何化合物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“消退”指與基礎(chǔ)的不致病的代表性受試者、細(xì)胞、組織或者器官相比，患病的受試者、細(xì)胞、組織或者器官返回到非病理的或者較小病理的狀態(tài)。例如，腫瘤的消退包括腫瘤質(zhì)量的減小以及一個(gè)或多個(gè)腫瘤的完全消失。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“防止”指減小受試者中超增殖性或者腫瘤性細(xì)胞的發(fā)生。防止可以是完全的，例如，受試者中完全不存在超增殖性或者腫瘤性細(xì)胞。防止還可以是部分的，從而受試者中超增殖性或者腫瘤性細(xì)胞的發(fā)生率小于不用本發(fā)明時(shí)出現(xiàn)的發(fā)生率。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“體外”指人工環(huán)境和在人工環(huán)境內(nèi)發(fā)生的過(guò)程或者反應(yīng)。體外環(huán)境可以由但是不限于試管和細(xì)胞培養(yǎng)物組成。術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)”指天然環(huán)境(例如，動(dòng)物或者細(xì)胞)和在天然環(huán)境內(nèi)發(fā)生的過(guò)程或者反應(yīng)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)物”指細(xì)胞的任何體外培養(yǎng)物。該術(shù)語(yǔ)包括連續(xù)細(xì)胞系(例如，具有永生表型)、原代細(xì)胞培養(yǎng)物、有限細(xì)胞系(例如，非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)，和體外保持的任何其他細(xì)胞群體，包括卵母細(xì)胞和胚胎。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“受試者”指將通過(guò)本發(fā)明的方法治療的生物。這樣的生物包括但不限于，人和獸醫(yī)學(xué)動(dòng)物(狗、貓、馬、豬、牛、綿羊、山羊等等)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“受試者”一般指將接受或者已經(jīng)接受治療的個(gè)體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“診斷的”指通過(guò)疾病的病征和癥狀或者基因分析、病理學(xué)分析、組織學(xué)分析等等對(duì)疾病的識(shí)別。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合”用于關(guān)于第一種分子，其具有結(jié)合與第二種分子所結(jié)合的相同的靶標(biāo)的活性。第一種分子的結(jié)合效率(例如，動(dòng)力學(xué)或者熱力學(xué))可以與第二種分子的靶標(biāo)結(jié)合效率相同或者更大或者更小。例如，兩種分子的結(jié)合靶標(biāo)的平衡結(jié)合常數(shù)(Kd)可以不同。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“反義”用于涉及與特定RNA序列(例如，mRNA)互補(bǔ)的核酸序列(例如，RNA、硫代磷酸DNA)。該定義包括天然或者合成的反義RNA分子，包括調(diào)節(jié)基因表達(dá)的分子，如小干擾RNA或者微型RNA。
術(shù)語(yǔ)“受試化合物”指任意化學(xué)實(shí)體、藥物、藥品等等，其可以用于治療或者預(yù)防疾病、病、病狀或者身體功能的紊亂，或者改變樣品的生理或者細(xì)胞狀態(tài)。受試化合物包含已知的和潛在的治療化合物。通過(guò)使用本發(fā)明的篩選方法可以確定受試化合物是治療劑?！耙阎闹委熁衔铩敝敢呀?jīng)證明(例如，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)或者先前施用于人的實(shí)驗(yàn))在此類治療或者預(yù)防中有效的治療化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，“受試化合物”是抗癌劑。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，“受試化合物”是在細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的抗癌劑。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“純化的”或者“純化”是指從樣品中除去不希望的組分。本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本純化的”指從它們的天然環(huán)境中取出、分離或分開(kāi)的，并且至少60％無(wú)，優(yōu)選至少75％無(wú)，最優(yōu)選至少90％無(wú)與它們天然結(jié)合的其他組分的分子(例如，多核苷酸、多肽、化合物)。例如，“分離的多核苷酸”因此是基本上純化的多核苷酸。
本文所用的“核酸序列”和“核苷酸序列”指寡核苷酸或者多核苷酸，和其片段或者部分，以及基因組或者合成來(lái)源的DNA或者RNA，它們可以是單鏈或者雙鏈的，并且代表有義或者反義鏈。本文所用的術(shù)語(yǔ)“編碼…的核酸分子”、“編碼…的DNA序列”、“編碼…的DNA”、“編碼…的RNA序列”和“編碼…的RNA”指沿著脫氧核糖核酸或者核糖核酸的鏈的脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的順序或者序列。這些脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的順序決定了沿著從mRNA翻譯的多肽(蛋白質(zhì))鏈的氨基酸的順序。從而DNA或者RNA序列編碼氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)“基因”指包含產(chǎn)生多肽或者前體(例如，胰島素原)所必需的編碼序列的核酸(例如，DNA或者RNA)序列。多肽可以由全長(zhǎng)編碼序列或者由編碼序列的任意部分編碼，只要保留全長(zhǎng)或者片段的所希望的活性或者功能性質(zhì)(例如，酶促活性、配體結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，等等)。該術(shù)語(yǔ)還包括結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)，和包括在5’和3’末端與編碼區(qū)以在任一端距離約1kb或以上相鄰近的序列，從而該基因?qū)?yīng)于全長(zhǎng)mRNA的長(zhǎng)度。位于編碼區(qū)的5’并且存在于mRNA上的序列稱作5’非翻譯序列。位于編碼區(qū)的3’或者下游并且存在于mRNA上的序列稱作3’非翻譯序列。術(shù)語(yǔ)“基因”包括基因的cDNA和基因組形式?；虻幕蚪M形式或者克隆含有用稱作“內(nèi)含子”或者“間插區(qū)”或者“間插序列”的非編碼區(qū)中斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄成核RNA(hnRNA)的基因區(qū)段；內(nèi)含子可以含有調(diào)節(jié)元件，如增強(qiáng)子。內(nèi)含子從核或者原始轉(zhuǎn)錄物中除去或“剪接去除”；因此內(nèi)含子不存在于信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中。mRNA在翻譯中所起的作用是規(guī)定新生多肽中的氨基酸序列或者順序。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“外源基因”指不天然存在于宿主生物或者細(xì)胞中，或者人工導(dǎo)入宿主生物或者細(xì)胞中的基因。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”指任何遺傳元件，如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病毒、病毒體等等，其當(dāng)結(jié)合適當(dāng)?shù)目刂圃r(shí)能夠復(fù)制并且可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移基因序列。從而，該術(shù)語(yǔ)包括克隆和表達(dá)載體，以及病毒載體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)”指通過(guò)基因的“轉(zhuǎn)錄”(即，通過(guò)RNA聚合酶的酶促作用)將基因中編碼的遺傳信息轉(zhuǎn)化成RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或者snRNA)的過(guò)程，或者對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的基因，通過(guò)mRNA的“翻譯”將基因中編碼的遺傳信息轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)的過(guò)程?；虮磉_(dá)可以在該過(guò)程中許多階段上受到調(diào)節(jié)?！吧险{(diào)”或者“激活”指增加基因表達(dá)產(chǎn)物(即，RNA或者蛋白質(zhì))的產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，而“下調(diào)”或者“阻抑”指減少產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。參與上調(diào)和下調(diào)的分子(例如，轉(zhuǎn)錄因子)通常分別稱作“激活劑”和“阻抑物”。
本文所用術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合蛋白”指結(jié)合特定抗原的蛋白質(zhì)?！翱乖Y(jié)合蛋白”包括但不限于，免疫球蛋白，包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、和人源化抗體、Fab片段、F(ab’)2片段和Fab表達(dá)文庫(kù)。本領(lǐng)域已知的多種方法可以用于產(chǎn)生多克隆抗體。為了產(chǎn)生抗體，通過(guò)注射對(duì)應(yīng)于所希望的表位的肽可以免疫多種宿主動(dòng)物，包括，但不限于，兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，肽綴合到免疫原性載體(例如，白喉類毒素、牛血清白蛋白(BSA)、或者匙孔血藍(lán)蛋白(KLH))。多種佐劑用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，取決于宿主種類，包括，但不限于，弗氏佐劑(完全和不完全弗氏佐劑)，礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚陰離子，肽，油乳液，匙孔血藍(lán)蛋白，二硝基苯酚，和可能有用的人類佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium paryum)。
為了制備單克隆抗體，可以使用在培養(yǎng)物中由連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)(見(jiàn)，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。這些技術(shù)包括，但不限于，最初由Khler和Milstein研發(fā)的雜交瘤技術(shù)(Khler和Milstein，Nature，256495-497(1975))，以及三源雜交瘤(trioma)技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(見(jiàn)，例如，Kozbor等人，Immunol.Today，472(1983))，和用以產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))。
根據(jù)本發(fā)明，為產(chǎn)生單鏈抗體描述的技術(shù)(U.S.4,946,778；這里引入作為參考)可以適用于產(chǎn)生所希望的特異單鏈抗體。本發(fā)明的一個(gè)額外實(shí)施方案使用本領(lǐng)域已知的用于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)的技術(shù)(Huse等人，Science，2461275-1281(1989))以快速和容易地鑒定具有所希望的特異性的單克隆Fab片段。
可以通過(guò)已知技術(shù)產(chǎn)生含有抗體分子的獨(dú)特型(抗原結(jié)合區(qū))的抗體片段。例如，此類片段包括，但不限于通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子可以產(chǎn)生的F(ab’)2片段；通過(guò)還原F(ab’)2片段的二硫鍵可以產(chǎn)生的Fab’片段；和通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子可以產(chǎn)生的Fab片段。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法分離編碼抗原結(jié)合蛋白的基因。在抗體的產(chǎn)生中，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)完成所希望抗體的篩選，所述技術(shù)為例如放射免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、“夾層”免疫測(cè)定、免疫放射分析、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、原位免疫測(cè)定(使用例如，膠體金、酶或者放射性同位素標(biāo)記)、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測(cè)定(例如，凝膠凝集測(cè)定、血細(xì)胞凝集測(cè)定等等)、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定、免疫熒光測(cè)定、蛋白A測(cè)定和免疫電泳測(cè)定，等等。
本文所用術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”指化合物影響(例如，促進(jìn)或者阻礙)細(xì)胞功能的一方面的活性，所述細(xì)胞功能包括，但不限于，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵入、血管發(fā)生、凋亡，等等。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及表征、調(diào)節(jié)、診斷和治療癌癥的組合物和方法。例如，本發(fā)明提供了抑制某些類型的癌細(xì)胞(包括乳腺癌細(xì)胞)的腫瘤發(fā)生和防止轉(zhuǎn)移的組合物和方法。本發(fā)明還提供了用于鑒定調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的化合物的系統(tǒng)和方法。
例如，本發(fā)明提供了用于鑒定腫瘤樣品中致瘤細(xì)胞的存在的研究和臨床診斷方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括檢測(cè)致瘤細(xì)胞特征性的一種或多種(例如，2，3，4…)標(biāo)記或者性質(zhì)(例如，不是非致瘤細(xì)胞特征性的一種或多種標(biāo)記或者性質(zhì))。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種標(biāo)記包括，但不限于，Notch4的表達(dá)、暴露于抗Notch4抗體時(shí)細(xì)胞死亡、Manic Fringe的表達(dá)、Notch配體Delta相對(duì)于所述非致瘤細(xì)胞改變的表達(dá)、Jagged的表達(dá)、和暴露于顯性失活腺病毒載體dnMAML1時(shí)細(xì)胞死亡。盡管本發(fā)明不被細(xì)胞的特性限定，但是在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞來(lái)自乳腺癌腫瘤。
