專利名稱：標記試劑、合成這樣的試劑的方法和檢測生物分子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物分子的新的標記試劑，合成所述標記的方法，以及用于標記生物分子的用途，特別是在采用核酸分析的診斷領域。
現有技術顯示，存在許多方法來標記核苷酸、寡核苷酸或核酸。
第一種方法在于，將標記連接在堿基上，不論該堿基是天然的還是經修飾的。第二種方法建議，將標記連接在糖上，在此仍然不論該糖是天然的還是經修飾的。第三種方法的目標是，將標記連接在磷酸上。
在堿基上進行標記尤其用于通過整合入經直接標記的核苷酸而對核酸進行標記的方法中。
在糖上進行標記常常用于通過化學合成制備的核酸探針的情況。
在磷酸上進行標記也用于在化學合成寡核苷酸期間引入功能化的臂和標記。
實際上，必須對核苷酸或者核苷酸類似物或核酸進行標記的本領域技術人員傾向于實施與堿基或糖的連接，這樣能夠提供更多的方便和選擇。此外，可從許多文獻的研究中獲知，例如對于堿基的EP-A-0.329.198、EP-A-0.302.175、EP-A-0.097.373、EP-A-0.063.879、US-A-5,449,767、US-A-5,328,824、WO-A-93/16094、DE-A-3.910.151、EP-A-0.567.841，或對于糖的EP-A-0.286.898。
將標記連接在磷酸上是比在于功能化堿基或糖的技術更復雜的技術，并且特別是由于磷酸的弱反應性而被使用的情況要少得多(例如參見Jencks W.P.等人，J.Amer.Chem Soc.，82，1778-1785，1960)。同樣地，在涉及將探針引入寡核苷酸片段中的方法的由O′Donnel和Mc Laughlin所作的綜述(″Reporter groups for the analysis of nucleicacid structure″，p 216-243，″Bioorganic ChemistryNucleic Acids″，EdHecht S.M.，Oxford University Press，1996)中，核苷酸間磷酸二酯的有效烷基化被認為是不可能的。
專利申請WO-A-99/65926描述了標記合成或天然的核糖核酸(RNA)的方法，其在于片段化RNA并在末端磷酸處進行標記。該文獻描述了一些能夠用于與片段化關聯地進行標記的官能團，例如官能團羥基、胺、肼、烷氧基胺、烷基鹵、芐基類型的烷基鹵，特別是衍生物5-(溴甲基)熒光素。這些官能團使得能夠標記核酸，但是必需結合片段化步驟以獲得有效標記，因為標記過程是在片段化期間在游離的磷酸上發(fā)生的。此外，還必需添加相對于RNA過量的標記試劑以獲得有效標記，這就引起了由過量的標記產生的背景噪聲的問題。最后，該方法不能有效地功能化雙鏈DNA。
因此，存在對于新的試劑的需求，該試劑從標記收率的角度來看是有效的，其在標記位置的水平上是特異的，特別是不影響在借助于氫鍵形成雙螺旋中所牽涉的堿基的雜交特性，其可用于DNA和RNA，和最后，其使得能夠無差別地標記核苷酸、寡核苷酸、核酸，它們是天然的或經酶促擴增而制備的。
申請人已經建議了這樣的新型標記，其滿足上述條件和使用重氮基甲基官能團作為用于進行標記的反應性官能團。這例如為下列文獻中的情況，專利申請WO-A-02/090319和WO-A-02/090584，或Laayoun等人的文章，發(fā)表在Bioconjugate Chem.2003，14，1298-1306中，題目為“Aryldiazomethanes for Universal Labelling of Nucleic Acids andAnalysis on DNA Chips”，讀者可以參考這些文獻以更好地理解這樣的組分的合成和使用的方式。
因此，重氮基甲基官能團(式-C(N2)-)已經用于磷酸基團的烷基化，但是存在一些問題。一方面，帶有至少一個重氮基官能團的試劑通常自身是不穩(wěn)定的，這就對在標記試劑盒中應用這些試劑造成了問題，如果經標記的產物具有證明任何樣品中生物靶分子的存在的功能，那么這是不可接受的。
最后，具有重氮基甲基官能團并與某些標記如生物素相連的試劑在水中是微溶的，這導致能夠將可與水混溶的有機溶劑用于與僅溶于水或水性緩沖液的生物分子的偶聯，但這些溶劑在標記反應中以高濃度存在，減慢了反應速度，因此損害了偶聯效率。
由上述文獻WO-A-02/090319和WO-A-02/090584所推薦的標記試劑也解決這些技術問題。在此引入這些申請的內容作為參考。
但是，即使這些用于進行標記的分子和方法是特別有效的，申請人還是成功地發(fā)現了新的分子和新的方法，其進一步改善了標記效率。本發(fā)明涉及使用多胺化的臂，其如同乙二醇臂一樣，使得生物素遠離反應中心(重氮基官能團)。因此，獲得了更好的在水性介質中的可溶性，因為引入了親水性的臂，并可能使胺在中性pH的介質中質子化，這引起帶負電的核酸與標記之間的吸引，從而導致下列兩個主要結果·更快速的標記過程，這可能對于低濃度的樣品來說是特別有益的，和·通過磷酸的負電荷的中和穩(wěn)定了雙螺旋。
此外，這些新的分子使得能夠實施能夠在酸性介質中功能化的方法，這對于帶有重氮基官能團的分子來說是特別有益的。因此，具有重氮基官能團的試劑的選擇性在酸性介質中更大。因此，被給予聚酰胺鏈的可溶性有助于洗滌，同時減小在隨后的檢測中的背景噪聲，甚至純化步驟的完全和簡單的去除。
根據本發(fā)明的第一個實施方案，本發(fā)明提出了式(0)的溫度穩(wěn)定的標記試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，·A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，其使得重氮基官能團能夠與芳環(huán)綴合，和u是0和2之間的整數，優(yōu)選0或1，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，和·p是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數。
根據本發(fā)明的第二個實施方案，本發(fā)明涉及根據權利要求1的式(1)的標記試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，和·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·m是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，和
·p是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數。
有利地，根據前兩個實施方案的變化形式，在試劑的式(0)或(1)中，值p小于或等于值m。
根據本發(fā)明的第三個實施方案，本發(fā)明提出了根據權利要求1-4中任一項的式(2)的試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，和·q是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數。
根據本發(fā)明的第四個實施方案，本發(fā)明描述了根據權利要求1-4中任一項的式(3)的試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，
·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，和·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基。
