專利名稱：用于鑒定能改變細(xì)胞蛋白表達(dá)的試劑的高通量分析系統(tǒng)及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定能改變細(xì)胞蛋白、尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的內(nèi)在膜蛋白(或整合膜蛋白)表達(dá)水平的試劑的高通量分析系統(tǒng)及方法。
背景技術(shù)：
對(duì)周圍環(huán)境產(chǎn)生反應(yīng)的能力以及控制分子進(jìn)出細(xì)胞膜是任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞基本的重要功能。這些功能在相當(dāng)程度上歸因于全部或部分駐留于細(xì)胞膜內(nèi)的多種蛋白。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜對(duì)水溶性物質(zhì)如離子、小無機(jī)分子、肽以及蛋白是相對(duì)不可滲透的。為了進(jìn)入和/或影響細(xì)胞，這樣的親水性物質(zhì)必須與至少一種蛋白(例如，受體、離子通道或者轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)相互作用，該蛋白駐留在細(xì)胞膜內(nèi)并且在細(xì)胞表面上至少部分暴露于胞外環(huán)境(extracellular milieu)中。相反，親脂性物質(zhì)如類固醇能夠直接通過細(xì)胞膜擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中，然后在胞質(zhì)中親脂性物質(zhì)與一種或多種目的蛋白相互作用。
當(dāng)外部刺激分子(例如，肽或者有機(jī)或無機(jī)分子)與細(xì)胞表面蛋白相互作用時(shí)，存在兩種來自細(xì)胞的基本反應(yīng)(i)通過穿過脂質(zhì)雙層的傳輸，將離子或分子(或大分子)物質(zhì)借助載體從細(xì)胞膜的外部傳送到細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)，反之亦然；和/或(ii)通過膜蛋白的變化(例如，膜蛋白的構(gòu)造變化和/或/)膜蛋白聚集狀態(tài)的變化)將信號(hào)傳送至胞質(zhì)或其中的蛋白。
穿過細(xì)胞的信號(hào)傳輸(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))起始于胞外物質(zhì)(離子、小分子、蛋白)結(jié)合至駐留在細(xì)胞膜中的蛋白的胞外區(qū)(或胞外結(jié)構(gòu)域)。該物質(zhì)結(jié)合到跨膜蛋白的胞外區(qū)使得該蛋白從非活性形式變?yōu)榛钚孕问健Ｈ缓?，這種活性形式激發(fā)催化活性，或者某種類似反應(yīng)，從而產(chǎn)生胞質(zhì)信號(hào)(有時(shí)該信號(hào)為細(xì)胞質(zhì)中的一種或多種第二信使物質(zhì)的形式)。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在兩種主要類型的這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(i)跨膜蛋白的胞質(zhì)區(qū)可以具有蛋白激酶活性，當(dāng)胞外物質(zhì)結(jié)合到跨膜蛋白上時(shí)，跨膜蛋白的活性被激活(然后激酶將其自身的胞質(zhì)區(qū)磷酸化，這使跨膜蛋白能夠結(jié)合并激活另一蛋白，而后者又依次作用于細(xì)胞質(zhì)中的其它蛋白和物質(zhì))；以及(ii)跨膜蛋白可以和與細(xì)胞膜相連的G蛋白相互作用，使得結(jié)合到G蛋白上的GDP(二磷酸鳥嘌呤)被GTP取代，從而造成G蛋白解離成單體和二聚物片段，接著，單體和二聚物片段中兩者之一或兩者又作用于目的蛋白(該蛋白也常與細(xì)胞膜相連，同樣地，要求它隨后作用于細(xì)胞質(zhì)中其它目的蛋白)。
物質(zhì)穿過細(xì)胞膜的物理傳送允許寬范圍的物質(zhì)進(jìn)入和/或離開細(xì)胞，包括離子、小分子(如糖和激素)以及大分子(如蛋白和酶)。這種物質(zhì)傳送存在三種主要途徑(i)駐留在細(xì)胞膜中的蛋白可以形成通道，使離子(如鈉、鉀和氯離子)從胞外環(huán)境穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，反之亦然；(ii)駐留在細(xì)胞膜中的蛋白能在細(xì)胞膜的一側(cè)結(jié)合小分子如糖，然后在細(xì)胞膜的相對(duì)側(cè)釋放該分子，從而起到運(yùn)載體的作用；以及(iii)駐留在細(xì)胞膜中的蛋白可以結(jié)合小分子并因此觸發(fā)內(nèi)化(internalization)過程，其中通過內(nèi)吞作用將已結(jié)合的蛋白分子對(duì)帶入細(xì)胞內(nèi)(在某些位點(diǎn)，蛋白分子對(duì)解離；然后蛋白返回到細(xì)胞表面與另一小分子相互作用或者被降解)。
所有這些蛋白的一般特性包括相對(duì)較大的大小、跨越細(xì)胞膜的多疏水區(qū)以及親水性的胞外區(qū)和/或胞內(nèi)區(qū)。
至于大分子物質(zhì)的通過或運(yùn)輸，蛋白啟動(dòng)了一個(gè)通路，通過共翻譯轉(zhuǎn)移使蛋白直接從核糖體分泌至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜。然后，這些蛋白轉(zhuǎn)移至高爾基體(Golgi apparatus)中，根據(jù)最終目的進(jìn)行分選，并朝細(xì)胞膜移動(dòng)。
更具體地，在合成過程中蛋白進(jìn)入ER，并至少部分折疊及糖基化。然后，該蛋白轉(zhuǎn)移到高爾基體的順式(cis)表面(此時(shí)，將要駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白返回到ER)。當(dāng)?shù)鞍讖捻樖?cis)到反式(trans)穿過高爾基堆疊體(stack)時(shí)，發(fā)生進(jìn)一步糖基化。特異信號(hào)使一些蛋白返回ER、一些蛋白保留在高爾基體中、一些蛋白傳送到核內(nèi)體和溶酶體、一些蛋白(細(xì)胞表面蛋白)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜并駐留其中。
