專利名稱：免疫學的定量方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到免疫學的定量方法和試劑。更詳細講涉及到可在短的反應(yīng)時間內(nèi)實施的高靈敏度的免疫學定量方法和試劑。
背景技術(shù)：
作為現(xiàn)有不均一體系免疫學的測定方法，特開平7-306204號公報中公開了使結(jié)合了配體的微粒分散于液體中，滴到多孔基質(zhì)上，被基質(zhì)捕捉，將含有測定對象的檢體滴到捕捉了上述微粒的多孔基質(zhì)上，再向上面滴下結(jié)合了標記物的標記配體，形成免疫復(fù)合物，然后對該免疫復(fù)合物中的該標記物進行測定的方法免疫測定方法。該方法，如上所述包括于多孔基質(zhì)上進行2次形成免疫復(fù)合物的不均一反應(yīng)的步驟，由于免疫復(fù)合物的形成不充分，存在著靈敏度不能提高的難點。
特開昭60-250257號公報公開了將針對配體特異的結(jié)合物質(zhì)固定于固相，使它與供試驗的樣品反應(yīng)，反應(yīng)生成生物素-標記配體-特異的結(jié)合物質(zhì)，再與進行了標記的抗生物素反應(yīng)，將未反應(yīng)試劑分離，然后測定固相或未反應(yīng)試劑中存在的標記，檢測存在于供試驗的樣品中配體量的免疫學的測定方法。
在上述方法中，由于針對配體的特異性結(jié)合物質(zhì)被固定于固相，以下的2個反應(yīng)，即與對生物素標記的配體的特異性結(jié)合物質(zhì)的反應(yīng)和與進行了標記的抗生物素的反應(yīng)無論那一個反應(yīng)都是在不均一體系進行的，所以與特開平7-306204號公報記載的方法同樣也存在著免疫復(fù)合物的形成不充分、靈敏度提高不充分的難點。
另外，特開平4-318462號公報公開了在玻璃纖維膜過濾器上準備與被測定物質(zhì)特異反應(yīng)的第1物質(zhì)結(jié)合的多孔基質(zhì)，然后在其上面依次供給含有被測定物質(zhì)的樣品、結(jié)合了可檢測的信號發(fā)生物質(zhì)的與被測定物質(zhì)或第1物質(zhì)特異反應(yīng)的第2物質(zhì)以及洗滌液，對于殘存在多孔基質(zhì)上的免疫復(fù)合物測定信號發(fā)生物質(zhì)，求被測定物質(zhì)的量的固相生物學的特異反應(yīng)測定方法。
上述方法也包括于玻璃纖維過濾器上進行2次形成免疫復(fù)合物的不均一反應(yīng)的步驟，所以也存在著與特開平7-306204號公報的方法同樣的難點。
另外在特開2001-235471號公報中也公開了雖然反應(yīng)步驟與特開平4-318462號公報不同，但也包括在多孔過濾器上進行用于形成免疫復(fù)合物的不均一反應(yīng)的步驟的免疫學測定方法。
另外，上述方法中的玻璃纖維過濾器等多孔基質(zhì)在使用時，為了抑制非特異反應(yīng)，預(yù)先用封閉液進行了處理，由于目前已知的封閉液是以磷酸緩沖生理鹽水為基礎(chǔ)做成的，所以對于某一種類的免疫學的定量方法容易引起非特異反應(yīng)，由于這個原因，再現(xiàn)性也變差。
還有，為了在象玻璃纖維過濾器那樣的過濾器上捕捉免疫復(fù)合物，要實施由過濾器的下方進行強制性抽濾的方法(參照特開平6-148184號公報、特開平6-258322號公報、日本專利第2935965號公報和日本專利第3134231號公報)。然而，如果使用現(xiàn)有的抽濾方法，由于液體急速通過過濾器，免疫復(fù)合物難于被過濾器確實捕捉或要想防止液體急速通過，需要額外設(shè)置壓力傳感器等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供在短的反應(yīng)時間內(nèi)可高靈敏度地進行免疫學的定量方法。
本發(fā)明的另外目的在于提供如下的定量方法通過于均一體系中使配體和針對配體特異的結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)，使作為配體和特異的結(jié)合物質(zhì)的反應(yīng)生成物的復(fù)合物生成，然后通過特異的結(jié)合物質(zhì)固定于固相粒子，使上述反應(yīng)在短時間內(nèi)充分進行，可以達到充分靈敏度的免疫學的定量方法。
本發(fā)明的另外目的在于提供如下的定量方法通過用多孔纖維基質(zhì)捕捉用上述方法被固定于固相粒子的配體，提供可以以確實捕捉、而且容易檢測配體存在量的狀態(tài)進行的免疫學的定量方法。
本發(fā)明的另外目的在于提供可以不依賴于測定對象的配體的種類，預(yù)先制備用于固定上述復(fù)合物的固相粒子，因此可適用于各種配體的定量的免疫學的定量方法。
本發(fā)明的另外目的在于提供含有不需要壓力傳感器等復(fù)雜的機構(gòu)或抽濾壓力的微調(diào)整的抽濾結(jié)構(gòu)的免疫學的定量方法。
本發(fā)明的另外目的在于提供含有使液體平穩(wěn)地濾過基質(zhì)，可確實捕捉固相免疫復(fù)合物的抽濾機構(gòu)的免疫學的定量方法。
本發(fā)明的另外目的在于提供即使在過濾基質(zhì)的下方不設(shè)置吸水層，也可以順利地進行過濾，因此可防止由于吸水層含有免疫反應(yīng)殘余物引起的誤檢測的含有抽濾結(jié)構(gòu)的免疫學的定量方法。
本發(fā)明的另外目的在于提供不在過濾基質(zhì)上進行免疫反應(yīng)，因此可防止免疫反應(yīng)成分對過濾基質(zhì)的非特異吸附的免疫學的定量方法。
本發(fā)明的另外目的在于提供可在本發(fā)明的上述免疫學的定量方法中使用的免疫學的定量試劑。
本發(fā)明的另外目的在于提供適合本發(fā)明的免疫學的定量方法的免疫學的封閉液。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點通過以下說明可以闡明。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的上述目的和優(yōu)點，第1可以通過將配體以固相配體復(fù)合物形式固定，通過免疫學的定量方法對固相復(fù)合物中的配體濃度進行測定的方法(以下有時稱為第1方法)達到，其特征是在該方法中，(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和針對配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物生成，(2)使上述復(fù)合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物生成，以及
(3)在配體的濃度測定中使用上述步驟(2)生成的固相復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的上述目的和優(yōu)點，第2可以通過免疫學的定量方法(以下有時稱為第2方法)達到，作為用于配體的測定的免疫學的定量方法，其特征是(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和針對配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物生成，(2)使上述復(fù)合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物生成，以及(3)將上述固相復(fù)合物捕捉到多孔纖維基質(zhì)中，生成固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，以及(4)對于上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，測定第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第2標記物質(zhì)的存在量。