在一些實(shí)施方案中，致瘤細(xì)胞的鑒定用于為受試者選擇治療行動(dòng)過(guò)程。例如，在一些實(shí)施方案中，治療行動(dòng)過(guò)程包括對(duì)受試者施用Notch4途徑抑制劑。在其他實(shí)施方案中，治療行動(dòng)過(guò)程包括施用啟動(dòng)線粒體凋亡的藥物(例如，Bak和Bax的調(diào)節(jié)劑、Bcl-2和BclXL的調(diào)節(jié)劑、電子轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)劑——見(jiàn)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030119029，這里完整引入作為參考，等等)。在一些實(shí)施方案中，治療行動(dòng)過(guò)程包括對(duì)所述受試者施用γ-分泌酶抑制劑。γ-分泌酶抑制劑包括，但不限于，美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)20030216380、20030135044、20030114387、20030100512、20030055005、20020013315和美國(guó)專利號(hào)6,448,229(將這些專利都完整引入本文作為參考)中描述的那些，以及通過(guò)商業(yè)途徑可獲得的抑制劑(例如，從Calbiochem)。在一些實(shí)施方案中，治療行動(dòng)過(guò)程包括對(duì)所述受試者施用Manic Fringe抑制劑。Manic Fringe抑制劑包括，但不限于，抗Manic Fringe抗體、靶定Manic Fringe表達(dá)的siRNA分子、抑制Manic Fringe的小分子等等。
本發(fā)明還提供了選擇或者表征化合物(例如，用于基礎(chǔ)研究、藥物篩選、藥物試驗(yàn)、監(jiān)測(cè)治療等等)的方法，其包括步驟a)提供包含致瘤細(xì)胞(例如，乳腺細(xì)胞)的樣品；b)將樣品暴露于受試化合物；和c)檢測(cè)細(xì)胞中響應(yīng)受試化合物而發(fā)生的改變。在一些實(shí)施方案中，受試化合物包含抗體(例如，調(diào)節(jié)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抗體)。在一些實(shí)施方案中，該化合物包含抗腫瘤化合物。在一些實(shí)施方案中，共同施用另一種或者額外的化合物(例如，已知的抗腫瘤性治療化合物)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包括檢測(cè)所述致瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡(例如，檢測(cè)凋亡標(biāo)記，如胱天蛋白酶，等等)。
本發(fā)明還提供了鑒定具有致瘤細(xì)胞的受試者和基于所鑒定的致瘤細(xì)胞的特性用合適的治療行動(dòng)過(guò)程治療受試者的方法。例如，本發(fā)明提供了治療具有致瘤細(xì)胞(例如，乳腺細(xì)胞)的受試者的方法，其包括步驟a)鑒定受試者中致瘤乳腺細(xì)胞的存在；b)鑒定致瘤細(xì)胞特征性的一種或多種標(biāo)記或者性質(zhì)以鑒定致瘤細(xì)胞的特性；和c)基于致瘤細(xì)胞的特性選擇治療行動(dòng)過(guò)程。在一些實(shí)施方案中，行動(dòng)的過(guò)程包括當(dāng)致瘤細(xì)胞的特征是表達(dá)Notch4，或者例如當(dāng)致瘤細(xì)胞不表達(dá)Notch4而是鄰近的非致瘤細(xì)胞表達(dá)Notch4時(shí)，對(duì)受試者施用Notch4途徑抑制劑或者其他合適的治療劑。在一些實(shí)施方案中，行動(dòng)的過(guò)程包括從受試者手術(shù)除去腫瘤和對(duì)受試者施用Notch4途徑抑制劑或者其他合適的治療化合物(例如，以預(yù)防腫瘤發(fā)生或者由剩余的致瘤細(xì)胞導(dǎo)致的轉(zhuǎn)移)。在一些實(shí)施方案中，行動(dòng)的過(guò)程包括對(duì)受試者共同施用Notch4途徑抑制劑或者其他合適的治療化合物和另一種抗腫瘤劑。
本發(fā)明還提供了例如，預(yù)防或者減少轉(zhuǎn)移的方法，其包括步驟對(duì)懷疑具有轉(zhuǎn)移(例如，懷疑經(jīng)歷轉(zhuǎn)移或者有轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn))的受試者施用Notch途徑抑制劑或者其他合適的治療化合物。在一些實(shí)施方案中，Notch途徑抑制劑包括抗Notch4抗體。在一些實(shí)施方案中，所述化合物包含啟動(dòng)線粒體凋亡的藥物。在一些實(shí)施方案中，所述化合物是γ-分泌酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述施用結(jié)合從受試者除去實(shí)體瘤(例如，乳腺腫瘤)進(jìn)行。
本發(fā)明還提供了減小或者清除癌癥(例如，乳腺癌)受試者中致瘤細(xì)胞的方法，其包括對(duì)受試者施用γ-分泌酶抑制劑(例如，處于使得致瘤細(xì)胞被殺死或者抑制而不能增殖或者導(dǎo)致轉(zhuǎn)移這樣的條件下)。
本發(fā)明還提供了減少或者清除癌癥(例如，乳腺癌)受試者中致瘤細(xì)胞的方法，其包括對(duì)受試者施用Manic Fringe抑制劑(例如，處于使得致瘤細(xì)胞被殺死或者抑制而不能增殖或者導(dǎo)致轉(zhuǎn)移這樣的條件下)。
發(fā)明詳述 實(shí)體瘤由癌細(xì)胞的異質(zhì)群體組成，所述癌細(xì)胞形成新腫瘤的能力不同。能夠形成腫瘤的癌細(xì)胞(即，致瘤癌細(xì)胞)和缺乏該能力的癌細(xì)胞(即，非致瘤癌細(xì)胞)可以基于表型區(qū)別1。因?yàn)橹铝霭┘?xì)胞和正常干細(xì)胞都有通過(guò)自我更新過(guò)程而自身復(fù)制的基本能力，所以在本發(fā)明的研發(fā)期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究了致瘤癌細(xì)胞中潛在的自我更新途徑以便允許表征和鑒定致瘤癌細(xì)胞，提供篩選癌癥治療劑的系統(tǒng)，和提供治療靶標(biāo)和針對(duì)那些靶標(biāo)的化合物。
從而，本發(fā)明涉及表征、調(diào)節(jié)、診斷和治療癌癥的組合物和方法。例如，本發(fā)明提供了抑制某些類型的癌細(xì)胞(包括乳腺癌細(xì)胞)的腫瘤發(fā)生和預(yù)防轉(zhuǎn)移的組合物和方法。本發(fā)明還提供了鑒定調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的化合物的系統(tǒng)和方法。
例如，本發(fā)明提供了鑒定致瘤細(xì)胞和診斷與致瘤細(xì)胞的存在有關(guān)的疾病(例如，超增殖性疾病)或者生物學(xué)事件(例如，腫瘤轉(zhuǎn)移)的方法。具體地，本發(fā)明鑒定了癌癥內(nèi)具有致瘤性的細(xì)胞的類別，并提供了這樣的細(xì)胞的可檢測(cè)的特征，從而例如在選擇是否將受試者進(jìn)行醫(yī)學(xué)介入、選擇合適的治療行動(dòng)過(guò)程、監(jiān)視治療行動(dòng)過(guò)程的成功或者進(jìn)展(例如，在藥物試驗(yàn)中或者在選擇個(gè)體化的正在進(jìn)行的治療中)、或者篩選新的治療化合物或治療靶標(biāo)之中確定它們的存在。
本發(fā)明還提供了治療組合物和方法。具體地，本發(fā)明鑒定了生物學(xué)靶標(biāo)和調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的那些生物學(xué)靶標(biāo)的調(diào)節(jié)劑。此類治療方法可以例如，單獨(dú)地或者與其他治療行動(dòng)過(guò)程組合(例如，共同施用其他抗腫瘤劑)或者與診斷過(guò)程組合(例如，通過(guò)本發(fā)明的診斷方法鑒定對(duì)本發(fā)明的治療方法順從的患者)使用。
本發(fā)明還提供了鑒定致瘤細(xì)胞表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)的系統(tǒng)和方法，以鑒定功能對(duì)腫瘤發(fā)生必需的蛋白質(zhì)、提供新的藥物靶標(biāo)。
在一些實(shí)施方案中，Notch蛋白質(zhì)和/或Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)劑的表達(dá)用于鑒定致瘤細(xì)胞。Notch蛋白質(zhì)和/或Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)劑還用于研究、藥物篩選和治療方法。例如，Notch表達(dá)或者功能(例如，Notch4)的抑制劑用于預(yù)防或者減少細(xì)胞增殖，超增殖性疾病發(fā)生或者進(jìn)展，和癌癥轉(zhuǎn)移。在一些實(shí)施方案中，除去實(shí)體瘤腫塊后利用抑制劑來(lái)幫助減少剩余的超增殖性細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。例如，在本文中表明非致瘤細(xì)胞(例如，可以在實(shí)體瘤腫塊的切除中除去的細(xì)胞)表達(dá)防止鄰近細(xì)胞經(jīng)歷增殖的因子。從而，腫瘤去除后適宜的治療介入提供了該功能的替代，抑制剩余致瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明不限于特定類型的致瘤細(xì)胞類型，本發(fā)明也不受到用于調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的化合物或者因子的特性的限制。從而，盡管下面用乳腺癌細(xì)胞以及腫瘤發(fā)生的抗體和腺病毒抑制劑來(lái)闡明本發(fā)明，但是技術(shù)人員將明白本發(fā)明不限于這些闡明性實(shí)施例。例如，預(yù)期多種腫瘤性狀況從本發(fā)明的教導(dǎo)受益，所述狀況包括但不限于，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、腎母細(xì)胞瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、硬腦膜肉瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤，和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。
同樣，本發(fā)明設(shè)想多種藥劑調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的用途，所述藥劑包括抗體、蛋白質(zhì)、肽、反義寡核苷酸(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)6,379,925，描述了Notch4反義寡核苷酸，本文完整引用作為參考)，包括小干擾RNA分子、小分子藥物，等等。
Notch途徑對(duì)于生殖細(xì)胞的和多種正常的干細(xì)胞的維持是重要的2，3，Notch突變導(dǎo)致小鼠中的乳腺癌4，5。本發(fā)明證明在一亞類癌癥(例如，人乳腺癌)中，Notch激動(dòng)劑Delta提供了致瘤性乳腺癌細(xì)胞的存活信號(hào)，允許它們?cè)隗w外形成集落。
Notch信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑(如Numb和Numb-樣；或者阻斷Notch活化的抗體或者小分子)可以用于本發(fā)明的方法中以抑制致瘤細(xì)胞。以這種方式，Notch途徑受到修飾而殺死致瘤細(xì)胞或者抑制致瘤細(xì)胞的增殖。例如，識(shí)別Notch4的抗體阻斷體外和體內(nèi)乳腺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利公布號(hào)20020119565，這里將其完整引入本文作為參考)，并且在這里發(fā)現(xiàn)用于例如，預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移(例如，在實(shí)體瘤去除后)。此外，如圖6和下面的實(shí)施例章節(jié)所示，γ-分泌酶抑制劑的施用可以用于處理致瘤細(xì)胞，表明以不直接靶定Notch4的方式對(duì)Notch途徑的抑制同樣也可用于本發(fā)明的方法中。同樣地，如圖5中所示，顯性失活的Mastermindlike-1腺病毒(dnMAML1Ad)(一種Notch轉(zhuǎn)錄激活的抑制劑)的施用可以用于處理致瘤細(xì)胞。
相反，以前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用可溶性Delta(Han等人，Blood 95(5)161625(2000))(一種Notch配體)刺激Notch會(huì)促進(jìn)體外腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。從而，以前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Notch途徑的刺激促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。
在本發(fā)明的研發(fā)期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，分別在來(lái)自測(cè)試的5個(gè)腫瘤的5個(gè)和3個(gè)腫瘤的2個(gè)之中的癌細(xì)胞中，顯性失活的Notch抑制劑或者抗Notch4的阻斷抗體對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)的抑制通過(guò)線粒體死亡途徑誘導(dǎo)凋亡。在一些情況中，致瘤和非致瘤癌細(xì)胞在它們的Notch、Notch配體和Notch修飾因子的Fringe家族成員的表達(dá)方面不同。在致瘤癌細(xì)胞不受到抗Notch4抗體的影響的腫瘤中，在非致瘤癌細(xì)胞中而不是在致瘤癌細(xì)胞中檢測(cè)到Notch4表達(dá)。從而，實(shí)驗(yàn)表明在乳腺癌的一些病例中，Notch信號(hào)傳導(dǎo)可以調(diào)節(jié)致瘤性亞類的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且致瘤和非致瘤癌細(xì)胞差別表達(dá)該信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分。這些結(jié)果表明致瘤癌細(xì)胞的預(yù)期鑒定使得可以鑒定能影響這些細(xì)胞的關(guān)鍵功能的因子。因?yàn)樵搧喨候?qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生，所以這些細(xì)胞中靶標(biāo)的鑒定提供了更有效的癌癥療法。
觀察到腫瘤含有小群的具有通常的細(xì)胞表面表型的致瘤細(xì)胞，該觀察對(duì)于理解實(shí)體瘤生物學(xué)和開(kāi)發(fā)有效的癌癥療法有重要的提示36。當(dāng)前的癌癥治療不能治愈轉(zhuǎn)移疾病可能是由于不能有效殺死致瘤細(xì)胞。如果致瘤細(xì)胞不能被藥劑全部殺死，那么腫瘤可能消退但是剩余的致瘤細(xì)胞將推動(dòng)腫瘤復(fù)發(fā)。通過(guò)集中于致瘤群體，可以鑒定與癌細(xì)胞的致瘤群體中基本的生物功能，如自我更新和存活有關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。通過(guò)從兩名不同受試者得到的腫瘤樣品T1和T4闡明了致瘤細(xì)胞的預(yù)期鑒定對(duì)于鑒定可以更有效地治療乳腺癌的潛在治療靶標(biāo)的重要性。盡管當(dāng)Notch信號(hào)傳導(dǎo)受到dnMAML1腺病毒抑制時(shí)兩個(gè)腫瘤都死亡并且兩個(gè)腫瘤都表達(dá)Notch4，但是當(dāng)暴露于抗Notch4抗體時(shí)，僅T1克隆發(fā)生細(xì)胞死亡。這可以通過(guò)如下觀察來(lái)解釋T2致瘤細(xì)胞表達(dá)Notch4，但是在表達(dá)Notch1和Notch2的致瘤T4細(xì)胞中不能檢測(cè)到Notch4的表達(dá)。觀察到Notch配體在致瘤癌細(xì)胞中以低水平表達(dá)對(duì)腫瘤生物學(xué)有提示。長(zhǎng)久以來(lái)假設(shè)基質(zhì)細(xì)胞-癌細(xì)胞相互作用可能在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起重要作用(37中的綜述)。因?yàn)镹otch活化促進(jìn)克隆發(fā)生細(xì)胞的生長(zhǎng)，所以特定組織中細(xì)胞對(duì)Notch配體的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤向該特定部位的擴(kuò)散。