根據與本發(fā)明的第四個實施方案相關的變化形式，R2由式(4)的D-生物素殘基組成 有利地，不論哪一個前述的試劑的實施方案，R1由CH3組成，以及R3和R4每一個均表示H。
有利地，不論哪一個前述的試劑的實施方案或變化形式，結構-(L)n-由下列組成·精胺或N，N′-雙(3-氨基丙基)-1，4-二氨基丁烷NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，或·亞精胺或N-(3-氨基丙基)-1，4-丁二胺H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，或·含有丙氨酸基序NH2-CH2-CH2-COOH的衍生物。
根據本發(fā)明的第五個實施方案，本發(fā)明還涉及式(6)的溫度穩(wěn)定的標記試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，
·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-·CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，·A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，其使得重氮基官能團能夠與芳環(huán)綴合，和u是0和2之間的整數，優(yōu)選0或1，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，和·p是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數。
根據本發(fā)明的第六個實施方案，本發(fā)明提出了式(7)的溫度穩(wěn)定的標記試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，
·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，和·p是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數。
有利地，不論哪一個前述的試劑的實施方案或變化形式，L包含基序-(O-CH2-CH2)-，其重復1-20次，優(yōu)選1-10次，更優(yōu)選2-5次，那么-Z-表示為-NH-、-NHCO-或-CONH-。
本發(fā)明還涉及合成標記試劑的方法，根據前面的實施方案，其包括下列步驟a)提供具有反應性官能團R6的標記或標記前體，b)提供式(8)的連接臂R7-(Z-(CH2)p)m-R8，其中，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，·p是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，·R7和R8表示相同或不同的兩個反應性官能團，c)在存在至少一種偶聯劑的情況下，使所述標記或標記前體的反應性官能團R6與式(8)的連接臂的官能團R7一起反應，以形成共價鍵，R6和R7是互補的，d)提供式(9)的衍生物 其中，·R1表示H或者烷基或芳基或取代的芳基，
·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，其使得重氮基甲基官能團能夠與芳環(huán)綴合，和u是等于0或1的整數，和·R9表示與R8互補的反應性官能團，e)在存在至少一種偶聯劑的情況下，使式(9)的衍生物的反應性官能團R9與式(8)的連接臂的官能團R8一起反應，以形成共價鍵，f)使肼或一種其衍生物在酮或醛官能團上反應，以形成腙，和g)通過合適的處理將腙轉化成重氮基甲基官能團。
有利地，該合成方法還可以包括·保護化合物(9)的酮或醛官能團的補充步驟，和·使所述的酮或醛官能團去保護的后繼補充步驟。
本發(fā)明還涉及標記生物分子，特別是核酸的方法，其包括在基本上水性的緩沖液中，在均質溶液中使生物分子與根據前述實施方案的試劑接觸。
本發(fā)明還涉及經標記的生物分子，其可以通過根據上述的進行標記的權利要求的方法而獲得。
本發(fā)明還涉及對單鏈或雙鏈核酸進行標記和片段化的方法，其包括下列步驟·使核酸片段化，·借助于選自根據前述實施方案的試劑的標記試劑，將標記連接至至少一個片段上，所述試劑共價地并且主要地偶聯在所述片段的至少一個磷酸上。
有利地，標記和片段化的方法借助于選自式(3)的化合物的標記試劑來實施 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，和·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基。
根據標記和片段化的方法的第一個實施變化形式，片段化和標記以兩個步驟實施。
根據標記和片段化的方法的第二個實施變化形式，片段化和標記以一個步驟實施。
不論采用何種標記和片段化的方法，標記在基本上水性的均質溶液中進行。
不論采用何種標記和片段化的方法，片段化通過酶的、物理的或化學的方法來進行。
本發(fā)明還涉及所有經標記的核酸，其可以通過前述的標記和片段化的方法而獲得。
本發(fā)明還涉及檢測靶核酸的試劑盒，其包含如上所定義的經標記的核酸。
本發(fā)明還涉及在其上固定至少一種如上所定義的試劑的固體支持物。
最后，本發(fā)明涉及捕獲核酸分子的方法，其包括下列步驟
·提供固體支持物，其上直接或間接地固定有至少一種前面定義的生物分子，或者也是前面定義的核酸，所述生物分子或核酸含有重氮基甲基官能團，·與可能含有游離核酸的生物樣品接觸，和·洗滌固體支持物，其中所述分子至少以共價方式連接至核酸。
“多聚體結構”意指由化學或生物合成子的重復單元形成的聚合物。實例可提及專利申請WO-A-02/090319的說明書的實施例34.2。如果本領域技術人員發(fā)現下文中所顯示的信息不足以完全地理解這一主題，請參考該文獻?？稍诒景l(fā)明中使用的這樣的結構的許多變體是已知的，例如·線性聚合物(EP-A-0.561.722、EP-A-0.669.991)，·分枝的聚合物(WO-A-01/92361)，·顆粒(particules)(EP-A-0 827 552)，·樹狀聚合物(US-A-4,507,466；US-A-4,568,737；US-A-6,083,708)，·多核苷酸，和·多肽。
如果證實是需要的，本領域技術人員還可以參考這些文獻以完整地理解這一主題。
“可檢測的標記”意指至少一種能夠直接或間接地產生可檢測的信號的標記。這些標記的非限制性列表如下·產生例如通過比色法、熒光、發(fā)光可檢測的信號的酶，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，·生色團，例如熒光、發(fā)光、染料化合物，·具有通過電子顯微鏡可檢測的電子密度的基團，或者通過其電特性如電導率、電流分析、電量測量、阻抗可檢測的基團，·可檢測的基團，例如該基團的分子足夠大以引入其物理和/或化學特征的可檢測的修飾，這種檢測可以通過光學方法如衍射、表面等離子體子共振、表面變化、接觸角的變化，或者物理方法如原子場光譜學、隧道效應來進行，
·放射性分子，例如32P、35S或125I。
優(yōu)選地，該標記不是放射性標記，以避免與這些標記相關的安全問題。
在本發(fā)明的一個特殊實施方案中，所述標記是可以提供電化學方法檢測的，特別地，所述標記是鐵的絡合物的衍生物，如二茂鐵。
還可以使用間接的系統(tǒng)，例如能夠與抗-配體反應的配體。配體/抗-配體對是本領域技術人員所熟知的，其例如為下列對的情況生物素/鏈霉抗生物素蛋白、半抗原/抗體、抗原/抗體、肽/抗體、糖/凝集素、多核苷酸/該多核苷酸的互補序列。在這種情況下，配體具有重氮基甲基反應性官能團。抗-配體可以通過前面段落中所描述的標記直接進行檢測，或者可以通過另一個配體/抗-配體對而自身進行檢測。這種堆疊系統(tǒng)在實施例中進行了闡述。