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的上述目的和優(yōu)點，第3可以通過將配體以固相配體復(fù)合物形式固定，通過免疫學的定量方法測定該固相復(fù)合物中的配體濃度的方法(以下有時稱為第3方法)，其特征是在該方法中包括(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和對第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體復(fù)合物和第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物的混合物生成，(2)使上述復(fù)合物混合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述各個復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物混合物生成，以及(3)在配體的濃度測定中使用上述步驟(2)生成的固相復(fù)合物混合物。
另外，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的上述目的和優(yōu)點，第4可以通過免疫學的定量方法(以下有時稱為第4方法)達到，作為用于配體測定的免疫學的定量方法，其特征是(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和對第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體復(fù)合物和第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物的混合物生成，(2)使上述復(fù)合物混合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述各個復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物混合物生成，以及(3)將上述固相復(fù)合物混合物捕捉到多孔纖維基質(zhì)中，生成固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，以及(4)對于上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，測定第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第2標記物質(zhì)的存在量。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的上述目的和優(yōu)點，第5可以通過用于配體測定的免疫學的定量試劑達到，其特征是具有對某配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、對某配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子和多孔纖維基質(zhì)的組合。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的上述目的和優(yōu)點，第6可以通過免疫學的封閉液達到，其特征是所述封閉液由含有酪蛋白、非離子表面活性劑、以及與鈣離子反應(yīng)不形成水不溶性鹽的具有pH7～9緩沖能力的緩沖劑，且pH7～9的水溶液構(gòu)成。
具體實施例方式
以下對本發(fā)明方法進行詳細敘述。首先就第1方法進行說明。在第1方法中，在步驟(1)中可以使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在均一體系中生成。配體可以是抗原和抗體中任一種。例如AFP、CA19-9、CA125、PSA、鐵蛋白、CEA、CA15-3等腫瘤標志；TSH、T3、T4、LH、FSH、hCG、催乳激素、hGH、[促]胃液素、生長抑素、胰高血糖素、胰島素等激素；象IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、TBG、CRP、β2-微球蛋白那樣的蛋白質(zhì)；彈性蛋白酶、堿性磷酸酶、淀粉酶、蛋白水解酶、脂肪酶、核糖核酸酶、烯醇化酶等酶；肝炎病毒、愛滋病毒等病毒和抗病毒抗體等。
作為含有配體的檢體，例如血液(包括血清和血漿)、淋巴液、唾液、尿等體液；糞便和來自生物體組織的提取液等。
另外，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)中的該特異的結(jié)合物質(zhì)既可以是同一物質(zhì)，也可以是不同物質(zhì)，無論那一種針對配體都具有特異的結(jié)合性，例如抗體、抗原、凝集素、蛋白A等。
作為第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該標記，例如生物素、抗生物素蛋白、鏈抗生物素蛋白、糖鏈等。
而作為第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該標記，例如同位素(125I等)、酶(過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、蟲熒光素酶等)、熒光體(熒光素、銪衍生物等)、發(fā)光體(アクリジニウムエステル、N-氨基丁基-N-乙酰異氨基苯二酰肼等)。
步驟(1)的反應(yīng)在溶劑中進行。作為溶劑，可以使用這方面眾所周知的緩沖液和可在該緩沖液中再含有少量的表面活性劑或/和蛋白質(zhì)的緩沖液。
反應(yīng)時間因配體和特異的結(jié)合物質(zhì)的種類不同而不同，優(yōu)選1～30分鐘，更優(yōu)選2～10分鐘。
步驟(1)中生成的上述復(fù)合物然后在步驟(2)中與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)例如與生物素特異性結(jié)合的物質(zhì)，例如擔載了抗生物素抗體的擔載固相粒子接觸。實際的操作可以在步驟(1)結(jié)束后的反應(yīng)液中加上述擔載固相粒子，根據(jù)需要可于攪拌狀態(tài)下放置。
作為固體粒子，例如高嶺土和碳等無機物的微粒；天然橡膠乳膠中的橡膠微粒；聚苯乙烯等有機高分子化合物的乳膠中的聚合物微粒等。作為上述聚合物微粒的原料，例如聚苯乙烯、苯乙烯等單體和帶有氨基、巰基、羧基、活性酯基、醛基等官能團的單體的共聚物、聚丙烯醛(polyacrolein)。更具體講，例如具有活性酯基的苯乙烯與甲基丙烯酸苯甲基锍硫酸鹽的共聚物、二甘醇二甲基丙烯酸與N-丙烯酰氧基琥珀酸亞胺的共聚物、二甘醇二甲基丙烯酸和1-甲基丙烯酰氧基苯并三唑的共聚物和含有醛基的聚丙烯醛。固相粒子既可以是單一粒子，也可以是凝集粒子。固相粒子的平均粒徑優(yōu)選是在0.3～1.0μm的范圍內(nèi)。另外，固相粒子的分布以窄為好。固相粒子的平均粒徑如果變大，在水性溶液中的分散性降低，由于每單位粒子重量的表面積降低，所以導致測定靈敏度降低。另外當平均粒徑過小時，用過濾器的捕捉效率降低，最終導致測定靈敏度降低。
為了使固相粒子擔載與第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)，可以使用目前眾所周知的方法。例如，有通過物理吸附的方法、或使用表面帶有官能團的固相粒子，通過交聯(lián)試劑與擔載的上述物質(zhì)的官能團結(jié)合的方法等。
在步驟(2)的反應(yīng)中，生成了上述復(fù)合物通過該第1標記物質(zhì)與擔載固相粒子結(jié)合的固相復(fù)合物。