以前報(bào)導(dǎo)Notch受體的活化與乳腺癌有關(guān)，并且Notch信號(hào)傳導(dǎo)在用活化的Ras癌基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中起作用，但是它在新生人乳腺癌中的作用是未知的17-20。在本發(fā)明的研發(fā)期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)通過(guò)將培養(yǎng)的細(xì)胞暴露于可溶形式的Notch配體Delta，Delta-Fc，測(cè)試了從患者分離的人乳腺癌細(xì)胞(稱作T1(腫瘤1))中Notch活化的影響?？扇艿腄elta將培養(yǎng)的未分級(jí)的T1癌細(xì)胞形成的集落數(shù)目增加了5倍(圖1a)。接著，通過(guò)用顯性失活的Mastermindlike-121-24腺病毒(dnMAML1Ad，圖5)(一種Notch轉(zhuǎn)錄活化抑制劑)感染細(xì)胞，測(cè)試了Notch信號(hào)傳導(dǎo)的抑制對(duì)從T1分離的致瘤細(xì)胞的能力的影響(圖1b)。感染后2天，dnMAML1Ad而不是對(duì)照腺病毒載體導(dǎo)致活的T1致瘤癌細(xì)胞或來(lái)自測(cè)試的其他患者的所有4個(gè)腫瘤(稱作T2-T5)的克隆生成乳腺癌細(xì)胞減少18％-45％(圖1c)。這些數(shù)據(jù)表明Notch活化促進(jìn)了測(cè)試的所有5個(gè)新生腫瘤中的克隆生成癌細(xì)胞的存活或者增殖。
檢查了Notch4在人乳腺癌中的潛在作用。在所檢查的5個(gè)腫瘤的4個(gè)中檢測(cè)到Notch4表達(dá)，包括T1和T4(表1)。
表1.定量RT-PCR基因表達(dá)分析 在抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)的針對(duì)Notch4的多克隆抗體的存在下培養(yǎng)T1癌細(xì)胞(圖2a)。當(dāng)表達(dá)Notch4的T1癌細(xì)胞(表1，圖2b)在體外暴露于該抗體時(shí)，集落形成受到顯著抑制(圖2c，d)。通過(guò)該抗體與Notch4肽的預(yù)溫育幾乎完全消除該抑制，其中針對(duì)所述Notch4產(chǎn)生所述抗體，證明了抗Notch4抗體的特異性(圖2c，d)。另一方面，T4癌細(xì)胞的集落形成不受到抗Notch4抗體的影響(圖2c)。使用定量RT-PCR，可以檢測(cè)T1和T4非致瘤癌細(xì)胞1中Notch4的表達(dá)(表1)。然而，當(dāng)測(cè)試T1和T4致瘤細(xì)胞時(shí)，在T1致瘤癌細(xì)胞中檢測(cè)到Notch4表達(dá)，而T4致瘤細(xì)胞表達(dá)Notch1和Notch2，而不表達(dá)Notch4(表1)。這些數(shù)據(jù)解釋了如下觀察來(lái)自兩種腫瘤的克隆生成細(xì)胞當(dāng)用dnMAML1腺病毒感染時(shí)死亡(圖1c)，但是僅僅T1克隆生成細(xì)胞受到抗Notch4抗體的影響(圖2c)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)測(cè)試了抗Notch4抗體是否抑制體內(nèi)致瘤性T1癌細(xì)胞的腫瘤形成。少至200個(gè)T1致瘤癌細(xì)胞能夠始終在NOD/SCID小鼠中形成腫瘤1。因此，將200個(gè)T1致瘤癌細(xì)胞與對(duì)照緩沖液或者抗Notch4抗體溫育，然后注射到小鼠中。未處理的細(xì)胞的9次注射中的7次和處理的細(xì)胞的9次注射中的0次形成腫瘤(圖2e)。較大數(shù)目的經(jīng)抗體處理的細(xì)胞的腫瘤形成相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞被延遲。
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究了抗Notch4抗體抑制該腫瘤中以及從另外患者分離的腫瘤細(xì)胞中的癌細(xì)胞的增殖。已經(jīng)證明Notch刺激在某些情況下促進(jìn)細(xì)胞增殖，在其他情況下抑制增殖，并且在其他情況下促進(jìn)細(xì)胞存活13，25，26。為了區(qū)分這些可能性，測(cè)量在用抗Notch4抗體培養(yǎng)的細(xì)胞中的生活力。暴露于抗體2天后，T1克隆生成癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡顯著增加，但是T4克隆生成癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡不顯著增加(圖3a，3b)。有足夠的T1、T4和T5腫瘤細(xì)胞用于進(jìn)一步分析來(lái)確定Notch4信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)理。從T1分離到的克隆生成癌細(xì)胞暴露于抗Notch4阻斷抗體導(dǎo)致T1致瘤癌細(xì)胞的積累，所述細(xì)胞具有凋亡的降解的DNA特征(圖3a)。與對(duì)照培養(yǎng)物比較，抗體暴露后36小時(shí)，在T1和T5克隆生成癌細(xì)胞中，但非T4克隆生成癌細(xì)胞中具有激活的胱天蛋白酶3/7的細(xì)胞數(shù)目顯著增加(圖3b)。這些數(shù)據(jù)表明在一亞類的人乳腺腫瘤中，Notch途徑活化為致瘤細(xì)胞群提供了必要的存活信號(hào)。
可以通過(guò)受體介導(dǎo)的(外在的)途徑或者線粒體(內(nèi)在的)途徑抑制程序性細(xì)胞死亡。不幸的是，對(duì)稀少的致瘤癌細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)的分子和生物化學(xué)分析在當(dāng)前技術(shù)上是不可能的。因此，得到了依賴Notch信號(hào)傳導(dǎo)存活的乳腺細(xì)胞系。MCF-7細(xì)胞表達(dá)Notch4(圖2b)，dnMAML1腺病毒和抗Notch4抗體都?xì)⑺肋@些細(xì)胞(圖3a、3c和3d)。如對(duì)于直接從腫瘤分離的細(xì)胞的情況，Notch信號(hào)傳導(dǎo)的抑制導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞中胱天蛋白酶的活化(圖3b)。為了確定細(xì)胞死亡是否通過(guò)內(nèi)在或者外在的細(xì)胞死亡途徑，使用表達(dá)顯性失活(dn)FADD或者Bcl-XL的MCF-7細(xì)胞，分別導(dǎo)致內(nèi)在和外在死亡途徑的抑制(圖3e)27，28。當(dāng)用dnMAML1腺病毒感染時(shí)，Bcl-XL而不是dnFADD保護(hù)MCF-7細(xì)胞免于凋亡(圖3c和3d)。這些結(jié)果表明Notch信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)癌細(xì)胞免于通過(guò)線粒體死亡途徑的凋亡。
Notch信號(hào)傳導(dǎo)是復(fù)雜的。有多種Notch和Notch配體以及修飾這些Notch來(lái)調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)的幾種Fringe。正常組織中干細(xì)胞和它們的祖細(xì)胞后代對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的多種成員的差別表達(dá)在干細(xì)胞命運(yùn)決定中起關(guān)鍵作用11，15，29。因?yàn)門4致瘤和非致瘤癌細(xì)胞對(duì)Notch4的差別表達(dá)提示在腫瘤中可能發(fā)生相似的情況，所以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)確定其他Notch途徑基因是否在不同的癌細(xì)胞群體中差別表達(dá)。為了鑒定從不同患者分離的乳腺癌細(xì)胞中的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑組分，用定量RT-PCR檢查來(lái)自5個(gè)腫瘤中每一個(gè)的癌細(xì)胞對(duì)Notch、Notch配體和Fringe的表達(dá)。在所有腫瘤中都檢測(cè)到一種或多種Notch的表達(dá)(表1)。在一些正常組織中，基質(zhì)細(xì)胞或者分化的后代表達(dá)Notch配體，其提供在干細(xì)胞中活化Notch的旁分泌信號(hào)3，11，30。在正常組織中通過(guò)表達(dá)三種Fringe蛋白質(zhì)即Manic、Lunatic和Radical進(jìn)一步調(diào)節(jié)Notch信號(hào)傳導(dǎo)。每種Fringe都差別地糖基化特定Notch受體并且調(diào)節(jié)受體信號(hào)傳導(dǎo)29，31，32。因此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)確定致瘤和非致瘤癌細(xì)胞在它們的Notch配體和/或Fringe蛋白的表達(dá)中是否不同。為了完成該實(shí)驗(yàn)，用從分離自T1和T4的2000個(gè)致瘤癌細(xì)胞和2000個(gè)非致瘤癌細(xì)胞1中分離的RNA進(jìn)行定量RT-PCR(圖4)。與T1致瘤細(xì)胞相比，在T1非致瘤細(xì)胞中Notch配體Delta1和Delta4的表達(dá)高三倍，而在兩個(gè)群體中Jagged1表達(dá)相同(表1)。類似地，T4非致瘤細(xì)胞比致瘤癌細(xì)胞表達(dá)高3倍的水平的Notch配體Delta1和Jagged1，而在任一群體中都沒(méi)有檢測(cè)到Delta3和Delta4的表達(dá)(表1)。
因?yàn)槎鄶?shù)腫瘤由非致瘤癌細(xì)胞組成1并且這些細(xì)胞比致瘤癌細(xì)胞表達(dá)更高水平的Notch配體，所以這些數(shù)據(jù)提示非致瘤癌細(xì)胞為致瘤癌細(xì)胞提供存活信號(hào)。當(dāng)通過(guò)定量RT-PCR檢查時(shí)，在檢查的兩種腫瘤中檢測(cè)到致瘤細(xì)胞而不是非致瘤細(xì)胞的Manic Fringe表達(dá)(表1)。相反地，在兩個(gè)腫瘤中檢測(cè)到非致瘤細(xì)胞而不是致瘤細(xì)胞的LunaticFringe和Radical Fringe的表達(dá)(表1)。這些數(shù)據(jù)是重要的，因?yàn)镸anic Fringe的強(qiáng)迫表達(dá)與致癌轉(zhuǎn)化有關(guān)33，并且在微陣列分析中，正常干細(xì)胞中Manic Fringe表達(dá)最高34。
最近觀察到Bmi-1癌基因調(diào)節(jié)正常的造血干細(xì)胞和白血病細(xì)胞的自我更新，該觀察將自我更新途徑與癌癥緊密相連8，35。因?yàn)檎８杉?xì)胞和腫瘤中的一亞類癌細(xì)胞都具有自我更新的基本能力，所以可能正常干細(xì)胞和致瘤癌細(xì)胞共有自我更新途徑。因此，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中自我更新的途徑的鑒定對(duì)于我們對(duì)這些疾病的理解是關(guān)鍵的。
上面的實(shí)驗(yàn)提供了致瘤細(xì)胞相對(duì)于非致瘤細(xì)胞特異的多種有區(qū)別的生物學(xué)標(biāo)記，允許人們表征樣品的特性，通過(guò)治療介入靶定，和有助于選擇和監(jiān)視療法、藥物篩選應(yīng)用和研究應(yīng)用。
治療劑 可以通過(guò)任何有效方法施用含有根據(jù)本發(fā)明的腫瘤發(fā)生調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。例如，可以通過(guò)任何有效方法施用Notch配體、抗Notch抗體或者作為Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/應(yīng)答途徑中蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑或者拮抗劑的其他治療劑。例如，含有有效濃度的抗Notch治療劑的生理上適宜的溶液可以局部地、眼內(nèi)、腸胃外、經(jīng)口、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或者通過(guò)任何其他有效方式施用。具體地，抗Notch治療劑可以通過(guò)針頭以有效治療靶組織的腫瘤細(xì)胞的量直接注射到靶癌或者腫瘤組織中。備選地，體腔如眼睛、胃腸道、尿生殖道(例如，膀胱)、肺和支氣管系統(tǒng)等等中存在的癌或者腫瘤可以接受生理上適宜的含有有效濃度的抗Notch治療劑的組合物(例如，無(wú)菌的溶液，如鹽水或者磷酸鹽緩沖液、懸浮液或者乳液)，這可以通過(guò)用針頭直接注射或者通過(guò)置于受到癌或者腫瘤折磨的中空器官中的導(dǎo)管或者其他遞送管來(lái)進(jìn)行。任何有效成像裝置，如X射線、聲波圖或者纖維光學(xué)顯像系統(tǒng)可以用于定位靶組織和引導(dǎo)針頭或者導(dǎo)管。在另一備選方法中，含有有效濃度的抗Notch治療劑的生理上適宜的溶液可以全身性地施用到血流中以治療不能直接到達(dá)或者不能解剖上分離的癌或者腫瘤。
所有這些操作的共同目的是將抗Notch治療劑與靶腫瘤足夠接觸以允許抗Notch治療劑接觸、轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞(取決于治療劑的性質(zhì))。在一個(gè)實(shí)施方案中，中空器官的上皮襯層中存在的實(shí)體瘤可以通過(guò)向中空的充滿流體的器官中輸注入載體懸浮液或者通過(guò)向中空的充滿氣體的器官中噴霧或霧化來(lái)治療。從而，腫瘤細(xì)胞(如實(shí)體瘤干細(xì)胞)可以存在于肺支氣管樹(shù)的襯層的上皮組織、胃腸道的襯層、女性生殖道的襯層、尿生殖道、膀胱、膽囊或者易受到與抗Notch治療劑接觸的影響的任何其他器官組織中或者中間。在另一實(shí)施方案中，實(shí)體瘤可以位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的襯層中或者上面，例如，脊髓、脊髓根或者腦，從而輸注入腦脊液中的抗Notch治療劑與該空間中的實(shí)體瘤細(xì)胞接觸并轉(zhuǎn)導(dǎo)。(因此，用本領(lǐng)域的方法可以修飾抗Notch治療劑以穿過(guò)血腦屏障)。腫瘤學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以明白，可以通過(guò)將載體懸浮液直接注射到腫瘤中對(duì)實(shí)體瘤施用抗Notch治療劑，從而，抗Notch治療劑接觸并影響腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。
通過(guò)本發(fā)明鑒定的致瘤細(xì)胞還可以用于產(chǎn)生抗癌細(xì)胞抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括得到致瘤細(xì)胞的富集群體或者分離的致瘤細(xì)胞；處理該群體以防止細(xì)胞復(fù)制(例如，通過(guò)放射)；并以有效誘導(dǎo)對(duì)實(shí)體瘤干細(xì)胞的免疫應(yīng)答的量對(duì)人或者動(dòng)物受試者施用所述經(jīng)處理的細(xì)胞。關(guān)于要注射或者經(jīng)口施用的細(xì)胞的有效劑量，見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6,218,166、6,207,147和6,156,305，將其引入本文作為參考。在另一實(shí)施方案中，該方法包括得到實(shí)體瘤干細(xì)胞的富集群體或者分離的實(shí)體瘤干細(xì)胞；將體外培養(yǎng)物中的腫瘤干細(xì)胞與來(lái)自人受試者或者宿主動(dòng)物的免疫效應(yīng)細(xì)胞混合(根據(jù)本領(lǐng)域已知的免疫學(xué)方法)，將要在所述人受試者或者宿主動(dòng)物中產(chǎn)生抗體；從培養(yǎng)物取出免疫效應(yīng)細(xì)胞；并以有效刺激動(dòng)物中免疫應(yīng)答的劑量對(duì)宿主動(dòng)物移植所述免疫效應(yīng)細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，治療劑是抗體(例如，抗Notch4抗體)?？梢杂猛ㄟ^(guò)連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)制備單克隆抗體。這些技術(shù)包括，但不限于，雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EBV-雜交瘤技術(shù)(見(jiàn)，例如，Kozbor，D.等人，J.Immunol.Methods8131-42(1985)；Cote R J等人，Proc.Natl.Acad.Sci.802026-2030(1983)；和Cole S P等人，Mol.Cell Biol.62109-120(1984))。