間接系統(tǒng)的另一個實例使用配體和抗-配體之間的特定的共價鍵，例如甲基酮和烷氧基胺。此系統(tǒng)的實例描述在專利申請WO-A-00/40590和WO-A-98/05766中。這些間接檢測系統(tǒng)在某些情況下能夠引起信號擴增，關于使用聚合物的化學擴增可參考先前的專利申請WO-A-00/07982、WO-A-01/92361和WO-A-95/08000，關于通過堆疊的化學擴增系統(tǒng)可參考申請WO-A-01/44506。
在信號擴增的一個特殊方式中，在標記試劑上存在至少兩個標記。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，示蹤劑是具有小的位阻的熒光化合物，例如熒光素，六氯熒光素(HEX)，丹磺酰(edans)，羅丹明，四甲基羅丹明(5或6-TAMRA)，羧基-X-羅丹明(ROX)，NIR型的生色團(LI-COR Inc，Lincoln NE，USA)，花青類如Cy5和Cy3的衍生物(Randolph J.B.等人，Nucleic Acids Res.，25(14)，p2923-2929，1997)，特別是Cy5的衍生物，或者示蹤劑是具有小的位阻的半抗原，例如生物素，聯硝基苯(dinitrohenyle)，或松香烷的衍生物(參見申請WO-A-00/07982)?！靶〉奈蛔琛币庵阜肿恿康陀?000g/mole。
在熒光團的情況下，優(yōu)選地，用其發(fā)射波長大于450nm，優(yōu)選大于600nm的熒光團進行工作。
在示蹤劑為自身不能產生信號的半抗原如生物素的情況下，檢測通過如上所述經標記的抗-配體的識別來進行。在生物素的情況下，優(yōu)選使用偶聯了熒光化合物如熒光素、Cy5或藻紅蛋白的鏈霉抗生物素蛋白或抗-生物素抗體。在松香烷的情況下，使用如專利申請WO-A-00/07982中所述的單克隆抗體。
特別地，本發(fā)明的標記試劑在極性溶劑如DMF、DMSO、CH3CN、THF、DMA(二甲基乙酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮)、DME(二甲氧基乙烷)中是可溶的。
優(yōu)選地，標記試劑在DMSO或水中是可溶的。
“可與水混溶的溶劑”意指可以以至少5體積％的比例與水或含鹽的水性緩沖液混溶的溶劑。
有利地，在前述的式中，臂L含有乙二醇或聚乙二醇基序以增加試劑在水中的溶解度。
A是包含至少一個烯型雙鍵的連接臂，其使得重氮基甲基官能團能夠與芳環(huán)綴合。連接臂A具有使重氮基甲基官能團遠離環(huán)的功能，以減小位阻，同時保持重氮基甲基官能團的穩(wěn)定性?！熬Y合”意指沿著連接臂A的碳鏈的芳環(huán)的電子離域作用。作為實例，臂A可以具有下列結構 其中，·v是1和10之間的整數，優(yōu)選v是1或2，和·R10是H或烷基，優(yōu)選R10是H、甲基或乙基。
因此，這些試劑能夠在均相中連接在生物分子上，所述均相由基本上水性的溶液組成，即含有至少50％的水。
“生物分子”意指具有至少一個使其能夠與生物目標靶分子反應的識別位點的化合物。作為實例，例如可以提及核酸、抗原、抗體、多肽、蛋白質、半抗原這些生物分子。
術語“核酸”表示至少兩個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的鏈，其可選地含有至少一個經修飾的核苷酸，例如至少一個含有經修飾的堿基如肌苷、甲基-5-脫氧胞苷、二甲基氨基-5-脫氧尿苷、脫氧尿苷、二氨基-2,6-嘌呤、溴-5-脫氧尿苷或者其他允許雜交的經修飾的堿基的核苷酸。該多核苷酸還可以在核苷酸間連接的水平上進行修飾，例如硫代磷酸酯、H-膦酸酯、烷基-膦酸酯，在主鏈的水平上進行修飾，例如α-寡核苷酸(FR 2 607 507)或PNA(M.Egholm等人，J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)或2′-O-烷基核糖。核酸可以是天然的或合成的，可以是寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖體RNA、信使RNA、轉運RNA、通過酶促擴增技術獲得的核酸，所述酶促擴增技術例如為·PCR(聚合酶鏈反應)，描述于專利US-A-4,683,195、US-A-4,683,202和US-A-4,800,159中，和其衍生形式RT-PCR(逆轉錄PCR)，尤其是一步形式的RT-PCR，如描述于專利EP-B-0.569.272中，·LCR(連接酶鏈反應)，例如公開于專利申請EP-A-0.201.184中，·RCR(修復鏈反應)，描述于專利申請WO-A-90/01069中，·3SR(自動維持序列復制)，見專利申請WO-A-90/06995，·NASBA(基于核酸序列的擴增)，見專利申請WO-A-91/02818，·TMA(轉錄介導的擴增)，見專利US-A-5,399,491，和·RCA(滾環(huán)擴增)(US-6,576,448)。
因此，“擴增子”用于表示通過酶促擴增技術產生的核酸。
這些修飾的每一個可以組合采用，只要核酸中存在至少一個磷酸酯。
“多肽”意指至少兩個氨基酸的鏈。
“氨基酸”意指·編碼蛋白質的基本氨基酸，·在酶促作用之后衍生的氨基酸，例如反-4-羥基脯氨酸，·天然的但不存在于蛋白質中的氨基酸，例如正纈氨酸、N-甲基-L亮氨酸、staline(參見Hunt S.，Chemistry and Biochemistry of theamino acids，Barett G.C.，ed.，Chapman and Hall，London，1985)，和·由可用于固體支持物上或液相中的合成的化學官能團所保護的氨基酸，和非天然氨基酸。
術語“半抗原”表示非免疫原性的化合物，即其自身不能通過抗體生成來促進免疫反應，但是能夠被通過在已知條件下免疫動物，特別是通過用半抗原-蛋白質綴合物進行免疫而獲得的抗體識別。這些化合物的分子量通常小于3000Da，最常見小于2000Da，它們可以例如為糖基化的肽、代謝物、維生素、激素、前列腺素、毒素或各種藥物、核苷和核苷酸。
術語“抗體”包括多克隆和單克隆抗體、通過基因重組獲得的抗體、和抗體片段如Fab或F(ab’)2片段。
術語“抗原”表示可以產生抗體的化合物。
術語“蛋白質”包括全蛋白質和異蛋白質如核蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金屬蛋白和糖蛋白，這些蛋白質為纖維狀或球狀并且以它們特征性的構象形式存在。
有利地，生物分子具有磷酸基團，即具有至少一個下述基序 或 其或者天然存在于生物分子中，或者可以例如通過化學或酶促修飾而引入。對于蛋白質的化學修飾的實例在″Chemistry of proteinconjugation and cross linking"，S.S.Wong，CRC Press，1991中提供。
優(yōu)選地，所述生物分子是核酸。
本發(fā)明的某些有利的試劑為a)式(10)
b)式(11) c)式(12) 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和·n是等于0或1的整數。
優(yōu)選地，標記試劑具有下式a)式(13) b)式(14) c)式(15)
其中R1表示甲基或苯基。
不論試劑的實施方案和變化形式如何，L可以包含基序-(NH-CH2-CH2)-，其重復1-20次，優(yōu)選1-10次，更優(yōu)選2-5次。