由于這個固相復(fù)合物按照依賴于配體存在于檢體中的濃度的濃度被固定，所以在步驟(3)中，通過測定第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第2標記的量來測定被固定的配體的濃度，可以對檢體中配體的濃度進行定量。
作為測定固相復(fù)合物中第2標記的存在量的方法，根據(jù)標記可以使用現(xiàn)有眾所周知的方法。例如，標記由酶構(gòu)成時，(1)使標記與發(fā)色底物接觸，通過使用積分球的比色計測定發(fā)色的方法，(2)與熒光底物接觸，使用反應(yīng)型的熒光測定機來測定熒光強度的方法，(3)與熒光底物接觸，計測發(fā)光強度的方法等。標記物是熒光體時，可以計測通過對基質(zhì)上照射適當?shù)募ぐl(fā)光產(chǎn)生的熒光。標記物為發(fā)光體時，通過添加適當?shù)呐潴w，可以計測產(chǎn)生的發(fā)光。
上述第1方法，更具體講，(i)配體是抗原，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗原的第1標記抗體，而第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗原的第2標記抗體，或者配體是抗體，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗體的第1標記抗原，而第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗體的第2標記抗原或第2標記抗體。
本發(fā)明的第2方法，在實施了與上述第1方法的步驟(1)、(2)同樣的步驟(1)、(2)后，實施將步驟(2)生成的固相復(fù)合物捕捉到多孔纖維基質(zhì)生成固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)的步驟(3)。
步驟(2)生成的固相復(fù)合物是依次結(jié)合了針對配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、擔載了與該第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的固體粒子的固相復(fù)合物。
作為多孔纖維基質(zhì)，例如玻璃纖維過濾器、石英纖維膜過濾器、硅纖維過濾器、硝基纖維素過濾器、聚醋酸酯過濾器、濾紙等。
其中玻璃纖維過濾器優(yōu)選。為了防止非特異吸附，也可以用適當?shù)牡鞍踪|(zhì)、糖、聚合物等包覆多孔纖維基質(zhì)。
多孔纖維基質(zhì)由于由三維空間交叉的很多條纖維構(gòu)成，所以通過這些纖維形成的孔(空隙)可以捕捉各種大小的粒子。這表明多孔纖維基質(zhì)即使在多孔纖維基質(zhì)內(nèi)部也可以捕捉能夠捕捉的大小的粒子。如果能夠按照分布于多孔纖維基質(zhì)內(nèi)部那樣捕捉固相復(fù)合物，可以容易、而且正確地進行固相復(fù)合物的檢測。本發(fā)明中使用的多孔纖維基質(zhì)優(yōu)選是具有能夠捕捉粒徑為0.2～8.0μm粒子的捕捉能力。這樣優(yōu)選的多孔纖維基質(zhì)作為市售品如可以購買到任一種玻璃纖維制的Millipore公司的商品名AP25、Whatman公司的商品名GF/D。
該多孔纖維基質(zhì)在步驟(3)使用前，優(yōu)選預(yù)先用由含有酪蛋白、非離子表面活性劑、以及與鈣離子反應(yīng)不形成水不溶性鹽的具有pH7～9緩沖能力的緩沖劑，且pH7～9的水溶液構(gòu)成的免疫學的封閉液進行處理。作為非離子表面活性劑，例如可以使用Tween20、Tween80、TritonX-100、ノイゲン157、辛基葡糖苷、辛基巰基葡糖苷、庚基巰基葡糖苷、MEGA-9、MEGA-10等。另外作為上述緩沖劑，優(yōu)選使用例如Tris-HCl、TES-NaOH、HEPES-NaOH、EPPS-NaOH、Tricine-NaOH、TAPS-NaOH等。上述免疫學的封閉液除了酪蛋白、非離子表面活性劑和緩沖劑之外還可以含有例如NaN3、Micr-O-protect、procline、mcrocide等防腐劑氯化鈉、氯化鎂、芒硝、季胺鹽等中性鹽聚乙二醇、羧甲基纖維素、フイコ-ル等水溶性高分子和葡萄糖、蔗糖、海藻糖等糖。上述免疫封閉液的pH為7～9。
多孔纖維基質(zhì)用免疫學的封閉液的處理可以通過例如將多孔纖維基質(zhì)浸漬到免疫學的封閉液中的方法、向多孔纖維基質(zhì)噴霧免疫學的封閉液等，使其浸潤的方法等進行。
作為將固相復(fù)合物捕捉到多孔纖維基質(zhì)的操作的步驟(3)為了使得多孔纖維基質(zhì)的過濾流量達到6～48mL/min/cm2，對于該多孔纖維基質(zhì)從下方進行抽濾。過濾流量優(yōu)選是9.5～16mL/min/cm2。
這樣的過濾流量可以通過例如在上述多孔纖維基質(zhì)的抽濾方向下方配置連續(xù)空隙物質(zhì)，然后借助于該連續(xù)空隙物質(zhì)，通過抽濾泵抽濾或者在上述多孔纖維基質(zhì)的抽濾下方設(shè)計一個通向大氣的空間，借助于該空間進行抽濾可以達到。
作為上述連續(xù)空隙物質(zhì)，只要是可以吸收液體、具有通氣性的就可以，沒有特別限定。作為其原材料，例如纖維素、玻璃、PVA、聚氨酯、聚酯、聚丙烯、氯乙烯、聚乙烯、陶瓷等。
連續(xù)空隙物質(zhì)的氣孔率優(yōu)選50～95％，更優(yōu)選80～95％。另外空隙的氣孔徑優(yōu)選20～2000μm，更優(yōu)選100～500μm。作為連續(xù)空隙物質(zhì)的市售品的優(yōu)選例子如アイオン株式會社生產(chǎn)的ベルイ-タ-D系列Y(D)。
通過上述連續(xù)空隙物質(zhì)進行抽濾，由于通過在連續(xù)空隙物質(zhì)不與多孔纖維基質(zhì)接觸的側(cè)面開的氣孔抽濾空氣，所以可以由與多孔纖維基質(zhì)接觸的面通過多孔纖維基質(zhì)平穩(wěn)地抽濾液體。抽濾的強度雖然依賴于連續(xù)空隙物質(zhì)的厚度、氣孔率、氣孔徑或抽濾泵的抽力等，但在連續(xù)空隙物質(zhì)和抽力都同樣的狀況下，希望在多數(shù)情況下可以通過連續(xù)空隙物質(zhì)的厚度、即配置在由多孔纖維基質(zhì)和由抽濾泵延伸出的抽濾端之間的連續(xù)空隙物質(zhì)的厚度進行調(diào)節(jié)。
另外，另一種方式，也可以在多孔纖維基質(zhì)的抽濾方向下方設(shè)計一個通向大氣的空間，通過這個空間進行抽濾。此時，將多孔纖維基質(zhì)與抽濾端分開一段距離，通過分開距離也可以調(diào)節(jié)抽力。此時為了將分開出現(xiàn)的空間圍起來，通過配置連續(xù)空隙物質(zhì)，可以平穩(wěn)地調(diào)節(jié)抽力。這種情況下的連續(xù)空隙物質(zhì)可以做成例如將由多孔纖維基質(zhì)的正下方開始到抽濾端間挖通，形成筒狀空間。
在第2方法中，在接下來的步驟(4)中，對于步驟(3)生成的上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，測定第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第2標記物質(zhì)的存在量。測定可以通過與第1方法中記載的同樣的方法進行。實際上可以將發(fā)色物質(zhì)或熒光物質(zhì)滴到固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)上，進行依賴于第2標記物質(zhì)的發(fā)色等。
本發(fā)明的第3方法和第4方法可以利用所謂的競爭法或所謂的競爭抑制法等眾所周知的方法。
