專利名稱：新型可溶性cd14抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可作為敗血癥診斷標志的生物體內(nèi)的新型抗原。本發(fā)明還涉及以測定該抗原為特征的敗血癥的診斷方法、使用特定的抗體的該抗原的測定試劑盒及其測定方法。本發(fā)明又涉及可用作該測定試劑盒的標準物質(zhì)的重組型可溶性片段、與該片段結(jié)合的抗體、該片段的生產(chǎn)方法、以及使用該片段篩選抗體的方法。
背景技術(shù)：
CD14分子作為由識別在單核細胞的膜表面表達的糖蛋白的一組抗體鑒定的蛋白質(zhì)，于1986年第3屆白細胞分型會議(Leukocyte TypingConference)上得到命名。1990年，Wright等人明確了CD14分子是內(nèi)毒素LPS的受體(Science(美國)、1990年、第249卷、1431-1433頁)。通過cDNA分析，明確了該CD14分子是分子量為53-55kDa的糖蛋白，其mRNA約1.4kb大小，含有356個氨基酸(Nucleic Acids Research(英國)、1988年、第16卷、4173頁)。
有報告指出人CD14分子除膜結(jié)合型CD14之外，還有可溶型CD14，血液中存在分子量不同的多種可溶型CD14(European Journalof Immunology(德國)、1993年、第23卷、2144-2151頁)。另外，Landmann等人報道對敗血癥患者血清中的可溶型CD14進行蛋白質(zhì)印跡分析，發(fā)現(xiàn)約55kDa的可溶型CD14在敗血癥死亡病例或陣發(fā)性睡眠性血紅蛋尿癥(PNH)患者中的數(shù)值高，而在正常人血清中未見該分子，而在正常人中檢測出了分子量稍小的49kDa的可溶型CD14(The Journal ofInfectious Disease(美國)、1995年、第171卷、639-644頁)。
關(guān)于該分子量不同的亞型，Stelter等人指出這與糖鏈的不同有關(guān)，另外，即使除去N和O結(jié)合型糖鏈，血液中仍存在兩種不同分子量的可溶型CD14(European Journal of Biochemistry(德國)、1996年、第236卷、457-464頁)。另外，Bufler等人對可溶型CD14的C末端進行分析，指出GPI基與可溶型CD14的第327位的絲氨酸殘基結(jié)合，具有約56kDa分子量的可溶型CD14是沒有GPI錨定的分子種類的(European Journal of Immunology(德國)、1995年、第25卷、604-610頁)。
關(guān)于重組型可溶性CD14的全長以及其片段，Juan等人報告含有人CD14的N末端1位-152位的片段具有將LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞的功能(Journal of Biological Chemistry(美國)、1995年、第278卷、1382-1387頁)，但含有N末端1位-124位的片段和含有N末端1位-98位的片段的表達并未成功。另外，Majerle等人指出具有三個單元富亮氨酸重復(fù)LRR區(qū)、含有人CD14的N末端1位-152位的片段再折疊，只具有兩個單元LRR區(qū)的、含有人CD14的N末端1位-134位的片段不發(fā)生再折疊，但是含有N末端1位-69位的片段的表達并未成功(Pflugers Arch-European Journal of Physiology(德國)、2000年、第439卷[Suppl]、R109-R110頁)，在本報告中，N末端1位-69位的片段表達并沒有成功。
人們制作了很多抗CD14抗體，其代表性的有Bazil等人制備的MEM-18(European Journal of Immunology(德國)、1986年、第16卷、1583-1589頁)、Shutt等人制備的RoMo-1(Allergie und Immunologie(德國)、1998年、第34卷、17-26頁)、Steinman等人制備的3C10(Journalof Experimental Medicine(美國)、1983年、第158卷、126-145頁)，它們用于CD14蛋白質(zhì)的鑒定。
Shutt等人(西德專利公開第286876號)、Bazil等人(MolecularImmunology(英國)、1989年、第26卷、657-662頁)；Grunwald等人(Journal of Immunological Methods(荷蘭)、1992年、第155卷、225-232頁)中報道了使用這些抗體的可溶型CD14的測定系統(tǒng)，可以測定人體液中的可溶型CD14。
并且，IBL-Hamburg、Medgenix、R&D Systems等公司銷售了可溶型CD14-ELISA試劑盒，可以在以敗血癥為代表的多種疾病中進行可溶型CD14的測定(Clinical Immunology And Immunopathology(美國)、1996年、第80卷、307-310頁；“臨床檢查”(日本)、1994年、第38卷、341-344頁)。
但是，即使是敗血癥以外的疾病，伴隨著疾病的進程，涉及上述約55kDa、49kDa的可溶型CD14(根據(jù)報告，其分子量不同，因此并不限于約55kDa、49kDa，以下也相同)的濃度上升，已明確可溶型CD14并不是敗血癥特異性標志物(Infection and Immunty(美國)、1999年、第67卷、417-420頁；Clinical and Experimental Immunology(英國)、2000年、第120卷、483-487頁；Clinical and Experimental Immunology(英國)、1994年、第96卷、15-19頁)。另外，雖然可溶型CD14有望成為敗血癥重癥的標志物，但是并未見到其與敗血癥性休克的相關(guān)性(Pediatric allergy and Immunology(丹麥)、1997年、第8卷、194-199頁)，也未見其與全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的相關(guān)性(EuropeanJournal of Clinical Investigation(英國)、1998年、第28卷、672-678頁)，并不能成為敗血癥的診斷藥。
與Landmann等人發(fā)現(xiàn)與所報道的上述約55kDa和49kDa兩種可溶型CD14(高分子量CD14(根據(jù)報告，其分子量不同，因此并不限于約55kDa、49kDa，以下也相同))不同的是，約36kDa的可溶型低分子量CD14存在于血液中，該低分子量CD14在正常人中少，在敗血癥患者中增加，并確認了可溶型低分子量CD14的測定在臨床上有用。作為該可溶型低分子量CD14的測定方法，有人提出了從血液中可溶型CD14的總量中減去血液中高分子量CD14的量，間接求出血液中低分子CD14的量(國際公開第WO01/22085號)。

發(fā)明內(nèi)容
在上述狀況下，人們希望有一種生物體內(nèi)的新型抗原，該抗原可可簡便地檢測、可作為敗血癥的診斷標志物。還希望獲得使用特定抗體測定該抗原的測定試劑盒及其方法。又希望有對該抗原的測定有用的抗體的篩選方法。還希望有與該抗原的免疫功能類似的重組型可溶性片段及其片段的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明人進行了深入地研究，結(jié)果發(fā)明了存在于人血液中、具有CD14序列的新型抗原。并且發(fā)明了通過測定該抗原進行的診斷敗血癥的方法或檢測敗血癥的方法。
還發(fā)明了與該抗原具有免疫學類似的性質(zhì)的重組型可溶性片段及其片段的生產(chǎn)方法，并發(fā)明了與該片段特異性結(jié)合的抗體。
又發(fā)明了可測定該抗原的試劑盒以及測定方法，所述試劑盒含有“與含有人全長可溶型CD14的特定氨基酸序列的肽特異性結(jié)合的抗體”或該抗體的片段、“以含有人全長可溶型CD14的特定氨基酸序列的肽作為抗原制備的抗體”或該抗體的片段、或者“與該片段特異性結(jié)合的抗體”或該抗體片段作為構(gòu)成要素。
本發(fā)明人又發(fā)明了可用作該抗原測定的抗體的篩選方法。
本說明書中，“可溶性CD14抗原”可以稱作“可溶性CD14蛋白質(zhì)”。另外，“重組型可溶性CD14片段”可稱作“重組型可溶性CD14蛋白質(zhì)”，不過，由于具有人全長可溶型CD14的部分序列的含義，因此使用術(shù)語“片段”。“片段”可以按照常規(guī)技術(shù)用語解釋。在本發(fā)明中，是含有對象蛋白質(zhì)的氨基酸序列部分序列的蛋白質(zhì)的一部分，與該蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)、糖鏈或者脂質(zhì)等附加物與對象蛋白質(zhì)的區(qū)別無關(guān)。
即，本發(fā)明提供以下(1)-(13)。
(1)可溶性CD14抗原，該抗原具有下述1)-3)的性質(zhì)1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)N末端序列中具有序列SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，以及3)與含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合。
(2)重組型可溶性CD14片段，該片段具有下述1)-3)的性質(zhì)，由下述<1>-<3>步驟獲得1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合，以及3)與含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合；<1>制備具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，其中被取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶切斷部位的序列；或者制備具有該部分序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)域有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，<2>將<1>中制備的重組型可溶性CD14片段用該規(guī)定的蛋白分解酶切斷的步驟，以及<3>回收<2>中切斷的片段的N末端一側(cè)的片段的步驟。
(3)重組型可溶性CD14片段，該片段具有下述1)-3)的性質(zhì)1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合，以及3)與含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合。
(4)敗血癥的診斷或檢測方法，其特征在于測定上述(1)的可溶性CD14抗原。
(5)可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其用于測定檢體中所含的上述(1)的可溶性CD14抗原，所述試劑盒含有至少一種與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段。
(6)上述(1)的可溶性CD14抗原的免疫學測定方法，其特征在于使至少一種與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合。
(7)抗體，該抗體與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合。
(8)抗體，該抗體與上述(2)的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合。
(9)抗體，該抗體與上述(3)的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合。
(10)可用于測定上述(1)的可溶性CD14抗原的抗體的篩選方法，所述篩選方法包含以下步驟1)制備一種抗體作為篩選對象檢體的步驟，其中所述抗體與含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合，2)制備含有CD14的測定對象液的步驟，3)使用1)中制備的抗體或2)中制備的測定對象液，構(gòu)成免疫測定系統(tǒng)的步驟，4)通過3)中構(gòu)成的免疫測定系統(tǒng)對測定對象液進行測定的步驟，以及5)由4)所得的測定結(jié)果評價可用于測定上述(1)的可溶性CD14抗原的抗體并選擇的步驟。
(11)可用于測定上述(1)的可溶性CD14抗原的抗體的篩選方法，該篩選方法包含以下步驟1)制備作為篩選對象檢體的抗體的步驟，2)制備上述(2)的重組型可溶性CD14片段的步驟，3)將1)中制備的抗體與2)中制備的片段反應(yīng)，評價1)中制備的抗體和2)中制備的片段的特異性結(jié)合的步驟，以及
4)選擇在3)中能與2)中制備的片段特異性結(jié)合的抗體作為可用于測定上述(1)的可溶性CD14抗原的抗體的步驟。
(12)上述(2)的重組型可溶性CD14片段的生產(chǎn)方法，該方法包含以下步驟<1>制備具有下述1)-4)的序列的重組型可溶性CD14片段的步驟1)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，2)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，3)C末端為SEQ ID No.3的134位-356位其中之一，4)在SEQ ID No.3的59位-70位的后面取代或插入以附加規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位序列；<2>將<1>中制備的重組型可溶性CD14片段用該規(guī)定的蛋白分解酶切斷的步驟；以及<3>將<2>中切斷的片段的N末端一側(cè)的片段進行回收的步驟。
以下，對本發(fā)明的上述(1)-(13)進行詳細描述。
即，本發(fā)明提供以下的新型可溶性CD14抗原、重組型可溶性CD14片段和新型的敗血癥診斷方法或檢測方法。
(1)下述(1-1)或(1-2)所示的新型可溶性CD14抗原。
(1-1)具有下述1)-3)性質(zhì)的可溶性CD14抗原1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)N末端序列具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，以及3)與以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合。
(1-2)4)可由人血漿得到的(1-1)的可溶性CD14抗原。
(2)下述(2-1)-(2-18)任一項所示的重組型可溶性CD14片段。
(2-1)重組型可溶性CD14片段，該片段具有下述1)-3)的性質(zhì)，由下述<1>-<3>的步驟得到
1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合，以及3)與抗體特異性結(jié)合，該抗體以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽為抗原制備；<1>制備具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，其中被取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶切斷部位的序列；或者制備具有該部分序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)域有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，<2>將<1>中制備的重組型可溶性CD14片段用該規(guī)定的蛋白分解酶切斷的步驟，以及<3>回收<2>中切斷的片段的N末端一側(cè)的片段的步驟；(2-2)(2-1)的重組型可溶性CD14片段，其中，在上述(2-1)、<1>的步驟中，制備具有下述4)-7)序列的重組型可溶性CD14片段4)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，5)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，6)C末端為SEQ ID No.3的134位-356位其中之一，以及7)在SEQ ID No.3的59位-90位的任一位置后取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位的序列；(2-3)(2-2)的重組型可溶性CD14片段，其中，在<1>步驟的7)中，規(guī)定的蛋白分解酶是ProScission Protease，切斷部位的序列為Leu、Glu、Val、Leu、Phe、Gln、Gly、Pro；(2-4)(2-2)的重組型可溶性CD14片段，其中，在<1>步驟的7)中，規(guī)定的蛋白分解酶是凝血酶，切斷部位的序列為Leu、Val、Pro、Arg、Gly、Ser；(2-5)(2-2)-(2-4)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在<1>步驟的5)中，N末端為SEQ ID No.3的1位-6位的其中之一；(2-6)(2-2)-(2-4)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在<1>步驟的5)中，N末端為SEQ ID No.3的1位；(2-7)(2-2)-(2-6)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在<1>步驟的7)中，在SEQ ID No.3的59位-80位的任一位置后面取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位序列；(2-8)(2-2)-(2-6)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在<1>步驟的7)中，在SEQ ID No.3的64位-75位的任一位置后面取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位序列；(2-9)(2-2)-(2-6)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在<1>步驟的7)中，在SEQ ID No.3的64位后面取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位序列；(2-10)(2-2)-(2-4)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在<1>步驟的5)中，N末端為SEQ ID No.3的1位，在7)中，在SEQ ID No.3的64位后面取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位序列；(2-11)(2-1)或(2-10)的重組型可溶性CD14片段，該片段具有下述8)-10)的序列8)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)域有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，9)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位的其中之一，以及10)C末端為SEQ ID No.3的59位-90位的其中之一；(2-12)(2-11)的重組型可溶性CD14片段，其中，在9)中，N末端為SEQ ID No.3的1位-6位其中之一；(2-13)(2-11)的重組型可溶性CD14片段，其中，在9)中，N末端為SEQ ID No.3的1位。