“肼的衍生物”意指具有NH2-NH-官能團的分子。甲苯磺?；率沁@樣的衍生物的一個實例。
腙轉化成重氮基甲基通過常用的方法，特別是通過用MnO2氧化而實現。
也可以使用其他方法，如下列文獻中所描述的X.Creary，OrganicSyntheses，WileyNew York，Coll.Vol.VII，p438-443，1990；H.Zollinger，Diazo Chemistry II，VCH，Weinheim，p34-47，1995；T.L.Holton和H.Shechter，J.Org.Chem.，60，4725-4729，1995。
在使用衍生物甲苯磺?；碌那闆r下，方法描述于X.Creary，Organic Syntheses；WileyNew York，Coll.Vol.VII，p438-443，1990中。
在這些合成方法的任一種的特殊實施方案中，所述方法包括·保護化合物(9)的酮或醛官能團(在R1為H的情況下)的補充步驟，和·使所述的酮或醛官能團去保護的后繼補充步驟。
所述保護例如可通過縮醛基團來實現。去保護通過合適的手段來進行，例如對于縮醛在酸性介質中。本領域技術人員會根據化合物而確定在合成過程的哪一個步驟處實施保護和去保護這兩個步驟。
在信號擴增的情況下，合成方法類似于前述方法。標記前體可以具有下面的式(17) 其中，GP1和GP2表示相同或不同的胺官能團保護基團，和p是1和10之間的整數，有利地2和6之間的整數，優(yōu)選4。有利地，GP1和GP2是不同的，以便能夠加入多個基序，如在下文中所解釋的。
可用于本發(fā)明的保護基團GP1或GP2的實例在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，JohnWiley and Sons，New York，1991中提供，優(yōu)選通常在肽合成中使用的那些，例如Boc(叔丁氧基羰基)、Fmoc(9-芴基亞甲基氧基羰基)、Cbz(羧基芐基)或Alloc(烯丙氧基羰基)。
特別地，GP1和GP2分別為保護基團Boc和Fmoc。
在存在偶聯劑的情況下，進行具有羧基官能團的該前體與式(18)的衍生物(見下式)之間的反應，以形成酰胺鍵， 在這兩個保護基團之一的常用條件下，例如對于Fmoc使用堿如哌啶，進行去保護，在去保護之后，使用游離的胺官能團用于偶聯另一個式(17)的分子。該過程重復根據需要的次數，以獲得大量由保護基團如Boc官能團保護的NH2官能團。以重復1-100次，優(yōu)選1-20次加入基序。
使肼在來自衍生物二苯酮的酮官能團上反應以形成腙，然后在MnO2存在下進行氧化以形成重氮基甲基殘基。然后，在將具有Boc基團的胺官能團去保護之后，將示蹤劑如通過N-羥基琥珀酰亞胺基團活化的生物素偶聯至胺官能團上，以產生其中的基序R2-(L)n-如式(5)所示的試劑。
本發(fā)明的另一個目標是描述一種用于標記生物分子(特別是核酸)的方法以及通過該方法獲得的產物，該方法包括在基本上水性的均質溶液中，在溶液中使生物分子與根據本發(fā)明的標記試劑接觸。
“基本上水性的溶液”意指含有至少50％的水的溶液。該溶液優(yōu)選含有鹽，如緩沖溶液。
“均質溶液”意指單相的溶液，例如水/DMSO溶液，而不是兩相的溶液，例如水/氯仿溶液。標記反應的具體條件根據生物分子和標記而有所不同。關于核酸，5和8之間的pH使得能夠進行有效的標記。特別地，5.5和7.0之間的pH對于本發(fā)明的全部試劑都是優(yōu)選的。使用式(11)的試劑時，用于進行標記的pH范圍更大。對于該試劑，3和8之間的pH可獲得良好的標記效率。
該標記和片段化的方法在這樣的情況下是特別有用的，即經標記的核酸必須與許多在預先確定的位置處固定在固體支持物上以形成DNA芯片的核酸(特別是寡核苷酸)雜交。“DNA芯片”意指小尺寸的固體支持物，在其上于預先確定的位置處固定有捕獲探針。事實上，固定在固體支持物上的核酸的密度在雜交期間造成顯著的空間阻礙，和片段化使得能夠改善這一雜交步驟。這些DNA芯片的實例例如提供在下列出版物中G.Ramsay，Nature Biotechnology，16，p40-44，1998；F.Ginot，Human Mutation，10，p1-10，1997；J.Cheng等人，Molecular diagnosis，1(3)，p183-200，1996；T.Livache等人，NucleicAcids Research，22(15)，p2915-2921，1994；J.Cheng等人，NatureBiotechnology，16，p541-546，1998。
片段化和標記以一步或者以兩步進行，和標記可以無區(qū)別地于片段化之前、之后或同時進行。
優(yōu)選地，標記和片段化同時進行，即將這兩個步驟所需的試劑與例如核酸在基本上水性的均質溶液中混合在一起。對于化學或酶促片段化的情況尤其是如此。在通過物理手段進行機械片段化的情況下，“標記和片段化同時進行”是指將物理手段施加于基本上水性的均質溶液，該溶液至少含有核酸和標記試劑。
核酸的片段化通過酶促、化學或物理方式來進行。
例如通過核酸酶來實現核酸的通過酶促方式的片段化。
例如通過超聲處理或輻射來實現核酸的通過物理方式的片段化。
如果核酸是RNA，通過常用的方法(參見例如Oivanen M.等人，Chem.Rev，98，961-990，1998)來實現通過化學方式的片段化。
金屬絡合物可用于DNA或RNA的片段化，例如在G.Pratviel等人的綜述，Adv.Org.Chem.，45，p251-312，1998，或G.Pratviel等人的綜述，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，34，p746-769，1995中所述的那些。
在第一個實施方案中，RNA的化學片段化通過與或不與化學催化劑聯合的金屬陽離子來進行。在這種情況下，金屬陽離子為Mg2+、Sr2+、Ba2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Ru3+、Ce3+、Eu3+、Tb3+、Tm3+、Yb3+或Lu3+離子，化學催化劑的組成為咪唑，取代的類似物如N-甲基-咪唑，或者任何具有對于RNA的親和力和帶有咪唑核的化學分子或取代的類似物。借助于金屬的片段化的條件充分地描述于專利申請WO-A-99/65926中。有利地，金屬為Mg2+、Mn2+、Zn2+、Tb3+或Ce3+，優(yōu)選Mg2+、Mn2+、Zn2+。
有效的片段化條件為，2-100mM的金屬陽離子如Mn++濃度，2-100mM的咪唑濃度。
特別有效的條件為，3-15mM的陽離子如Mn++濃度，20-50mM，特別是30mM的咪唑濃度。
反應的pH必須是微堿性的。有利地，pH為8.5-9，這代表了對于用RNA進行標記和片段化組合非常有益的折衷方案。
在第二個實施方案中，RNA的化學片段化通過多胺如精胺、腐胺或尸胺的作用來進行。5-100mM的濃度使得能夠進行片段化。從10mM的多胺開始，片段化是完全的。
在第三個實施方案中，RNA的化學片段化通過人工核酸酶(參見G.Pratviel等人，Adv.Inorg.Chem.，45，p251-312，1998；D.S.Sigman等人，Chem.Rev.，93，p2295-2316，1993)的作用來實現，例如與金屬陽離子如鐵、銅或鋅聯合的1，10-菲咯啉。這些陽離子分別來自溶液中的FeSO4或CuCl2或ZnCl2。對于RNA的片段化使用濃度為2-50mM的1，10-菲咯啉，特別是4-10mM。
DNA的通過化學方式的片段化通過將核酸與形成無堿基(abasique)位點的化學手段放在一起來進行。無堿基位點的形成是由于切割了連接糖2-脫氧核糖與核堿基的N-糖苷鍵。這涉及通過失去帶負電的嘌呤(鳥嘌呤、腺嘌呤)的脫嘌呤化，或在失去帶正電的嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶)的情況下的脫嘧啶化。