在第3方法中，步驟(1)中作為在均一體系中使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體復(fù)合物和第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物的混合物生成，作為配體、含有配體的檢體可以與第1方法中記載的同樣。第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)與第1方法不同，不是針對配體的，而是針對第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的物質(zhì)。作為第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)可以使用與第1方法記載同樣的物質(zhì)。作為第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)如酶標記配體、熒光體標記配體、配體進行了偶聯(lián)的酶標記KLH(匙孔血藍蛋白)。
在步驟(2)中，使上述復(fù)合物混合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸。與第1方法不同之處在于由于使用了復(fù)合物混合物，各個復(fù)合物與擔載固相粒子生成通過第1標記結(jié)合的固相復(fù)合物的混合物。即在其中的各個混合物中，存在著配體與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的復(fù)合物、和第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的復(fù)合物。這些復(fù)合物的比例依賴于配體和第2標記特異物質(zhì)對第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合強度以及配體和第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的存在量，互相進行競爭。
接下來在步驟(3)中，對于步驟(2)中生成的固相復(fù)合物混合物測定配體的濃度，即與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)結(jié)合后被固定的配體的濃度，對檢體中的配體的量進行定量。
本發(fā)明的第4方法在實施了與上述第3方法的步驟(1)、(2)同樣的步驟(1)、(2)后，實施將步驟(2)生成的固相復(fù)合物混合物捕捉到多孔纖維基質(zhì)生成固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)的步驟(3)。步驟(3)與第2方法的步驟(3)同樣進行。
第3方法和第4方法的步驟(3)中生成的固相復(fù)合物混合物由配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、擔載了與該第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記特異性結(jié)合的物質(zhì)的固相粒子依次以該順序結(jié)合的第1固相復(fù)合物、和對該第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、擔載了與該第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記特異性結(jié)合的物質(zhì)的固體粒子依次以該順序結(jié)合的第2固相復(fù)合物構(gòu)成。
另外有關(guān)本發(fā)明的第3方法和第4方法，沒有記載的事項可以理解為第1方法和第2方法中記載的事項直接或在進行了本領(lǐng)域的技術(shù)人員都明白的變更后被運用。
在本發(fā)明的第1～第4方法中，在各個步驟間根據(jù)需要可以設(shè)置洗滌步驟。
根據(jù)本發(fā)明，就像由上述說明理解的那樣，由于被擔載固體粒子擔載的物質(zhì)不是與配體特異性結(jié)合的物質(zhì)，而是與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)，所以存在著可以不用根據(jù)配體的種類不同來準備不同擔載固體粒子的優(yōu)點。因此，根據(jù)本發(fā)明，利用這樣的優(yōu)點，可以提供(i)用于配體測定的免疫學的定量試劑，其特征是具有對某配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、對某配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子和多孔纖維基質(zhì)的組合，以及(ii)用于配體測定的免疫學的定量試劑，其特征是具有對某配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、對第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子和多孔纖維基質(zhì)的組合。
另外，根據(jù)本發(fā)明，同樣提供免疫學的封閉液，作為適合用于實施本發(fā)明的免疫學的封閉液，其特征是由含有酪蛋白、非離子表面活性劑、以及與鈣離子反應(yīng)不形成水不溶性鹽的具有pH7～9緩沖能力的緩沖劑，且pH7～9的水溶液構(gòu)成。
實施例為了對本發(fā)明進行更詳細說明，以下舉出實施例進行說明，但本發(fā)明并不限定于這些實施例。
實施例11)擔載抗生物素抗體的固相粒子溶液的制作向用50mM磷酸緩沖液(pH7.4)(以下略為磷酸緩沖液)離心清洗的1.0％乳膠粒子(積水化學工業(yè)株式會社生產(chǎn)，N-500，平均粒徑0.5μm)溶液1mL中添加用磷酸緩沖液配置的濃度達到0.7mg/mL的來自山羊的抗生物素多克隆抗體1mL，于37℃下振蕩2小時。然后添加用磷酸緩沖液配置的1％的牛血清白蛋白(BSA)(オリエンタル酵母工業(yè)株式會社制)，再于37℃下振蕩2小時。對擔載了上述抗生物素抗體的乳膠粒子進行離心分離除去上清后，添加4mL含有0.8％的NaCl和1％的BSA的HEPES緩沖液(pH8.0)(以下略為HEPES-S緩沖液)，使該乳膠粒子分散。然后，再次對乳膠粒子進行離心分離除去上清后，添加HEPES緩沖液4mL，使該乳膠粒子分散，作為擔載抗生物素抗體的固相粒子溶液。
2)堿性磷酸酶標記抗胰島素抗體的制作向用磷酸緩沖液配置的濃度達到1mg/mL的抗胰島素單克隆抗體(ダコ公司生產(chǎn)，OXI005，來自小鼠)溶液1mL中加1mg/mL的2-亞胺噻茂烷鹽酸鹽水溶液0.1mL，于25℃下振蕩1小時。然后通過凝膠過濾從上述單克隆抗體溶液中除去未反應(yīng)的2-亞胺噻茂烷，制作導入巰基的抗胰島素抗體。將堿性磷酸酶(キツコ-マン株式會社)溶解于上述的1mg/mL導入巰基的抗胰島素抗體溶液1mL后，添加20μL溶解于二甲基甲酰胺的濃度達到5mg/mL的N-(γ-馬來酰亞胺丁基氧)琥珀酰亞胺，于25℃下振蕩過夜。然后通過過濾，收集表現(xiàn)出抗體活性和酶活性兩方活性的級分，制作堿性磷酸酶標記抗胰島素抗體。
3)生物素標記抗胰島素抗體的制作向用10mM的HEPES緩沖液(pH8.5)配置的濃度達到1mg/mL的抗胰島素單克隆抗體(ダコ公司生產(chǎn)，OXI018，來自小鼠)溶液1mL中加用二甲基亞砜溶解的濃度達到1mM的Biotin-AC5-OSu(株式會社同仁化學研究所生產(chǎn))0.1mL，于25℃下靜置4小時。然后通過凝膠過濾除去未反應(yīng)的Biotin-AC5-OSu，制作生物素標記抗胰島素抗體。
4)測定對象物質(zhì)(被檢體)在測定中使用的被檢體通過將市售的胰島素(和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn))按照分別達到0、0.1、1、10、100μIU/mL那樣用磷酸緩沖液稀釋制作。