那些運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜并駐留其中的蛋白經(jīng)歷最長(zhǎng)且最廣泛的運(yùn)輸路徑(trafficking pathway)，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜隨后穿過轉(zhuǎn)運(yùn)小泡(transition vesicle)、高爾基復(fù)合物和分泌小泡(secretory vesicle)的膜，然后才到達(dá)其最終目的地。這些蛋白包括主動(dòng)和被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及細(xì)胞表面受體。
為了說明運(yùn)輸路徑的復(fù)雜性，內(nèi)襯于體腔的上皮細(xì)胞中，ER的分選和分布機(jī)理將不同的蛋白置于細(xì)胞膜的不同亞部(subpart)。例如，腸上皮細(xì)胞中運(yùn)輸糖和氨基酸的蛋白分布在細(xì)胞膜面向腸腔的區(qū)域。MHC分子和結(jié)合抗體的poly-Ig受體在面向體內(nèi)一側(cè)的相對(duì)側(cè)的上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜片段中卷攏(wind up)。
下表是一些已知的細(xì)胞表面分子、受體以及膜相關(guān)蛋白。



因此，對(duì)多種不同前景以及多個(gè)預(yù)定目標(biāo)來說，鑒定能改變一種或多種這些蛋白的表達(dá)水平的化合物是非常重要的。例如，鑒定能改變特定蛋白表達(dá)水平的化合物可能導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)新的治療藥劑?？蛇x地，這樣的鑒定可能導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)缺陷或失調(diào)的原因或途徑。以這種方式，開辟了全新的研究領(lǐng)域以及大量以前未知的可能用于治療干預(yù)的靶點(diǎn)。
另外，鑒定能改變一種或多種這些蛋白表達(dá)水平的化合物應(yīng)該包括直接或者間接影響蛋白表達(dá)水平的化合物。改變內(nèi)在膜蛋白(integral membrane protein)表達(dá)水平的化合物可以直接影響蛋白表達(dá)，例如，通過直接結(jié)合到蛋白上并抑制其運(yùn)輸(trafficking)?？蛇x地，化合物可以間接改變蛋白表達(dá)水平，例如通過作用于一種有助于細(xì)胞膜中膜蛋白運(yùn)輸和整合的伴侶蛋白，或者通過作用于降解目標(biāo)膜蛋白的蛋白。
因此，在本領(lǐng)域存在對(duì)鑒定能改變蛋白、尤其內(nèi)在膜蛋白表達(dá)水平的化合物的分析方法的需要，以及對(duì)改變蛋白水平的機(jī)理的需要。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供分析(法)和方法，用于鑒定能改變蛋白、尤其內(nèi)在膜蛋白如心臟離子通道的表達(dá)水平的試劑。這樣的試劑可以是來自化合物文庫的化合物或者來自DNA文庫的肽。
根據(jù)這些目的和其它目的，本發(fā)明的第一實(shí)施例針對(duì)用于鑒定(能)改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上蛋白表達(dá)水平的試劑的方法，包括a)制備培養(yǎng)基，其含有表達(dá)興趣蛋白(protein of interest)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)加入有效量的候選試劑；c)在候選試劑存在時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間；d)用固定劑(fixtive)處理細(xì)胞；e)加入至少一種有效量的能結(jié)合到蛋白上的抗體；以及f)測(cè)定結(jié)合水平，其中，結(jié)合水平的變化表明候選試劑能改變蛋白表達(dá)水平。
本發(fā)明的第二實(shí)施例針對(duì)用于鑒定能改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白總體表達(dá)水平的試劑的方法，包括a)制備培養(yǎng)基，其含有表達(dá)興趣蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)加入有效量的候選試劑；c)在候選試劑存在時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間；d)先用固定劑隨后用透化劑(permeabilizing agent)處理細(xì)胞；e)加入有效量的至少一種結(jié)合到蛋白上的抗體；以及f)測(cè)定結(jié)合水平，其中，結(jié)合水平的變化表明候選試劑改變了蛋白表達(dá)水平。
本發(fā)明的第三實(shí)施例針對(duì)用于鑒定封閉哺乳動(dòng)物細(xì)胞中離子通道的試劑的方法，包括(i)實(shí)施上述本發(fā)明的第一實(shí)施例的方法，以便確定該試劑是否改變離子通道的表達(dá)水平；(ii)采用蛋白印跡法(Western blot assay)以確定該試劑是否改變離子通道的成熟；以及(iii)采用尾電流分析法以便確定該試劑是否改變離子通道的功效(functional effect)。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目的和特征，部分將在下面的說明中闡述，部分在查看下述內(nèi)容后對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說變得顯而易見，或者通過本發(fā)明的實(shí)施而被掌握。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)并獲得，如所附權(quán)利要求所特別指出的。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例包括用于鑒定試劑的分析系統(tǒng)和方法，該試劑結(jié)合蛋白(如膜離子通道)，從而增加或減少其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施例中，該分析法和系統(tǒng)測(cè)定試劑結(jié)合到蛋白上從而改變其表面表達(dá)的能力。表面表達(dá)的這種改變可以由結(jié)合蛋白特定位點(diǎn)的試劑產(chǎn)生，和/或由減少或者促進(jìn)蛋白的胞內(nèi)運(yùn)輸和/或加工的試劑產(chǎn)生。另外，這樣的改變還可以由結(jié)合到興趣蛋白以外的蛋白上從而間接改變蛋白表達(dá)水平的試劑產(chǎn)生。