此外，可以使用為產(chǎn)生“嵌合抗體”而開(kāi)發(fā)的技術(shù)，如將小鼠抗體基因剪接到人抗體基因而得到具有合適的抗原特異性和生物活性的分子(見(jiàn)，例如，Morrison S L等人，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-6855(1984)；Neuberger M S等人，Nature 312604-608(1984)；和Takeda S等人，Nature 314452-454(1985))。
多種免疫測(cè)定法可以用于篩選以鑒定具有所希望的特異性的抗體。使用具有確定的特異性的多克隆或者單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合或者免疫放射分析的許多方案是本領(lǐng)域公知的。
抗體還可以是人源化抗體。本文所用術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指這樣的抗體分子，即其中非抗原結(jié)合區(qū)中的氨基酸序列已經(jīng)改變從而抗體更像人抗體，并且仍然保持它的最初結(jié)合能力?？贵w經(jīng)人源化從而它們的免疫原性更低并且因此當(dāng)治療性地施用于患者時(shí)能堅(jiān)持更長(zhǎng)時(shí)間。
可以用來(lái)自Abgenix(Fremont，Calif，USA)的XENOMOUSE技術(shù)產(chǎn)生人抗體，該技術(shù)使得可以產(chǎn)生和選擇適于抗體治療的基本上任何疾病靶標(biāo)的高親和力的完全人抗體產(chǎn)物候選物。見(jiàn)，美國(guó)專利號(hào)6,235,883、6,207,418、6,162,963、6,150,584、6,130,364、6,114,598、6,091,001、6,075,181、5,998,209、5,985,615、5,939,598和5,916,771，將每個(gè)專利都引入作為參考；Yang X等人，Crit Rev OncolHemato 38(1)17-23(2001)；Chadd H E & Chamow S M.Curr OpinBiotechnol 12(2)188-94(2001)；Green L L，Journal ofImmunological Methods 231 11-23(1999)；Yang X-D等人，CancerResearch 59(6)1236-1243(1999)；和Jakobovits A，AdvancedDrug Delivery Reviews 3133-42(1998)。用遺傳工程化的小鼠品系產(chǎn)生具有完全人蛋白質(zhì)序列的抗體，在所述小鼠品系中，小鼠抗體基因表達(dá)受到抑制并且被人抗體基因表達(dá)功能性地置換，而同時(shí)保持小鼠免疫系統(tǒng)的剩余部分完整。此外，針對(duì)本發(fā)明的存在于致瘤細(xì)胞中或者上面的標(biāo)記的抗體的產(chǎn)生可以用作鑒定藥物開(kāi)發(fā)靶標(biāo)的方法。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗腫瘤發(fā)生的治療劑與其他抗腫瘤療法共同施用。多種治療劑可以用于本發(fā)明。可以與本發(fā)明的藥劑共同施用或者與本發(fā)明的藥劑聯(lián)合的任何治療劑都適宜用于本發(fā)明的方法中。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了施用本發(fā)明的治療化合物和至少一種另外的治療劑(例如，包括，但不限于，化學(xué)治療抗腫瘤劑、抗微生物劑、抗病毒劑、抗真菌劑和消炎劑)的方法(治療方法、研究方法、藥物篩選方法)和/或治療技術(shù)(例如，外科手術(shù)、放射療法)。
計(jì)劃將多種類別的抗腫瘤(例如抗癌)劑用于本發(fā)明的某些實(shí)施方案中。適于用于本發(fā)明的抗癌劑包括，但不限于，誘導(dǎo)凋亡的抗癌劑，抑制腺苷脫氨酶功能、抑制嘧啶生物合成、抑制嘌呤環(huán)生物合成、抑制核苷酸互變、抑制核糖核苷酸還尿酶、抑制胸苷一磷酸(TMP)合成、抑制二氫葉酸還原、抑制DNA合成、與DNA形成加合物、破壞DNA、抑制DNA修復(fù)、嵌入DNA、使天冬酰胺脫氨、抑制RNA合成、抑制蛋白質(zhì)合成或者穩(wěn)定性、抑制微管合成或者功能的抗癌劑，等等。
在一些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的組合物和方法的示例性抗癌劑包括，但不限于1)生物堿類，包括微管抑制劑(例如，長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春地辛等等)，微管穩(wěn)定劑(例如，紫杉醇(TAXOL)、和多西他賽，等等)，和染色質(zhì)功能抑制劑，包括拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，如表鬼臼毒素類(例如，依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等等)，和靶定拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抗癌劑(例如，喜樹(shù)堿和isirinotecan(CPT-11)，等等)；2)共價(jià)DNA結(jié)合劑(烷基化劑)，包括氮芥類(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺和白消安(MYLERAN)，等等)，亞硝基脲類(例如，卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀)，和其他烷基化劑(例如，達(dá)卡巴嗪、羥甲基蜜胺、塞替派和絲裂霉素，等等)；3)非共價(jià)DNA結(jié)合劑(抗腫瘤抗生素)，包括核酸抑制劑(例如，更生霉素(放線菌素D)，等等)，蒽環(huán)類抗生素(例如，柔紅霉素(道諾霉素和正定霉素)、多柔比星(阿霉素)和伊達(dá)比星(去甲氧柔紅霉素)，等等)、蒽二酮類(例如，蒽環(huán)類抗生素類似物，如米托蒽醌，等等)，博來(lái)霉素(BLENOXANE)，等等，和普卡霉素(光輝霉素)等等；4)抗代謝物，包括抗葉酸劑(例如，氨甲喋呤、FOLEX、和MEXATE，等等)，嘌呤抗代謝物(例如，6-巰基嘌呤(6-MP，PURINETHOL)、6-硫鳥(niǎo)嘌呤(6-TG)、硫唑嘌呤、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷、更昔洛韋、氯代脫氧腺苷、2-氯代脫氧腺苷(CdA)和2’-脫氧助間型霉素(噴司他丁)等等)，嘧啶拮抗劑(例如，氟嘧啶類(例如，5-氟尿嘧啶(ADRUCIL)、5-氟脫氧尿苷(FdUrd)(氟尿苷))等等)，和阿糖胞苷類(例如，CYTOSAR(ara-C)和氟達(dá)拉濱，等等)；5)酶，包括L-天冬酰胺酶，和羥基脲，等等；6)激素，包括糖皮質(zhì)激素類，抗雌激素藥(例如，他莫昔芬，等等)，非類固醇抗雄激素藥(例如，氟他胺，等等)，和芳香酶抑制劑(例如，阿那曲唑(ARIMIDEX)，等等)；7)鉑化合物(例如，順鉑和卡鉑等等)；8)綴合抗癌藥物、毒素和/或放射性核素的單克隆抗體，等等；9)生物反應(yīng)修飾劑(例如，干擾素(例如，IFN-α等等)和白介素(例如，IL-2，等等)，等等)；10)過(guò)繼免疫治療；11)造血生長(zhǎng)因子；12)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的治療劑(例如，全反式視黃酸，等等)；13)基因治療技術(shù)；14)反義治療技術(shù)；15)腫瘤疫苗；16)針對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的療法(例如，巴馬司他，等等)；17)血管發(fā)生抑制劑；18)蛋白體抑制劑(例如，VELCADE)；19)乙?；?或甲基化抑制劑(例如，HDAC抑制劑)；20)NFκB的調(diào)節(jié)劑；21)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的抑制劑(例如，CDK抑制劑)；22)p53蛋白功能的調(diào)節(jié)劑；和23)放射。
常規(guī)用于癌癥治療背景中的腫瘤消解劑可以用于本發(fā)明的組合物和方法。例如，美國(guó)食品和藥品管理局(U.S.Food and DrugAdministration)維持了批準(zhǔn)在美國(guó)使用的腫瘤消解劑的藥品集。美國(guó)FDA的國(guó)際上的對(duì)應(yīng)機(jī)構(gòu)維持了相似的藥品集。表X提供了批準(zhǔn)在美國(guó)使用的一組示例性抗腫瘤劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白在所有美國(guó)批準(zhǔn)的化學(xué)治療劑上的“產(chǎn)品標(biāo)簽”描述了對(duì)于示例性治療劑的批準(zhǔn)的適應(yīng)癥、給藥信息、毒性數(shù)據(jù)等等。
抗微生物治療劑也可以用作本發(fā)明中的治療劑?？梢允褂每梢詺⑺?、抑制或者減弱微生物生物體的功能的任何治療劑，以及預(yù)期具有此類活性的任何治療劑?？刮⑸飫┌?，但不限于，單獨(dú)或者組合使用的天然和合成的抗生素、抗體、抑制性蛋白質(zhì)(例如，防衛(wèi)素)、反義核酸、膜破壞劑等等。實(shí)際上，可以使用的任何類型的抗生素包括，但不限于，抗細(xì)菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑，等等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與能夠特異靶向特定細(xì)胞類型(例如，腫瘤細(xì)胞)的靶向劑結(jié)合的本發(fā)明化合物(和任何其他化學(xué)治療劑)。通常，與靶向劑結(jié)合的治療化合物通過(guò)靶向劑與經(jīng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被攝入細(xì)胞的細(xì)胞表面部分相互作用而靶向贅生性細(xì)胞。
已知位于靶細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)表面上的任何部分可以用于本發(fā)明。例如，針對(duì)此類部分的抗體將本發(fā)明的組合物靶向含有所述部分的細(xì)胞表面。備選地，靶向部分可以是導(dǎo)向細(xì)胞表面上存在的受體的配體，或者反之亦然。類似地，也可以用維生素將本發(fā)明的治療劑靶向特定細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“靶向分子”指用于將治療化合物靶向目標(biāo)細(xì)胞、組織或者器官的化學(xué)部分，和其部分。預(yù)期多種類型的靶向分子用于本發(fā)明，包括，但不限于，信號(hào)肽、抗體、核酸、毒素等等。靶向部分可以額外促進(jìn)化合物(例如，小分子)的結(jié)合或者化合物進(jìn)入靶定的細(xì)胞、組織和器官。優(yōu)選地，根據(jù)靶向部分在將連接的化合物選擇性地遞送到受試者、組織或者細(xì)胞，包括特定亞細(xì)胞位置和細(xì)胞器內(nèi)的靶定位點(diǎn)中的特異性、親和性和功效來(lái)選擇靶向部分。
多種效率問(wèn)題影響所有藥物，尤其高度細(xì)胞毒性藥物(例如，抗癌藥物)的施用。一個(gè)尤其重要的問(wèn)題是確保施用的治療劑僅影響靶定的細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)、組織或者器官。高度細(xì)胞毒性的藥劑向非靶定的細(xì)胞的非特異或者非希望的遞送可以導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性問(wèn)題。
已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試來(lái)設(shè)計(jì)藥物靶向方案以處理與非特異性藥物遞送有關(guān)的問(wèn)題(見(jiàn)，例如，K.N.Syrigos和A.A.EpenetosAnticancer Res.，19606-614(1999)；Y.J.Park等人，J.Controlled Release，7867-79(2002)；R.V.J.Chari，Adv.DrugDeliv.Rev.，3189-104(1998)；和D.Putnam和J.Kopecek，Adv.Polymer Sci.，12255-123(1995))。靶向部分如抗體和配體肽(例如，內(nèi)皮細(xì)胞的RDG)與藥物分子的綴合已經(jīng)用于減輕與特定藥物有關(guān)的一些并行毒性問(wèn)題。然而，僅將藥物與靶向部分綴合不能完全消除對(duì)非靶定細(xì)胞的潛在副作用，因?yàn)樗幬锿ǔＴ谒鼈兊竭_(dá)靶細(xì)胞的途中是生物活性的。靶定部分-前體藥物綴合物的發(fā)展已經(jīng)減少了這些方面的一些問(wèn)題，所述靶定部分-前體藥物綴合物在到達(dá)特定的靶定組織的途中是無(wú)活性的。生物轉(zhuǎn)化，如酶切割通常將前體藥物在靶位點(diǎn)轉(zhuǎn)化成生物活性分子。
因此，在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了前體藥物綴合物，其在到達(dá)它們的靶位點(diǎn)前是無(wú)活性的，在靶位點(diǎn)它們隨后被轉(zhuǎn)化成活性的治療藥物分子。ADEPT和ATTEMPTS是與本發(fā)明的某些實(shí)施方案相容的兩種示例性前體藥物遞送系統(tǒng)。(見(jiàn)K.N.Syrigos和A.A.Epenetos，Anticancer Res.，19606-614(1999)；K.D.Bagshawe，Brit.J.Cancer，56531-532(1987)；Y.J.Park等人，J.Controlled Release，72145-156(2001)；和Y.J.Park等人，J.Controlled Release，7867-79(2002))。
某些類型的治療劑，特別是水溶性低分子量藥劑從受試者的血流中的快速清除造成了有效的小分子施用的另一個(gè)障礙。其他障礙來(lái)自施用的藥劑的快速清除(例如，蛋白水解降解)或者潛在的免疫原性。
在天然系統(tǒng)中，受試者中小分子(例如，藥物)的清除和其他藥物動(dòng)力學(xué)行為受到一系列轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)。(見(jiàn)，例如，H.T.Nguyen，Clin.Chem.Lab.Anim.，(2nd Ed.)pp.309-335(1999)；和G.J.Russel1-Jones和D.H.Alpers，Pharm.Biotechnol.，12493-520(1999))。從而，在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)測(cè)試和開(kāi)發(fā)潛在治療劑時(shí)，考慮了治療劑的藥物動(dòng)力學(xué)。
受試者中藥劑清除的速率通常是可控制的。例如，將藥劑附著(例如，結(jié)合)到大分子載體上通常可延長(zhǎng)循環(huán)和滯留時(shí)間。因此，本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了綴合至聚乙二醇(PEG)或者相似生物聚合物的小分子，以減小(防止)分子的降解和改善它在受試者的血流中的滯留。(見(jiàn)，例如，R.B.Greenwald等人，Critical Rev.TherapeuticDrug Carrier Syst.，17101-161(2000))。PEG阻礙蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的能力可以減小許多藥物的免疫原性。
影響某些治療劑，特別是親水和大分子藥物，如肽和核酸的施用的另一問(wèn)題是這些藥劑難以穿過(guò)靶向的細(xì)胞膜。小的(通常小于1,000道爾頓)疏水分子進(jìn)入靶細(xì)胞膜的困難較小。此外，低分子量細(xì)胞毒性藥物通常更有效地定位在正常組織而不是靶組織如腫瘤中(K.Bosslet等人，Cancer Res.，581195-1201(1998))，這是由于在快速生長(zhǎng)的腫瘤中高間隙壓和不利的血流性質(zhì)(R.K.Jain，Int.J.Radiat.Biol.，6085-100(1991)；和R.K.Jain和L.T.Baxter，Cancer Res.，487022-7032(1998))。