5)粒子的捕捉器具制作在圓柱狀的吸器上由下依次層疊吸水材料、玻璃過濾器(Millipore公司生產(chǎn)，AP-25)的器具，作為乳膠粒子的捕捉材料。
6)測定操作將用含有1％的酪蛋白的磷酸緩沖液稀釋成5μg/mL的生物素標記抗胰島素抗體溶液18μL、用含有1％的酪蛋白的磷酸緩沖液稀釋成0.2μg/mL的堿性磷酸酶標記抗胰島素抗體溶液18μL、以及被檢體24μL混合，于37℃下溫育5分鐘。然后添加20μL上述1)制作的擔載抗生物素抗體的固相粒子溶液，再于37℃下溫育3分鐘，制備通過生物素標記抗胰島素抗體和胰島素固定了堿性磷酸酶標記抗胰島素抗體的粒子(以下稱為堿性磷酸酶固定粒子)。將制備的50μL堿性磷酸酶固定粒子滴到用50μL的25％ブロツクエ-ス(大日本制藥株式會社生產(chǎn))浸潤的捕捉材料，將含有0.05％Tween20(和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn))的磷酸緩沖液0.1mL以2次滴到捕捉材料，對捕捉材料中的玻璃過濾器進行清洗。然后，將該捕捉材料供堿性磷酸酶活性的測定用。
7)堿性磷酸酶活性的測定捕捉材料中的堿性磷酸酶活性的測定通過全自動化學發(fā)光測定裝置MI02(株式會社エイアンドデイ-生產(chǎn))進行。作為化學發(fā)光底物使用APS-5(ルミジエン公司生產(chǎn))，每1個捕捉材料滴30μL的APS-5。
8)測定結(jié)果表1給出了胰島素濃度與通過上述測定得到的信號強度的關(guān)系。
表1
實施例2將實施例1中的堿性磷酸酶標記的抗胰島素抗體換成抗PSA單克隆抗體(フイツツジエラルド公司生產(chǎn)、10-P20)，生物素標記的抗胰島素抗體換成抗游離的PSA單克隆抗體(フイツツジエラルド公司生產(chǎn)、10-P21)，并分別進行標記，測定時除了將生物素標記抗游離的PSA單克隆抗體溶液中的抗體濃度配成20μg/mL，取10μL溶液量，堿性磷酸酶標記的游離的PSA單克隆抗體溶液中的抗體濃度配成2μg/mL，取10μL溶液量，被檢體量變更為50μL，將被檢體規(guī)定為用磷酸緩沖液稀釋后制作的游離的PSA(濃度0、0.005、0.05、0.5、5ng/mL)以外，其它根據(jù)實施例1進行測定。結(jié)果如表2所示。
表2
實施例3將實施例1中的堿性磷酸酶標記的抗胰島素抗體換成抗N-ANP單克隆抗體(メデイツクスバイオケミカ公司生產(chǎn)、7905)，生物素標記的抗胰島素抗體換成抗N-ANP單克隆抗體(メデイツクスバイオケミカ公司生產(chǎn)、7801)，并分別進行標記，測定時除了將生物素標記抗N-ANP單克隆抗體溶液中的抗體濃度配成10μg/mL，取15μL溶液量，堿性磷酸酶標記的抗N-ANP單克隆抗體溶液中的抗體濃度配成2μg/mL，取15μL溶液量，被檢體量變更為30μL，將被檢體規(guī)定為用磷酸緩沖液稀釋后制作的N-ANP(濃度0、5、50、500、5000pmol/L)以外，其它根據(jù)實施例1進行測定。結(jié)果如表3所示。
表3
實施例4
將實施例1中的堿性磷酸酶標記的抗胰島素抗體換成抗C-肽單克隆抗體(ダコ公司生產(chǎn)、PEP-001)，生物素標記的抗胰島素抗體換成抗C-肽單克隆抗體(ダコ公司生產(chǎn)、CPT-3F11)，并分別進行標記，測定時除了將生物素標記抗C-肽單克隆抗體溶液中的抗體濃度配成5μg/mL，取20μL溶液量，堿性磷酸酶標記的抗C-肽單克隆抗體溶液中的抗體濃度配成0.2μg/mL，取20μL溶液量，被檢體量變更為20μL，將被檢體規(guī)定為用磷酸緩沖液稀釋后制作的C-肽(濃度0、0.01、0.1、1、10ng/mL)以外，其它根據(jù)實施例1進行測定。結(jié)果如表4所示。
表4
實施例5將實施例1中的堿性磷酸酶標記的抗胰島素抗體換成抗胃蛋白酶原I單克隆抗體(メデイツクスバイオケミカ公司生產(chǎn)、8003)，生物素標記的抗胰島素抗體換成抗胃蛋白酶原I單克隆抗體(メデイツクスバイオケミカ公司生產(chǎn)、8009)，并分別進行標記，測定時除了將生物素標記抗胃蛋白酶原I單克隆抗體溶液中的抗體濃度配成10μg/mL，取20μL溶液量，堿性磷酸酶標記的抗胃蛋白酶原I單克隆抗體溶液中的抗體濃度配成0.4μg/mL，取20μL溶液量，被檢體量變更為20μL，將被檢體規(guī)定為用磷酸緩沖液稀釋后制作的胃蛋白酶原I(濃度0、0.1、2、16、160ng/mL)以外，其它根據(jù)實施例1進行測定。結(jié)果如表5所示。
表5
實施例6除了將實施例1中的捕捉材料中的玻璃過濾器由AP-25變更為GF/D(Whatman公司生產(chǎn))以外，用與實施例1相同的方法測定被檢體。結(jié)果如表6所示。
表6
實施例7除了將實施例1中的擔載抗生物素多克隆抗體的乳膠粒子變更為N-300(積水化學工業(yè)株式會社生產(chǎn)，平均粒徑0.3μm)，捕捉材料中的玻璃過濾器由AP-25變更為AP-15(Millipore公司生產(chǎn))以外，用與實施例1相同的方法測定被檢體。結(jié)果如表7所示。
表7
實施例81)擔載抗生物素抗體的固相粒子溶液的制作向用50mM磷酸緩沖液(pH7.4)(以下略為磷酸緩沖液)離心清洗的1.0％乳膠粒子(積水化學工業(yè)株式會社生產(chǎn)，N-500，平均粒徑0.5μm)溶液1mL中添加用磷酸緩沖液配置的濃度達到0.7mg/mL的來自山羊的抗生物素多克隆抗體1mL，于37℃下振蕩2小時。然后添加用磷酸緩沖液配置的1％的牛血清白蛋白(BSA)(オリエンタル酵母工業(yè)株式會社制)，再于37℃下振蕩2小時。對擔載了上述抗生物素多克隆抗體的乳膠粒子進行離心分離除去上清后，添加4mL含有0.8％的NaCl和1％的BSA的HEPES緩沖液(pH8.0)(以下略為HEPES-S緩沖液)，使該乳膠粒子分散。然后，再次對乳膠粒子進行離心分離除去上清后，添加HEPES-S緩沖液4mL，使該乳膠粒子分散，作為擔載抗生物素抗體的固相粒子溶液。
2)堿性磷酸酶標記抗C-肽抗體的制作向用磷酸緩沖液配置的達到1mg/mL的抗C-肽單克隆抗體(ダコ公司生產(chǎn)，PEP001，來自小鼠)溶液1mL中加1mg/mL的2-亞胺噻茂烷鹽酸鹽水溶液0.1mL，于25℃下振蕩1小時。然后通過凝膠過濾從上述單克隆抗體溶液中除去未反應(yīng)的2-亞胺噻茂烷，制作導入巰基的抗胰島素抗體。將堿性磷酸酶(キツコ-マン株式會社)溶解于上述的1mg/mL導入巰基的抗胰島素抗體溶液1mL后，添加20μL溶解于二甲基甲酰胺的濃度達到5mg/mL的N-(γ-馬來酰亞胺丁基氧)琥珀酰亞胺，于25℃下振蕩過夜。然后通過凝膠過濾，收集表現(xiàn)出抗體活性和酶活性兩方活性的級分，制作堿性磷酸酶標記抗C-肽抗體。
3)生物素標記抗C-肽抗體的制作向用10mM的HEPES緩沖液(pH8.5)配置的達到1mg/mL的抗C-肽單克隆抗體(ダコ公司生產(chǎn)，CPT3F11，來自小鼠)溶液1mL中加用二甲基亞砜溶解的濃度達到1mM的Biotin-AC5-OSu(株式會社同仁化學研究所生產(chǎn))0.1mL，于25℃下靜置4小時。然后通過凝膠過濾除去未反應(yīng)的Biotin-AC5-OSu，制作生物素標記抗C-肽抗體。
4)測定對象物質(zhì)(被檢體)用于測定的被檢體通過將市售的C-肽(コスモバイオ株式會社生產(chǎn))按照分別達到0、0.1、3ng/mL那樣用磷酸緩沖液稀釋來制作。
5)粒子的捕捉器具制作在圓柱狀的吸器上由下依次層疊吸水材料、玻璃過濾器(Millipore公司生產(chǎn)，AP-25)的器具，作為乳膠粒子的捕捉材料。