現(xiàn)存在多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且可獲得的形式(format)用于恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)合分析。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，將一種或多種表達(dá)興趣蛋白的細(xì)胞在合適的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并使其暴露于一種或多種候選化合物，而在其它實(shí)施例中細(xì)胞則可以固定在表面上。類似地，根據(jù)本發(fā)明的其它一些實(shí)施例，可以將一種或多種候選化合物固定在表面上，并暴露于含有一種或多種表達(dá)興趣蛋白的細(xì)胞的液體培養(yǎng)基，或者將候選化合物包含在合適的液體培養(yǎng)基中，將一種或多種表達(dá)興趣蛋白的細(xì)胞加入到該培養(yǎng)基中。
在其中至少一種候選化合物和興趣蛋白被標(biāo)記(例如，用熒光、放射性、酶、抗體等，包括其組合，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的)的系統(tǒng)中通常更容易檢測(cè)結(jié)合。在將候選化合物暴露于表達(dá)蛋白的細(xì)胞并洗掉或者用別的方式除掉未結(jié)合的試劑之后，測(cè)定標(biāo)記部分的存在(即，結(jié)合到該測(cè)定系統(tǒng)的未標(biāo)記成分上)。
用于進(jìn)行多種結(jié)合分析的方法在本領(lǐng)域是為人熟知的，包括但不限于如在PCT申請(qǐng)US98/18368中所述的那些分析系統(tǒng)。多個(gè)參考文獻(xiàn)提供了對(duì)用于蛋白結(jié)合分析法的多種形式的一般性描述，包括競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析法和直接結(jié)合分析法(見例如，Stites and Terr，Basicand Clinical Immunology，7th ed.(1991)；Maggio，EnzymeImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1980)；and Tijssen，Practice and TheoLy of Enzyme Immunoassays，in LaboratoryTeelmiques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier SciencePublishers，B.V.Amsterdam，(1985))。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施例涉及鑒定化合物的分析系統(tǒng)和方法，該化合物通過改變蛋白的活性和/或通過改變(封閉或促進(jìn))蛋白的胞內(nèi)運(yùn)輸和/或加工來增加或減少興趣蛋白的表達(dá)。
因此，根據(jù)某些特別優(yōu)選的實(shí)施例，提供了免疫測(cè)定法，其中，表達(dá)興趣蛋白的一種或多種細(xì)胞通常結(jié)合到合適的固相載體上(如微孔板的孔、微縮卡或者任何為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的類似形式)，并與候選試劑結(jié)合，觀察興趣蛋白表達(dá)水平的變化。因此，在這些優(yōu)選的實(shí)施例中，一種或多種分析成分附著到固體表面上。
根據(jù)某些實(shí)施例，例如當(dāng)興趣蛋白不在細(xì)胞表面表達(dá)時(shí)，可以使用透化劑。這樣的透化劑有助于抗體、尤其是標(biāo)記的抗體穿透進(jìn)入細(xì)胞中。
透化劑優(yōu)選包含洗滌劑(detergent)，更優(yōu)選陰離子洗滌劑。合適的洗滌劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知且可得到的。合適的陰離子洗滌劑的示例性實(shí)例包括例如二氧膽酸鈉、N-十二烷基肌氨酸鹽以及十二烷基硫酸鈉。
洗滌劑的濃度取決于例如所采用的具體洗滌劑，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。合適的濃度可以在0.001％至10％之間，例如在0.01％至5％之間。
透化劑還優(yōu)選包含寡糖，如海藻糖。透化劑中的寡糖濃度將取決于例如所采用的具體洗滌劑和寡糖，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。合適濃度的示例性實(shí)例在0.001M至1.0M的范圍，優(yōu)選在0.01M至0.1M的范圍。
透化劑的pH可以是適合于被研究的特定蛋白和所采用的細(xì)胞系(cell line)的任何水平，優(yōu)選通常在3至8之間。合適的pH(或pH范圍)可以通過加入本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且可獲得的一種或合適的緩沖劑來實(shí)現(xiàn)。
透化緩沖液(permeabilizing buffer)優(yōu)選大致等滲壓的，可以包含一種或多種用于調(diào)節(jié)其等滲壓性的合適試劑，如氯化鈉。