某些實(shí)施方案，特別是涉及遞送細(xì)胞毒性劑的實(shí)施方案利用一種或多種下面的方法或者組合物來(lái)幫助遞送本發(fā)明的治療組合物微注射(見(jiàn)，例如，M.Foldvari和M.Mezei，J.Pharm.Sci.，801020-1028，(1991))；刮擦加載(scrape loading)(見(jiàn)例如，P.L.McNeil等人，J.Cell Biol.，981556-1564(1984))；電穿孔(見(jiàn)例如，R.Chakrabarti等人，J.Biol.Chem.，2615494-15500(1989))；脂質(zhì)體(見(jiàn)例如，M.Foldvari等人，J.Pharm.Sci.，801020-1028(1991))；和J.N.Moreira等人，Biochim Biophys Acta.，515167-176(2001))；納米載體，如水溶性聚合物(例如，增強(qiáng)的滲透和滯留″EPR″，見(jiàn)例如，H.Maeda等人，J.Controlled Release，65271-284(2000)；H.Maeda等人，同上；和L.W.Seymour，Crit.Rev.Therapeu.Drug Carrier Systems，9135-187(1992))；細(xì)菌毒素(見(jiàn)例如，T.I.Prior等人，Biochemistry，313555-3559(1992)；和H.Stenmark等人，J.Cell Biol.，1131025-1032(1991))；受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和吞噬作用，包括腫瘤激活的前體藥物(TAP)系統(tǒng)(見(jiàn)例如，R.V.J.Chari，Adv.Drug Deliv.Rev.，3189-104(1998)；I.Mellman，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，12575-625(1996)；C.P.Leamon和P.S.Low，J.Biol.Chem.，267(35)24966-24971(1992)；H.Ishihara等人，Pharm.Res.，7542-546(1990)；S.K.Basu，Biochem.Pharmacol.，401941-1946(1990)；和G.Y.Wu和C.H.Wu，Biochemistry，27887-892(1988))；其他適宜的組合物和方法是本領(lǐng)域已知的。
所述化合物和抗癌劑可以在任何無(wú)菌、生物相容的藥物載體中施用，所述藥物載體包括但不限于，鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖和水。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以含有一種藥劑(例如，抗體)。在其他實(shí)施方案中，藥物組合物含有至少兩種藥劑的混合物(例如，抗體和一種或多種常規(guī)抗癌劑)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有至少兩種藥劑，它們?cè)谝环N或多種下面的條件下施用于患者以不同的周期，以不同的持續(xù)時(shí)間，以不同濃度，通過(guò)不同施用途徑，等等。在一些實(shí)施方案中，在施用抗癌劑之前，例如，在施用抗癌劑0.5、1、2、3、4、5、10、12、或18小時(shí)、1、2、3、4、5、或6天、1、2、3或4周之前施用治療化合物。在一些實(shí)施方案中，在施用抗癌劑之后，例如，在施用抗癌劑0.5、1、2、3、4、5、10、12、或18小時(shí)、1、2、3、4、5、或6天、1、2、3或4周之后施用治療化合物。在一些實(shí)施方案中，治療化合物和抗癌劑在同時(shí)施用但是以不同的時(shí)間安排施用，例如，治療化合物每天施用，而抗癌劑每周一次，每?jī)芍芤淮危咳芤淮?，或者每四周一次施用。在其他?shí)施方案中，每周一次施用治療化合物，而每天，每周一次，每?jī)芍芤淮危咳芤淮?，或者每四周一次施用抗癌劑?br> 取決于所治療的狀況，配制并全身或者局部施用本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選實(shí)施方案。配制和施用技術(shù)可以見(jiàn)″Remington′sPharmaceutical Sciences″(Mack Publishing Co，Easton Pa.)的最新版本。合適的途徑可以例如，包括經(jīng)口和經(jīng)粘膜施用，以及腸胃外遞送(例如，肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或者鼻內(nèi)施用)。
根據(jù)可接受的藥物遞送方法和制備技術(shù)，本發(fā)明計(jì)劃施用治療化合物，在一些實(shí)施方案中，施用一種或多種常規(guī)抗癌劑。例如，治療化合物和適宜的抗癌劑可以在可藥用載體如生理鹽水中靜脈內(nèi)施用于受試者?？紤]了用于藥物試劑的細(xì)胞內(nèi)遞送的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，通過(guò)脂質(zhì)體遞送)。此類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑用于腸胃外施用(例如，靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、髓內(nèi)和腹膜內(nèi))。施用基因治療試劑和技術(shù)也可以完成某些所考慮的抗癌劑(例如，治療性多肽)的治療性共同施用。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將治療化合物單獨(dú)或者與一種或者多種常規(guī)抗癌劑(例如，核苷酸序列、藥物、激素等等)組合或者以藥物組合物施用于受試者，在所述藥物組合物中，組分任選與賦形劑或者其他可藥用載體混合。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可藥用載體是生物學(xué)上惰性的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域公知的可藥用載體以適于經(jīng)口施用的劑量配制本發(fā)明的藥物組合物。這樣的載體使得可以將藥物組合物配制成片劑、丸劑、膠囊劑、糖錠劑、液體、凝膠劑、糖漿劑、漿液、溶液劑、混懸劑等等，用于受試者分別口服或者經(jīng)鼻攝入。
通過(guò)將活性化合物與固體賦形劑組合，任選碾磨所得混合物，并且如果希望，在加入合適的輔料后將混合物加工成顆粒以得到片劑或者糖錠劑核心，可以得到用于經(jīng)口施用的藥物制劑。適宜的賦形劑是糖類或者蛋白質(zhì)填充劑，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或者山梨醇；玉米、小麥、大米、馬鈴薯等等的淀粉；纖維素，如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或者羧甲基纖維素鈉；樹(shù)膠，包括阿拉伯樹(shù)膠和西黃蓍膠；和蛋白質(zhì)，如明膠和膠原。如果希望，可以加入崩解劑或者增溶劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或者其鹽如藻酸鈉。
對(duì)于注射，可以將本發(fā)明的藥物組合物在水性溶液中配制，優(yōu)選生理上相容的緩沖液，如Hanks溶液、林格溶液或者生理緩沖鹽水。對(duì)于組織或者細(xì)胞施用，使用對(duì)于待透過(guò)的特定屏障合適的滲透劑。此類滲透劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
適宜用于本發(fā)明的藥物組合物包括其中含有有效量的活性成分以實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的的組合物。藥劑的有效量的確定完全在藥理學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)，特別是考慮到本文提供的公開(kāi)內(nèi)容時(shí)尤其如此。
除了活性成分外，優(yōu)選的藥物組合物還可以含有適宜的可藥用載體，包括賦形劑和輔料，其有助于將活性化合物加工成藥學(xué)上的有用形式。
可以用制備藥物組合物的任何可接受的技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的藥物組合物，這些技術(shù)包括，但不限于，通過(guò)常規(guī)混合、溶解、?；⒅铺清V劑、磨細(xì)、乳化、包膠、陷入或者凍干方法，等等。
本組合物的可攝入的制劑可以還包括美國(guó)農(nóng)業(yè)部(United StatesDepartment of Agriculture)批準(zhǔn)的可以包括在食品中的任何材料和通常認(rèn)為安全(GRAS)的物質(zhì)，如食品添加劑、調(diào)味劑、著色劑、維生素、礦物質(zhì)，和植物營(yíng)養(yǎng)素(phytonutrients)。本文所用的術(shù)語(yǔ)植物營(yíng)養(yǎng)素指從植物分離的具有生物學(xué)作用的有機(jī)化合物，其包括但不限于，下面類別的化合物異黃酮類、寡聚原花色素、吲哚-3-甲醇、sulforaphone、纖維配基、植物固醇、阿魏酸、anthocyanocides、三萜類、ω3/6脂肪酸、聚乙炔、醌類、萜類、cathechins、沒(méi)食子酸和櫟精。
將合適的包衣，如濃縮的糖溶液提供給糖錠劑核心，所述包衣還可以含有阿拉伯樹(shù)膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝膠、聚乙二醇、和/或二氧化鈦、紫膠漆溶液、和適宜的有機(jī)溶劑或者溶劑混合物?？梢詫⑷玖匣蛘呱丶尤肫瑒┗蛘咛清V劑包衣中以用于產(chǎn)品識(shí)別或者表征活性化合物的量(即，劑量)。
計(jì)劃用于經(jīng)口施用的藥物制劑包括明膠制造的輕壓配合膠囊以及明膠和包衣如甘油或者山梨醇的密封軟膠囊。在一些實(shí)施方案中，輕壓配合膠囊可以含有與填充劑或者黏合劑如乳糖或者淀粉，潤(rùn)滑劑如滑石或者硬脂酸鎂，和任選地穩(wěn)定劑混合的活性成分。在一些軟膠囊實(shí)施方案中，活性化合物溶解或者懸浮在適宜的液體或者溶劑，如脂肪油、液體石蠟或者液態(tài)聚乙二醇中，其中使用或者不用穩(wěn)定劑。
用于腸胃外施用的藥物制劑包括活性化合物的水溶液。水性注射混懸劑任選含有增加混懸劑的粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或者葡聚糖。此外，活性化合物的混懸劑可以制備成合適的油性注射混懸劑。在該方面，適宜的親脂溶劑或者載體包括脂肪油如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂質(zhì)體。任選地，混懸劑含有適宜的穩(wěn)定劑或者增加化合物的穩(wěn)定性從而允許制備高度濃縮溶液的物質(zhì)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，臨床醫(yī)生或者藥理學(xué)領(lǐng)域的其他技術(shù)人員基于公知的藥學(xué)和治療上的因素定制給藥和施用方案，所述因素包括，但不限于，所希望的治療效果的水平，和可以得到的治療效果的實(shí)際水平。通常，合適的是按照施用化學(xué)治療劑的公知的藥理學(xué)原則(例如，通常合適的是偶而和只是每3-4個(gè)藥劑半壽期不改變劑量50％以上)。對(duì)于具有相對(duì)較小或者沒(méi)有劑量相關(guān)的毒性因素的組合物，并且其中希望得到最大功效(例如，癌細(xì)胞的破壞)的情況，超過(guò)平均需要的劑量的劑量并不是罕見(jiàn)的。該給藥方法通常稱作“最大劑量”策略。
另外的給藥因素涉及對(duì)于正在施用的藥劑計(jì)算正確的目標(biāo)水平、藥劑的積累和潛在毒性、抗性的刺激、功效的缺乏、和描述藥劑的治療指數(shù)范圍。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮使用滴定藥劑的施用的常規(guī)方法。一種常見(jiàn)的施用策略是對(duì)受試者中的藥劑設(shè)置合理的目標(biāo)水平。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，測(cè)量受試者的血漿中的藥劑水平。然后設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)膭┝克胶皖l率以對(duì)該藥劑實(shí)現(xiàn)希望的穩(wěn)態(tài)目標(biāo)水平。監(jiān)視(例如，每小時(shí)、每天、每周等等)受試者中該藥劑的實(shí)際或者平均水平，從而可以調(diào)節(jié)給藥水平或者頻率以保持目標(biāo)水平。當(dāng)然，正在施用的特定藥劑的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)(例如，生物利用率、清除和生物積累、生物分布、藥物相互作用，等等)可以潛在影響所考慮的合理的目標(biāo)水平，從而影響給藥水平或者頻率。
目標(biāo)水平給藥方法通常依賴于建立按照受試者中的藥劑的希望范圍(或者治療范圍)定義的合理的治療目的。通常，治療范圍的下限大體等于提供約50％最大可能的治療效果的藥劑濃度。治療范圍的上限通常由藥劑的毒性而不是其功效確定。本發(fā)明考慮，特定藥劑的治療范圍的上限將是小于5％或10％的受試者表現(xiàn)出毒副作用時(shí)的濃度。在一些實(shí)施方案中，治療范圍的上限為下限的約2倍或以下。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些給藥因素是高度可變的并且在一定程度上是個(gè)體特異的(例如，基于遺傳素質(zhì)、免疫學(xué)因素、耐受性、抗性，等等)。從而，在一些實(shí)施方案中，特定受試者中藥劑的有效目標(biāo)給藥水平可以比另一受試者中的最佳水平大1，...5，...10，...15，...20，...50，...75，...100，...200，...X％。相反地，以比在一些或者多數(shù)受試者中通常產(chǎn)生最佳治療水平的給藥水平或者頻率小得多(1，...5，...10，...15，...20，...50，...75，...100，...200，...X％)的給藥水平或者頻率，一些受試者可能遭受嚴(yán)重的副作用和毒性相關(guān)的健康問(wèn)題。不存在更具體的信息時(shí)，目標(biāo)施用水平通常設(shè)置在治療范圍的中間。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了間歇給藥方法，因?yàn)榻o藥之間藥劑濃度的顯著波動(dòng)通常是不希望的。在藥劑的吸收和分布得到平衡并且是自發(fā)的條件下，由藥劑的消除半壽期決定濃度波動(dòng)。
在其中施用的組合物相對(duì)無(wú)毒的實(shí)施方案中，可以使用最大給藥方法，因?yàn)樯踔翈妆队诖_保治療功效所需劑量的藥劑濃度也可以良好耐受。在這些實(shí)施方案中，給藥間隔延長(zhǎng)，從而在從受試者中清除并且需要額外施用以將藥劑的水平恢復(fù)到治療有效范圍之前，受試者的系統(tǒng)中藥劑的濃度在治療有效性范圍內(nèi)保持相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間。從而，在這些實(shí)施方案的一些方案中，給藥間隔長(zhǎng)于藥劑的清除半壽期。
在其他實(shí)施方案中，當(dāng)組合物具有相對(duì)窄的治療范圍時(shí)，計(jì)算在特定給藥間隔下將發(fā)生的最大和最小濃度是重要的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，施用的藥劑的最小穩(wěn)態(tài)濃度用方程確定，任選對(duì)藥劑的生物利用率進(jìn)行校正，其是藥理學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
在其他實(shí)施方案中，當(dāng)藥劑遵循多指數(shù)動(dòng)力學(xué)并且經(jīng)口施用藥劑時(shí)，最大穩(wěn)態(tài)濃度的估計(jì)涉及處理與藥劑分布和吸收有關(guān)的幾個(gè)指數(shù)常數(shù)。