(2-14)(2-11)-(2-13)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在10)中，C末端為SEQ ID No.3的59位-80位其中之一；(2-15)(2-11)-(2-13)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在10)中，C末端為SEQ ID No.3的64位-75位其中之一；(2-16)(2-11)-(2-13)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在10)中，C末端為SEQ ID No.3的64位；(2-17)(2-11)的重組型可溶性CD14片段，其中，在9)中，N末端為SEQ ID No.3的1位，在10)中，C末端為SEQ ID No.3的64位；(2-18)(2-1)-(2-18)的重組型可溶性CD14片段，該片段還具有下述11)的性質(zhì)11)不與LPS結(jié)合。
(3)重組型可溶性CD14片段，該片段如下述(3-1)-(3-9)中任一項所示(3-1)重組型可溶性CD14片段，該片段具有下述1)-3)的性質(zhì)1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合，以及3)與含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合；(3-2)(3-1)的重組型可溶性CD14片段，該片段還具有下述4)的性質(zhì)4)不與LPS結(jié)合；(3-3)(3-1)或(3-2)的重組型可溶性CD14片段，該片段具有下述5)-7)的序列5)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，6)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，以及7)C末端為SEQ ID No.3的59位-90位其中之一；(3-4)(3-3)的重組型可溶性CD14片段，其中，在6)中，N末端為SEQ ID No.3的1位-6位其中之一；(3-5)(3-3)的重組型可溶性CD14片段，其中，在6)中，N末端為SEQ ID No.3的1位；(3-6)(3-3)-(3-5)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在7)中，C末端為SEQ ID No.3的59位-80位其中之一；(3-7)(3-3)-(3-5)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在7)中，C末端為SEQ ID No.3的64位-75位其中之一；(3-8)(3-3)-(3-5)中任一項的重組型可溶性CD14片段，其中，在6)中，N末端為SEQ ID No.3的1位，在7)中，C末端為SEQ ID No.3的64位-75位其中之一；(3-9)(3-3)-(3-8)中任一項的重組型可溶性CD14片段，該片段具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列。
(4)敗血癥的診斷方法，該方法如下述(4-1)-(4-4)中任一項所示(4-1)敗血癥的診斷或檢測方法，其特征在于測定上述(1)的可溶性CD14抗原；(4-2)(2-1)的敗血癥的診斷或檢測方法，其特征在于包含下述步驟1)對由受試者采集的血液中所含有上述(1)的可溶性CD14抗原進行測定，2)將測定值與正常人的標準值進行比較，以及3)評價受試者是否為敗血癥；(4-3)(2-2)的敗血癥的診斷或檢測方法，其特征在于測定上述(1)的可溶性CD14抗原的步驟是免疫學測定。
(4-4)(2-2)的敗血癥的診斷或檢測方法，其特征在于測定上述(1)的可溶性CD14抗原的步驟是通過夾層免疫測定法測定。
本發(fā)明還提供以下的新型可溶性CD14抗原測定試劑盒和測定方法。
(5)上述(1)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，該試劑盒如下述(5-1)-(5-8)中任一項所示(5-1)可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其用于測定檢體中所含的上述(1)的可溶性CD14抗原，該試劑盒含有至少一種上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段；(5-2)(5-1)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其特征在于含有以下a)-d)中的任意抗體或該抗體的片段作為可與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段a)與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體，b)以含有選自SEQ ID No.2氨基酸序列的連續(xù)8-16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，c)以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體；d)與上述(2)或(3)的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體；(5-3)(5-1)或(5-2)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段是d)與上述(2)或(3)的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段；(5-4)(5-1)-(5-3)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段是以上述(2)或(3)的重組型可溶性CD14片段作為抗原而制備的抗體或該抗體的片段；(5-5)(5-1)-(5-4)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段是以上述(2)或(3)的重組型可溶性CD14片段作為抗原而制備的單克隆抗體或該抗體的片段。
(5-6)(5-1)-(5-4)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，該測定試劑盒如下述(5-6-1)-(5-6-19)中任一項所示，通過夾層免疫測定法測定上述(1)的可溶性CD14抗原(5-6-1)通過夾層免疫測定法測定上述(1)的可溶性CD14抗原，(5-6-2)(5-6-1)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，該試劑盒還含有與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)，(5-6-3)(5-6-2)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，上述第二結(jié)合物質(zhì)是與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段，(5-6-4)(5-6-2)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，上述第二結(jié)合物質(zhì)是與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體，(5-6-5)(5-6-2)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，上述第二結(jié)合物質(zhì)是與SEQ ID No.3的人全長可溶型CD14蛋白質(zhì)的1位-52位氨基酸殘基的任何區(qū)特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段，或者是與上述抗體競爭或顯示交叉反應(yīng)性的抗體或該抗體的片段，上述抗體是指與SEQ ID No.3的人全長可溶型CD14蛋白質(zhì)的1位-52位氨基酸殘基的任何區(qū)特異性結(jié)合的抗體，(5-6-6)(5-6-2)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，上述第二結(jié)合物質(zhì)是與SEQ ID No.3的人全長可溶型CD14蛋白質(zhì)的17位-26位氨基酸殘基中任何區(qū)特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段，或者是與上述抗體競爭或顯示交叉反應(yīng)性的抗體或該抗體的片段，上述抗體是指與SEQ ID No.3的人全長可溶型CD14蛋白質(zhì)的17位-26位氨基酸殘基的任何區(qū)特異性結(jié)合的抗體，(5-6-7)(5-6-1)-(5-6-6)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，上述a)-d)的任意抗體或該抗體的片段與不溶性載體結(jié)合。
(5-6-8)(5-6-2)-(5-6-6)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，上述第二結(jié)合物質(zhì)與不溶性載體結(jié)合。
(5-6-9)(5-6-1)-(5-6-6)或(5-6-8)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，上述a)-d)的任意抗體或該抗體的片段被標記。
(5-6-10)(5-6-1)-(5-6-7)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，上述第二結(jié)合物質(zhì)被標記。
(5-6-11)(5-6-2)-(5-6-10)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，該測定試劑盒還含有形成第二特異結(jié)合的第二特異結(jié)合物質(zhì)。
(5-6-12)(5-6-11)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，與第二特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的對象是上述a)-c)中任一項的抗體或該抗體的片段、或者是上述第二結(jié)合物質(zhì)。
(5-6-13)(5-6-11)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，該測定試劑盒還含有與第二特異結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第二特異結(jié)合物質(zhì)的對象。
(5-6-14)(5-6-11)-(5-6-13)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，形成第二特異結(jié)合的第二特異結(jié)合物質(zhì)或第二特異結(jié)合物質(zhì)的對象與不溶性載體結(jié)合。
(5-6-15)(5-6-11)-(5-6-13)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，形成第二特異結(jié)合的第二特異結(jié)合物質(zhì)或第二特異結(jié)合物質(zhì)的對象被標記。
(5-6-16)(5-6-1)-(5-6-8)或(5-6-11)-(5-6-14)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，該測定試劑盒含有標記的上述(1)的可溶性CD14抗原或標記的上述(1)的可溶性CD14抗原的類似物，通過競爭法的夾層免疫測定法測定，(5-6-17)(5-6-9)、(5-6-10)、(5-6-15)或(5-6-16)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，標記是通過酶、染料、膠體金、著色膠乳、化學發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)或同位素的至少一種進行標記。
(5-6-18)(5-6-16)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，標記的上述(1)的可溶性CD14抗原的類似物是標記的上述(2)的重組可溶性CD14片段，(5-6-19)(5-6-2)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其中，上述a)-c)的任意抗體或該抗體的片段與不溶性載體結(jié)合，上述第二結(jié)合物質(zhì)是上述d)的抗體或該抗體的片段；(5-7)(5-1)-(5-6)中任一項的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，該測定試劑盒通過凝聚法、直接固相法或競爭法測定；(5-8)(5-1)-(5-7)的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，該測定試劑盒還含有上述(2)或(3)的重組型可溶性CD14片段作為標準物質(zhì)。
(6)上述(1)的可溶性CD14抗原的測定方法，該測定方法如下述(6-1)-(6-3)中任一項所示(6-1)上述(1)的可溶性CD14抗原的免疫學測定方法，其特征在于使至少一種與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合；(6-2)(6-1)的可溶性CD14抗原的免疫學測定方法，其特征在于使用下述a)-d)的任意的抗體或該抗體的片段作為與上述(1)可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段a)與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體，b)以含有選自SEQ ID No.2氨基酸序列的連續(xù)8-16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，c)以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，d)與上述(2)或(3)的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體；(6-3)(6-2)的可溶性CD14抗原的免疫學測定方法，其特征在于使用與上述(1)的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)，通過上述a)-c)中任意的抗體或該抗體的片段和該第二結(jié)合物質(zhì)的夾層免疫測定法，測定上述(1)的可溶性CD14抗原。
本發(fā)明又提供以下的新型抗體和可用于上述(1)的可溶性CD14抗原測定的抗體的篩選方法。
(7)與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體，該抗體如下述(7-1)-(7-4)所示(7-1)與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體；(7-2)(7-1)的抗體，該抗體基本上不與人血液中的全長可溶型CD14蛋白質(zhì)結(jié)合，而與上述(1)的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合；(7-3)(7-1)或(7-2)的抗體，其特征在于該抗體以上述(2)的重組型可溶性CD14片段作為抗原進行制備；(7-4)(7-1)-(7-3)中任一項的抗體，該抗體為單克隆抗體。
(8)與上述(2)的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體，該抗體如下述(8-1)-(8-5)中任一項所示(8-1)與上述(2)的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗；(8-2)(8-1)的抗體，該抗體基本上不與人血液中的全長可溶型CD14蛋白質(zhì)結(jié)合，而與上述(2)的重組型可溶性CD14片段結(jié)合；(8-3)(8-1)或(8-2)的抗體，其特征在于該抗體以上述(2)的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備；(8-4)(8-1)-(8-3)中任一項的抗體，該抗體為單克隆抗體；(8-5)(8-4)的抗體，該抗體為F1237-3-4抗體。
(9)與上述(3)的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體，該抗體如下述(9-1)-(9-4)中任一項所示(9-1)與上述(3)的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體；(9-2)(9-1)的抗體，該抗體基本上不與人血液中的全長可溶性CD14蛋白結(jié)合，而與上述(3)的重組型可溶性CD14片段結(jié)合；(9-3)(9-1)或(9-2)的抗體，其特征在于該抗體以上述(3)的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備；(9-4)(9-1)-(9-3)中任一項的抗體，該抗體為單克隆抗體。