在一些實(shí)施例中，分析系統(tǒng)可以用于(如在本領(lǐng)域已知的)檢測(cè)由于候選試劑的結(jié)合而引起的興趣蛋白表面表達(dá)的變化。例如，如果興趣蛋白是膜離子通道，可以使用膜片鉗分析法(patch clampassay)檢測(cè)離子穿過膜的通量變化，其可指示離子通道的表面表達(dá)水平的提高。
在可選實(shí)施例中，使用了間接免疫分析系統(tǒng)，其中，通過加入一種或多種針對(duì)蛋白抗原決定簇的抗體對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，正如本領(lǐng)域中所知的。如果該蛋白不在細(xì)胞表面表達(dá)，可能需要加入透化劑以促進(jìn)抗體穿透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
當(dāng)本發(fā)明的方法中使用固相載體時(shí)，幾乎任何固體表面均合適，只要表面材料與分析試劑相容并且可能將成分粘附到表面而不過度改變分析成分的反應(yīng)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到在固相分析中一些成分表現(xiàn)出活性降低，但是只要活性足以被檢測(cè)和/或定量，通常是可以接受的。
合適的固相載體包括但不限于材料或細(xì)胞可以粘附的任何固相表面，如玻璃珠、平面玻璃、可控孔徑玻璃、塑性多孔塑性金屬、或樹脂等。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到在一些實(shí)施例中，在本發(fā)明方法中的固相載體可以通過官能團(tuán)(例如，羥基、胺、羧基、酯、以及硫氫基)衍生以便為連接子(1inker)的粘附提供反應(yīng)位點(diǎn)，或者通過候選試劑或其它分析成分的直接粘附。
分析成分粘附到固相載體上可以是直接的(即，成分直接接觸固相表面)或者間接的(即，試劑和/或成分(例如抗體)結(jié)合到載體上，其它分析成分結(jié)合到該試劑或成分上而不是結(jié)合到固相載體上)。在一些實(shí)施例中，試劑或成分為共價(jià)固定的(例如，使用半胱氨酸的單反應(yīng)硫醇基團(tuán)用于錨定蛋白成分(見例如，Bioconjug.Chem.，4528-536(1993))、或者非共價(jià)但特定的(例如通過所固定的抗體或者其它特異結(jié)合蛋白(見例如，Adv.Mater.，3388-391(1991)；Anal.Chem.，6783-87(1995)))、生物素/抗生蛋白鏈菌素系統(tǒng)(見例如，Biophys.Biochem.Res.Commun.，23076-80(1997))、或者金屬螯合的Langmuir-Blodgett膜(見例如，Langmuir114048-4055(1995)；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，35317-320(1996)；Proc.Natl.Acad Sci.USA934937-4941(1996)；and J.Struct.Biol.，113117-123(1994))、以及金屬螯合的自我組裝單層(見例如，Anal.Chem.，68490-497(1996))，用于聚組氨酸融合蛋白的結(jié)合。
在一些特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本領(lǐng)域中通常為人熟知的標(biāo)準(zhǔn)的直接或間接ELISA、IFA、或RIA方法用來檢測(cè)候選試劑與興趣蛋白的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，在樣品中檢測(cè)到蛋白的表面表達(dá)水平的提高，而在其它實(shí)施例中，檢測(cè)到表面表達(dá)水平的降低。因此，顯然，本發(fā)明的方法適于多種成分(multiple element)的檢測(cè)、鑒定和表征。
因此，本發(fā)明方法特別優(yōu)選的一些實(shí)施例中，可以使用夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試法)，其采用用于捕獲的單克隆或多克隆抗體(Aa捕獲抗體@)以及用于檢測(cè)已結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物的第二抗體(Aa報(bào)告抗體(reporter anibody)@)。
在一些優(yōu)選的ELISA實(shí)施例中，使用堿性磷酸酶軛合物，而在其它優(yōu)選實(shí)施例中，使用辣根過氧物酶軛合物。另外，也可以使用抗生物素蛋白/生物素系統(tǒng)，尤其對(duì)于需要增強(qiáng)信號(hào)的分析系統(tǒng)。用于優(yōu)選實(shí)施例的合適的酶包括但不限于過氧化物酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶及兩種或多種上述酶的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例，可以在加入抗體前用固定劑處理細(xì)胞。為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并可獲得的這樣的合適的固定劑包括但不限于低聚甲醛、甲醛溶液(福爾馬林)、戊二醛、丙酮、乙醇以及丙烯醛。參見，例如，美國(guó)專利No.4,857,300；美國(guó)專利No.5,104,640；美國(guó)專利No.5,422,277；美國(guó)專利No.5,597,688；美國(guó)專利No.5,824,495；以及美國(guó)專利No.6,194,165。
固定劑的濃度取決于例如所采用的具體試劑而變化，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。低聚甲醛的合適濃度的示例性實(shí)例是在合適緩沖液如磷酸緩沖鹽(PBS)中為4％。