本發(fā)明還提供了對(duì)受試者施用負(fù)荷劑量的一種或多種藥劑的方法。本文所用的“負(fù)荷劑量”是一種或一系列劑量，其當(dāng)在治療開(kāi)始時(shí)給予時(shí)快速提供治療劑的目標(biāo)濃度。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于得到使用恒定速度施用所提供的藥劑的穩(wěn)態(tài)目標(biāo)水平所需的時(shí)間，對(duì)立即需要目標(biāo)水平的藥劑的受試者施用負(fù)荷劑量。應(yīng)該在施用前對(duì)患者狀況的緊迫性和她對(duì)負(fù)荷劑量的需要權(quán)衡多種負(fù)面因素。這些因素包括，但不限于1)負(fù)荷劑量通常以一個(gè)大的快速濃注施用，其可以使患者突然暴露于毒性濃度的藥劑；2)具有長(zhǎng)半壽期的藥劑與以較低恒速方案施用的藥劑相比將保持在高于目標(biāo)水平的水平上。負(fù)荷劑量通常是大、快速和腸胃外給予的，從而，在藥劑可以在受試者的血漿中得到平衡之前，可能在施用部位發(fā)生危險(xiǎn)的副作用。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，臨床醫(yī)生基于已知的藥理學(xué)原理和方程合理地設(shè)計(jì)個(gè)體化的給藥方案。通常，臨床醫(yī)生基于藥劑的多種藥理學(xué)和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的知識(shí)設(shè)計(jì)個(gè)體化的給藥方案，所述性質(zhì)包括但不限于，F(xiàn)(劑量的相對(duì)生物利用率(fractional bioavailability of thedose))、Cp(血漿中的濃度)、CL(清除/清除速率)、Vss(穩(wěn)態(tài)下藥物分布的體積)、Css(穩(wěn)態(tài)時(shí)的濃度)和t1/2(藥物半壽期)，以及關(guān)于藥劑的吸收速率和分布的信息。關(guān)于這些變量的進(jìn)一步解釋和闡明個(gè)體化給藥方案的計(jì)算的完整方程，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考許多公知的藥理學(xué)教材(例如，Goodman和Gilman′s，Pharmaceutical Basis ofTherapeutics，第10版，Hardman等人，編著，2001)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠預(yù)測(cè)個(gè)體受試者中這些變量可能的波動(dòng)。例如，F(xiàn)、CL和Vss的觀察值的標(biāo)準(zhǔn)差通常分別為約20％，50％和30％。各受試者中可能變化很大的參數(shù)的實(shí)際效果是，受試者中獲得Css的時(shí)間的95％在獲得目標(biāo)水平的時(shí)間的35到270％之間。對(duì)于具有低治療指數(shù)的藥物，這不希望地是一個(gè)寬范圍。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，一旦測(cè)量了藥劑的Cp(血漿中的濃度)，那么可能直接估計(jì)F、CL和Vss的值。這允許臨床醫(yī)生有效而精確地調(diào)整具體受試者的給藥方案。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明計(jì)劃用連續(xù)治療藥物監(jiān)視技術(shù)進(jìn)一步調(diào)節(jié)個(gè)體的給藥方法和方案。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，用Css數(shù)據(jù)進(jìn)一步完善CL/F的估計(jì)和隨后使用已知的藥理學(xué)原理和方程來(lái)調(diào)節(jié)個(gè)體的維持給藥以實(shí)現(xiàn)所希望的藥劑目標(biāo)水平。在給藥時(shí)間表期間可以實(shí)際上在任何時(shí)間進(jìn)行治療藥物監(jiān)視。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在給藥期間，特別當(dāng)施用間歇?jiǎng)┝繒r(shí)在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)視。例如，可以不管所用的給藥方法(例如，間歇給藥、負(fù)荷劑量、維持給藥、隨機(jī)給藥或者任何其他給藥方法)，在藥劑施用的一秒、數(shù)秒、數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月等等內(nèi)相伴地進(jìn)行藥物監(jiān)視。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，當(dāng)藥劑施用后快速采樣時(shí)，藥劑效果和動(dòng)力學(xué)的改變可能不易觀察到，因?yàn)樗巹┑难獫{濃度的改變可能延遲(例如，由于緩慢的分布速率或者其他藥效動(dòng)力學(xué)因素)。因此，藥劑施用后短時(shí)間內(nèi)得到的受試者樣品可能具有有限或者降低的價(jià)值。
在預(yù)測(cè)的施用的穩(wěn)態(tài)目標(biāo)水平期間從受試者收集生物樣品的主要目的是根據(jù)隨后對(duì)藥劑的CL/F比的經(jīng)校正的估計(jì)值進(jìn)行計(jì)算來(lái)修改該個(gè)體的給藥方案。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解早期吸收后藥物濃度通常不反映藥劑清除。早期吸收后藥物濃度主要由藥劑的吸收速率、藥劑分布的中心體積而不是穩(wěn)態(tài)體積、和分布的速率決定。當(dāng)計(jì)算治療性長(zhǎng)期維持給藥方案時(shí)，這些藥物動(dòng)力學(xué)特征每種都有有限的價(jià)值。
因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)目的是治療性長(zhǎng)期維持給藥時(shí)，正好在施用以前的劑量后，甚至更優(yōu)選在施用接下來(lái)的計(jì)劃劑量之前不久從目標(biāo)受試者、細(xì)胞或者組織得到生物樣品。
在其他實(shí)施方案中，在給藥之間的時(shí)間間隔中，治療劑幾乎完全被受試者清除，因而本發(fā)明計(jì)劃在前面的施用后，最優(yōu)選在劑量施用后不久的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)從受試者收集生物樣品。
在另外的實(shí)施方案中，當(dāng)藥劑的低清除率成為問(wèn)題，并且毒性問(wèn)題可能來(lái)自它的積累時(shí)，本發(fā)明計(jì)劃在施用隨后劑量之前即刻測(cè)量藥劑濃度。在這些實(shí)施方案中，優(yōu)選測(cè)定最大和最小藥劑濃度。
本發(fā)明的方法還計(jì)劃當(dāng)施用恒定的維持劑量時(shí)，僅在四個(gè)藥劑半壽期期滿后達(dá)到穩(wěn)態(tài)。給藥后太快收集的樣品不能準(zhǔn)確反映藥劑清除。然而，對(duì)于可能高毒性的藥劑，在藥劑的第四個(gè)半壽期期滿前可能已經(jīng)發(fā)生了嚴(yán)重毒性和損害。從而，在一些情況中，當(dāng)重要的是保持對(duì)藥劑濃度的控制時(shí)，假定沒(méi)有施用負(fù)荷劑量，在兩個(gè)半壽期后采集第一個(gè)樣品。如果藥劑濃度已經(jīng)超過(guò)了最終預(yù)期的平均穩(wěn)態(tài)濃度的90％，那么將給藥率減半，在另外的兩個(gè)半壽期后得到另一樣品。如果該樣品再次超過(guò)目標(biāo)水平，那么該劑量再次減半。如果第一種濃度不超過(guò)耐受極限，那么隨后的施用以最初給藥率進(jìn)行。如果濃度低于預(yù)期值，那么可能可以在約2個(gè)半壽期內(nèi)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)，這時(shí)可以如本文描述的來(lái)調(diào)節(jié)給藥率。
在包含間歇?jiǎng)┝康膶?shí)施方案中，與濃度信息收集的時(shí)間選擇有關(guān)的額外考慮是，如果在下一個(gè)預(yù)定的劑量前即刻得到樣品，那么濃度將為最小值，而不是平均值；然而，如本文討論的，可以使用藥理學(xué)領(lǐng)域中已知的方程計(jì)算估計(jì)的平均濃度。
當(dāng)施用具有一級(jí)動(dòng)力學(xué)的治療劑時(shí)，穩(wěn)態(tài)時(shí)的平均、最小和最大濃度與劑量和給藥率線性相關(guān)。從而，在這些實(shí)施方案中，測(cè)量的和期望的藥劑濃度之間的比用于調(diào)節(jié)給藥。
在本發(fā)明的另一方面，計(jì)算機(jī)程序可幫助設(shè)計(jì)給藥方案。通常，這些計(jì)算機(jī)程序考慮測(cè)量的藥物濃度和與個(gè)體受試者有關(guān)的多種因素(例如，測(cè)量的或者預(yù)測(cè)的因素)。
本發(fā)明不限于對(duì)收集受試者、組織、細(xì)胞培養(yǎng)物或者動(dòng)物藥物施用數(shù)據(jù)或者樣品的任何特定的時(shí)間限制。而且，本發(fā)明不限于從受試者、組織、細(xì)胞培養(yǎng)物或者試驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物等收集任何特定類型的樣品(例如，生物樣品)。實(shí)際上，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明計(jì)劃獲得生物樣品，其包括，但不限于，多核苷酸、多肽、脂類、糖類、糖脂、離子種類、代謝物、無(wú)機(jī)分子、大分子、和大分子前體，以及細(xì)胞級(jí)分、血液(例如，細(xì)胞和可溶性或不溶性血液組分，包括，但不限于，血漿、血清、代謝物、因子、酶、激素、和有機(jī)或者無(wú)機(jī)分子)、滲出液、分泌物、痰、排泄物、細(xì)胞和組織活組織檢查物、CNS液體(腦脊液)、淚腺、唾液腺和其他腺體的分泌物、精液，等等，和這些或任何其他亞細(xì)胞的、細(xì)胞的、組織的、器官的(organismal)、系統(tǒng)的或者生物體的生物材料的組合?？梢詫?duì)從受試者得到的生物樣品就施用治療劑導(dǎo)致的化學(xué)或者生物化學(xué)改變(例如，基因表達(dá)的改變)或者其他效應(yīng)進(jìn)行分析。下面描述了其他生物樣品和采樣考慮。
在這些實(shí)施方案的一些中，對(duì)收集的樣品用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法來(lái)確定治療組合物的生物學(xué)和藥理學(xué)效應(yīng)，所述方法包括但不限于，顯微術(shù)(例如，光學(xué)的、熒光(共聚焦熒光、免疫熒光)、相差、微分干涉相差、暗場(chǎng)、或者電子(透射、掃描、低-)、NMR、放射自顯影)、細(xì)胞分選技術(shù)(例如，熒光激活的)、層析技術(shù)(例如，凝膠過(guò)濾、離子交換、疏水層析、親和層析、HPLC)、電泳技術(shù)(例如，SDS-PAGE、2D-、3D-、等電聚焦)、超速離心、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)(例如，ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫印跡)、核酸包括重組核酸技術(shù)(例如，PCR(反向、逆轉(zhuǎn)錄、嵌套式)、RNA印跡、DNA印跡、DNA-蛋白質(zhì)印跡、原位雜交、FISH、切口轉(zhuǎn)譯、DNA酶足跡法、DNA酶超敏感位點(diǎn)作圖、Maxam-Gilbert測(cè)序法、Sanger測(cè)序法、凝膠移位(泳動(dòng)率變動(dòng))分析、S1核酸酶分析、RNA酶保護(hù)測(cè)定、CAT測(cè)定、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除技術(shù)和報(bào)告基因系統(tǒng))、氨基酸分析(例如，Edman降解)，形態(tài)的、病理的或者表型的觀察，和用或者不用儀器進(jìn)行的其他觀察。
在一些實(shí)施方案中，對(duì)受試者直接或者間接詢問(wèn)他們的健康狀況和由于施用本發(fā)明的治療組合物(例如，藥物、小分子、和其他治療劑和技術(shù))和方法造成的任何改變。
多種患者間和患者內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)因素影響對(duì)個(gè)體患者的給藥和施用方案的設(shè)計(jì)。對(duì)于任何給定的藥物，在特定受試者中的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)存在很大變異，并且最終應(yīng)答中存在高達(dá)一半或者以上的總變異。這些可變因素的重要性部分地取決于藥劑和它的通常清除途徑。例如，主要通過(guò)腎臟除去并且不變地排泄到泌尿系統(tǒng)中的藥劑傾向于比代謝失活的藥劑在具有相似腎功能的受試者中表現(xiàn)出更小的患者間可變性。廣泛代謝的藥劑與具有高代謝清除和大的首過(guò)消除率的藥劑在患者間生物利用率中表現(xiàn)出大的差異。具有較低生物轉(zhuǎn)化率的藥劑通常在個(gè)體受試者中的清除率方面存在最大的變異。受試者基因型的差異在決定不同的代謝率中也起重要作用。個(gè)體受試者的器官功能中的病理和生理變異(例如，腎臟或者肝臟疾病)是可以影響藥劑的處置速率的主要因素。腎臟或者肝臟疾病通常損害藥物處置，從而增加患者間藥物可變性。其他因素(例如，年齡)也可以影響靶定細(xì)胞和組織(例如，腦)對(duì)本發(fā)明的特定組合物或方法的響應(yīng)性，并且可以改變藥劑的治療目標(biāo)水平的預(yù)期范圍。
當(dāng)必需侵入性患者樣品(例如，血液、血清、血漿、組織等等)來(lái)測(cè)定受試者中治療劑的濃度時(shí)，應(yīng)該在考慮多種標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行收集步驟的設(shè)計(jì)，這些標(biāo)準(zhǔn)包括，但不限于1)藥劑的濃度和任何希望的治療效果或者可避免的毒性作用之間是否存在關(guān)系；2)這些是重要的患者間變異，還是藥劑處置中小的患者間變異；3)監(jiān)視藥劑的效果是否困難或者不實(shí)際；和4)藥劑的治療濃度是否接近毒性濃度。在其他實(shí)施方案中，除了濃度測(cè)量，還進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)、藥效動(dòng)力學(xué)或者藥理學(xué)作用的額外測(cè)量。
在一些情況下，藥劑的濃度調(diào)節(jié)到目標(biāo)水平后，存在顯著的患者間應(yīng)答變異。對(duì)于一些藥劑，該藥效動(dòng)力學(xué)可變性占受試者應(yīng)答中總變異的多數(shù)。在一些實(shí)施方案中，藥劑的濃度和所觀察到的應(yīng)答程度的關(guān)系可能是復(fù)雜的，甚至當(dāng)在體外簡(jiǎn)化系統(tǒng)中測(cè)量應(yīng)答時(shí)也是如此，盡管通常見(jiàn)到S形濃度效應(yīng)曲線。藥劑濃度(例如，患者的血漿中)和測(cè)量的效果之間通常沒(méi)有單一的特征性關(guān)系。在一些實(shí)施方案中，濃度效應(yīng)曲線可以是向上凹的。在其他實(shí)施方案中，該曲線是向下凹的。在其他實(shí)施方案中，該數(shù)據(jù)曲線是線性的、S形或者倒置的U形。此外，如果測(cè)量的響應(yīng)是幾種效應(yīng)的復(fù)合，那么得到的濃度效應(yīng)關(guān)系曲線可以是扭曲的。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到的計(jì)算和技術(shù)將復(fù)合的濃度-效應(yīng)曲線分解成更簡(jiǎn)單的分曲線。
簡(jiǎn)化的濃度效應(yīng)關(guān)系，不管它們的精確形狀，可以視為具有四個(gè)特征變量效力、斜率、最大效能、和個(gè)體變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，通過(guò)用濃度軸與濃度效應(yīng)曲線相交來(lái)測(cè)量藥劑的效力。盡管效力通常表示為產(chǎn)生所希望的效果所需的藥劑的劑量，但是它更合適地表示為與受試者中(例如，血漿中)藥劑的濃度相關(guān)，該濃度最接近體外系統(tǒng)中所希望的條件，以避免復(fù)雜的藥物動(dòng)力學(xué)變量。盡管效力影響藥劑給藥，但是僅僅藥劑的效力的知識(shí)在臨床使用中是相對(duì)不重要的，只要可以方便地對(duì)受試者施用足夠得到目標(biāo)水平的劑量。公認(rèn)效力更大的藥劑不一定在治療上優(yōu)于效力較小的藥劑。然而，該原理的一個(gè)例外是經(jīng)皮藥劑的領(lǐng)域中。
藥劑可以在受試者中誘導(dǎo)的最大效應(yīng)稱作它的最大或者臨床效能。藥劑的最大效能通常由該藥劑的性質(zhì)和它的受體-效應(yīng)器系統(tǒng)決定并且在濃度-效應(yīng)曲線的平頂中反映。然而，在臨床使用中，藥劑的劑量可以受到不希望的作用(例如，毒性)的限制，并且在不危害受試者的情況下，藥劑的真實(shí)的最大效能實(shí)際上是不可能實(shí)現(xiàn)的。