(10)可用于上述(1)的可溶性CD14抗原測定的抗體的篩選方法，該篩選方法如下述(10-1)-(10-13)中任一項所示(10-1)可用于上述(1)的可溶性CD14抗原測定的抗體的篩選方法，該方法包含以下步驟1)制備與含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體作為篩選對象檢體，2)制備含有CD14的測定對象液的步驟，3)使用1)中制備的抗體或2)中制備的測定對象液構(gòu)成免疫測定系統(tǒng)的步驟，4)通過3)中構(gòu)成的免疫測定系統(tǒng)對測定對象液進行測定的步驟，以及5)通過4)中得到的測定結(jié)果，對可用作上述(1)的可溶性CD14抗原的測定的抗體進行評價并選擇的步驟；(10-2)(10-1)的篩選方法，其特征在于上述1)步驟中制備的抗體是與含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中N末端選擇1位-314位的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體；(10-3)(10-1)的篩選方法，其特征在于上述1)步驟中制備的抗體是以含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)8-30個氨基酸殘基的肽作為抗原而制備的抗體；(10-4)(10-2)的篩選方法，其特征在于上述1)步驟中制備的抗體是以下述的肽作為抗原而制備的抗體，該肽含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中N末端選自1位-314位氨基酸序列的連續(xù)8-30個氨基酸殘基；(10-5)(10-1)的篩選方法，其特征在于上述2)的步驟中制備的測定對象液是正常人的體液或人高分子量CD14的標準品；(10-6)(10-1)-(10-5)中任一項的篩選方法，其特征在于由上述3)的步驟構(gòu)成的免疫測定系統(tǒng)是抗原固相法；(10-7)(10-6)的篩選方法，其特征在于進一步制備1)中所制備的抗體的標記抗體，由上述3)的步驟構(gòu)成的抗原固相法是使2)中的測定對象液與不溶性載體結(jié)合構(gòu)成，4)的步驟是通過3)中構(gòu)成的抗原固相法，使1)中制備的抗體和該標記抗體與測定系統(tǒng)依次反應(yīng)；(10-8)(10-6)或(10-7)的篩選方法，其特征在于上述5)的評價、選擇步驟是對1)中制備的抗體不與高分子量CD14特異性結(jié)合進行評價并選擇；(10-9)(10-1)-(10-4)中任一項的篩選方法，該方法進一步含有以下步驟，并具有以下特征制備1)-(2)的另外一種與含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體或抗CD14抗體的步驟，上述2)步驟中制備的測定對象液是正常人的體液和敗血癥患者的體液，上述3)步驟中構(gòu)成的免疫測定系統(tǒng)是使用1)和1)-(2)中制備的兩種抗體的夾層測定法，對上述5)的抗體進行評價、選擇的步驟是將正常人的體液測定結(jié)果與敗血癥患者的體液測定結(jié)果進行比較，根據(jù)所比較的測定結(jié)果的不同，評價并選擇對敗血癥的診斷有用的、應(yīng)用于夾層免疫測定法中的抗體；(10-10)(10-9)的篩選方法，其特征在于該方法是對可用于本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原測定的、用于夾層免疫測定方法中的抗體的組合進行篩選的方法；(10-11)(10-9)或(10-10)的篩選方法，其特征在于上述2)步驟中制備的正常人和敗血癥患者的體液是血液樣本；(10-12)(10-9)或(10-10)的篩選方法，其特征在于在由上述3)的步驟構(gòu)成的夾層免疫系統(tǒng)中，使1)或1)-(2)中制備的抗體與不溶性載體結(jié)合；(10-13)(10-9)或(10-10)的篩選方法，其特征在于在由上述3)的步驟構(gòu)成的夾層免疫系統(tǒng)中，對1)或1)-(2)中制備的抗體進行標記。
(11)可用于上述(1)的可溶性CD14抗原測定的抗體的篩選方法，該方法以如下述(11-1)-(11-5)中任一項所示(11-1)可用于測定上述(1)的可溶性CD14抗原的抗體的篩選方法，該方法包含以下步驟1)制備作為篩選對象檢體的抗體的步驟，2)制備上述(2)的重組型可溶性CD14片段的步驟，3)使1)中制備的抗體與2)中制備的片段反應(yīng)，對1)中制備的抗體和2)中制備的片段的特異性結(jié)合進行評價的步驟，以及4)在3)中，選擇與2)中制備的片段特異性結(jié)合的抗體作為可用于上述(1)的可溶性CD14抗原測定的抗體的步驟；(11-2)(11-1)的篩選方法，其特征在于在1)的步驟中制備的抗體是與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體，該蛋白質(zhì)含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-356個任意個數(shù)的氨基酸殘基；(11-3)(11-1)的篩選方法，其特征在于在1)的步驟中制備的抗體是與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體，該抗體含有選自SEQ ID No.3的53位-68位的連續(xù)至少7個氨基酸殘基；(11-4)(11-1)-(11-3)中任一項的篩選方法，其特征在于在3)的步驟中反應(yīng)并進行特異性結(jié)合的評價的系統(tǒng)是抗原固相法；(11-5)(11-1)-(11-3)中任一項的篩選方法，其特征在于在3)的步驟中反應(yīng)并進行特異性結(jié)合的評價的系統(tǒng)是夾層免疫測定法；(11-6)(11-1)-(11-3)中任一項的篩選方法，其特征在于在3)的步驟中反應(yīng)并進行特異性結(jié)合的評價的系統(tǒng)是生物體分子間相互作用分析法。
本發(fā)明又提供以下特定的上述(2)的重組型可溶性CD14片段的生產(chǎn)方法。
(12)上述(2)的重組型可溶性CD14片段的生產(chǎn)方法，該方法如下述(12-1)-(12-3)中任一項所示。
(12-1)上述(2-3)的重組型可溶性CD14片段的生產(chǎn)方法，該方法包含下述步驟<1>制備具有下述1)-4)序列的重組型可溶性CD14片段的步驟1)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者為在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段、2)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一、3)C末端為SEQ ID No.3的134位-356位其中之一、4)在SEQ ID No.3的59位-70位的后面取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位序列，<2>將1中制備的重組型可溶性CD14片段用該規(guī)定的蛋白分解酶切斷的步驟，以及<3>將2中切斷的片段的N末端一側(cè)的片段進行回收的步驟；(12-2)(12-1)中的上述(2-3)的重組型可溶性CD14片段的生產(chǎn)方法，其中，在<1>步驟的4)中，規(guī)定的蛋白分解酶是ProScissionProtease，切斷部位的序列為Leu、Glu、Val、Leu、Phe、Gln、Gly、Pro；(12-3)(12-1)中上述(2-3)的重組型可溶性CD14片段的生產(chǎn)方法，其中，在<1>步驟的4)中，規(guī)定的蛋白分解酶為凝血酶，切斷部位的序列為Leu、Val、Pro、Arg、Gly、Ser。
發(fā)明效果本發(fā)明的新型可溶性CD14抗原可用作敗血癥患者的診斷標志物。該可溶性CD14抗原可作為該可溶性CD14抗原測定中使用的標準物質(zhì)或競爭物質(zhì)。
本發(fā)明的重組型可溶性CD14片段與該可溶性CD14抗原具有免疫學類似的性質(zhì)，因此可作為該可溶性CD14抗原測定中使用的標準物質(zhì)或競爭物質(zhì)，還可以用于可在該可溶性CD14抗原測定中使用的抗體的篩選。
與該可溶性CD14抗原有免疫學類似的性質(zhì)是表示本發(fā)明的重組型可溶性CD14片段在與公知的CD14抗體的結(jié)合性和與該可溶性CD14抗原所結(jié)合的抗體的結(jié)合性方面，該可溶性CD14抗原和本發(fā)明的重組型可溶性CD14片段大體一致。
本發(fā)明的該可溶性CD14抗原的測定試劑盒和測定方法可以高靈敏度、簡便且特異性地對該可溶性CD14抗原進行定性或定量，可用于敗血癥患者的診斷。
本發(fā)明的篩選方法可用于對該新型可溶性CD14抗原測定中所使用的抗體的探索。
本發(fā)明的重組型可溶性CD14片段的生產(chǎn)方法可以進行目前在原核細胞或真核細胞、特別是酵母細胞中無法表達的重組型可溶性CD14片段的生產(chǎn)。
附圖簡述

圖1是表示只有S68肽抑制S68肽多克隆抗體和本發(fā)明的可溶性CD14抗原的結(jié)合的結(jié)果圖。(A)表示正常人血清中未結(jié)合的狀態(tài)，(B)表示敗血癥患者血清中S68肽的結(jié)合抑制。
圖2是表示使用sCD14(1-307)S286C蛋白質(zhì)的實施例7-(1)的EIA試劑盒的標準曲線圖。
圖3是表示來自正常人血清的可溶性CD14抗原對于使用sCD14(1-307)S286C蛋白質(zhì)的實施例7-(1)的EIA試劑盒的測定值沒有影響的圖。
圖4是表示將通過凝膠過濾色譜得到的敗血癥患者血清中可用實施例7-(1)的EIA試劑盒檢測的可溶性CD14抗原和高分子量CD14蛋白質(zhì)分別用實施例7-(1)的EIA試劑盒和市售CD14-EIA試劑盒(IBL-Hamburg)進行分析的結(jié)果圖。
圖5是表示將通過凝膠過濾色譜得到的敗血癥患者血清中可用實施例7-(1)的EIA試劑盒檢測的可溶性CD14抗原和高分子量CD14蛋白質(zhì)分別用實施例7-(1)的EIA試劑盒和市售CD14-EIA試劑盒(IBL-Hamburg)進行分析的結(jié)果圖。上方的黑箭頭表示在校正曲線中使用的標志的位置。由左至右分別為BSA、卵清蛋白、胰凝乳蛋白酶原A、核糖核酸酶A。
圖6是表示將敗血癥患者血清過以F1024-1-3-SepharosTM4B作為預(yù)備柱的S68-瓊脂糖TM4FF抗體柱，然后將組分通過凝膠過濾色譜進行分離，通過實施例7-(1)的EIA試劑盒和市售CD14-EIA試劑盒(IBL-Hamburg)對組分中可由實施例7-(1)的EIA試劑盒檢測的可溶性CD14抗原和高分子量CD14蛋白質(zhì)進行分析的結(jié)果圖。上方的黑箭頭與圖5同樣。
圖7是表示將圖6的凝膠過濾色譜分離組分10-16分別冷凍干燥，進行蛋白質(zhì)印跡法測試的結(jié)果圖。
圖8是表示將正常人血清過以F1024-1-3-SepharosTM4B作為預(yù)備柱的S68-瓊脂糖TM4FF抗體柱，然后將組分通過凝膠過濾色譜進行分離，將組分10-16分別冷凍干燥，進行蛋白質(zhì)印跡法測試的結(jié)果圖。
圖9是將純化的rsCD14-ST(2ST64)和(PSP64)進行SDS-PAGE電泳，然后通過銀染法進行染色的圖像。
圖10是表示將sCD14-ST和PSP64用S68抗體進行染色所得到的蛋白質(zhì)印跡圖像。
圖11是使用rs CD14-ST(2ST64)的實施例16的EIA試劑盒的標準曲線圖。
圖12是將給予了rs CD14-ST(PSP64)的兔抗血清的抗體滴度與正常兔血清進行比較的圖。
圖13是表示使用rs CD14-ST(2ST64)的實施例19的EIA測定系統(tǒng)的標準曲線圖。
實施發(fā)明的最佳方式以下，更詳細地說明本發(fā)明。
存在于人血液中的主要可溶性CD14蛋白質(zhì)有背景技術(shù)中記載的、由Landmann等人報告的約55kDa和約49kDa的可溶型CD14蛋白質(zhì)。它們是人全長可溶型CD14蛋白質(zhì)以及人全長可溶型CD14蛋白質(zhì)C末端只缺失41個氨基酸或以下的蛋白質(zhì)(以下可省略“人”，記為高分子量CD14)。WO01/22085號公報中確認了這些高分子量CD14與F1025-3-1抗體特異性結(jié)合。
除上述高分子量CD14之外，作為低分子量的CD14，還報道有分子量36kDa的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)上述高分子量CD14和WO01/22085號記載的分子量36kDa的CD14不同，與正常人比較，在敗血癥患者的血液中較多存在，是新型的可溶型CD14蛋白質(zhì)。
本說明書中的“可溶型CD14蛋白質(zhì)”是存在于人血漿中(或者人血清中)的蛋白質(zhì)，也可以稱為“可溶性CD14蛋白質(zhì)”。特別是在與與細胞膜結(jié)合、不存在于血漿中的“膜結(jié)合型CD14蛋白質(zhì)”對比使用時，要稱為“可溶型CD14蛋白質(zhì)”。
本發(fā)明中的“以肽或片段等“作為抗原制備的抗體””或““以肽或片段等作為抗原制備的抗體””是指將作為“抗原”的肽或片段免疫各種動物而要制備的或已制備的抗體。該抗體是將作為“抗原”的肽或片段作為表位或表位的一部分。另外，該抗體與作為“抗原”的肽或片段特異性結(jié)合。
“作為抗原要制備的抗體”或“作為抗原制備的抗體”中，為了使作為“抗原”的肽具有免疫原性，可以以附加有載體或載體蛋白、或者附加有其它氨基酸殘基的肽作為免疫原而制備的抗體，只要表示出上述性質(zhì)，它們也包含在“作為抗原要制備的抗體”或“作為抗原制備的抗體”中。
“特異性結(jié)合的抗體”是指與特異性結(jié)合對象免疫學結(jié)合的抗體、或者與特異性結(jié)合對象顯示通常的抗原抗體反應(yīng)的抗體。例如，顯示抗原抗體反應(yīng)時，這可通過凝聚法、夾層法、固相直接法或固相結(jié)合法、競爭法等進行確認。另外，“特異性結(jié)合的抗體”和要特異性結(jié)合的對象的結(jié)合以親和性的形式表示時，通常解離常數(shù)(KD)低于10-7M。在結(jié)合實驗上，如果不能測定解離常數(shù)，則可記為基本上不結(jié)合。另外，與“特異性結(jié)合”的情況相比，其結(jié)合能力只能確認為10倍或以下、優(yōu)選100倍或以下、更優(yōu)選1000倍或以下等的非特異性結(jié)合時，也記為基本上不結(jié)合。
“不與LPS結(jié)合”是指該重組型可溶性CD14片段與LPS的結(jié)合能力沒有或幾乎沒有。生物體內(nèi)全長CD14或者SEQ ID No.3的人全長可溶型CD14蛋白質(zhì)在生物體或血清中具有與LPS的結(jié)合能力，該復(fù)合物激活細胞?！安慌cLPS結(jié)合”的該重組型可溶性CD14片段是指生物體內(nèi)全長CD14或SEQ ID No.3的人全長可溶型CD14蛋白質(zhì)與LPS的結(jié)合能力最多為1/100或以下。
本發(fā)明第一方案是具有下述1)-3)性質(zhì)的可溶性CD14抗原1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)N末端序列具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，以及3)與含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合。
本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原具有上述1)的性質(zhì)。即，通過非還原條件下的SDS-PAGE，在分子量為13±2kDa的位置上檢測出來自本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的條帶。
特別是在非還原條件下的12.5％ SDS-PAGE中，使用Precisionplus proteinTM雙色標準品(Bio-Rad制備)計算分子量，則在分子量為13±2kDa的位置上檢測出條帶。
本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原具有上述2)的性質(zhì)。SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列與SEQ ID No.3的人CD14 N末端氨基酸序列一致。由此可以確認本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原是人CD14的一種。
本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原具有上述3)的性質(zhì)。作為上述3)的特征的、含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽相當于SEQID No.3的人CD14第53位-68位的16個氨基酸殘基。目前在人蛋白質(zhì)中，包含SEQ ID No.2序列的其它蛋白質(zhì)除人CD14之外并無其它，因此可以說該序列特異性地含有CD14的序列。由此可以確認本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原是人CD14的一種。
本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原還優(yōu)選通過下述4)的性質(zhì)賦予其特征4)可由人血漿得到的(1-1)的可溶性CD14抗原。
具有上述4)的性質(zhì)的特征的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原是存在于人血漿中的蛋白質(zhì)。通過后述的純化方法，本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原可以以高純度獲得。本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原在敗血癥患者體內(nèi)呈現(xiàn)高濃度。由此可作為敗血癥的診斷或檢測方法的標志物。
本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原可成為試劑盒中使用的標準物質(zhì)或競爭物質(zhì)，所述試劑盒用于測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原，所述抗原可用作敗血癥的診斷或檢測。
關(guān)于本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的純化方法如下所述。
本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原可通過人CD14相關(guān)抗體親和柱層析、凝膠過濾色譜、SDS-PAGE的組合，由人血漿或人血清中純化。通過使用后述本發(fā)明第五方案——本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，可以高效地檢測作為柱層析的洗脫組分的、本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原。