固定劑的pH可以是適合被研究的具體蛋白和所采用的細(xì)胞系(cell line)的任何水平，優(yōu)選通常在6至8之間，例如在7左右，如約7.2。合適的pH(或pH范圍)可以通過加入為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并可獲得的一種或多種合適的緩沖劑來實(shí)現(xiàn)。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)示例性方法中，將在胞外抗原決定簇過表達(dá)具有HA標(biāo)簽的鉀通道hERG的細(xì)胞系接種(plate)到96孔微板中(～40000細(xì)胞/孔)。96孔微板(具有透明底部的黑色板)用聚-D-賴氨酸預(yù)涂，以促進(jìn)細(xì)胞粘附到孔的底部。將細(xì)胞接種到由含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12加抗生素組成的完全培養(yǎng)基中，接種約6小時(shí)后將培養(yǎng)基移出，用不含血清或抗生素的DMEM/F12漂洗孔，加入試驗(yàn)物(test article)(在不含血清和抗生素的DMEM/F12中稀釋)。試驗(yàn)物最常溶于DMSO中，在分析中DMSO終濃度為0.1％。載體對(duì)照也含有0.1％DMSO。在表面表達(dá)分析開始之前，將板在37℃/5％CO2中孵育過夜(大約16小時(shí))。
表面表達(dá)分析優(yōu)選于室溫下在臺(tái)式操作臺(tái)(bench top)進(jìn)行。用PBS(磷酸緩沖鹽)將細(xì)胞漂洗三次，接著用新制冰冷4％低聚甲醛/PBS固定(pH7.2，20分鐘)。為了測(cè)定hERG表面表達(dá)，沒有透化細(xì)胞。將固定劑去除后，用PBS洗滌細(xì)胞。通過用1％羊血清/PBS(封閉緩沖液)孵育30分鐘而封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)。將封閉緩沖液去除，用在封閉緩沖液中稀釋的大鼠抗HA抗體(第一抗體)將細(xì)胞孵育2小時(shí)。將第一抗體移除后，用1％羊血清/PBS洗滌細(xì)胞3次(10min/洗滌)。將HRP軛合的羊抗大鼠抗體(第二抗體)在封閉緩沖液中稀釋，并孵育細(xì)胞1小時(shí)。第二抗體混合物也包含熒光DNA結(jié)合染料(SYBR Green)，以便實(shí)驗(yàn)流程結(jié)束時(shí)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。孵育后，用PBS洗滌細(xì)胞3次(10min/洗滌)。用微板熒光檢測(cè)儀(microplate fluorescence reader)測(cè)定熒光，信號(hào)比較于熒光與細(xì)胞數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便確定試驗(yàn)物是否有毒(toxic)并校正試驗(yàn)流程過程中的細(xì)胞損失。用SuperSignal ELISA FemtoMaximum Sensitivity Substrate(Pierce Chemical Co.)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將PBS從孔中移除，加入檢測(cè)試劑，立即用GloRunner光度計(jì)捕獲信號(hào)。
也可加入其它步驟以檢測(cè)內(nèi)在膜蛋白或任何胞內(nèi)蛋白的總體細(xì)胞表達(dá)。固定后，可以采用透化劑(例如，洗滌劑)促進(jìn)抗體到達(dá)胞內(nèi)蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的第一特別優(yōu)選實(shí)施例，提供用于鑒定試劑(諸如肽、蛋白、抗體或者化學(xué)試劑)的方法，該試劑改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白優(yōu)選內(nèi)在膜蛋白(如hERG)的表面表達(dá)水平。該方法包括a)制備第一培養(yǎng)基，其含有表達(dá)興趣蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)加入有效量的候選試劑；c)在候選試劑存在時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)足夠時(shí)間；d)加入有效量的至少一種抗體，其結(jié)合到蛋白的至少一種胞外抗原決定簇；以及e)將細(xì)胞與候選試劑一起孵育后，測(cè)定抗體結(jié)合到蛋白的胞外抗原決定簇的水平。
在候選試劑的存在時(shí)，結(jié)合水平相對(duì)于對(duì)照的任何變化(如升高或降低)表明候選試劑改變蛋白的表面表達(dá)水平。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上文的步驟(d)包括加入有效量的至少一種第一抗體和有效量的至少一種第二抗體。根據(jù)該實(shí)施例，第一抗體優(yōu)選結(jié)合到興趣蛋白的至少一種胞外抗原決定簇上。根據(jù)該實(shí)施例，更優(yōu)選地，第二抗體結(jié)合到第一抗體上。
優(yōu)選地，將第一抗體和/或第二抗體偶聯(lián)到酶上，以便促進(jìn)結(jié)合水平的檢測(cè)和測(cè)定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，用于本發(fā)明方法的合適的酶是已知且可獲得的。合適酶的示例性實(shí)例包括但不限于過氧化物酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶及兩種或多種上述酶的混合物。
可以使用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已知并且可以獲得的任何方法和技術(shù)，進(jìn)行興趣蛋白表面表達(dá)水平的測(cè)定。優(yōu)選地，通過熒光、發(fā)光(luminescence)、放射性、吸光度或者這些方法中兩種或多種的組合，測(cè)定結(jié)合水平。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，抗體結(jié)合的膜蛋白上的胞外抗原決定簇優(yōu)選是野生型抗原決定簇，即，胞外抗原決定簇通常存在于自然產(chǎn)生形式的興趣蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施例，膜蛋白上的胞外抗原決定簇具有標(biāo)簽(tag)。合適的標(biāo)簽對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知并且可以獲得的。用于本發(fā)明方法中特別優(yōu)選的標(biāo)簽為血凝素(HA)標(biāo)簽。標(biāo)簽可以插入到蛋白的胞外區(qū)(胞外結(jié)構(gòu)域)中，或者取代其胞外區(qū)的一部分。