該脫嘌呤化在生理條件(pH 7.4，37℃)下是自發(fā)的，但是反應速度非常慢，為3×10-11脫嘌呤/秒這樣的級別，即不能用于有效的片段化。為了加快反應速度，使用使得N-糖苷鍵變得不穩(wěn)固的烷基化試劑，或者對于整合有尿嘧啶的DNA使用尿嘧啶-DNA糖基化酶(glycosilase)。
通過脫嘌呤或脫嘧啶獲得的無堿基位點是非常不穩(wěn)定的。在堿性介質中于環(huán)境溫度下獲得了在該位點水平上的片段化。在酸性介質中，升高溫度也可以加速該片段化。使用能夠起始β-消除現象的分子也可加速此片段化。
片段化的優(yōu)選實施方案是通過使用酸性pH，即低于5的pH而獲得的。有利地，pH為3。
pH為3的甲酸鈉緩沖液使得能夠根據本發(fā)明有效地進行片段化。該緩沖液與一步標記的條件是相容的，如將在實施例中所證明的。更有利地，使用酸性介質(HCl、碳酸鹽、H2SO4)。
在本發(fā)明的一個特殊的實施方案中，意欲進一步增強片段化，脫氧核糖核酸含有至少一個可以更容易地產生無堿基位點的經修飾的堿基。
可以使用多種經修飾的堿基，例如N7-烷基嘌呤、N3-烷基嘌呤、O6-烷基嘌呤、8-溴嘌呤、8-硫代嘌呤、8-烷基硫代嘌呤、8-疊氮基嘌呤或8-烷基磺?；堰省?br> 當待標記的核酸通過酶促擴增技術如PCR來產生時，使用8-溴嘌呤使得能夠在擴增過程中獲得有效的整合，這同樣有助于本發(fā)明的片段化和標記方法，同時保持對于酶促擴增步驟的優(yōu)異的靈敏度。
本發(fā)明描述了經標記的生物分子，特別是經標記的核酸，其可以通過根據本發(fā)明的方法中的任一種方法而獲得。
本發(fā)明還涉及檢測生物分子，特別是靶核酸的試劑盒，其包含根據本發(fā)明的標記試劑。根據試劑盒的應用，在該試劑盒中還整合了其他元件，例如裂解(微生物和/或細胞)的手段和/或濃縮的手段(例如二氧化硅或磁性顆粒)和/或酶促擴增的手段。
本發(fā)明涉及如上所述的經標記的生物分子，特別是經標記的核酸的用途，其用作檢測靶生物分子，特別是靶核酸的探針。
本發(fā)明還涉及如上所述的核酸的用途，其用作能夠結合至捕獲探針的經標記的靶標。
為了能夠檢測和/或定量和/或純化靶生物分子，經標記的生物分子能夠與靶生物分子形成復合物。作為實例，為了證明核酸類型的靶分子，經標記的核酸以足夠的程度與靶標互補，以便根據反應條件，特別是反應介質的溫度和鹽濃度而特異地雜交。
該檢測方法可用于測序，信使RNA的表達特性圖譜的繪制，或為了研究目的的突變的篩選，以及在制藥工業(yè)中篩選藥物，傳染性或遺傳性疾病的診斷，食品或工業(yè)的控制。
在診斷方面，特別是診斷傳染性疾病(例如AIDS或結核病)，趨勢是降低靈敏度水平，直至可檢測樣品中的單個分子，所述樣品在抽取血液或尿液類型的液體或者腦脊液的情況下可以為幾個毫升。如果從取樣開始至給出結果的所有步驟都進行了優(yōu)化，也僅能獲得該靈敏度水平。本發(fā)明的多種手段使得能夠毫無困難地實現這一優(yōu)化，因為本發(fā)明的試劑、方法和過程可以以非常廣泛的方式應用于各種不同的生物分子。特別是在需要酶促擴增步驟以獲得所需的靈敏度(病毒或細菌感染，如HIV、HCV或結核病)的情況下，如本發(fā)明所述的，標記和/或片段化的方法使得能夠不影響擴增技術的靈敏度，這或許是因為不需要替換在酶促擴增技術中所用的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或許是因為整合入的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸不改變靈敏度。
從反應性和特異性的觀點來看，本發(fā)明所述的接枝(greffage)化學具有這樣的特征，下面描述了其他應用·在第一個實施方案中，該接枝化學用于將核酸共價固定在固體支持物上。
·在該方法的第一個變化形式中，在化學合成過程中引入重氮基甲基官能團的前體例如前述的酮或肼，和在第二個步驟中將重氮基甲基官能團引入至核酸上。
·在該方法的第二個優(yōu)選變化形式中，將重氮基甲基官能團引至固體支持物上，并借助于核酸的磷酸，特別是末端(5′或3′)磷酸，將核酸固定在固體支持物上。
核酸的3′或5′末端的磷酸的引入是熟知的(參見"Protocols forOligonucleotides and Analogs，Synthesis and Properties″，S.Agrawal編，Humana Press，Totowa，New Jersey)。
在這樣的固體支持物的一個特殊實施方案中，將具有配體，特別是半抗原如生物素或松香烷的標記試劑結合在固體支持物上，在所述固體支持物上以共價方式或通過吸附結合有抗-配體，如鏈霉抗生物素蛋白或抗體。這些固體支持物在現有技術中是熟知的，并且甚至可商購獲得(例如微量滴定板-鏈霉抗生物素蛋白或膠乳-鏈霉抗生物素蛋白)。在此情況下，標記的功能不再允許進行檢測，但允許標記試劑結合在固體支持物上。從而，重氮基甲基官能團可用于與核酸反應。式(13)、(14)、(15)的衍生物或衍生物PDAM是可用于制備這樣的固體支持物的試劑的實例。單克隆抗體技術使得能夠制備針對大量的標記如熒光素或Cy5的衍生物的抗體。本領域技術人員通過該固體支持物間接制備方法可以沒有過多困難地運用具有本發(fā)明的標記試劑的固體支持物，在所述間接制備方法中，使用配體/抗-配體反應來將重氮基甲基官能團固定在固體支持物上。
固體支持物的第二個實施方案涉及特殊的支持物，如膠乳。多種不同的聚合方式可以用于制備具有重氮基甲基官能團的顆粒，該制備從可聚合的功能性單體開始，所述單體具有重氮基甲基官能團或者優(yōu)選地具有重氮基甲基官能團的前體官能團如醛或酮，和特別地·稱為“批式聚合(batch)”的封閉式反應器聚合在反應開始之前，將單體與其他成分引入反應器中，以后不再添加。由于單體的反應性的差異，該方法常常導致出現組成的偏移。這一點通過獲得組成隨著轉化而明顯發(fā)生變化的大分子而表現出來。該方法對于表面整合具有較低的有效性，因為存在很大一部分的功能性單體在顆粒內部或者以水溶性聚合物的形式而損失掉這樣的風險。當與具有極性性質的單體以“分批”進行共聚時，獲得了大量的更小的顆粒，但是轉化有限。該行為與這些單體在水中的高溶解度有關，這歸因于均相成核機制的優(yōu)勢。
·半連續(xù)聚合至少一部分單體在反應開始和結束之間這一段時間內引入反應器中。該再添加可以以固定的速度或者根據給定的特性來進行。目的是控制單體混合物的添加以獲得具有受控的組成的共聚物(控制界面的組成)；就是這樣，常常采用這樣的添加條件，從而聚合的速度比添加的速度更快。
·稱為“爆發(fā)式聚合(shot)”的通過延遲添加的聚合一旦進行聚合反應，就將功能性單體單獨地或者在基礎單體(monomère de base)存在下以受控方式引入系統(tǒng)中。因此，該操作的成功取決于對于共聚動力學的現有知識程度。這是促進表面整合的有效方法。實驗條件(添加時的轉化程度、單體混合物的組成和濃度)的選擇使得能夠優(yōu)化表面的產率。
·種子聚合其在于將功能性單體引入含有膠乳的系統(tǒng)中，該膠乳已經形成并經完全地表征。功能性單體可以單獨添加或者以與種子的基礎單體的混合物進行添加，添加可以是一步的或半連續(xù)的。
種子聚合、通過延遲添加的聚合、半連續(xù)聚合的技術是優(yōu)選的，因為它們導致最大化地在表面上引入具有重氮基甲基官能團的前體的衍生物。具有醛官能團的顆粒的實例例如提供在B.Charleux等人，DieMakromolecular Chem.，193，p 187和p.205，1992或者專利EP-B-0.350.407中。