濃度效應(yīng)曲線的斜率和形狀反映了該藥劑的作用機(jī)理，包括該曲線的形狀，其至少部分描述了對(duì)該藥劑受體的結(jié)合。濃度效應(yīng)曲線的上升表明該藥劑的臨床上有用的劑量范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，本文應(yīng)用的劑量范圍是基于可靠的藥理學(xué)原理的近似值，并且在給予相同濃度的藥劑的情況下，實(shí)際應(yīng)答將在不同個(gè)體之間變化，并且甚至將在特定個(gè)體中隨著時(shí)間而變。公知濃度效應(yīng)曲線是基于平均應(yīng)答，或者經(jīng)過(guò)適應(yīng)性改變以反映特定個(gè)體中特定時(shí)間的實(shí)際應(yīng)答。
在特定個(gè)體中產(chǎn)生指定效應(yīng)的藥劑濃度稱作個(gè)體有效濃度。個(gè)體有效濃度通常表現(xiàn)為對(duì)數(shù)正態(tài)分布，導(dǎo)致從濃度的對(duì)數(shù)對(duì)實(shí)現(xiàn)所希望的效果的頻率作圖得到正規(guī)變分曲線。作為藥劑濃度的函數(shù)的實(shí)現(xiàn)所希望效果的個(gè)體的累積頻率分布稱作濃度百分?jǐn)?shù)曲線或者量子濃度效應(yīng)曲線。該曲線的形狀通常是S形的。濃度百分?jǐn)?shù)曲線的斜率是群體中藥效動(dòng)力學(xué)可變性的表達(dá)而不是個(gè)體患者中從閾值到最大效應(yīng)的濃度范圍的表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解半數(shù)有效量(ED50)是足夠在50％群體中產(chǎn)生所希望的效果的藥劑劑量。
在臨床前藥物研究中，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中測(cè)定劑量(MTD)。MTD與ED50的比表示該藥劑的治療指數(shù)并且是藥劑在產(chǎn)生它的期望效應(yīng)中的選擇性的量度。在臨床研究中，將足夠產(chǎn)生毒性效應(yīng)的藥劑劑量，或者優(yōu)選濃度與群體中治療效果所需的濃度比較以提供臨床治療指數(shù)。然而，由于群體中的個(gè)體藥效動(dòng)力學(xué)變異，在大多數(shù)受試者中產(chǎn)生治療效果所需的藥劑濃度或者劑量有時(shí)與在一些受試者中產(chǎn)生毒性的濃度重疊，盡管該藥劑具有大的治療指數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解很少的治療劑產(chǎn)生單一效應(yīng)，從而，取決于測(cè)量的效應(yīng)，該藥劑的治療指數(shù)可以改變。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案提供了個(gè)體化給藥水平和方案的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在考慮多種生物學(xué)和藥理學(xué)因素后設(shè)計(jì)對(duì)于特定受試者的最佳治療方案，這些因素包括，但不限于，受試者中應(yīng)答所施用的藥劑的可能變異來(lái)源、診斷細(xì)節(jié)(例如，疾病的嚴(yán)重性和階段、并發(fā)癥的存在，等等)、服用的其他處方和非處方藥物、預(yù)定的效能目標(biāo)、可接受的毒性界限、治療對(duì)非治療或者用其他多種可得藥劑治療的成本-益處分析、受試者依從性的可能性、可能的投藥差錯(cuò)、藥劑吸收速率和程度、受試者的身體大小和組成、藥劑的分布、藥劑的藥物動(dòng)力學(xué)特性(例如，生理學(xué)變量、病理學(xué)變量、遺傳因素和素質(zhì)、藥物相互作用、潛在的藥物抗性、預(yù)測(cè)的清除率)、可能的藥物-受體相互作用、功能狀態(tài)、和安慰劑效果。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，臨床醫(yī)生選擇合適的標(biāo)記來(lái)測(cè)量受試者中施用的藥劑的最終有效性。本發(fā)明計(jì)劃在一些實(shí)施方案中，藥劑有效性的合適的標(biāo)記包括某些可測(cè)量的生物學(xué)狀態(tài)、狀況或者化學(xué)水平(例如，毒素負(fù)荷、病毒滴度、抗原負(fù)荷、溫度、炎癥、血細(xì)胞數(shù)、抗體、腫瘤形態(tài)，等等)的降低(或者升高)。許多診斷方法和測(cè)試可以用于收集多種標(biāo)記的信息，這些方法和測(cè)試包括但不限于，細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法(例如，軟凝膠中的侵入測(cè)定法，等等)、放射照相檢查(例如，胸部X射線)、計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)掃描、計(jì)算機(jī)化斷層X(jué)線攝影法掃描或者計(jì)算機(jī)控制軸向斷層攝影術(shù)(CAT)掃描、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)掃描、磁共振成像(MRI或者NMRI)、乳房造影法、超聲檢查法(經(jīng)陰道、經(jīng)結(jié)腸直腸)、閃爍乳房造影法(例如，锝99m sestamibi、锝99m替曲膦)、吸引術(shù)(例如，子宮內(nèi)膜的)、觸診、PAP測(cè)試(例如，涂片)、乙狀結(jié)腸鏡檢查(例如，柔韌的光導(dǎo)纖維的)、糞潛血試驗(yàn)(例如，基于愈創(chuàng)木脂的FOBT)、直腸指診、結(jié)腸鏡檢查、虛擬結(jié)腸鏡檢查(也稱作結(jié)腸成像術(shù)(colonography))、鋇灌腸、糞便分析(見(jiàn)，例如，K.W.Kinzler和B.Vogelstein，Cell，87(2)159-70(1996)；S.M.Dong等人，J.Natl.Cancer Inst.，93(11)858-865(2001)；G.Traverso等人，N.Engl.J.Med.，346(5)311-20(2002)；G.Traverso等人，Lancet，359(9304)403(2002)；和D.A.Ahlquist等人，Gastroenterology，119(5)1219-1227，(2000))、血清前列腺特異性抗原(PSA)篩選、內(nèi)窺鏡檢查、鎵掃描、骨髓和組織活組織檢查(例如，核心針，經(jīng)皮針吸活檢，胸廓切開(kāi)術(shù)，子宮內(nèi)膜的，等等)和組織學(xué)檢查、直接和/或間接臨床觀察(例如，患者調(diào)查、詢問(wèn)或者問(wèn)卷)、細(xì)胞學(xué)采樣和生物學(xué)組織、流體和其中的標(biāo)記的收集(例如，血液、尿(例如，血尿篩選、尿細(xì)胞學(xué)檢查)、痰(例如，痰細(xì)胞學(xué))、糞便、CNS液(例如，LP、腰椎穿刺)、血液產(chǎn)物，包括蛋白質(zhì)和肽(例如，Bcl-2家族蛋白質(zhì))、癌癥標(biāo)記(例如，CA125(卵巢癌)、CA 15-3(乳腺癌)、CEA(卵巢、肺、乳腺、胰腺和胃腸道癌)、PSA(前列腺癌)、p53基因產(chǎn)物、MIC2基因產(chǎn)物)、代謝產(chǎn)物(例如，香草扁桃酸(VMA)，和高香草酸(HVA))、抗原(例如，血清甲胎蛋白(AFP))、鹽、礦物質(zhì)、維生素、可溶性因子、不溶性因子、核酸，等等)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用在細(xì)胞培養(yǎng)物或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中為了例如測(cè)定MTD和ED50的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法來(lái)確定藥劑的毒性和治療效果。優(yōu)選顯示出大的治療指數(shù)的藥劑。從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定或者動(dòng)物模型得到的數(shù)據(jù)可以用于配制例如哺乳動(dòng)物(例如，人、家馬(Equus caballus)、家貓(Felis catus)和家犬(Canis familiaris)等)中的給藥范圍。優(yōu)選的給藥濃度接近對(duì)于藥劑所計(jì)算或者觀測(cè)到的ED50值。更優(yōu)選的給藥濃度接近藥劑的ED50值并且導(dǎo)致很小的毒性或者不導(dǎo)致毒性。取決于制劑、患者的敏感性和施用途徑，任何給定的劑量可以在任何特定藥劑的治療指數(shù)內(nèi)變動(dòng)，超過(guò)或者小于該治療指數(shù)。
實(shí)施例 提供下面的實(shí)施例用于證明和進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案和方面，并且不應(yīng)理解為限定本發(fā)明的范圍。
方法 腫瘤建立和分析如以前報(bào)導(dǎo)的在8周齡的雌性NOD-SCID小鼠中建立人乳腺癌腫瘤1。
細(xì)胞培養(yǎng)將第一代或第二代原初乳腺癌細(xì)胞以一式三份在12-膠原包被孔的皿中接種于HAM-F12培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)加胎牛血清(1％)、胰島素(5μg/ml)、氫化可的松(1μg/ml)、EGF(10μg/ml)、霍亂毒素(0.1μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒(GIBCO BRL，推薦的稀釋度)、pen/strep、和兩性霉素B(Gibco/BRL)。培養(yǎng)基每?jī)商旄鼡Q一次。
流式細(xì)胞術(shù)為了制備用于流式細(xì)胞術(shù)分析的細(xì)胞，在小鼠中傳代一次或兩次的人乳腺癌腫瘤1的單一細(xì)胞懸浮液通過(guò)切碎腫瘤并用200u/ml膠原酶3(Worthington)在M199培養(yǎng)基(Gibco/BRL，Rockville，MD)中于37℃下恒定攪拌消化2-4小時(shí)來(lái)制備。抗體包括抗-CD44、抗-CD24、抗ESA-FITC(Biomeda，CA)、抗-H2K、和山羊抗-人Notch4(Santa Cruz Products，Santa Cruz，CA)。除非說(shuō)明，抗體購(gòu)自Pharmingen(San Diego，CA)。取決于實(shí)驗(yàn)，將抗體直接綴合到多種熒光染料。在所有實(shí)驗(yàn)中，在流式細(xì)胞術(shù)中通過(guò)拋棄H2K+(I類MHC)細(xì)胞來(lái)去除小鼠細(xì)胞。通過(guò)生活力染料7-AAD來(lái)除去死細(xì)胞。在FACSVantage(Becton Dickinson，San Jose，CA)上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。
Notch報(bào)道子測(cè)定法用HES-1Notch應(yīng)答元件制備HES-1-螢光素酶報(bào)道構(gòu)建體38。HES-1鼠基因的-194和+160之間的片段通過(guò)PCR擴(kuò)增并亞克隆到pGL2基本載體(Promega)的KpnI和BglII位點(diǎn)之間。MCF-7細(xì)胞用HES-1-luc構(gòu)建體和pSV2Neo共轉(zhuǎn)染并在含有遺傳霉素的培養(yǎng)基中選擇。轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞在12孔板中于存在或不存在Notch4多克隆抗體(Santa Cruz；20μg/ml終濃度)、可溶性Delta-Fc(13)或者Notch4抗體阻斷肽(4mg/100ml終濃度，Santa CruzProducts)時(shí)共培養(yǎng)。如所述的進(jìn)行螢光素酶測(cè)定38。Delta-Fc或者Fc對(duì)照蛋白質(zhì)從經(jīng)工程化而分泌它們的293細(xì)胞的上清液濃縮11。將Delta-Fc或者Fc對(duì)照蛋白質(zhì)與交聯(lián)性抗-Fc抗體(JacksonImmunoresearch)一起加入乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)物中11。
細(xì)胞凋亡測(cè)定10,000-20,000個(gè)致瘤T1細(xì)胞(ESA+CD44+CD24-/low譜系)或者來(lái)自T5、T7和T8的譜系-腫瘤細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選并在膠原涂布的組織培養(yǎng)板上生長(zhǎng)。然后將抗-Notch4多克隆抗體(Santa Cruz，CA)加入培養(yǎng)基(20mg/ml終濃度)，而PBS加入對(duì)照板。為了封閉抗-Notch4抗體，將抗-Notch4抗體與封閉肽(SantaCruz，CA)在冰上預(yù)溫育30分鐘，之后加入培養(yǎng)基中。48小時(shí)后，將細(xì)胞用胰蛋白酶處理并收集。將105個(gè)細(xì)胞懸浮在HBSS 2％熱失活的小牛血清中，然后用FAM-DEVD-FMK測(cè)定細(xì)胞凋亡以檢測(cè)活細(xì)胞中的活性胱天蛋白酶，F(xiàn)AM-DEVD-FMK是對(duì)胱天蛋白酶3和7特異的羧基熒光素標(biāo)記的肽底物(CaspaTagTM Caspase Activity Kit，Intergen Company，NY)。用FACSVantage流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，CA)區(qū)分胱天蛋白酶陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞。如所描述的進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的PI染色39。
重組腺病毒 如下構(gòu)建稱作Ad-GFP-dnMAML1的E3缺失的腺病毒載體用具有EcoRI位點(diǎn)和ATG起始密碼子的正向引物，和具有HpaI位點(diǎn)的反向引物，通過(guò)PCR從正常乳腺細(xì)胞產(chǎn)生人MAML1的氨基酸1-302的編碼區(qū)。所得的DNA片段在IRES-GFP基因上游克隆入MSCVneoEB載體中。然后將dnMAML1-IRES-GFP克隆在腺病毒穿梭載體pACCMV2的EcoRI和BamHI位點(diǎn)處。然后在密歇根大學(xué)(University of Michigan)病毒核心產(chǎn)生重組腺病毒。細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)并以一式三份進(jìn)行感染事件。在沒(méi)有FBS的培養(yǎng)基中加入不同濃度的病毒顆粒進(jìn)行病毒感染。最初，用AD-GFP對(duì)每種細(xì)胞系或者原代細(xì)胞確定最佳病毒濃度以實(shí)現(xiàn)高基因表達(dá)和低病毒滴度的最佳平衡，從而最小化細(xì)胞毒性。培養(yǎng)4小時(shí)后，將感染培養(yǎng)基補(bǔ)充對(duì)每種細(xì)胞類型合適的FBS量。通過(guò)將在40倍放大倍數(shù)下來(lái)自三個(gè)不同的顯微鏡視野中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)除以細(xì)胞總數(shù)，或者當(dāng)用FACS檢查GFP時(shí)，通過(guò)Cellquest來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(感染后24小時(shí))。
PCR分析 通過(guò)定量RT-PCR進(jìn)行Fringes、Notch和它們的配體的基因表達(dá)分析。用于所檢查基因的PCR反應(yīng)的引物從Applied Biosystems購(gòu)買。對(duì)于每個(gè)群體和每種測(cè)定的基因，使用上述標(biāo)記通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)一式三份地分離2000個(gè)致瘤和非致瘤細(xì)胞。用Trizol按照GIBCO BRL方案進(jìn)行RNA分離。用OligodT錨引物進(jìn)行cDNA產(chǎn)生，用TaqmanAssay-on-demand系統(tǒng)(Applied Biosystems)準(zhǔn)備PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)在ABI PRISM7900HT Sequence Detection System(AB)上進(jìn)行，其是高通量實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，該系統(tǒng)檢測(cè)并定量核酸序列。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析表明為單一PCR產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)。用2ΔΔCT方法40進(jìn)行差別基因表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