為了說明目的而不是為了限制，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，將離子通道(如hERG)改造成可表達(dá)胞外標(biāo)簽(如HA標(biāo)簽)，該標(biāo)簽位于跨膜區(qū)S1與S2之間的連接子(linker)內(nèi)(這樣的標(biāo)簽優(yōu)選不應(yīng)改變通道的功能特性)。將穩(wěn)定表達(dá)該標(biāo)簽蛋白的細(xì)胞(如HEK 293細(xì)胞)接種(plate)到合適的容器(如96孔微板)中，并用一種或多種候選試劑培養(yǎng)足夠時(shí)間，如過夜。然后，優(yōu)選將細(xì)胞固定，如用甲醛，但是優(yōu)選不透化，并加入識(shí)別HA標(biāo)簽的抗體。第二抗體，優(yōu)選為軛合到酶(如辣根過氧物酶)上的抗體，用于結(jié)合已結(jié)合到所固定細(xì)胞表面上的抗HA抗體。然后，用合適的方法(如化學(xué)發(fā)光反應(yīng)混合法)使細(xì)胞表面信號(hào)顯示出來(develop)，并在例如微盤冷光儀(microtiter plate luminometer)中測(cè)定其水平。對(duì)照細(xì)胞通常用水和/或任何液相載體結(jié)合候選試劑(如DMSO)來培養(yǎng)。
根據(jù)上述方法的更加特別優(yōu)選的實(shí)施例，從培養(yǎng)箱中取出微孔板并去除浸泡細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)，分析蛋白表面表達(dá)。用PBS(100μl)漂洗孔3次，然后用低聚甲醛(例如在PBS中濃度為4％，pH7.2，100μl)固定，然后用PBS漂洗。優(yōu)選將在細(xì)胞表面上的非特異性結(jié)合部位封閉，例如通過用1％羊血清/PBS(封閉緩沖液)孵育細(xì)胞。將封閉緩沖液去除之后，用第一抗體如在封閉緩沖液中的大鼠抗HA抗體孵育細(xì)胞。然后，將第一抗體移出，洗滌細(xì)胞(例如用封閉緩沖液洗滌3次)。加入第二抗體，如在封閉緩沖液中的辣根過氧物酶軛合的抗大鼠羊抗體。然后去除第二抗體，并優(yōu)選洗滌細(xì)胞。
根據(jù)該實(shí)施例，使用合適技術(shù)，如SuperSignal ELISA FemtoMaximum Sensitivity Substrate(Pierce Chemical Co.)可以將化學(xué)發(fā)光信號(hào)顯示出來。加入合適量的試劑(例如微孔板中的每孔50μl)，并用GloRunner光度計(jì)(luminometer)(Turner Designs)獲得數(shù)據(jù)。
可選地，加入熒光反應(yīng)以便監(jiān)控每孔中的細(xì)胞數(shù)量。
采用本發(fā)明的某些實(shí)施例，可以鑒定影響內(nèi)在膜蛋白表達(dá)的肽。例如，在MOI(感染復(fù)數(shù))約為1的條件下，由人心臟產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)文庫(retroviral epression library)可以用于將基因穩(wěn)定遞送至變異的hERG親代細(xì)胞系。在感染之后兩天，將活細(xì)胞用HA特異性第一抗體標(biāo)記，接著用FITC軛合的第二抗體標(biāo)記。用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)對(duì)熒光細(xì)胞進(jìn)行分選，從而選出與親代細(xì)胞相比hERG蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)增加的細(xì)胞。將分選出的細(xì)胞群擴(kuò)增(expand)幾天，然后應(yīng)用上述選擇標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行再次分選。表面染色持久改變的細(xì)胞克隆用于捕獲轉(zhuǎn)化基因。使用克隆位點(diǎn)側(cè)面的載體特異性引物(vector specific primer)在基因組DNA上進(jìn)行PCR反應(yīng)。
為了尋找差異，從FACS分選出的表面表達(dá)增加的細(xì)胞及親代克隆(在PCR反應(yīng)中用作對(duì)照模板)中，將基因組DNA分離。將PCR產(chǎn)物亞克隆至PCR-II-TOPO載體并測(cè)序。使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，在電生理學(xué)和免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)中對(duì)該篩選分離的克隆調(diào)節(jié)hERG蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)能力進(jìn)行測(cè)試。因此，可以鑒定對(duì)有運(yùn)輸能力的hERG蛋白的生物發(fā)生及翻譯后加工過程很關(guān)鍵的基因。