與人CD14相關(guān)的抗體是抗人CD14抗體、或來自人CD14的氨基酸序列的肽的抗體。例如，通過采用作為抗人CD14抗體的F1025-3-1抗體或F1024-1-3抗體的親和柱層析，可以與高分子量CD14分離。此時，高分子量CD14與抗體吸附，本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原分離到最初的流分中。再通過使用與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體的親和柱層析，可以與血清中的其它蛋白分離。
本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原與抗體吸附，通過使溶劑為酸性來洗脫。生成F1025-3-1抗體和F1024-1-3抗體的雜交瘤分別如WO01/22085號和WO01/72993號記載，以保藏號FERM BP-7296和保藏號FERM BP-7511，國際保藏于日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(IPOD)。
通過抗人CD14多克隆抗體的親和柱層析，可以使血清中的可溶性CD14抗原與其它蛋白分離。然后通過上述抗人CD14單克隆抗體的親和柱層析，可以與高分子量CD14分離。
將人血清或者通過上述親和柱層析部分純化的組分進行凝膠過濾色譜，由此可以進一步純化本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原。此時，如上所述，也可以使用本發(fā)明的第五方案的測定試劑盒，檢測出本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的組分進行收集。還可通過使用分子量標志，收集分子量為35±10kDa的組分。
如上所述，可以將部分純化的組分進行非還原SDS-PAGE，收集13±2kDa的位置，進一步純化。所收集的組分中，本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原作為主要蛋白質(zhì)，可以高純度純化。
還可以通過陰離子交換柱層析、反相色譜、等電點電泳等進行純化，由此可以獲得更高純度。例如，本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原在pH 8.5的陰離子交換柱層析中，可以以0.3M附近的離子強度溶出。
本發(fā)明第二方案是具有下述1)-3)性質(zhì)的重組型可溶性CD14片段1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合，以及3)與以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段可例舉具有下述5)-7)序列的重組型可溶性CD14片段5)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-63位以外的區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代而成的片段，6)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，7)C末端為SEQ ID No.3的59位-90位的其中之一。
該例示中，優(yōu)選6)中N末端為SEQ ID No.3的1位-6位其中之一的重組型可溶性CD14片段，更優(yōu)選N末端為SEQ ID No.3的1位的重組型可溶性CD14片段。
還優(yōu)選7)中C末端為SEQ ID No.3的59位-80位其中之一的重組型可溶性CD14片段，更優(yōu)選C末端為SEQ ID No.3的64位-75位其中之一的重組型可溶性CD14片段，進一步優(yōu)選C末端為SEQ ID No.3的64位的重組型可溶性CD14片段。
特別優(yōu)選6)中N末端為SEQ ID No.3的1位、7)中C末端為SEQ IDNo.3的64位的(2-3)-(2-5)的任一項的重組型可溶性CD14片段。
優(yōu)選具有5)中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段的重組型可溶性CD14片段。
以下對基因工程學生產(chǎn)本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段的方法進行說明，其方法并不限于此，可采用常規(guī)方法。
通常已知，編碼氨基酸的基因的DNA三聯(lián)體(密碼子)根據(jù)氨基酸的種類不同而存在一種至六種，因此，編碼本發(fā)明片段的氨基酸序列的基因的DNA堿基序列并不限于一種。因此，只要是含有編碼本發(fā)明片段的堿基序列的基因即可，可以含有任何堿基序列。該基因可以是cDNA、染色體DNA和它們的組合、以及適當拼接的包含內(nèi)含子的cDNA，從基因工程學上容易處理的角度考慮，優(yōu)選cDNA。
該基因可通過任何方法獲得。例如可以是化學合成的，也可以是由適當?shù)腄NA文庫獲得的，還可以是以DNA為模板、通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法獲得。其中所述作為模板的DNA含有編碼CD14全長或部分的基因的DNA?？梢愿鶕?jù)需要，將由這些方法獲得的基因或其片段進行退火、連接，進行制備。
該基因的DNA可如下進行化學合成。具體如下將該基因的DNA分成含有約20-30個堿基的片段，使用DNA化學合成儀(例如394型、Appliedバオオシステム制造)，合成多個片段，然后根據(jù)需要將各片段的5’末端磷酸化，將各片段退火，連接，得到目標DNA。
該基因還可以通過以基因組文庫或cDNA文庫等為模板的PCR法獲得。采用PCR法時，以公知的堿基序列和編碼本發(fā)明的片段或插入或取代有蛋白分解酶的切斷部位的片段(以下可稱為本發(fā)明的片段等)的基因的DNA等堿基序列為基礎(chǔ)，還可根據(jù)需要組合限制酶識別序列等進行設(shè)計，制備有義引物和反義引物，對于任意的DNA文庫等，可按照公知的方法(參照Michael AI.等編、Polymerase Chain Reaction，PCR Protocols，a guide to methods and applications、1990、AcademicPress)來獲得。上述DNA文庫只要含有該基因的DNA或其一部分即可，沒有特別限定。因此，可以使用市售的DNA文庫，也可以根據(jù)需要將由人的末梢血等得到的淋巴細胞、人的確立細胞株、或者雜交瘤等適當?shù)募毎眠m當?shù)幕罨瘎┗罨凑誗ambrook J.等人的方法制備cDNA。通常已知，編碼氨基酸的基因的DNA三聯(lián)體(密碼子)根據(jù)氨基酸種類不同而存在一種至六種，因此，編碼本發(fā)明片段等氨基酸序列的基因的DNA堿基序列不限于一種。因此，只要是含有編碼本發(fā)明片段等的堿基序列的基因即可，可以含有任何堿基序列。
重組載體可以是環(huán)狀或直鏈狀等、單鏈或雙鏈以及它們的復(fù)合鏈等任何形式，可以根據(jù)目的適當選擇，從操作容易的角度或容易整合到宿主中的角度考慮，優(yōu)選環(huán)狀，從穩(wěn)定性等角度考慮，優(yōu)選雙鏈。
“重組型可溶性CD14片段”是具有SEQ ID No.3的人全長CD14蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列、通過基因重組而制備的可溶性片段。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有上述1)的性質(zhì)。即，通過非還原條件下的SDS-PAGE，在分子量13±2kDa的位置可以檢測出來自本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段的條帶。
特別是在非還原條件下的12.5％SDS-PAGE中，使用Precisionplus proteinTM雙色標準品(Bio-Rad制備)計算分子量，則在分子量為13±2kDa的位置上檢測出條帶。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有上述2)的性質(zhì)。即，不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合。
“不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合”是指該重組型可溶性CD14片段不與3C10和MEM-18兩種抗體免疫學結(jié)合，或者不顯示通常的抗原抗體反應(yīng)?！安慌c3C10和MEM-18特異性結(jié)合”的本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段與生物體內(nèi)全長CD14或SEQ ID No.3的人全長重組型可溶型CD14蛋白質(zhì)比較，與3C10和MEM-18的結(jié)合能力分別為1/100或以下。優(yōu)選1/1,000或以下。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有上述3)的性質(zhì)。特別是與多克隆抗體特異性結(jié)合。上述3)的特征中所描述的含有SEQID No.2所示的氨基酸殘基的肽相當于SEQ ID No.3的人CD14第53位-68位的16個氨基酸殘基。該多克隆抗體識別7個氨基酸或以上長度的序列(參照后述實施例4)，因此第二方案的重組型可溶性CD14片段至少具有SEQ ID No.3的人CD14第53位-68位的任意連續(xù)的7個氨基酸或以上長度的序列。
3C10和MEM-18是非常著名的抗CD14抗體，CD14上的表位如果分別位于7位-14位和57位-64位，則可以識別。以往的來自人CD14的重組型可溶性CD14片段只要其序列具有上述表位部分的區(qū)域，則可與3C10或MEM-18結(jié)合，被識別。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有上述1)-3)的性質(zhì)，由此，與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原具有物性和免疫學類似的性質(zhì)。特別是免疫學性質(zhì)類似，這可以推定可作為表位的氨基酸殘基序列的立體結(jié)構(gòu)與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原類似。因此，特別適合作為測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原時的標準物質(zhì)。測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原時的常規(guī)標準物質(zhì)可以使用具有人CD14的N末端1位-307位的氨基酸、且將286位的絲氨酸取代成半胱氨酸的重組多肽(以下稱為rsCD14(1-307)S286C)，本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段由于其分子量近似，因此適合將免疫學反應(yīng)換算成物質(zhì)量。另外，即使溶劑的狀態(tài)改變，本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的反應(yīng)性也類似。例如，在含檸檬酸的血液和含EDTA的血液的檢體中，本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原與rsCD14(1-307)S286C的免疫學反應(yīng)性不同，但是本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原和本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段的免疫學反應(yīng)性一致。同樣，其可以作為通過競爭法等測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原時的類似物使用。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原具有免疫學類似的性質(zhì)，因此在進行篩選用于測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的抗體時，可以用作特異性結(jié)合的對象。本來，也可以使用本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原作為特異性結(jié)合的對象，但是其在生物體內(nèi)只有極微量存在，因此本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為其代用品特別有用。
如上所述，本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有各種有用性，這是由于其具有上述1)-3)的性質(zhì)。即，具有上述1)-3)性質(zhì)的本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段并不是通過其序列表達，而是通過CD14片段的物性和免疫學性質(zhì)這些功能來表達。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有上述4)不與LPS結(jié)合的性質(zhì)。國際公開第WO96/20956號中并未記載具體的肽，但是公開了具有8-60個含有人CD14的57位-64位的氨基酸、并與LPS結(jié)合的肽。該肽與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段并不一致，本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特別具有上述4)的性質(zhì)，由此可以理解其它們的明顯不同。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段可以例舉具有下述5)-7)序列的重組型可溶性CD14片段5)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代而成的片段，6)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，7)C末端為SEQ ID No.3的59位-90位其中之一。
該例子中，優(yōu)選6)中N末端為SEQ ID No.3的1位-6位其中之一的重組型可溶性CD14片段，更優(yōu)選N末端為SEQ ID No.3的1位的重組型可溶性CD14片段。
還優(yōu)選7)中C末端為SEQ ID No.3的59位-80位其中之一的重組型可溶性CD14片段，更優(yōu)選C末端為SEQ ID No.3的64位-75位其中之一的重組型可溶性CD14片段，進一步優(yōu)選C末端為SEQ ID No.3的64位的重組型可溶性CD14片段。
特別優(yōu)選6)中N末端為SEQ ID No.3的1位、7)中C末端為SEQ IDNo.3的64位的(2-3)-(2-5)中任意的重組型可溶性CD14片段。
還優(yōu)選為5)中具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段的重組型可溶性CD14片段。
以下對基因工程生產(chǎn)本發(fā)明的片段的方法進行說明，并沒有特別限定，可以使用常規(guī)方法。
通常，已知編碼氨基酸的基因的DNA三聯(lián)體(密碼子)根據(jù)氨基酸種類而存在一種至六種，因此，編碼本發(fā)明片段的氨基酸序列的基因的DNA堿基序列不限為一種。因此，只要是含有編碼本發(fā)明片段的堿基序列的基因即可，可以含有任何堿基序列。該基因可以是cDNA、染色體DNA以及它們的組合、以及可適當拼接的含有內(nèi)含子的cDNA，從基因工程中容易應(yīng)用的角度考慮，優(yōu)選cDNA。
該基因可以通過任何方法獲得。例如可以是化學合成的，也可以是由適當?shù)腄NA文庫獲得，還可以是以DNA為模板、通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法獲得。其中所述作為模板的DNA含有編碼CD14全長或部分的基因的DNA?？梢愿鶕?jù)需要，將由這些方法獲得的基因或其片段進行退火、連接，進行制備。
該基因的DNA可如下進行化學合成。具體如下將該基因的DNA分成含有約20-30個堿基的片段，使用DNA化學合成儀(例如394型、Appliedバオオシステム制造)，合成多個片段，然后根據(jù)需要將備片段的5’末端磷酸化，將各片段退火，連接，得到目標DNA。
該基因還可以通過以基因組文庫或cDNA文庫等為模板的PCR法獲得。采用PCR法時，以公知的堿基序列和編碼本發(fā)明的片段或插入或取代有蛋白分解酶的切斷部位的片段(以下可稱為本發(fā)明的片段等)的基因的DNA等堿基序列為基礎(chǔ)，還可根據(jù)需要組合限制酶識別序列等進行設(shè)計，制備有義引物和反義引物，對于任意的DNA文庫等，可按照公知的方法(參照Michael AI.等編、Polymerase Chain Reaction，PCR Protocols，a guide to methods and applications、1990、AcademicPress)來獲得。上述DNA文庫只要含有該基因的DNA或其一部分即可，沒有特別限定。因此，可以使用市售的DNA文庫，也可以根據(jù)需要，將由人的末梢血等得到的淋巴細胞、人的確立細胞株、或者雜交瘤等適當?shù)募毎眠m當?shù)幕罨瘎┗罨凑誗ambrook J.等人的方法制備cDNA。通常已知，編碼氨基酸的基因的DNA三聯(lián)體(密碼子)根據(jù)氨基酸種類不同而存在一種至六種，因此，編碼本發(fā)明片段等氨基酸序列的基因的DNA堿基序列不限于一種。因此，只要是含有編碼本發(fā)明片段等的堿基序列的基因即可，可以含有任何堿基序列。
重組載體可以是環(huán)狀或直鏈狀等、單鏈或雙鏈以及它們的復(fù)合鏈等任何形式，可以根據(jù)目的適當選擇，從操作容易的角度或容易整合到宿主中的角度考慮，優(yōu)選環(huán)狀，從穩(wěn)定性等角度考慮，優(yōu)選雙鏈。
所連接的信號序列可以適當選擇，優(yōu)選編碼人CD14的信號肽——Met Glu Arg Ala Ser Cys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val HisVal Ser Ala序列的信號序列(Goyer等人、Nuclic Acid Research、16卷、4173頁、1988年)。