固體支持物的第三個實施方案在于提供含有第一親核或親電子反應性基團例如NH2、SH、OH、O-NH2、烷基酮、醛、異氰酸鹽(酯)、異硫氰酸鹽(酯)、馬來酰亞胺、烷基鹵、N-羥基琥珀酰亞胺的酯、甲苯磺酸鹽(酯)的固體支持物，然后與結合中間體反應，該結合中間體含有與固體支持物的第一反應性官能團互補的反應性官能團。固體支持物與結合中間體之間的該反應可選地在存在偶聯劑的情況下進行以形成共價鍵。
根據上述多種不同的實施例的、含有至少一個重氮基甲基官能團的這樣的固體支持物，特別是其上間接地固定有本發(fā)明的標記試劑的固體支持物，也是本發(fā)明的目標，以及含有借助于重氮基甲基官能團而固定在固體支持物上的核酸的固體支持物。
這樣的固體支持物的第一種應用是制備DNA芯片。存在有將核酸于離散并預定的位置處分散在固體支持物上的方法。
專利US-A-6,110,426推薦了借助于毛細管制備這些DNA芯片的方法，其中將所述毛細管與固體表面接觸以遞送受控制的體積的液體。在毛細管的末端和固體支持物之間發(fā)生有效的接觸，以便通過毛細作用滴上一滴。類似地，專利US-A-6,083,763描述了一套毛細管，其在裝置中滑動，從而補償它們中的每一個的高度差異。將它們與平的表面接觸，以便通過毛細作用放置下特異的寡核苷酸。
專利US-A-6,083,762推薦了一種液滴分配系統(tǒng)，其包含與壓電換能器聯接的微分散器，以便將小于納升的液滴體積噴射到固體表面上。類似的結果可以通過在毛細管壁上施加熱源以形成噴射指定體積的液體的泡而獲得(參見T.Okamoto等人，Nature Biotechnology，18，p438-441，2000)。
因此，重氮基甲基官能團使得能夠將核酸以共價的方式接枝到支持物上。該接枝過程是簡單的，連接是穩(wěn)定的，尤其是相對于吸附來說，相關于末端磷酸，該反應的選擇性使得能夠將核酸定向偶聯到固體支持物上，這就相應地有助于隨后的雜交步驟，因為減小了位阻。
根據本發(fā)明的固體支持物的第二種應用是純化核酸。
在純化的情況下，純化是直接的(帶有重氮基甲基官能團的固體支持物與待純化的核酸反應)或間接的(捕獲核酸固定在固體支持物上)。這些捕獲核酸以足夠的程度與待捕獲的靶標互補，以便以所希望的特異性程度進行雜交，正是“捕獲核酸/固體支持物”這一復合物使得能夠純化靶核酸。
固體支持物優(yōu)選為分散的形式以用于純化，例如膠乳顆粒，如磁性顆粒。
“純化步驟”尤其意指分離微生物的核酸與在裂解步驟中釋放的細胞組分，所述裂解步驟在純化核酸之前進行。這些裂解步驟是熟知的；作為象征性的實例，可以使用如下列專利申請中所述的裂解方法-WO-A-00/60049，超聲裂解，-WO-A-00/05338，磁性和機械混合裂解，-WO-A-99/53304，電裂解，和-WO-A-99/15621，機械裂解。
本領域技術人員可以使用其他熟知的裂解方法，例如熱激或滲透壓震擾或用離液劑(例如胍鹽)處理(專利US-A-5,234,809)。
這一步驟通常使得能夠濃縮核酸。作為實例，可以使用磁性顆粒(關于這一主題請參見專利US-A-4,672,040和US-A-5,750,338)，從而通過洗滌步驟來純化結合在這些磁性顆粒上的核酸。如果希望隨后擴增所述的核酸，這一純化核酸的步驟是特別有益的。這些磁性顆粒的一個特別有益的實施方案描述在專利申請WO-A-97/45202和WO-A-99/35500中。
本文所使用的術語“固體支持物”包括任何能夠在其上固定核酸的材料。合成的材料或天然的材料，可選地經化學修飾的材料，可以用作固體支持物，尤其是多糖，例如基于纖維素的材料，例如紙、纖維素衍生物如乙酸纖維素和硝化纖維素，或者葡聚糖；聚合物，共聚物，尤其是具有苯乙烯型單體的那些，天然纖維如棉花，和合成纖維如尼龍；礦物材料，例如二氧化硅、石英、玻璃、陶瓷；膠乳；磁性顆粒；金屬衍生物，凝膠等。固體支持物可以是微量滴定板、膜、顆?；蚧旧掀降牟ＡЩ蚬杌蜓苌锏陌宓男问健?br> 最后，本發(fā)明涉及捕獲核酸的方法，其包括下列步驟·提供固體支持物，其上直接或間接地固定有至少一種含有重氮基甲基官能團的分子，·與可能含有游離核酸的生物樣品接觸，和·洗滌固體支持物，其中所述分子至少以共價方式連接至核酸。
補充的信息可以在本發(fā)明人的另一個專利申請WO02/090584(以2001年5月4日的優(yōu)先權提交的)中找到。
所附的實施例和附圖提供了特殊的實施方案，而并不能認為是限制了本發(fā)明的范圍。


圖1表示在本發(fā)明中使用的多種試劑的結構式以及名稱的縮寫(o-表示鄰，m-表示間，p-表示對)圖2表示m-bio-TETA-PMDAM根據其濃度的對于rpoB的信號平均值和相似性百分數。
實施例1參考試劑的合成間-BioPMDAM·間-苯乙酮生物素化合物1a將D-生物素(1.0克(g)，4.1毫摩爾(mmol))溶解在45毫升(mL)熱的無水DMF中。在氬氣氣氛中冷卻至0℃，然后依次添加N-甲基嗎啉(590微升(μL)，5.33mmol)和氯甲酸異丁酯(840μl，6.60mmol)。將混合物攪拌30分鐘(min)，然后加入在10mL DMF中的3-氨基苯乙酮(824mg，6.10mmol)和N-甲基嗎啉(480μL，4.35mmol)。將溶液于0℃下攪拌，并保持2小時(h)，然后蒸發(fā)至干。取出殘留物并置于3mL MeOH中，然后加入50mL水。過濾獲得的沉淀，用水、CH2Cl2和乙醚洗滌，得到1.2g(80％)的粗產物1a。在MeOH-H2O對中重結晶，得到白色粉末狀的1a(1.01g，70％)。
Mp 145℃.-IR(KBr)3280，2931，2857，1691，1590，1540，1487，1434，1298，1266cm-1.-1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝1.3-1.7(m，6H)；2.33(t，J＝8Hz，2H)；2.55(s，3H)；2.58；(d，J＝12Hz，1H)；2.83(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.13(m，1H)；4.15(m，1H)；4.31(m，1H)；6.34(s，1H)；6.41(s，1H)；7.44(t，J＝8Hz，1H)；7.64(d，J＝8Hz，1H)；7.85(d，J＝8Hz，1H)；8.17(S，1H)；10.05(S，1H).-MS(FAB/甘油)，m/z362[M+H]+.
·間-腙化合物2a將1a(500mg，1.38mmol)與肼一水合物(200μL，4.15mmol)在無水乙醇(8mL)中的溶液回流加熱2h。冷卻至環(huán)境溫度后，過濾白色沉淀，用水洗滌，然后用乙醚洗滌，并干燥。因此獲得385mg(74％)白色粉末狀的產物2a。
Mp 185℃.-IR(KBr)3298，2931，2857，1698，1665，1626，1541，1494，1470，1446，1330，1265cm-1.-1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝1.3-1.7(m，6H)；1.98(s，3H)；2.26(t，J＝8Hz，2H)；2.56；(d，J＝12Hz，1H)；2.81(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.11(m，1H)；4.13(m，1H)；4.29(m，1H)；6.39(s，3H)；6.42(s，1H)；7.22(m，2H)；7.50(d，J＝8Hz，1H)；7.84(s，1H)；9.82(s，1H).-MS(FAB/甘油)，m/z376[M+H]+.