使用FACS對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的基本步驟描述于Ficker et.al.，Am J Physiol.2000；279H1748-H1756以及Ficker et.al.J MolCell Cardial.2000；322327-2337。為了生產(chǎn)病毒，將AmphoPack-293細(xì)胞(Clonetech)以5×106細(xì)胞的密度接種于100mm培養(yǎng)皿。48h后，如制造商(Roche Biochemicals)所推薦的，將10μg質(zhì)粒文庫DNA(Viraport人心臟逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)文庫(Viraport Human HeartRetroviral Expression Library)，Stratagene)與Fugene混合，在血清存在時(shí)加入培養(yǎng)皿中。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA中無選擇標(biāo)記，通過監(jiān)控對(duì)照板上用表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP(Clontech)的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的熒光細(xì)胞，確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和病毒效價(jià)(viral titer)。將表達(dá)中等水平帶HA標(biāo)簽的hERG WT S1HAS2通道蛋白的COS-7細(xì)胞(106)懸浮在5～10ml DMEM中，在MOI(感染復(fù)數(shù))約為1時(shí)用病毒上清液進(jìn)行感染，并接種到100mm培養(yǎng)皿中。幾小時(shí)后，用完全DMEM取代培養(yǎng)基。兩天后，將細(xì)胞用抗HA抗體標(biāo)記，接著用FITC軛合的第二抗體(見上文)標(biāo)記，并用熒光激活細(xì)胞分選儀進(jìn)行分選。當(dāng)與親代細(xì)胞系比較時(shí)，表面熒光顯示出明顯改變的細(xì)胞首先擴(kuò)增(expand)10天，然后進(jìn)行再次分選。從兩次分選出的細(xì)胞群中分離基因組DNA，使用載體特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)以捕獲文庫插入物(insert)。
現(xiàn)在，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了全面描述，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明或者其任何實(shí)施例的保護(hù)范圍的條件下，在廣泛而等價(jià)范圍的條件、配方、以及其它參數(shù)下能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。
將本文引用的所有專利和出版物以引用方式全文結(jié)合于此。任何出版物的引用是為了在提交目之前披露，而不應(yīng)解釋為承認(rèn)這些出版物是現(xiàn)有技術(shù)或者承認(rèn)本發(fā)明就先發(fā)明而言不早于這些出版物。
權(quán)利要求
1.一種鑒定改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白表面表達(dá)水平的試劑的方法，所述方法包括a)制備第一培養(yǎng)基，其含有表達(dá)所述蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入有效量的候選試劑；c)在所述候選試劑存在的情況下將所述細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間；d)用有效量的固定劑處理所述細(xì)胞；e)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入有效量的至少一種結(jié)合到所述蛋白上的抗體；以及f)測(cè)定所述抗體與和所述候選試劑一起的所述蛋白的結(jié)合水平，其中，所述結(jié)合水平相對(duì)于對(duì)照的變化表明所述候選試劑改變所述蛋白的表面表達(dá)水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(e)包括加入有效量的至少一種第一抗體，接著加入有效量的至少一種第二抗體，其中所述第一抗體結(jié)合到所述蛋白的至少一種胞外抗原決定簇上，所述第二抗體結(jié)合到所述第一抗體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過熒光、發(fā)光、放射性、吸光度或者其兩種或多種的組合，測(cè)定所述結(jié)合水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述蛋白為內(nèi)在膜蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述至少一種胞外抗原決定簇包括野生型抗原決定簇。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述至少一種胞外抗原決定簇包含標(biāo)簽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述胞外標(biāo)簽取代所述蛋白的胞外區(qū)的至少一部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述胞外標(biāo)簽插入到所述蛋白的胞外區(qū)中。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述胞外標(biāo)簽包括血凝素(HA)標(biāo)簽。
10.一種鑒定改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的試劑的方法，所述方法包括a)制備第一培養(yǎng)基，其含有表達(dá)所述蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入有效量的候選試劑；c)在所述候選試劑存在下，將所述細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間；d)先用固定劑、隨后用透化劑處理所述細(xì)胞；e)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入有效量的至少一種結(jié)合到所述蛋白上的抗體；以及f)測(cè)定所述抗體與和所述候選試劑一起的所述蛋白的結(jié)合水平，其中，相對(duì)于對(duì)照所述結(jié)合水平的變化表明所述候選試劑改變所述蛋白的表達(dá)水平。