6)測定操作將用含有1％的酪蛋白的磷酸緩沖液稀釋成5μg/mL的生物素標記抗C-肽抗體溶液20μL、用含有1％的酪蛋白的磷酸緩沖液稀釋成0.1μg/mL的堿性磷酸酶標記抗C-肽抗體溶液10μL、以及被檢體10μL混合，于37℃下溫育10分鐘。然后添加20μL上述1)制作的擔載抗生物素抗體的固相粒子溶液，再于37℃下溫育3分鐘，制備通過生物素標記抗C-肽抗體和C-肽固定了堿性磷酸酶標記抗C-肽抗體的粒子(以下稱為堿性磷酸酶固定粒子)。將制備的50μL堿性磷酸酶固定粒子滴到由1％酪蛋白(和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn))和0.1％Triton X100、0.8％的NaCl溶解的Tris鹽酸緩沖液(pH7.4)構(gòu)成的封閉液50μL浸潤的捕捉材料，將含有0.05％Tween20(和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn))的磷酸緩沖液0.1mL以2次滴到捕捉材料，對捕捉材料中的玻璃過濾器進行清洗。然后，將該捕捉材料供堿性磷酸酶活性的測定用。對于同一被檢體進行2次上述的測定操作。
7)堿性磷酸酶活性的測定捕捉材料中的堿性磷酸酶活性的測定通過全自動化學發(fā)光測定裝置MI02(株式會社エイアンドテイ-生產(chǎn))進行。作為化學發(fā)光底物使用APS-5(ルミジエン公司生產(chǎn))，對于每1個捕捉材料滴30μL的APS-5。
8)測定結(jié)果表8給出了C-肽與通過上述測定得到的信號強度的關(guān)系。
表8
實施例91)擔載抗生物素抗體的固相粒子溶液的制作向用0.05moL/L磷酸緩沖液(pH7.4)(以下略為磷酸緩沖液)離心清洗的1.0％乳膠粒子(積水化學工業(yè)株式會社生產(chǎn)，N-500，平均粒徑0.5μm)溶液1mL中添加用磷酸緩沖液配置的濃度達到0.7mg/mL的來自山羊的抗生物素多克隆抗體1mL，于37℃下振蕩2小時。然后添加用磷酸緩沖液配置的1％的牛血清白蛋白(BSA)(オリエンタル酵母工業(yè)株式會社制)1mL，再于37℃下振蕩2小時。對擔載了上述抗生物素多克隆抗體的乳膠粒子進行離心分離除去上清后，添加4mL含有0.8％的NaCl和1％的BSA的HEPES緩沖液(pH8.0)(以下略為HEPES-S緩沖液)，使該乳膠粒子分散。然后，再次對乳膠粒子進行離心分離除去上清后，添加HEPES-S緩沖液4mL，使該乳膠粒子分散，作為擔載抗生物素抗體的固相粒子溶液。
2)堿性磷酸酶標記抗C-肽抗體的制作向用磷酸緩沖液配置的達到1mg/mL的抗C-肽單克隆抗體(ダコ公司生產(chǎn)，PEP-001，來自小鼠)溶液1mL中加1mg/mL的2-亞胺噻茂烷鹽酸鹽水溶液0.1mL，于25℃下振蕩1小時。然后通過凝膠過濾從上述單克隆抗體溶液中除去未反應(yīng)的2-亞胺噻茂烷，制作導入巰基的抗C-肽抗體。將堿性磷酸酶(キツコ-マン株式會社)溶解于上述的1mg/mL導入巰基的抗C-肽抗體溶液1mL后，添加20μL溶解于二甲基甲酰胺的濃度達到5mg/mL的N-(γ-馬來酰亞胺丁基氧)琥珀酰亞胺，于25℃下振蕩過夜。然后通過凝膠過濾收集表現(xiàn)出抗體活性和酶活性兩方活性的級分，制作堿性磷酸酶標記抗C-肽抗體。
3)生物素標記抗C-肽抗體的制作向用0.01mol/L的HEPES緩沖液(pH8.5)配置的達到1mg/mL的抗C-肽單克隆抗體(ダコ公司生產(chǎn)，CPT-3-F11，來自小鼠)溶液1mL中加用二甲基亞砜溶解的濃度達到0.001mol/L的Biotin-AC5-OSu(株式會社同仁化學研究所生產(chǎn))0.1mL，于25℃下靜置4小時。然后通過凝膠過濾除去未反應(yīng)的Biotin-AC5-OSu，制作生物素標記抗C-肽抗體。
4)測定對象物質(zhì)(被檢體)用于測定的被檢體通過將市售的C-肽(コスモバイオ株式會社生產(chǎn))按照分別達到0、0.1、3ng/mL那樣用磷酸緩沖液稀釋來制作。
5)粒子的捕捉器具制作在底面開了直徑6mm洞的圓柱狀的吸器的底設(shè)置玻璃過濾器(Millipore公司生產(chǎn)，AP-25)的器具，作為乳膠粒子的捕捉材料。
6)抽濾排液裝置抽濾導管(內(nèi)徑2.5mm的不銹鋼管)的一端安裝加工成一邊為1cm的立方體的PVA海綿(アイオン株式會社生產(chǎn)的ベルイ-タ-D系列Y(D))，該海綿配置在設(shè)置了上述玻璃過濾器的圓柱狀吸器的洞的下面。在該不銹鋼管的另一端安裝耐壓管，通過排液閥門接在真空泵(メド-產(chǎn)業(yè)株式會社生產(chǎn)，VP0125，吐出空氣量7L/min)上，做成抽濾排液裝置。使用該裝置時，在上述5)的捕捉材料中使用的玻璃過濾器中的過濾流量為12mL/min/cm2。
7)測定操作將用含有1％的酪蛋白的磷酸緩沖液稀釋成5μg/mL的生物素標記抗C-肽抗體溶液20μL、用含有1％的酪蛋白的磷酸緩沖液稀釋成0.1μg/mL的堿性磷酸酶標記抗C-肽抗體溶液10μL、以及被檢體10μL混合，于37℃下溫育10分鐘。然后添加20μL上述1)制作的擔載抗生物素抗體的固相粒子溶液，再于37℃下溫育3分鐘，制備通過生物素標記抗C-肽抗體和C-肽固定了堿性磷酸酶標記抗C-肽抗體的粒子(以下稱為堿性磷酸酶固定粒子)。將上述5)制作的捕捉材料設(shè)置在上述6)中做成的抽濾排液裝置的PVA海綿上。將制備的30μL堿性磷酸酶固定粒子滴到預(yù)生由1％酪蛋白(和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn))和0.1％Triton X-100、0.8％的NaCl溶解的Tris鹽酸緩沖液(pH7.4)構(gòu)成的封閉液50μL浸潤的捕捉材料，將含有0.05％Tween20(和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn))的磷酸緩沖液0.1mL以2次滴到捕捉材料，對捕捉材料中的玻璃過濾器進行清洗。然后，將該捕捉材料供堿性磷酸酶活性的測定用。對于同一被檢體進行2次上述的測定操作。
8)堿性磷酸酶活性的測定捕捉材料中的堿性磷酸酶活性的測定于暗處使用光電子倍增管組件(濱松ホトニクス株式會社生產(chǎn)，H7360-02)進行。作為化學發(fā)光底物使用APS-5(ルミジエン公司生產(chǎn))，對于每1個捕捉材料滴30μL的APS-5。從滴下1分鐘后開始，每隔0.1秒測定10次信號強度，其平均值作為測定值。
9)測定結(jié)果表9給出了C-肽濃度和通過上述測定得到的信號強度。
表9
如上所述，通過本發(fā)明的免疫學的定量方法和試劑可以再現(xiàn)性好、時間短而且高靈敏度地對測定對象的配體的存在量進行定量。
另外，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的免疫學的定量方法在用多孔纖維基質(zhì)捕捉固相復(fù)合物時，由于不需要壓力傳感器等復(fù)雜的機構(gòu)和抽濾壓力的微調(diào)整，液體平穩(wěn)地通過多孔纖維基質(zhì)，可以確實吸附固相復(fù)合物，由于不需要在多孔纖維基質(zhì)的下方設(shè)置含有反應(yīng)殘余物的吸水層，所以可以防止誤檢測，另外由于在多孔纖維基質(zhì)上不進行長時間的免疫反應(yīng)，可以減少反應(yīng)成分對該基質(zhì)的非特異吸附，因此可以再現(xiàn)性好、時間短而且高靈敏度地對測定對象的配體的存在量進行定量。
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.免疫學的定量方法，作為用于配體測定的免疫學的定量方法，其特征是(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和針對配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物生成，(2)使上述復(fù)合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物生成，其中上述擔載固相粒子的固相粒子具有0.3～1.0μm的平均粒徑，(3)將上述固相復(fù)合物捕捉到具有可捕捉粒徑0.2～8.0μm的捕捉能力的多孔纖維基質(zhì)中，使即使在多孔纖維基質(zhì)的內(nèi)部也生成捕捉有上述固相復(fù)合物的固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，以及(4)對于上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，測定第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第2標記物質(zhì)的存在量。