·間-重氮甲烷化合物3a將2a(180mg，0.48mmol)溶解在2mL DMF中。然后加入MnO2(340mg，3.9mmol)。在常溫下攪拌30分鐘后，將混合物通過含有硅藻土(厚度0.5cm)和粉末狀的3_分子篩(0.5cm)的燒結漏斗過濾。將反應混合物濃縮至大約0.5mL的體積，然后加入5mL乙醚。過濾得到的沉淀，用乙醚洗滌，然后干燥。得到粉紅色粉末狀的化合物3a(170mg，95％)。
Mp 160℃.-IR(KBr)3278，2935，2859，2038，1704，1666，1605，1577，1536，1458，1430，1263cm-1.-1H NMR(300 MHz)δ＝1.3-1.7(m，6H)；2.11(s，3H)；2.28(t，J＝8Hz，2H)；2.57；(d，J＝12Hz，1H)；2.81(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.11(m，1H)；4.13(m，1H)；4.29(m，1H)；6.33(s，1H)；6.41(s，1H)；6.60(m，1H)；7.25(m，3H)；9.84(s，1H)).
實施例2試劑N-(3，6，9-三胺壬基)-生物素酰胺(Bio-TETA)(1)的合成將D-生物素(2.80g，11.40mmol)溶解在30mL無水DMF中。加入羰基二咪唑(1.5當量；2.78g)，幾分鐘后形成沉淀。活化30分鐘后，將得到的懸浮液小心地加至三亞乙基四胺(2當量；5.00g)在20mL DMF中的懸浮液之中。反應在60℃的油浴中進行2h。
通過在硅膠上的快速色譜法純化產物，使用CH2Cl2/MeOH/NH4OH 20∶80∶3作為洗脫劑。蒸發(fā)濃縮的級分后，獲得1.94g白色粉末狀的產物(46％)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝7.75(s，1H，-NH-CO-)；6.40(d，2H，-NH-biot)；4.30(t，1H，-CH-biot)；4.15(d，1H，-CH-biot)；3.30(m，12H，-CH2-NH-)；3.11(m，1H，-CH-S-)；2.8(dd，2H，-CH2-S-)；2.55(m，5H，-NH-CH2-&-NH2)；2.04(t，2H，-CH2-CO-)；1.52(m，6H，-CH2-).
N-(3’-乙酰苯基)-琥珀酰胺(ACBA)(2)將3-氨基苯乙酮(5.0g；37mmol)在氬氣氣氛中溶解在50mL無水乙腈中。加入琥珀酸酐(1.3當量；4.62g)，并在氬氣氣氛中反應1小時。產物2以沉淀的形式出現。在沉淀經過過濾并用乙醚洗滌之后，獲得7.29g白色粉末(84％)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝12.10(s，1H，-OH)；10.17(s，1H，-NH-)；8.19(s，1H)；7.82(d，1H)；7.66(d，1H)；7.50(t，1H)；2.56(m，7H，-(CH2)2-和-CH3).
N-(3’-乙酰苯基)-N’-(3，6-二胺-9-生物素酰基氫基壬基)-琥珀酰胺 (Bio-(TETA)-AP)(3)將ACBA(2)(1.03g；4.39mmol)在氬氣氣氛中溶解在20mL無水DMF中。在冰上冷卻該介質，并依次加入N-甲基嗎啉(1.25當量；725μL)和氯甲酸異丁酯(1當量；690μL)介質在30分鐘后變混濁。同時，將Bio-TETA(1)(0.8當量；1.94g)在熱的條件下溶解在50mLDMF和三乙胺(0.8當量；750μL)中。將其加入在0℃活化30分鐘的ACBA中。然后在環(huán)境溫度下靜置過夜。純化通過硅膠上的快速色譜法來進行，使用CH2Cl2/MeOH/NH4OH 85∶30∶3作為洗脫劑。合并含有產物3的級分，并蒸發(fā)掉溶劑。獲得1.01g片狀的白色固體(33％)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝10.16(s，1H，Ph-NH-CO-)；8.18(s，1H)；7.97(s，1H，-CO-NH-CH2-)；7.80(d，1H)；7.85(s，1H，-CH2-NH-CO-)；7.60(d，1H)；7.43(t，1H)；6.38(d，2H，-NH-biot)；4.3(t，1H，-CH-biot)；4.10(d，1H，-CH-biot)；3.35(m，12H，-CH2-NH-)；3.10(m，1H，-CH-S-)；2.80(dd，2H，-CH2-S-)；2.60(s，4H，-CH2-CO-)；2.55(s，3H，-CO-CH3)；2.50(m，2H，-CH2-CH2-CO-)；2.15(m，2H，-NH-)；1.40(m，6H，-CH2-).
N-[3’-(1-亞肼基-乙基)苯基]-N’-(3，6-二胺-9-生物素?；被苫?-琥珀酰胺(Bio-(TETA)-Hv)(4)將Bio-(TETA)-AP(3)(1.0g；1.71mmol)懸浮在25mL熱的(60℃)乙醇中。在回流情況下，加入肼一水合物(9當量；750μL)。讓反應在回流條件下進行2h，然后在冰上冷卻。短時間后形成了沉淀。分離兩相，并將沉淀置于真空中。獲得690mg絮狀固體(68％)。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.95(s，1H，Ph-NH-CO-)；8.0(s，1H，-CO-NH-CH2-)；7.90(s，1H)；7.80(s，1H，-CH2-NH-CO-)；7.5(d，1H)；7.28(m，2H)；6.41(s，1H，-NH-biot)；6.36(d，3H，-NH-biot & -NH2)；4.64(t，1H，-CH-biot)；4.30(d，1H，-CH-biot)；3.43(m，12H，-CH2-NH-)；3.12(m，1H，-CH-S-)；2.80(dd，2H，-CH2-S-)；2.60(s，4H，-CH2-CO-)；2.50(s，3H，-CO-CH3)；2.10(m，2H，-CH2-NH-CH2-)；1.50(m，6H，-CH2-).
N-[3’-(1-重氮基-乙基)苯基]-N’-(3，6-二胺-9-生物素酰基氨基壬基)-琥珀酰胺(m-Bio-(TETA)-PMKAM)(5)
在氬氣氣氛中，將Bio-(TETA)-Hy(4)(150mg；250.4μmol)溶解在1mL無水DMSO中。與MnO2(s)(15當量；330mg)反應30分鐘，然后在含有硅藻土(厚度0.5cm)和3_分子篩(厚度0.5cm)的燒結漏斗上過濾。100μL用于NMR，其中添加380μL DMSO-d6和20μL甲醇-d4。用無水DMSO和4％甲醇調節(jié)終體積為4.5mL。在工具箱(une boite àgants)中，于氬氣氣氛下等分成250μL的等分試樣?；衔锸瞧芳t色的。通過1H NMR和UV-可見光(UV-vis)分光光度測定法(重氮基甲基的吸收峰在516nm)檢查純度(重氮基甲基含量)。
1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝9.93(s，1H，Ph-NH-CO-)；7.3(s，3H，H芳族)；6.6(s，1H，H芳族)；6.4(s，1H，-NH-biot)；6.3(s，1H，-NH-biot)；4.3(t，1H，-CH-biot)；3.3(m，12H，-CH2-NH-)；3.3(m，1H，-CH-S-)；2.9(dd，2H，-CH2-S-)；2.5(4H，-CH2-CO-)；2.1(s，3H，-CH3)；2.0(m，2H，-CH2-NH-CH2-)；1.50(m，6H，-CH2-).