以內(nèi)含體的形式表達時，優(yōu)選附加甲硫氨酸或N末端含有甲硫氨酸的肽，其中所述內(nèi)含體以大腸肝菌作為宿主。
從宿主的角度考慮，該重組載體的優(yōu)選例子為可以使本發(fā)明的片段等轉(zhuǎn)化動物細胞或酵母等真核細胞，使其表達的載體。因此，該重組載體的優(yōu)選例子是該重組載體除翻譯啟始密碼子、終止密碼子、選擇標志基因之外，至少還具有polyA附加序列、在動物細胞中發(fā)揮功能的SV40的啟動子、EF1α的啟動子、SRα的啟動子或在酵母中發(fā)揮功能的AOX1的啟動子、以及SV40的復(fù)制起點等。
該重組載體可通過將該基因的DNA與具有任意堿基序列的其它DNA片段連接的方法、或者導(dǎo)入到任意的載體中的方法(參照Sambrook J.等、molecular Cloning a Laboratory Manual 2nded.，ColdSpring Harbor Laboratory，New York、1989年)等獲得。
轉(zhuǎn)化體可通過將該重組載體導(dǎo)入到作為宿主的細胞或微生物中來獲得。
該轉(zhuǎn)化體可以是表達本發(fā)明的片段等的轉(zhuǎn)化體，特別優(yōu)選表達本發(fā)明的片段等、并且在培養(yǎng)上清中分泌的轉(zhuǎn)化體。如果使用上述轉(zhuǎn)化體，則可以容易地大量生產(chǎn)本發(fā)明的片段等。
培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，根據(jù)需要進行基因的擴增或表達誘導(dǎo)。接著將培養(yǎng)混合物回收，根據(jù)需要，將濃縮、增溶、透析、各種層析等操作適當組合，進行本發(fā)明的片段等的純化。
“培養(yǎng)混合物”是指轉(zhuǎn)化體、含有轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基、或者培養(yǎng)上清或溶胞產(chǎn)物等分泌物。
在該生產(chǎn)方法中使用的轉(zhuǎn)化體只要是表達本發(fā)明片段等的轉(zhuǎn)化體即可，沒有特別限定，優(yōu)選COS細胞、CHO細胞等哺乳動物細胞或者酵母、或選自大腸桿菌其中之一的細胞作為宿主的轉(zhuǎn)化體。
以下，給出使用大腸桿菌、CHO細胞等哺乳動物細胞、畢赤屬(Pichia)酵母細胞作為轉(zhuǎn)化體時的培養(yǎng)和表達誘導(dǎo)的例子。
在用具有trp啟動子的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的大腸肝菌中，在L-Broth中進行菌體預(yù)培養(yǎng)，然后將其以1/50的量接種于M9-CA培養(yǎng)基中，在37℃下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)開始數(shù)小時后，在培養(yǎng)基的OD 550值達到1-4(即對數(shù)增殖期)時，添加3β-吲哚基丙烯酸，使終濃度為10μg/mL，進行表達誘導(dǎo)。再培養(yǎng)約1-2天，可得到含有目標蛋白質(zhì)的培養(yǎng)混合物。
在使用用具有AOX1啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化的畢赤屬酵母時，在BMGY培養(yǎng)基上預(yù)備培養(yǎng)約2天，更換培養(yǎng)基，然后加入甲醇進行表達誘導(dǎo)。再在30℃培養(yǎng)約1-2天，可得到含有目標蛋白質(zhì)的培養(yǎng)混合物。
用具有EF1α啟動子的重組載體轉(zhuǎn)化CHO細胞等哺乳動物細胞，所得的轉(zhuǎn)化體在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以約1-10×104細胞/mL的濃度接種細胞，在37℃、5％CO2/95％空氣的條件下進行培養(yǎng)。通常2-3天后達到匯合狀態(tài)，在此時將培養(yǎng)基更換成不含血清的D-MEM。接著再培養(yǎng)2-3天，由此可得到含有目標蛋白質(zhì)的培養(yǎng)混合物。目標蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量少時，可以如上所述，通過氨甲碟呤擴增基因，使生產(chǎn)量增加。
由上述培養(yǎng)混合物純化本發(fā)明的片段等的方法可以從常規(guī)的片段、蛋白質(zhì)或多肽純化所使用的方法中選擇適當?shù)姆椒ㄟM行。具體可從鹽析法、超濾法、等電點沉淀法、凝膠過濾法、電泳法、離子交換色譜、疏水層析或抗體層析等各種親和層析、層析聚焦法、吸附色譜和反相色譜等通常使用的方法中選擇適當?shù)姆椒ú⒔M合，還可以根據(jù)需要使用HPLC系統(tǒng)等進行純化。
該生產(chǎn)方法中，本發(fā)明的片段等可以以大腸肝菌的β-半乳糖苷酶或與其它多肽的融合蛋白的形式表達，這種情況下，必須在純化步驟的一個階段中，進行將融合蛋白質(zhì)用溴化氰或羥胺等化學物質(zhì)或蛋白酶等酶進行處理、切取該蛋白質(zhì)的操作。
所使用的轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌時，以不溶蛋白——內(nèi)含體的形式生產(chǎn)本發(fā)明的片段等，則在純化時，可以使內(nèi)含體溶解、變性，在純化的適當?shù)碾A段進行再折疊(Thomas E等，J.Molecular Biology，87，563-577，1974)。
具體來說，首先，將菌體破碎，通過離心回收顆粒。接著向顆粒中添加尿素或適量含有胍基鹽酸、表面活性劑、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽的增溶緩沖液(例如含有5M胍基鹽酸、0.005％吐溫80、50mM Tris鹽酸(pH 8.0)、5mM EDTA、2mM還原型谷胱甘肽、0.02mM氧化型谷胱甘肽的緩沖液)，加入2-巰基乙醇，進行變性，然后從上述增溶緩沖液中除去胍基鹽酸，對所得溶液進行透析，進行再折疊。以融合蛋白的形式表達時，在這些操作之后，通過溴化氰等化學物質(zhì)或蛋白酶等酶切斷不需要的蛋白質(zhì)部分，然后進行適當?shù)膶游觥?br> 本發(fā)明的片段可通過常規(guī)方法進行化學合成，由化學合成制備的片段也包含在本發(fā)明的片段中。例如，可通過市售的肽合成儀制備。另外，還可以通過肽合成儀合成本發(fā)明的片段的斷片，再將其化學結(jié)合而制備。
本發(fā)明第三方案是重組型可溶性CD14片段，該片段具有下述1)-3)的性質(zhì)，由下述<1>-<3>步驟獲得1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合，以及3)與抗體特異性結(jié)合，該抗體以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原而制備；<1>制備具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，其中被取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶切斷部位的序列；或者制備具有該部分序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)域有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，<2>將<1>中制備的重組型可溶性CD14片段用該規(guī)定的蛋白分解酶切斷的步驟，以及<3>回收<2>中切斷的片段的N末端一側(cè)的片段的步驟。
本發(fā)明人如下推定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原在血液中存在的機理，使用與該推定的生產(chǎn)過程相同的方法嘗試生產(chǎn)本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段。但并不是同過該推定的生產(chǎn)過程來約束或限定本發(fā)明。
如后所述，本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原在敗血癥時在血液中特異性增加。即，通過在敗血癥的初期階段、特別是生物體與內(nèi)毒素等接觸后立即發(fā)生的生物體內(nèi)現(xiàn)象即可知其增加。
例如，生物體與內(nèi)毒素等接觸后立即發(fā)生的生物體內(nèi)現(xiàn)象是指嗜中白細胞的活化，被活化的嗜中白細胞釋放嗜中白細胞彈性蛋白酶等蛋白酶。此時，生物體內(nèi)的可溶型全長CD14、模型CD14(以后可稱為全長CD14)等高分子CD14被該彈性蛋白酶等分解，由此可以推定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原增加。彈性蛋白酶的切斷的特異性低，因此可能產(chǎn)生各種片段，可推定最終產(chǎn)生本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原。當然，通過與其它蛋白酶等的相互作用，也可以推定產(chǎn)生本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原。
通過彈性蛋白酶等蛋白酶，全長CD14分解，產(chǎn)生的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原在生物體(血清中)中至少以可檢測的程度穩(wěn)定存在。
如后所述，本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原可以與全長CD14區(qū)別地進行免疫學測定，這樣就可以理解所產(chǎn)生的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原與全長的CD14在立體結(jié)構(gòu)方面已經(jīng)不同。
本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段是本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的重組型可溶性CD14片段，因此與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原立體結(jié)構(gòu)類似的片段、即免疫學特異性類似的片段可嘗試通過蛋白酶，從比較大的CD14片段中切斷C末端的生產(chǎn)方法，結(jié)果成功的生產(chǎn)出本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段，并進行了分離純化。
以下描述本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段的制備例。
在<1>的步驟中，制備具有下述8)-11)序列的重組型可溶性CD14片段8)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代而成的片段，9)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，10)C末端為SEQ ID No.3的134位-356位其中之一，11)在SEQ ID No.3的59位-90位的任一位置后面取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位的序列。
<1>步驟的11)中，規(guī)定的蛋白分解酶有ProScission Protease、凝血酶、Xa因子等。規(guī)定的蛋白分解酶為RroScission Protease時，切斷部位的序列為Leu、Glu、Val、Leu、Phe、Gln、Gly、Pro，可以例舉將該8個氨基酸殘基取代或插入在SEQ ID No.3的59位-70位的任一位置后面。當規(guī)定的蛋白質(zhì)為凝血酶時，切斷部位的序列為Leu、Val、Pro、Arg、Gly、Ser，可以例舉將該6個氨基酸殘基取代或插入在SEQID No.3的59位-70位的任一位置后面。當規(guī)定的蛋白分解酶為Xa因子時，切斷部位的序列為Ile、Glu、Gly、Arg，可以例舉將該4個氨基酸殘基取代或插入在SEQ ID No.3的59位-70位的任一位置后面。
在<1>的步驟中，優(yōu)選為制成并生產(chǎn)在9)中N末端為SEQ ID No.3的1位-6位其中之一的片段的重組性可溶性CD14片段。進一步優(yōu)選為制成并生產(chǎn)N末端為SEQ ID No.3的1位的片段的重組型可溶性CD14片段。
在<1>的步驟中，優(yōu)選為制成并生產(chǎn)在11)中、在SEQ ID No.3的59位-68位的任一位置后面取代或插入規(guī)定蛋白分解酶的切斷部位序列的片段的重組型可溶性CD14片段。
進一步優(yōu)選為制成并生產(chǎn)將規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位的序列取代或插入到SEQ ID No.3的64位后面的重組型可溶性CD14片段。
特別優(yōu)選為N末端為SEQ ID No.3的1位-6位其中之一，在SEQ IDNo.3的64位后面取代或插入有規(guī)定蛋白分解酶的切斷部位序列的片段的重組型可溶性CD14片段。
例如如上所述，如果確定了序列，<1>的步驟即可以按照本發(fā)明第二方案的記載，制備重組型可溶性CD14片段。
<2>的將插入或取代了規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位的片段用該規(guī)定的蛋白分解酶進行切斷的步驟可以采用該規(guī)定的蛋白分解酶的最佳條件，進行常規(guī)反應(yīng)。例如，規(guī)定的蛋白分解酶為ProScission Protease時，可以使酶∶底物比＝0.001-10∶1(U∶μg)，在4℃進行切斷反應(yīng)過夜。規(guī)定的蛋白分解酶為凝血酶時，可以使酶∶底物比＝0.001-10∶1(U∶μg)，在22℃靜置過夜，進行凝血酶的切斷反應(yīng)。規(guī)定的蛋白分解酶為Xa因子時，可以以酶∶底物比＝0.0008-8∶1(U∶μg)添加，進行切斷反應(yīng)過夜。
<3>的將切斷的片段中N末端一側(cè)的片段回收的步驟可與上述純化本發(fā)明的片段等的方法同樣進行。
根據(jù)該生產(chǎn)方法，可以均勻且高效率、工業(yè)化大量生產(chǎn)本發(fā)明的片段。
通過上述步驟即可理解本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段的具體序列。優(yōu)選的片段與本發(fā)明第二方案的片段序列相同。本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段的C末端可以附加一部分規(guī)定蛋白分解酶的切斷部位序列。
特別優(yōu)選本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段的理由是與不檢測血液中的高分子CD14、只檢測本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的試劑盒反應(yīng)，通過蛋白質(zhì)印跡進行檢測，可以確認顯示與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原具有同等的反應(yīng)性(參照后述實施例14-(2))，由此可以推定其與本發(fā)明第一實施方案的可溶性CD14抗原的立體結(jié)構(gòu)基本上相同。
以下將本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段和本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段進行共同說明。(可將兩者共同描述為本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段或本發(fā)明的重組型可溶性CD14片段)“重組型可溶性CD14片段”是具有SEQ ID No.3的人全長CD14蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列、通過基因重組而制備的可溶性片段。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有上述1)的性質(zhì)。即，非還原條件下的SDS-PAGE中，在分子量為13±2kDa的位置可以檢測出本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段的條帶。
特別是在非還原條件下的12.5％SDS-PAGE中，使用Precisionplus proteinTM雙色標準品(Bio-Rad制備)計算分子量，則在分子量為13±2kDa的位置上檢測出條帶。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有上述2)的性質(zhì)。即，不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合。
“不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合”是指該重組型可溶性CD14片段不與3C10和MEM-18兩種抗體免疫學結(jié)合，或者不顯示通常的抗原抗體反應(yīng)。“不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合”的本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段與生物體內(nèi)全長CD14或者SEQ ID No.3的人全長重組型可溶型CD14蛋白質(zhì)比較，與3C10和MEM-18的結(jié)合能力分別為1/100或以下。優(yōu)選1/1,000或以下。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有上述3)的性質(zhì)。特別是與多克隆抗體特異性結(jié)合。上述3)的特征中所描述的含有SEQID No.2所示的氨基酸殘基的肽相當于SEQ ID No.3的人CD14第53位-68位的16個氨基酸殘基。由于該多克隆抗體識別7個氨基酸或以上長度的序列(參照后述實施例4)，因此第二方案的重組型可溶性CD14片段至少具有SEQ ID No.3的人CD14第53位-68位的任意連續(xù)的7個氨基酸或以上長度的序列。