2.權(quán)利要求1所述的免疫學的測定方法，其中配體是抗原，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗原的第1標記抗體，第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗原的第2標記抗體。
3.權(quán)利要求1所述的免疫學的測定方法，其中配體是抗體，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗體的第1標記抗原，第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗體的第2標記抗原或第2標記抗體。
4.權(quán)利要求1所述的免疫學的測定方法，其中多孔纖維基質(zhì)預(yù)先用下述封閉液處理，所述封閉液由含有酪蛋白、非離子表面活性劑、以及與鈣離子反應(yīng)不形成水不溶性鹽的具有pH7～9緩沖能力的緩沖劑，且pH7～9的水溶液構(gòu)成。
5.權(quán)利要求1所述的免疫學的測定方法，其中由該多孔纖維基質(zhì)下方抽吸生成上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，以使多孔纖維基質(zhì)的過濾流量達到6～48mL/min/cm2。
6.免疫學的定量方法，作為用于配體測定的免疫學的定量方法，其特征是(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和針對第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體復(fù)合物和第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物的混合物生成，(2)使上述復(fù)合物混合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述各個復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物混合物生成，其中，上述擔載固相粒子的固相粒子具有0.3～1.0μm的平均粒徑，(3)將上述固相復(fù)合物混合物捕捉到具有可捕捉粒徑0.2～8.0μm的捕捉能力的多孔纖維基質(zhì)中，使即使在多孔纖維基質(zhì)的內(nèi)部也生成捕捉有上述固相復(fù)合物的固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，以及(4)對于上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，測定第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第2標記物質(zhì)的存在量。
7.權(quán)利要求6所述的免疫學的定量方法，其中配體是抗原，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗原的第1標記抗體，第2標記的特異性的結(jié)合物質(zhì)是被標記了的該抗原。
8.權(quán)利要求6所述的免疫學的定量方法，其中配體是抗體，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗體的第1標記抗原，第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是被標記了的該抗體。
9.權(quán)利要求6所述的免疫學的定量方法，其中多孔纖維基質(zhì)預(yù)先用下述封閉液處理，所述封閉液由含有酪蛋白、非離子表面活性劑、以及與鈣離子反應(yīng)不形成水不溶性鹽的具有pH7～9緩沖能力的緩沖劑，且pH7～9的水溶液構(gòu)成。
10.權(quán)利要求6所述的免疫學的測定方法，其中由該多孔纖維基質(zhì)下方抽濾生成上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，以使多孔纖維基質(zhì)的過濾流量達到6～48mL/min/cm2。
11.用于配體測定的免疫學的定量試劑，其特征是具有針對一定配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、針對一定配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、擔載了與該第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子和多孔纖維基質(zhì)的組合，其中，上述擔載固相粒子的固相粒子具有0.3～1.0μm的平均粒徑，并且上述多孔纖維基質(zhì)具有可捕捉粒徑0.2～8.0μm的捕捉能力。
12.用于配體測定的免疫學的定量試劑，其特征是具有針對一定配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、針對第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子和多孔纖維基質(zhì)的組合，其中，上述擔載固相粒子的固相粒子具有0.3～1.0μm的平均粒徑，并且上述多孔纖維基質(zhì)具有可捕捉粒徑0.2～8.0μm的捕捉能力。
權(quán)利要求
1.測定方法，是將配體以固相復(fù)合物形式固定，通過免疫學的定量方法測定該固相復(fù)合物中配體的濃度的方法，其特征是在該方法中，(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和針對配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物生成，(2)使上述復(fù)合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物生成，以及(3)在配體的濃度測定中使用上述步驟(2)生成的固相復(fù)合物。
2.免疫學的定量方法，作為用于配體測定的免疫學的定量方法，其特征是(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和針對配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物生成，(2)使上述復(fù)合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物生成，(3)將上述固相復(fù)合物捕捉到多孔纖維基質(zhì)中，生成固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，以及(4)對于上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，測定第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第2標記物質(zhì)的存在量。
3.權(quán)利要求1所述的免疫學的測定方法，其中配體是抗原，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗原的第1標記抗體，第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗原的第2標記抗體。