實施例3核酸DNA和RNA的制備實施例3.1DNA擴增子的制備采用來自Roche的Fast Start試劑盒，使用0.2mM的每種脫氧核糖核苷酸(d-ATP、d-CTP、d-GTP、d-TTP)、0.3μM的引物和0.4μL的酶，從結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)16S基因組DNA靶標(10+4拷貝作為起始靶標)開始通過PCR產生DNA擴增子。
PCR的參數如下-95℃4分鐘，然后35個循環(huán)(95℃30秒；55℃30秒；72℃30秒)，然后4℃。
通過瓊脂糖凝膠電泳(1.5％，TBE 0.5X)來定量分析擴增子。加載的體積為5μL，遷移在100伏特(V)進行20分鐘。PCR產物的顯像在用溴化乙錠染色后于UV燈下進行。
分枝桿菌的培養(yǎng)、提取條件，以及擴增引物在專利申請WO-A-99/65926中提供。
實施例3.2轉錄的RNA的制備從PCR靶標(結核分枝桿菌的16S RNA的片段)開始進行轉錄，其使用來自Ambion的MEGAscript試劑盒7.5mM的每種核苷酸(ATP、CTP、GTP和UTP)和2μL的酶(RNA聚合酶)。溫育時間為3小時(h)，于37℃。PCR的擴增引物具有T3或T7聚合酶啟動子，如申請WO-A-99/65926或文章J.Clin Microbiol.37(1)，p49-55，1999中所述的，其使得能夠實現擴增。
通過瓊脂糖凝膠電泳(1.5％；TBE 0.5X)來分析轉錄物。加載的體積為5μL，遷移在100V進行20分鐘。轉錄物的顯像在用溴化乙錠染色后于UV燈下進行。
從本發(fā)明的觀點來看，相同的結果可以使用其他擴增技術如NASBA或TMA來獲得，這些擴增技術直接產生RNA擴增子。
權利要求
1.式(0)的溫度穩(wěn)定的標記試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，·A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，其使得重氮基官能團能夠與芳環(huán)綴合，和u是0和2之間的整數，優(yōu)選0或1，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，和·p是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數。
2.根據權利要求1的式(1)的標記試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，和·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·m是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，和·p是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數。
3.根據權利要求1或2中任一項的試劑，其特征在于p小于或等于m。
4.根據權利要求1-4中任一項的式(2)的試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，和·q是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數。
5.根據權利要求1-4中任一項的式(3)的試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，和·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基。
6.根據權利要求5的試劑，其特征在于R2由式(4)的D-生物素殘基組成
7.根據權利要求1-6中任一項的試劑，其特征在于R1由CH3組成，以及R3和R4每一個均表示H。
8.根據權利要求1-7中任一項的試劑，其中結構-(L)n-由下列組成·精胺或N，N′-雙(3-氨基丙基)-1，4-二氨基丁烷NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，或·亞精胺或N-(3-氨基丙基)-1，4-丁二胺H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，或·含有丙氨酸基序NH2-CH2-CH2-COOH的衍生物。
9.式(6)的溫度穩(wěn)定的標記試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，·A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，其使得重氮基官能團能夠與芳環(huán)綴合，和u是0和2之間的整數，優(yōu)選0或1，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，和·p是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數。
10.根據權利要求9的式(7)的標記試劑 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，和·p是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數。
11.根據權利要求1-10中任一項的試劑，其特征在于L包含基序-(O-CH2-CH2)-，其重復1-20次，優(yōu)選1-10次，更優(yōu)選2-5次，那么-Z-表示為-NH-、-NHCO-或-CONH-。
12.根據權利要求1-11中任一項的標記試劑的合成方法，其包括下列步驟a)提供具有反應性官能團R6的標記或標記前體，b)提供式(8)的連接臂R7-(Z-(CH2)p)m-R8，其中，·-Z-表示-NH-、-NHCO-、-CONH-或-O-，·m是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，·p是1和10之間的整數，優(yōu)選1和3之間的整數，·R7和R8表示相同或不同的兩個反應性官能團，c)在存在至少一種偶聯劑的情況下，使所述標記或標記前體的反應性官能團R6與式(8)的連接臂的官能團R7一起反應，以形成共價鍵，R6和R7是互補的，d)提供式(9)的衍生物 其中，·R1表示H或者烷基或芳基或取代的芳基，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基，·-Y-X-表示-CONH-、-NHCO-、-CH2O-、-CH2S-，·A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，其使得重氮基甲基官能團能夠與芳環(huán)綴合，和u是等于0或1的整數，和·R9表示與R8互補的反應性官能團，e)在存在至少一種偶聯劑的情況下，使式(9)的衍生物的反應性官能團R9與式(8)的連接臂的官能團R8一起反應，以形成共價鍵，f)使肼或一種其衍生物在酮或醛官能團上反應，以形成腙，和g)通過合適的處理將腙轉化成重氮基甲基官能團。
13.根據權利要求12的合成方法，其特征在于該方法包括·保護化合物(9)的酮或醛官能團的補充步驟，和·使所述的酮或醛官能團去保護的后繼補充步驟。
14.標記生物分子，特別是核酸的方法，其包括在基本上水性的緩沖液中，在均質溶液中使生物分子與根據權利要求1-11中任一項獲得的試劑接觸。
15.經標記的生物分子，其可以通過根據權利要求14的方法而獲得。
16.對單鏈或雙鏈核酸進行標記和片段化的方法，其包括下列步驟·使核酸片段化，·借助于選自根據權利要求1-11中任一項獲得的試劑的標記試劑，將標記連接至至少一個片段上，所述試劑共價地并且主要地偶聯在所述片段的至少一個磷酸上。
17.根據權利要求16的方法，其特征在于所述標記試劑選自式(3)的化合物 其中，·R1表示H或者烷基、芳基或取代的芳基，·R2表示可檢測的標記或者通過至少一個多聚體結構而相互連接的至少兩個可檢測的標記，·L是包含至少兩個共價鍵的直鏈的連接臂，和n是等于0或1的整數，和·R3和R4彼此獨立地表示H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，其中R為烷基或芳基。
18.根據權利要求16或17中任一項的方法，其特征在于片段化和標記以兩個步驟實施。
19.根據權利要求16-17中任一項的方法，其特征在于片段化和標記以一個步驟實施。
20.根據權利要求18-17中任一項的方法，其特征在于標記在基本上水性的均質溶液中進行。
21.根據權利要求16-20中任一項的方法，其特征在于片段化通過酶的、物理的或化學的方法來進行。
22.經標記的核酸，其可以通過根據權利要求16-21中任一項的方法而獲得。
23.檢測靶核酸的試劑盒，其包含根據權利要求22的經標記的核酸。
24.固體支持物，其上固定根據權利要求1-11中任一項的試劑。
25.捕獲核酸的方法，其包括下列步驟·提供固體支持物，其上直接或間接地固定有至少一種根據權利要求15的生物分子，或者根據權利要求22的核酸，所述生物分子或核酸含有重氮基甲基官能團，·與可能含有游離核酸的生物樣品接觸，和·洗滌固體支持物，其中所述分子至少以共價方式連接至核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有式(0)的溫度穩(wěn)定的標記試劑，其中R
文檔編號G01N33/58GK1938329SQ200580009785
公開日2007年3月28日 申請日期2005年3月24日 優(yōu)先權日2004年3月26日
發(fā)明者A·拉尤恩, E·伯納爾-門德茲 申請人:拜奧默里克斯公司