蛋白質(zhì)印跡分析 對(duì)來(lái)自用pcDNA3轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞(MCF-7-V)、用顯性失活FADD轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞(MCF-7/dnFADD)27、和用Bcl-XL轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞的2個(gè)克隆(MCF-7/BCL-XL，克隆1和2)28的等量細(xì)胞裂解物測(cè)試期望的蛋白質(zhì)的表達(dá)。將293T細(xì)胞用pcDNA3-FLAG-BCL-XL瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。用抗-FLAG抗體已經(jīng)證實(shí)了FLAG-BCL-XL蛋白質(zhì)的表達(dá)。為了檢測(cè)AUI標(biāo)記的dnFADD蛋白質(zhì)，使用抗-AUI小鼠單克隆抗體(1/1,000)(Covance，Berkeley-CA)。用抗-BCL-Xs/l(S-18)兔多克隆抗體(稀釋度1/500)(Santa Cruz Biotecnology Inc.，Santa Cruz-CA)檢測(cè)BCL-XL水平。對(duì)于原代腫瘤1和腫瘤4(稱作T1和T4)，如以前描述的1從每種腫瘤中分選ESA+CD44+CD24-/low譜系-群體(稱作T)的2000個(gè)細(xì)胞的樣品或者非致瘤群體(稱作NT)的2000個(gè)細(xì)胞的樣品。對(duì)于原代腫瘤2、3和5(稱作T2、T3和T5)，如以前描述的從每種腫瘤分選2000個(gè)H2K-細(xì)胞。這代表致瘤和非致瘤癌細(xì)胞的混合群體。每種基因用3個(gè)獨(dú)立分選的細(xì)胞樣品進(jìn)行分析。(+)表示檢測(cè)到基因的表達(dá)。(-)表示沒(méi)有檢測(cè)到基因表達(dá)。(ND)表示沒(méi)有進(jìn)行該測(cè)定。指出了4種Notch受體的每一種的分析，以及Delta和Jagged家族的Notch配體。還分析了Fringes(Lunatic、Manic和Radical)。
通過(guò)調(diào)節(jié)Notch途徑信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)癌癥干細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié) 該實(shí)施例描述了通過(guò)靶定Notch途徑信號(hào)傳導(dǎo)而不直接靶定Notch4來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的化合物和方法。
γ-分泌酶抑制劑。對(duì)顯示出表達(dá)Notch的20,000個(gè)MCF-7細(xì)胞在6孔板中一式三份接種以測(cè)定細(xì)胞生活力。48小時(shí)后，向細(xì)胞加入1.19μg/mlγ-分泌酶抑制劑。12、24和48小時(shí)后對(duì)總的細(xì)胞和錐蟲(chóng)藍(lán)陰性(活)細(xì)胞計(jì)數(shù)并確定與對(duì)照孔相比的活細(xì)胞的％。
在本發(fā)明的開(kāi)發(fā)期間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)用來(lái)測(cè)試Notch信號(hào)傳導(dǎo)阻斷對(duì)MCF-7細(xì)胞的存活和增殖的影響。將細(xì)胞與γ-分泌酶抑制劑共培養(yǎng)，γ-分泌酶抑制劑抑制Notch受體的最終切割，防止Notch胞內(nèi)(IC)結(jié)構(gòu)域的釋放，基本上阻斷Notch信號(hào)傳導(dǎo)(Karlstrom等人，J.Biol.Chem.，2776763(2002))。暴露于抑制劑后測(cè)定細(xì)胞生活力。暴露后12、24和48小時(shí)確定活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。24小時(shí)后生活力顯著降低，大多數(shù)細(xì)胞在48小時(shí)后死亡。為了確定γ-分泌酶抑制劑對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的特異性，使用用處于HES-1啟動(dòng)子控制下的螢光素酶報(bào)道基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)螢光素酶測(cè)定法監(jiān)視HES-1啟動(dòng)子的反式活化或者抑制，HES-1啟動(dòng)子是Notch信號(hào)傳導(dǎo)的下游元件。將細(xì)胞與γ-分泌酶抑制劑共同培養(yǎng)并監(jiān)視螢光素酶活性的改變。暴露后12小時(shí)該抑制劑明顯減小了螢光素酶的活性，而細(xì)胞生活力仍然很高，表明它特異性地抑制Notch受體的表達(dá)。
為了確定MCF-7細(xì)胞中Notch信號(hào)傳導(dǎo)的抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)理，測(cè)定暴露于γ-分泌酶抑制劑的細(xì)胞中的胱天蛋白酶活化。暴露后24小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞中降解的DNA的積累，因?yàn)檫@是細(xì)胞凋亡特有的。與對(duì)照MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)物比較。在暴露于γ-分泌酶抑制劑的細(xì)胞中具有激活的胱天蛋白酶3/7的細(xì)胞數(shù)目顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明在MCF-7細(xì)胞系中，阻斷的Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過(guò)胱天蛋白酶3/7活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試Notch信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)來(lái)自5名不同乳腺腫瘤患者的乳腺癌細(xì)胞在體外增殖能力的影響。培養(yǎng)來(lái)自患者的細(xì)胞。通過(guò)將這5種不同細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于γ-分泌酶抑制劑來(lái)檢查Notch信號(hào)傳導(dǎo)的作用。將細(xì)胞置于膠原包被的培養(yǎng)板上的以前建立的細(xì)胞培養(yǎng)基中并允許生長(zhǎng)。然后向培養(yǎng)物中加入抑制劑并在48小時(shí)后進(jìn)行生活力測(cè)定。γ-分泌酶抑制劑對(duì)這些細(xì)胞的生活力有顯著影響，如圖7中所示。這些數(shù)據(jù)證明，Notch活化促進(jìn)了在所有這5種重新生長(zhǎng)的腫瘤中乳腺癌細(xì)胞的存活或增殖。
體內(nèi)Notch信號(hào)傳導(dǎo)的抑制抑制了致瘤癌細(xì)胞的腫瘤形成 進(jìn)一步來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定Notch信號(hào)傳導(dǎo)的阻斷是否抑制體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的腫瘤形成。以前發(fā)現(xiàn)在乳腺癌腫瘤中僅乏部分稱作致瘤癌細(xì)胞的癌細(xì)胞在異種移植的小鼠模型中形成腫瘤，而多數(shù)癌細(xì)胞缺乏該能力(Al-Hajj等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1003983(2003))。少至1000個(gè)來(lái)自患者乳腺腫瘤1(TP1)的致瘤癌細(xì)胞和10,000個(gè)來(lái)自患者乳腺腫瘤4(TP4)的致瘤癌細(xì)胞能夠在NOD/SCID小鼠中形成新腫瘤(Al-Hajj等人，同上)。因此，將TP1和TP4致瘤癌細(xì)胞與對(duì)照腺病毒或者dnMAML1腺病毒培養(yǎng)3小時(shí)。每組NOD/SCID小鼠注射10,000個(gè)或者1,000個(gè)TP1致瘤癌細(xì)胞。即使在注射到小鼠體內(nèi)的時(shí)候，絕大多數(shù)感染了對(duì)照或者dnMAML1腺病毒的癌細(xì)胞仍然存活，用dnMAML1腺病毒感染的TP1細(xì)胞感染的細(xì)胞的10次注射中的0次形成腫瘤，而感染了對(duì)照腺病毒的細(xì)胞的所有注射都形成腫瘤。類似地，感染了對(duì)照腺病毒的10,000個(gè)TP4細(xì)胞的所有5次注射都形成腫瘤，而感染了dnMAML-1腺病毒的10,000個(gè)細(xì)胞的注射都不形成腫瘤。這些數(shù)據(jù)表明，Notch信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)癌細(xì)胞存活和體內(nèi)新腫瘤的形成是重要的，并且通過(guò)本發(fā)明的方法對(duì)該途徑的阻斷導(dǎo)致這些細(xì)胞失去形成腫瘤的能力。
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權(quán)利要求
1.鑒定腫瘤樣品中致瘤細(xì)胞的存在的方法，其包括檢測(cè)所述致瘤細(xì)胞特征性的一種或多種標(biāo)記或者性質(zhì)，其中所述一種或多種標(biāo)記或者性質(zhì)不是非致瘤細(xì)胞特征性的，其中所述一種或多種標(biāo)記或者性質(zhì)選自Notch4的表達(dá)、暴露于抗Notch4抗體時(shí)細(xì)胞死亡、ManicFringe的表達(dá)、Notch配體Delta相對(duì)于所述非致瘤細(xì)胞改變的表達(dá)、Jagged的表達(dá)、和暴露于顯性失活腺病毒載體dnMAML1或γ-分泌酶抑制劑時(shí)細(xì)胞死亡。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤包括乳腺癌腫瘤。
3.權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)所述一種或多種標(biāo)記或者性質(zhì)的兩種或更多種。
4.權(quán)利要求1的方法，其還包括基于所述致瘤細(xì)胞的存在或不存在為受試者選擇治療行動(dòng)過(guò)程。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述治療行動(dòng)過(guò)程包括對(duì)所述受試者施用Notch4途徑抑制劑。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述治療行動(dòng)過(guò)程包括對(duì)所述受試者施用啟動(dòng)線粒體凋亡的藥物。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述治療行動(dòng)過(guò)程包括對(duì)所述受試者施用γ-分泌酶抑制劑。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述治療行動(dòng)過(guò)程包括對(duì)所述受試者施用Manic Fringe抑制劑。
9.選擇或者表征化合物的方法，其包括a)提供包含致瘤乳腺細(xì)胞的樣品；b)將所述樣品暴露于受試化合物；和c)檢測(cè)所述細(xì)胞中響應(yīng)所述受試化合物而發(fā)生的改變。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物包含抗體。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物包含抗腫瘤化合物。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞還用已知的抗腫瘤治療化合物進(jìn)一步處理。
13.權(quán)利要求9的方法，其中所述樣品包含人乳腺組織。
14.權(quán)利要求9的方法，其中所述檢測(cè)包括檢測(cè)所述致瘤乳腺細(xì)胞的細(xì)胞死亡。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所述檢測(cè)包括檢測(cè)所述致瘤細(xì)胞特征性的一種或多種標(biāo)記或者性質(zhì)的改變。
16.治療帶有致瘤乳腺細(xì)胞的受試者的方法，其包括a)鑒定所述受試者中致瘤乳腺細(xì)胞的存在；b)鑒定所述致瘤乳腺細(xì)胞特征性的一種或多種標(biāo)記或者性質(zhì)以鑒定所述致瘤乳腺細(xì)胞的特性；和c)基于所述致瘤乳腺細(xì)胞的所述特性選擇治療行動(dòng)過(guò)程。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述一種或多種標(biāo)記或者性質(zhì)選自Notch4的表達(dá)、暴露于抗Notch4抗體時(shí)細(xì)胞死亡、Manic Fringe的表達(dá)、Notch配體Delta相對(duì)于所述非致瘤細(xì)胞改變的表達(dá)、Jagged的表達(dá)、和暴露于顯性失活腺病毒載體dnMAML1或γ-分泌酶抑制劑時(shí)細(xì)胞死亡。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述行動(dòng)過(guò)程包括當(dāng)所述致瘤乳腺細(xì)胞的特征是表達(dá)Notch4時(shí)，對(duì)所述受試者施用Notch4途徑抑制劑。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述行動(dòng)過(guò)程包括從所述受試者手術(shù)除去腫瘤和對(duì)所述受試者施用Notch途徑抑制劑。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述行動(dòng)過(guò)程包括對(duì)所述受試者共同施用Notch途徑抑制劑和另一種抗腫瘤劑。
21.預(yù)防或者減少轉(zhuǎn)移的方法，其包括對(duì)懷疑有轉(zhuǎn)移的受試者施用Notch途徑抑制劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述Notch途徑抑制劑包含抗-Notch4抗體。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述化合物包含γ-分泌酶抑制劑。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述化合物包含Manic Fringe抑制劑。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述化合物包含啟動(dòng)線粒體凋亡的藥物。
26.權(quán)利要求21的方法，其中結(jié)合從所述受試者除去實(shí)體瘤進(jìn)行所述施用。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述實(shí)體瘤包括乳腺腫瘤。
28.減少或者清除乳腺癌受試者中致瘤細(xì)胞的方法，其包括對(duì)所述受試者施用γ-分泌酶抑制劑。
29.減少或者清除乳腺癌受試者中致瘤細(xì)胞的方法，其包括對(duì)所述受試者施用Manic Fringe抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及表征、調(diào)節(jié)、診斷和治療癌癥的組合物和方法。例如，本發(fā)明提供了抑制某些類型的癌細(xì)胞(包括乳腺癌細(xì)胞)的腫瘤發(fā)生和預(yù)防轉(zhuǎn)移的組合物和方法。本發(fā)明還提供了鑒定調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的化合物的系統(tǒng)和方法。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1950518SQ200580009740
公開(kāi)日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月3日
發(fā)明者M·F·克拉克, M·阿爾－哈吉 申請(qǐng)人:密執(zhí)安州立大學(xué)董事會(huì)