4.權(quán)利要求1所述的免疫學的測定方法，其中配體是抗體，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗體的第1標記抗原，第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗體的第2標記抗原或第2標記抗體。
5.權(quán)利要求1所述的免疫學的測定方法，其中固相粒子的平均粒徑為0.3～1.0μm。
6.權(quán)利要求1所述的免疫學的測定方法，其中多孔纖維基質(zhì)具有可捕捉粒徑為0.2～8.0μm的粒子的捕捉能力。
7.權(quán)利要求1所述的免疫學的測定方法，其中多孔纖維基質(zhì)預(yù)先用由下述封閉液處理，所述封閉液由含有酪蛋白、非離子表面活性劑、以及與鈣離子反應(yīng)不形成水不溶性鹽的具有pH7～9緩沖能力的緩沖劑、且pH7～9的水溶液構(gòu)成。
8.權(quán)利要求1所述的免疫學的測定方法，其中由該多孔纖維基質(zhì)下方抽濾生成上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，以使多孔纖維基質(zhì)的過濾流量達到6～48mL/min/cm2。
9.測定方法，是將配體以固相復(fù)合物形式固定，通過免疫學的定量方法對固相復(fù)合物中配體的濃度進行測定的方法，其特征是(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和對第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體復(fù)合物和第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物的混合物生成，(2)使上述復(fù)合物混合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述各個復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物混合物生成，以及(3)在配體的濃度測定中使用上述步驟(2)生成的固相復(fù)合物混合物。
10.免疫學的定量方法，作為用于配體測定的免疫學的定量方法，其特征是(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和對第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-配體復(fù)合物和第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)-第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物的混合物生成，(2)使上述復(fù)合物混合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述各個復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物混合物生成，(3)將上述固相復(fù)合物混合物捕捉到多孔纖維基質(zhì)中，生成固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，以及(4)對于上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，測定第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第2標記物質(zhì)的存在量。
11.權(quán)利要求10所述的免疫學的定量方法，其中配體是抗原，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗原的第1標記抗體，第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是被標記了的該抗原。
12.權(quán)利要求10所述的免疫學的定量方法，其中配體是抗體，第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是針對該抗體的第1標記抗原，第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)是被標記了的該抗體。
13.權(quán)利要求11所述的免疫學的定量方法，其中固相粒子的平均粒徑為0.3～1.0μm。權(quán)利要求10所述的免疫學的定量方法，其中多孔纖維基質(zhì)具有可捕捉粒徑為0.2～8.0μm的粒子的捕捉能力。
14.權(quán)利要求10所述的免疫學的定量方法，其中多孔纖維基質(zhì)預(yù)先用由下述封閉液進行處理，所述封閉液由含有酪蛋白、非離子表面活性劑、以及與鈣離子反應(yīng)不形成水不溶性鹽的具有pH7～9緩沖能力的緩沖劑，而且pH7～9的水溶液構(gòu)成。
15.權(quán)利要求10所述的免疫學的測定方法，其中由該多孔纖維基質(zhì)下方抽濾生成上述固相復(fù)合物捕捉基質(zhì)，以使多孔纖維基質(zhì)的過濾流量達到6～48mL/min/cm2。
16.用于配體測定的免疫學的定量試劑，其特征是具有針對一定配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、針對一定配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子和多孔纖維基質(zhì)的組合。
17.用于配體測定的免疫學的定量試劑，其特征是具有針對一定配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、針對第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)、擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子和多孔纖維基質(zhì)的組合。
18.免疫學的封閉液，其特征是由含有酪蛋白、非離子表面活性劑、以及與鈣離子反應(yīng)不形成水不溶性鹽的具有pH7～9緩沖能力的緩沖劑，且pH7～9的水溶液構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明提供將配體以固相復(fù)合物形式固定，通過免疫學的定量方法對固相復(fù)合物中配體的濃度進行測定的方法，該方法包括下面(1)、(2)步驟(1)使配體、針對配體的第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)和針對配體的第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)在溶劑中接觸，使第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)－配體－第2標記的特異性結(jié)合物質(zhì)復(fù)合物生成，以及(2)使上述復(fù)合物與擔載了與第1標記的特異性結(jié)合物質(zhì)的該第1標記物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)的擔載固相粒子接觸，使上述復(fù)合物和上述擔載固相粒子通過第1標記物質(zhì)結(jié)合的固相復(fù)合物生成。
文檔編號G01N33/543GK1969188SQ20058001553
公開日2007年5月23日 申請日期2005年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月21日
發(fā)明者川野充康, 巖本久彥 申請人:A&T株式會社