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，步驟(e)包括加入有效量的至少一種第一抗體，接著加入有效量的至少一種第二抗體，其中，所述第一抗體結(jié)合到所述蛋白的至少一種抗原決定簇上，所述第二抗體結(jié)合到所述第一抗體上。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，通過熒光、發(fā)光、放射性、吸光度或者其兩種或多種的組合，測(cè)定所述結(jié)合水平。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述蛋白為內(nèi)在膜蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述至少一種抗原決定簇包括野生型抗原決定簇。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述至少一種抗原決定簇包括標(biāo)簽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述標(biāo)簽取代所述蛋白的結(jié)構(gòu)域的至少一部分。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述標(biāo)簽插入到所述蛋白的結(jié)構(gòu)域中。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述標(biāo)簽包括血凝素(HA)標(biāo)簽。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或10所述的方法，其中，所述第一抗體和/或所述第二抗體偶聯(lián)到酶上。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或10所述的方法，其中，所述酶選自由過氧化物酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶及兩種或多種上述酶的混合物組成的組。
21.一種鑒定改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中內(nèi)在膜蛋白表達(dá)水平的肽的方法，所述方法包括a)制備第一培養(yǎng)基，其含有表達(dá)所述蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)文庫；c)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入有效量的至少一種抗體，該抗體結(jié)合到所述蛋白的至少一種胞外抗原決定簇上；d)向所述培養(yǎng)基中加入熒光標(biāo)記的第二抗體；以及e)根據(jù)熒光將所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行分選。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述蛋白為離子通道。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述至少一種抗原決定簇包括野生型抗原決定簇。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述至少一種抗原決定簇包含標(biāo)簽。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述標(biāo)簽取代所述蛋白的結(jié)構(gòu)域的至少一部分。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述標(biāo)簽插入到所述蛋白的結(jié)構(gòu)域中。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述標(biāo)簽包括血凝素(HA)標(biāo)簽。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，將所述第一抗體和/或所述第二抗體偶聯(lián)到酶上。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述酶選自由過氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶及兩種或多種上述酶的混合物組成的組。
30.根據(jù)權(quán)利要求6，15或24所述的方法，其中，在所述胞外抗原決定簇上的所述標(biāo)簽是所述蛋白上存在的唯一標(biāo)簽。
31.根據(jù)權(quán)利要求1或10所述的方法，其中，所述蛋白包含熒光標(biāo)簽。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述標(biāo)簽選自由綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白以及選擇性結(jié)合具有可檢測(cè)特性分子的氨基酸序列組成的組。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述標(biāo)簽取代所述蛋白胞內(nèi)區(qū)的至少一部分。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述標(biāo)簽插入到所述蛋白的胞內(nèi)區(qū)中。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的方法，其中，在所述胞內(nèi)區(qū)中的所述標(biāo)簽是所述蛋白上存在的唯一標(biāo)簽。
全文摘要
本發(fā)明披露了用于鑒定能改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白、尤其是內(nèi)在膜蛋白(整合膜蛋白)表達(dá)水平的試劑的高通量分析系統(tǒng)及方法。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1973203SQ200580014279
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者阿瑟·M·布朗, ?？斯隆し瓶藸? 芭芭拉·A·威布爾 申請(qǐng)人:成泰斯特公司