3C10和MEM-18是非常著名的抗CD14抗體，如果CD14上的表位分別位于7位-14位和57位-64位則可以識別。以往來自人CD14的重組型可溶性CD14片段只要其序列具有上述表位部分的區(qū)域，則與3C10或MEM-18結(jié)合，可識別。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有上述1)-3)的性質(zhì)，由此，與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原具有物性和免疫學類似的性質(zhì)。特別是免疫學性質(zhì)類似，這可以推定可作為表位的氨基酸殘基序列的立體結(jié)構(gòu)與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原類似。因此，可特別用作測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原時的標準物質(zhì)。測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原時的常規(guī)標準物質(zhì)可以使用具有人CD14 N末端1位-307位的氨基酸、且將286位的絲氨酸取代成半胱氨酸的重組多肽(以下稱為rsCD14(1-307)S286C)，本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段分子量與其近似，因此適合將免疫學反應(yīng)換算成物質(zhì)量。另外，即使溶劑狀態(tài)變化，本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的反應(yīng)性也類似。例如，在含檸檬酸的血液和含EDTA的血液的檢體中，本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原與rsCD14(1-307)S286C的免疫學反應(yīng)性不同，但是本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原和本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段的免疫學反應(yīng)性一致。同樣，其可以作為通過競爭法等測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原時的類似物使用。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原具有免疫學類似的性質(zhì)，因此在篩選用于測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的抗體時，可以用作特異性結(jié)合的對象。本來，也可以使用本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原作為特異性結(jié)合的對象，但是其在生物體內(nèi)只有極微量存在，因此本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為其代用品特別有用。
如上所述，本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有各種有用性，這是由于其具有上述1)-3)的性質(zhì)。即，具有上述1)-3)性質(zhì)的本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段并不是通過其序列表達，而是通過CD14片段的物性和免疫學性質(zhì)這些功能來表達。
本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段具有上述4)不與LPS結(jié)合的性質(zhì)。國際公開第WO96/20956號中并未記載具體的肽，但是公開了具有8-60個含有人CD14的57位-64位的氨基酸、并與LPS結(jié)合的肽。該肽與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段并不一致，本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特別具有上述4)的性質(zhì)，由此可以理解其它們的明顯不同。
將插入或取代了規(guī)定蛋白分解酶切斷部位的片段用該規(guī)定的蛋白分解酶切斷的步驟可以采用該規(guī)定蛋白分解酶的最佳條件，進行常規(guī)反應(yīng)。例如，規(guī)定的蛋白分解酶為ProScission Protease時，可以使酶∶底物比＝0.001-10∶1(U∶μg)，在4℃進行切斷反應(yīng)過夜。規(guī)定的蛋白分解酶為凝血酶時，可以使酶∶底物比＝0.001-10∶1(U∶μg)，在22℃靜置過夜，進行凝血酶的切斷反應(yīng)。規(guī)定的蛋白分解酶為Xa因子時，可以以酶∶底物比＝0.0008-8∶1(U∶μg)添加，進行切斷反應(yīng)過夜。
將切斷的片段中N末端一側(cè)的片段回收的步驟可與上述純化本發(fā)明的片段等的方法同樣進行。
根據(jù)該生產(chǎn)方法，可以均勻且高效率、工業(yè)化大量生產(chǎn)本發(fā)明的片段等。
本發(fā)明的片段可通過常規(guī)方法進行化學合成，由化學合成制備的片段也包含在本發(fā)明的片段中。例如，可通過市售的肽合成儀制備。另外，還可以通過肽合成儀合成本發(fā)明的片段的斷片，再將其化學結(jié)合而制備。
本發(fā)明第四方案是敗血癥的診斷或檢測方法，其特征在于對本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原進行測定。通過采用本發(fā)明第四方案的敗血癥診斷或檢測方法，可以對受試者進行敗血癥的診斷或檢測。
本方案的特征在于優(yōu)選包含下述1)-3)的步驟1)對由受試者采集的血液中所含有本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原進行測定的步驟，2)將測定的值與正常人的標準值進行比較的步驟，以及3)評價受試者是否為敗血癥的步驟。
在1)的步驟中，由受試者采集的血液可以使用由受試者采集的血液、即全血，也可以將由受試者采集的血液制備成血漿或血清。優(yōu)選制備成血漿或血清，進行本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定步驟。“對本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原進行測定”是指測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的量，如無特別說明，也可以測定單位溶液的量、即濃度。在2)的步驟中，結(jié)合要比較的標準值的單位，取得測定結(jié)果。
在1)的步驟中，通過夾層免疫測定法進行測定，這簡便，因此優(yōu)選。例如，可通過后述的本發(fā)明第六方案的測定方法進行。也可以通過使用本發(fā)明第五方案的測定試劑盒進行。不過，1)的步驟并不限于這些測定方法，例如，可以通過電泳，將由受試者采集的血液、血漿或血清中的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原分離并檢測，通過光密度分析法測定要檢測的條帶的濃度或?qū)挾鹊鹊姆椒āＴ摲椒ǖ膬?yōu)選例子是通過非還原下的SDS-PAGE進行分離，然后使用本發(fā)明第五方案的測定試劑盒中所使用的抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測條帶。除此之外，測定方法還可以采用質(zhì)譜法、HPLC、氣相色譜法或TLC等的分離和檢測等的方法。
2)的步驟是預(yù)先求出多名正常人的測定結(jié)果，通過該測定結(jié)果的平均值或取范圍等，將標準化的正常人的值或正常人的值的范圍作為正常人的標準值，與1)步驟中測定的值進行比較的步驟。例如，可將正常人的平均值+2SD或3SD作為截止值，求出正常人的標準值。也可以在2)的步驟中，預(yù)先求出敗血癥患者的基準值，與1)步驟中測定的值進行比較。將該步驟代替2)與正常人標準值進行比較的步驟進行。
3)的步驟是根據(jù)在2)步驟中進行比較的結(jié)果，評價受試者是敗血癥(陽性)或不是敗血癥(陰性)的步驟。除陽性、陰性之外，還可以進行假陽性的評價或預(yù)測性診斷。例如，正常人的標準幅度為0-0.1μg/mL，敗血癥患者的值為0.2μg/mL或以上，將測定值比較時，如果受試者的值為0-0.1μg/mL，則評價為陰性，如果是0.1-0.2μg/mL，則評價為假陽性，為0.2μg/mL以上時，評價為陽性；或者例如可以進行24小時內(nèi)敗血癥發(fā)病的可能性高等診斷等。
在臨床中，檢體中的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的穩(wěn)定性是重要的因素。例如反復(fù)凍融、或長時間在室溫下放置時，血清中的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原分解，可能無法測定，另外，血清中的高分子量CD14被分解為本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原或與其相近的結(jié)構(gòu)，這也可能引起測定結(jié)果的失誤。
因此，為了保證本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原和高分子量CD14的穩(wěn)定性，可以在血清中添加各種添加劑。例如，采血時添加的添加劑有血漿采血所使用的乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素、檸檬酸。還可以通過向血清中添加抗凝血酶III、α1-抗胰蛋白酶、抑酶肽、亮異蛋白酶肽、α2-巨球蛋白、抑胃酶肽、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制劑、氨肽霉抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、苯甲基磺酰氟(PMSF)、EGTA、E-64、芐脒、4-氟-(2-氨基乙基)苯磺酰氯(AEBSF)等各種蛋白酶抑制劑作為穩(wěn)定劑來抑制蛋白的分解。還可以通過添加乳糖、蔗糖、海藻糖等糖或PEG等合成高分子等，使液體中本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原和高分子量CD14的穩(wěn)定性提高。
本發(fā)明第五方案是可溶性CD14抗原的測定試劑盒，該測定試劑盒至少含有一種與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段，用于測定檢體中所含的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原。
本發(fā)明的試劑盒含有至少一種與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段，測定檢體中所含的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原。另外，為了檢測作為目標的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原，可以對本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原進行直接測定。還優(yōu)選該試劑盒只檢測作為目標的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原，而不檢測人高分子量可溶性CD14抗原和36kDa可溶型CD14蛋白質(zhì)。實際上，如果不對人血清進行特別處理而直接作為檢體用于測定，則本發(fā)明的測定試劑盒則不檢測人高分子量可溶型CD14蛋白質(zhì)和36kDa可溶型CD14蛋白質(zhì)。特別處理是指向人血清中添加蛋白，或者使人血清中的蛋白改性等處理。該抗體的片段是指該抗體的Fab、Fab’、或者F(ab’)2。
本發(fā)明的測定試劑盒只要含有至少一種與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段，可以測定檢體中所含的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原即可，沒有特別限定。優(yōu)選所述可溶性CD14抗原的測定試劑盒含有以下a)-d)的任意的抗體或該抗體片段作為與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段a)與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體；b)以含有選自SEQ ID No.2氨基酸序列的連續(xù)8-16個任意個數(shù)的氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，c)以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，d)與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段或本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體。
更優(yōu)選為含有上述a)、c)或d)的抗體或該抗體的片段的測定試劑盒。進一步優(yōu)選含有d)的抗體或該抗體的片段的測定試劑盒。特別優(yōu)選含有d)與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段結(jié)合的抗體或該抗體的片段的測定試劑盒。
d)的抗體也包含與a)與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體、b)以含有選自SEQ ID No.2氨基酸序列的連續(xù)的8-16個任意個數(shù)的氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體、或者c)以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體、具有同樣性質(zhì)的抗體，一部分重復(fù)。因此，d)的抗體也可以含有上述a)-c)的抗體的一部分。另外，為了明確區(qū)別d)的抗體和上述a)-c)的抗體，可以從d)抗體中除去上述a)-c)的抗體。
與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段、特別是d)的抗體優(yōu)選以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段或本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的抗體或該抗體的片段。還優(yōu)選以本發(fā)明第一方案的可溶CD14抗原作為抗原制備的抗體或該抗體的片段。更優(yōu)選以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的抗體或該抗體的片段。還優(yōu)選以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體或該抗體的片段。特別優(yōu)選基本上不與人高分子量CD14或具有人CD14的N末端1位-356位氨基酸的可溶性多肽(以下稱為rsCD14(1-356))等重組型高分子量CD14結(jié)合的抗體。
關(guān)于測定原理，只要是使用該抗體或該抗體的片段，免疫學測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的方法即可，沒有特別限定。
測定原理的一個例子是使用a)抗體、即“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段為抗原制備的單克隆抗體”，通過夾層免疫測定法測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定試劑盒(以下可稱為夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒)，對其具體描述如下。
夾層免疫測定法可以采用公知的技術(shù)。關(guān)于測定法的原理、應(yīng)用和改良方法，例如可參考“超高感度酵素免疫測定法”石川榮治著、學會出版センタ一(1993年)、“免疫測定法の新しい活用事例と診斷試薬·治療薬開発への応用”免疫測定法開發(fā)研究會、經(jīng)營教育出版、酵素免疫測定法(第3版)石川榮治等編、醫(yī)學書院(1987年)。
本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒含有與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體。該與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體的特征、以及制備方法等均如本發(fā)明第一實施方案所述。該抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，沒有特別限定。
夾層免疫測定法是使用識別部位不同的兩種或以上的抗體，通過形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物，對通常要測定的蛋白質(zhì)進行測定的方法。
首先，制備第一抗體所結(jié)合的不溶性載體，以其作為固相或反應(yīng)場所。將檢體添加到固相的該不溶性載體上，使其反應(yīng)。反應(yīng)一定時間后，洗滌，除去不與固相特異性結(jié)合的物質(zhì)。接著添加標記的第二抗體。反應(yīng)一定時間后，洗滌，除去未形成復(fù)合物的標記抗體，根據(jù)標記物，對特異性結(jié)合的復(fù)合物的量進行特異性定性或定量。夾層法可以采用上述以兩階段進行的方法(兩步法)和同時加入抗原和標記抗體的一階段法(一步法)的任何方法。
本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒中，通過形成“與含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”-“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”復(fù)合物來進行測定。
本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒的構(gòu)成包含不溶性載體、標記的第二結(jié)合物質(zhì)(以下簡稱為第二結(jié)合物質(zhì))，其中不溶性載體與“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”結(jié)合，標記的第二結(jié)合物質(zhì)與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”結(jié)合；或者包含第二結(jié)合物質(zhì)所結(jié)合的不溶性載體、以及“與含有SEQ IDNo.2的16個氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的標記抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的標記單克隆抗體”。
第二結(jié)合物質(zhì)的例子有與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”特異性結(jié)合的抗體。與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”特異性結(jié)合的該抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，沒有特別限定，從夾層免疫測定法的適合性角度考慮，優(yōu)選單克隆抗體。所述夾層免疫測定法使用了與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體。可以是該單克隆抗體的片段?？贵w的片段為該單克隆抗體的Fab、Fab’或F(ab’)2。
與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體(以下可稱為第二抗體)可以是與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體，也可以是與高分子量CD14特異性結(jié)合的抗體，沒有特別限定，優(yōu)選該第二抗體是與“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”和“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”特異性結(jié)合的區(qū)域不同的抗體。更優(yōu)選上述第二結(jié)合物質(zhì)為與人高分子量CD14的1位-52位氨基酸殘基的任何區(qū)域特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片斷、或者與上述抗體競爭或顯示交叉反應(yīng)性的抗體或該抗體的片段，所述“上述抗體”是與人高分子量CD14的1位-52位氨基酸殘基的任何區(qū)域特異性結(jié)合的抗體。特別優(yōu)選上述第二結(jié)合物質(zhì)為與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的17位-26位氨基酸殘基的任何部分特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段、或者與上述抗體競爭(顯示交叉反應(yīng)性)的抗體或該抗體的片段，所述“上述抗體”是與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的17位-26位氨基酸殘基的任何部分特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段。
上述抗體制備方法例如可以是以高分子量CD14、“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”、高分子量CD14和“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的混合物或者重組CD14作為抗原，與本發(fā)明第一方案的方法同樣地制備多克隆抗體或單克隆抗體。以高分子量CD14和“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的混合物、以及重組CD14為抗原進行的第二抗體的制備方法舉例如后述實施例3所示。
在進行實際測定之前，優(yōu)選與后述實施例3同樣，預(yù)備性地構(gòu)成與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體和第二抗體的后補抗體以及夾層測定法的系統(tǒng)，確認測定精度，選擇第二抗體。
抗體的片段Fab、Fab’、F(ab’)2可通過公知的方法(“超高感度酵素免疫 定法”石川榮治著、25-40頁、學會出版センタ一、1993年)制備。
在上述夾層免疫測定法中，詳細地描述了使抗體與不溶性載體結(jié)合的夾層免疫測定法，不過也可以不使用不溶性載體，而在溶液中進行。例如，是將抗原和標記抗體以及進行了第二標記的第二結(jié)合物質(zhì)在液相中反應(yīng)，測定該標記與該第二標記的相互作用的方法。
夾層免疫測定法中，作為上述其它方法，可通過競爭法進行測定。是在形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物的過程中，通過使檢體中的抗原與標記的抗原或者標記的抗原類似物競爭來進行測定的方法。
本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒中，通過形成“與含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-標記的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”(或其類似物)-“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”復(fù)合物來測定。
作為本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒的競爭法的構(gòu)成，其含有“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”所結(jié)合的不溶性載體、第二結(jié)合物質(zhì)、以及標記的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”或標記的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的類似物，或者含有“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”、第二結(jié)合物質(zhì)所結(jié)合的不溶性載體、以及標記的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”或標記的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的類似物。
“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的類似物例如有本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段、具有人CD14的N末端1位-285位氨基酸的可溶性多肽(以下稱為rsCD14(1-285))和rsCD14(1-307)S286C。特別優(yōu)選本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段。不過，只要是在測定系統(tǒng)中可以與檢體中的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原競爭的物質(zhì)即可，沒有特別限定。關(guān)于rsCD14(1-285)和rsCD14(1-307)S286C的制備方法，在WO01/72993號公報中有記載。
在夾層免疫測定法中，作為另外一種方法，還可以利用第二特異結(jié)合進行測定。該方法是形成抗體-抗原-抗體-第二特異結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合物或者抗體-抗原-抗體-第二特異結(jié)合物質(zhì)-第二特異結(jié)合物質(zhì)的特異結(jié)合對象(以下可稱為第二特異結(jié)合對象)的復(fù)合物來測定的方法。
在本發(fā)明的夾層免疫測定系試劑盒中，可通過形成“與含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”-“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”-第二特異結(jié)合物質(zhì)的復(fù)合物；形成“與含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”-“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”-第二特異結(jié)合物質(zhì)-第二特異結(jié)合對象的復(fù)合物；或者形成“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”-“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-第二特異結(jié)合物質(zhì)-第二特異性結(jié)合對象的復(fù)合物來測定。
作為本發(fā)明的夾層免疫測定系試劑盒中利用第二特異結(jié)合的構(gòu)成，例如當?shù)诙禺惤Y(jié)合物質(zhì)的對象為“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”或“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”時，還可以含有標記的第二特異結(jié)合物質(zhì)。第二特異結(jié)合物質(zhì)可以是上述第二特異結(jié)合物質(zhì)的對象的抗體。
上述第二特異結(jié)合物質(zhì)的對象為第二特異性結(jié)合對象時，可以含有“第二特異性結(jié)合物質(zhì)所結(jié)合的、與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“第二特異結(jié)合物質(zhì)所結(jié)合的、以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”、與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的標記的第二結(jié)合物質(zhì)、以及第二特異結(jié)合對象所結(jié)合的不溶性載體；或者含有與含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的標記抗體或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的標記單克隆抗體”、與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”結(jié)合的第二特異結(jié)合物質(zhì)所結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)、以及第二特異結(jié)合對象所結(jié)合的不溶性載體。
作為第二特異性結(jié)合物質(zhì)-第二特異結(jié)合對象的組合，可以是抗原及其抗體、配體及其受體、含糖鏈物質(zhì)和凝集素、生物素和抗生物素蛋白或者鏈霉抗生物素等。
包括上述，夾層免疫測定法還可例舉利用抗抗體、即抗免疫球蛋白抗體形成抗體-抗原-抗體-抗免疫球蛋白抗體復(fù)合物進行測定的方法；利用抗免疫球蛋白抗體和第二特異結(jié)合，形成抗免疫球蛋白抗體-抗體-抗原-抗體-第二特異結(jié)合物質(zhì)-第二特異結(jié)合對象等進行測定的方法。
本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒中，可通過形成“與含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”-“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”-抗免疫球蛋白抗體的復(fù)合物；形成“與含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”-“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”-抗免疫球蛋白抗體的復(fù)合物；或者形成抗免疫球蛋白抗體-“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”-“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”-第二特異結(jié)合物質(zhì)-第二特異結(jié)合對象；或者形成抗免疫球蛋白抗體-“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”-“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-第二特異結(jié)合物質(zhì)-第二特異結(jié)合對象等來測定。
任何夾層免疫測定法中，只要是通過形成含有“與含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”-“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)”的復(fù)合物進行測定的測定方法即可，利用第二特異結(jié)合制備固相、標記物等，均包含在本發(fā)明的測定方法中。
即，任何夾層免疫測定法中，夾層免疫測定系統(tǒng)的試劑盒只要含有“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”，則均包含在本發(fā)明的試劑盒中。同樣，只要包含上述a)-d)的任意抗體，則均包含在本發(fā)明的試劑盒中。(以下，“只要含有“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體””的描述也同樣)。
本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒中所使用的不溶性載體可以使用珠、膠乳顆粒、磁性顆粒、片、管或膜等。珠、板或管的材料可以使用聚苯乙烯、尼龍、玻璃、硅橡膠、不銹鋼、塑料等。膜可以使用纖維素、纖維素衍生物、硝基纖維素、多孔性合成聚合物、石墨、布、非織造布、濾紙等。關(guān)于形狀，珠、膠乳顆粒或磁性顆粒等可以使用球形。在保存時可以節(jié)約空間，因此優(yōu)選。板或管可以使用中空筒狀。它們可以對應(yīng)市售的自動測定儀器、讀板器等，因此優(yōu)選。另外，膜可以用于后述的免疫色譜法、流透法。
與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體、第二結(jié)合物質(zhì)、第二特異結(jié)合物質(zhì)或其對象、或抗免疫球蛋白抗體與不溶性載體的結(jié)合可通過熱吸附法、化學結(jié)合法等進行。
另外，對于上述物質(zhì)與不溶性載體不結(jié)合的非吸附面，優(yōu)選用不影響測定系統(tǒng)的物質(zhì)進行封閉處理。這可以提高測定系統(tǒng)的特異性或靈敏度。不影響測定系統(tǒng)的物質(zhì)有BSA、酪蛋白等蛋白質(zhì)以及吐溫20、NP-40等表面活性劑等。
本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒中使用的標記可以使用過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、氧化酶和尿酸酶等酶，吖啶酯或其衍生物、或水母發(fā)光蛋白或其變性體等化學發(fā)光物質(zhì)，F(xiàn)ITC或者銪(Eu)或釤(Sm)等鑭系等熒光物質(zhì)，染料，膠體金、著色膠乳或同位素。
利用使用過氧化物酶作為酶時，顯色底物使用3，3’，5，5’-四聯(lián)苯胺或1，2-苯二胺等；使用堿性磷酸酶時，顯色底物使用磷酸4-硝基苯酯等；使用β-D-半乳糖苷酶時，顯色底物使用2-硝基苯基·β-D-半乳糖苷等。
對與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體、第二結(jié)合物質(zhì)、第二特異結(jié)合物質(zhì)或其對象、或抗免疫球蛋白抗體進行酶標記，這可以通過戊二醛兩步交聯(lián)法、高碘酸法、馬來酰亞胺法、吡啶·二硫化物法等進行。
對于酶以外的標記，可以利用熱吸附法、化學結(jié)合法等公知的技術(shù)進行。
酶標記如果上述例舉的顯色底物，則可以使用通常的吸光度測定系統(tǒng)進行測定，靈敏度也比較高，因此優(yōu)選。
使用化學發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、著色標記或同位素作為標記時，可通過與其標記相適應(yīng)的測定儀器測定。另外，使用穴狀化合物(例如穴狀Eu3+絡(luò)合物)等熒光物質(zhì)時，可以使用XL665等別藻藍蛋白衍生物作為第二標記，測定熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
簡易的測定試劑盒、例如后述的利用免疫色譜法、流透法的試劑盒中所使用的標記優(yōu)選使用染料、膠體金或著色膠乳等可以目視觀察的標記。
本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒的特征是通過夾層免疫測定法進行測定，包含與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體。夾層免疫測定法可以利用上述公知的技術(shù)，除上述具體說明之外，如果是以夾層免疫測定法為特征的試劑盒，只要包含“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”，則均包含在本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒中，沒有特別限定。即，只要含有“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”以及夾層免疫測定法所必需的試劑即可，只要對基于該測定原理得到的測定結(jié)果沒有阻礙，則不限定其所含。
例如，作為任意的構(gòu)成要素，可以是檢體或標記抗體等的緩沖液或稀釋劑，在標記抗體中使用酶時適合酶的顯色底物(參照上述)、封閉劑、反應(yīng)中止劑或洗滌劑等。稀釋劑沒有特別限定，優(yōu)選包含檢體中所含的物質(zhì)的稀釋劑。檢體為血清、在EDTA或檸檬酸存在下采血獲得血清時，稀釋劑中優(yōu)選存在等量的EDTA或檸檬酸。例如優(yōu)選稀釋劑中含有0.2-1mg/mL的EDTA.
還可例舉標準物質(zhì)。標準物質(zhì)有“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”、“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的類似物。標準物質(zhì)特別優(yōu)選本發(fā)明的重組型可溶性CD14片段。
本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒也包含以夾層免疫測定法為測定原理、利用免疫色譜法或流透法的試劑盒。本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒也可以利用通過電化學測定標記信號的MEDIA法(日本特開平5-264552)進行的測定，通過使用微芯片的免疫測定法(バイオサイエンスとインダストリ一、第61卷、449-454頁、2003年)、時間分解熒光免疫測定法(“Analytical biochemistry”(美國)、1984年、第137卷、335-343頁)以及均相免疫測定法進行的測定。使用這些原理的測定試劑盒只要是以夾層免疫測定法測定為特征、包含“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”，則均包含在本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒中。
本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒的特征在于含有“與含有SEQID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”，可特異性測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原。本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒所使用的檢體優(yōu)選水性檢體。特別優(yōu)選血液、血清或血漿等血液成分，尿液、其它體液，細胞培養(yǎng)上清，或柱洗脫液等，可用作其中所包含的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定。但是，對于人血液成分以外的檢體、例如人尿液或其它體液，人以外其它種類的血液成分、尿液或其它體液、細胞培養(yǎng)上清或柱洗脫液等檢體，不僅可以測定“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”，還可以測定“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的類似蛋白質(zhì)、多肽等。只要包含“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”，則用于測定上述“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的類似蛋白質(zhì)、多肽等的試劑盒也包含在本發(fā)明的夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒中。
以上說明中，也可以使用“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體片段Fab、Fab’、或(Fab’)2”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體的片段Fab、Fab’、或(Fab’)2”代替“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”。
上述中，夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒的一個例子是具體給出了使用a)的“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”的例子，也可以使用b)的“以含有選自SEQ ID No.2氨基酸序列的連續(xù)8-16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體”、c)的“以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體”或d)的“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的抗體”、或這些抗體的片段Fab、Fab’、或(Fab’)2。
測定的原理的例子除了夾層免疫測定法之外，還有凝聚法、固相結(jié)合法和溶液反應(yīng)法，優(yōu)選將至少一種與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段構(gòu)成分別與含有本發(fā)明的抗體或該抗體的片段的這些方法相適應(yīng)的試劑盒。特別是不使用第二結(jié)合物質(zhì)、使用單獨的抗體構(gòu)成試劑盒時，作為與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段，優(yōu)選使用人血液中的全長可溶型CD14蛋白質(zhì)(以下稱為人高分子量CD14)或具有人CD14的N末端1位-356位氨基酸的可溶性多肽(以下稱為rsCD14(1-356))等重組型高分子量CD14基本上不結(jié)合的抗體。
凝聚法是使抗體與顆粒的表面結(jié)合，通過存在抗原，產(chǎn)生顆粒的凝聚，以該顆粒的凝聚程度為指標，對抗原進行特異性定性或定量。
本發(fā)明的凝聚法免疫測定系統(tǒng)試劑盒中，例如可通過形成“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”并使其凝聚來測定。
本發(fā)明的凝聚系免疫測定系統(tǒng)試劑盒的構(gòu)成包含本發(fā)明的抗體與其表面結(jié)合的顆粒。
顆?？梢允褂媚z乳、紅細胞(例如羊紅細胞)、明膠、微珠或碳顆粒等通常采用的顆粒。
固相結(jié)合法是通過在固相上形成抗體和抗原的復(fù)合物進行測定的方法。將含有抗原的檢體吸附在不溶性載體(即固相、以下也相同)上。接著添加標記抗體使其反應(yīng)，根據(jù)標記物，對與固相結(jié)合的復(fù)合物的量進行特異性定性或定量。
競爭法是使抗原類似物吸附于不溶性載體上，通過使標記抗體與檢體中的抗原進行競爭反應(yīng)，來測量與抗原類似物特異性結(jié)合的標記抗體的量的方法。競爭法的另一種方法是使抗體吸附在不溶性載體上，通過標記抗原類似物來競爭抗體與檢體中的抗原的反應(yīng)，測定與抗體特異性結(jié)合的標記抗原類似物的量的方法。
本發(fā)明的固相結(jié)合法免疫測定系統(tǒng)試劑盒中，通過形成“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的復(fù)合物；形成“與含有SEQ IDNo.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”-標記的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”(或其類似物)復(fù)合物；或者形成“與含有標記的SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的標記的單克隆抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”(或其類似物)復(fù)合物來測定。
關(guān)于不溶性載體、“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的類似物，標記以及吸附的試劑，如夾層免疫測定系統(tǒng)試劑盒的說明中所述。
溶液反應(yīng)法是使抗原和標記抗體在液相中反應(yīng)，然后通過使用抗體的凝聚沉淀法或物理化學方法，使抗原、抗體和抗原抗體復(fù)合物分離，對“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”進行特異性定性或定量的方法。
以上說明中，可以使用“以含有選自SEQ ID No.2氨基酸序列的連續(xù)8-16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體”、“以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體”、“以本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原作為抗原制備的抗體”或“以本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原而制備的抗體”或者“這些抗體的片段Fab、Fab’、(Fab’)2”代替“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”。
以上是根據(jù)測定原理描述本發(fā)明的測定試劑盒的例子，但本發(fā)明的試劑盒并不限于這些原理。只要是含有至少一種與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段、可直接測定檢體中含有的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”，則均包含在本發(fā)明的測定試劑盒中。關(guān)于免疫測定法的原理，可以利用公知的技術(shù)。也可參考上述“超高感度酵素免疫測定法”石川榮治著、學會出版センタ一(1993年)、“免疫測定法の新しい活用事例と診斷試薬·治療薬開発への応用”免疫測定法開發(fā)研究會、經(jīng)營教育出版、酵素免疫測定法(第3版)石川榮治等編、醫(yī)學書院(1987年)。
可通過本發(fā)明的試劑盒特異性測定的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”在敗血癥患者體內(nèi)增加。因此，測定“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”，這成為敗血癥的診斷指標，本發(fā)明的試劑盒可用于敗血癥的診斷。
“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”或“以本發(fā)明的重組型可溶性CD14片段作為抗原制備的單克隆抗體”以對該肽或“本發(fā)明的重組型可溶性CD14片段”的親和性表示時，優(yōu)選解離常數(shù)(KD)低于10-7M。更優(yōu)選為10-8M或以下，進一步優(yōu)選10-9M或以下的抗體。
在“與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”的制備中，作為抗原的肽是含有連續(xù)的8個或以上SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的氨基酸的肽，優(yōu)選連續(xù)10個或以上，更優(yōu)選連續(xù)12個或以上，特別優(yōu)選為含有連續(xù)的16個氨基酸的肽。并且，肽只要含有連續(xù)8個或以上SEQ ID No.2中的任意氨基酸殘基的氨基酸即可，對于其它的氨基酸序列沒有限定，優(yōu)選肽的全部氨基酸序列均來自SEQ ID No.2中的任意的氨基酸序列。
優(yōu)選為以含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的連續(xù)8個或以上的氨基酸的肽作為抗原制備的抗體。優(yōu)選以連續(xù)10個或以上、更優(yōu)選以連續(xù)12個或以上、特別優(yōu)選以含有連續(xù)的16個氨基酸的肽作為抗原制備的抗體。
在“以含有選自SEQ ID No.2氨基酸序列的連續(xù)8-16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體”的制備中，作為抗原的肽只要是含有選自SEQ ID No.2氨基酸序列的連續(xù)8-16個氨基酸殘基的肽即可，對氨基酸殘基數(shù)沒有特別限定。優(yōu)選以連續(xù)的10個或以上、更優(yōu)選以連續(xù)12個或以上、特別優(yōu)選以含有連續(xù)的16個氨基酸的肽作為抗原制備的抗體。即，“以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體”。
“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”與高分子量CD14的分子量不同，氨基酸序列比高分子量CD14的短。因此，血液中的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的結(jié)構(gòu)與高分子量CD14不同，對抗體的反應(yīng)性也不同，可以認為本發(fā)明第五方案的測定試劑盒中所包含的與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”特異性結(jié)合的抗體的優(yōu)選例子——上述a)-d)的抗體(以下簡稱為“上述a)-d)的抗體”)與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”強力結(jié)合，即親和性高。
上述a)-d)的抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。本發(fā)明的抗體的來源動物種沒有特別限定。從容易制作抗體的角度考慮，優(yōu)選兔、山羊等。對于分子種類也沒有特別限定?？梢允侨魏畏诸悶轭?、亞類或亞型的免疫球蛋白。
作為免疫原的肽的制備方法可以有通常采用的使用肽合成儀(ペプチドシンセサイザ一433A型、パ一キン一エルマ一ジヤパン制造)等的方法、基因重組法(東京大學醫(yī)科學研究所制癌研究部編、新細胞工學プロトコ一ル、秀潤社)等。
例如，含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的連續(xù)8個或以上氨基酸的肽可以使用433A型肽合成儀，通過Fmoc法合成，然后進行TFA的脫保護，從樹脂上切取，然后使用C18 HPLC柱(Capcell-pak、資生堂)進行純化，制備目標肽。
抗原為蛋白質(zhì)時，可以直接作為免疫原，但為8-30個氨基酸殘基或以下的肽時，由于分子量小，可能不具有通常的免疫原性。此時，可以使其與載體結(jié)合，或者使用多抗原肽(MAP)法，制備MAP肽，使其具有可產(chǎn)生免疫原性的分子量，作為免疫原使用。
與上述肽結(jié)合的載體有載體蛋白、聚合物。載體蛋白有牛血清白蛋白、匙孔血藍蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白或卵清蛋白等不同種白蛋白。這些載體蛋白可以利用肽或載體蛋白的氨基酸中所含的支鏈的官能團，或者導(dǎo)入馬來酰亞胺基、N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)或醛基，與上述肽結(jié)合。聚合物有甘露聚糖或殼聚糖等糖類、聚乙烯吡咯烷酮(PVA)。這些聚合物可通過吸附或上述化學結(jié)合與上述肽結(jié)合。
作為抗原的本發(fā)明的重組型可溶性CD14片段的制備方法如本發(fā)明第二方案和第三方案的說明所述。以該片段作為抗原時，可以直接作為免疫原使用，也可以與上述同樣地，使其與載體等結(jié)合，制成免疫原。
本發(fā)明的抗體可采用公知技術(shù)進行制備(例如參照免疫實驗操作法、日本免疫學會編、日本免疫學會發(fā)行)。例如，多克隆抗體可按照下述方法制備。
將20-1000μg上述制備的免疫原與氟氏完全佐劑、RIBI佐劑、ALUM等佐劑混合，免疫各種動物。各種動物可以使用馬、羊、山羊、豬、兔、大鼠、小鼠等。免疫方法可以采用肌內(nèi)給予、皮內(nèi)給予、皮下給予、腹腔內(nèi)給予、淋巴結(jié)給予等方法，初次給予后間隔1-4周，可將與氟氏不完全佐劑、RIBI佐劑、ALUM等佐劑混合的免疫原同樣地給予，或者將免疫原直接給予靜脈內(nèi)，由此進行追加免疫?？寡蹇赏ㄟ^通常的采血方法例如頸動脈、耳靜脈、心臟、爪的靜脈等由免疫動物中采集血液，通過離心等分離血清來制備。所得抗血清可通過添加硫酸銨、硫酸鈉等的鹽析法，使γ球蛋白組分沉淀，用適當?shù)木彌_液透析，然后采用可特異性的純化蛋白A、蛋白G等γ球蛋白的親和基質(zhì)(affinity matrix)法制備與目標肽相對應(yīng)的IgG組分的純化多克隆抗體。還可通過選擇與上述抗原特異性結(jié)合的抗體進行特異性純化。
單克隆抗體可通過下述方法制備。
使被免疫的哺乳動物的免疫細胞與骨髓瘤細胞融合，制備雜交瘤，然后從該雜交瘤中選擇生成抗體的克隆，從而可以制備本發(fā)明的抗體。其中所述抗體是與上述肽特異性結(jié)合的抗體。優(yōu)選以含有53位-68位氨基酸殘基的連續(xù)10個或以上的肽作為免疫原。更優(yōu)選以含有連續(xù)12個或以上、特別優(yōu)選連續(xù)16個或以上氨基酸的肽作為免疫原。
被免疫的哺乳動物沒有特別限定，優(yōu)選考慮與細胞融合中所使用的骨髓瘤細胞的適應(yīng)性進行選擇，優(yōu)選小鼠、大鼠或倉鼠等。骨髓瘤細胞可以使用各種公知的細胞。其中包含P3、P3U1、SP2/O、NS-1、YB2/0和Y3-Ag1、2、3等骨髓瘤細胞。
免疫可通過公知的方法進行。例如可以將抗原給予腹腔內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或爪墊進行。該抗原的給予可以結(jié)合佐劑使用，優(yōu)選多次給予。免疫細胞優(yōu)選是在最終給予抗原的數(shù)天后，例如3天后，來自摘除的脾細胞或淋巴結(jié)的細胞。免疫細胞與骨髓瘤細胞的融合可采用Milstein等方法(Methods in Enzymol.，73卷3頁)等公知的方法進行。例如有使用聚乙二醇(PEG)作為融合劑的方法或電融合法等。
免疫細胞與骨髓瘤細胞的混合比只要是它們可以融合的比例即可，沒有特別限定，優(yōu)選相對于免疫細胞，使用1/10量至等量的骨髓瘤細胞。在使用PEG(平均分子量為1,000-4,000)進行細胞融合的方法中，對于PEG濃度沒有特別限定，但優(yōu)選以50％進行。另外，可以添加二甲基亞砜(DMSO)等助劑作為融合效率促進劑。融合可通過將加熱至37℃的PEG溶液添加到混合的細胞中開始，反應(yīng)1-5分鐘后，通過添加培養(yǎng)基使其結(jié)束。通過該融合形成的雜交瘤可以在含有次黃嘌呤、胸苷、氨基蝶呤的培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)等選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-7天，與未融合的細胞分離。
還可以通過所生成的抗體進一步選擇所得雜交瘤。將選擇的雜交瘤按照公知的有限稀釋法進行單一克隆，構(gòu)建單一克隆性抗體生成雜交瘤。檢測雜交瘤所產(chǎn)生的抗體的活性的方法可使用公知的方法。例如有ELISA法、凝聚反應(yīng)法、放射免疫測定法。將構(gòu)建的雜交瘤通過公知的方法培養(yǎng)，可以由該培養(yǎng)上清獲得單克隆抗體。還可以通過將雜交瘤給予與其具有適合性的哺乳動物進行增殖，由其腹水獲得。抗體的純化可以使用鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法或親和層析法等公知的純化手段進行。
如本發(fā)明第四方案的診斷方法所述，可以推定受到本發(fā)明的可溶性CD14抗原和高分子量CD14的穩(wěn)定性的影響，測定值會發(fā)生變化。為提高試劑盒的性能，更優(yōu)選使用與可溶性CD14抗原的特異性高、與保存中發(fā)生變化并使測定值發(fā)生變動的原因物質(zhì)的反應(yīng)性低的抗體?？珊Y選得到用于構(gòu)成不發(fā)生所述變化的試劑盒的抗體。
本發(fā)明的第六方案是上述“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的免疫學測定方法，其特征在于使至少一種與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段與上述“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”特異性結(jié)合。
本發(fā)明第六方案的測定方法是“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的免疫學測定方法，該方法是為了不檢測人高分子量CD14，而測定“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”，使用至少一種與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”特異性結(jié)合的抗體，直接測定檢體中所含的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”。該測定方法的優(yōu)選方案的特征是使用以下a)-d)的任意抗體或該抗體的片段a)與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體，b)以含有選自SEQ ID No.2氨基酸序列的連續(xù)8-16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，或者c)以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，或者d)與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段或本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體。
更優(yōu)選的測定方法的特征是使用上述a)、c)或d)的抗體或該抗體的片段。進一步優(yōu)選含有d)的抗體或該抗體片段的測定試劑盒。以上說明中，抗體的片段是指該單克隆抗體的Fab、Fab’或F(ab’)2。
還優(yōu)選下述“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的測定方法使用與“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)，通過上述a)-d)中任意的抗體或該抗體的片段與該第二結(jié)合物質(zhì)的夾層免疫測定法，測定“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”。
可以將上述a)-d)中任意的抗體作為固相抗體或標記抗體等使用。另外，也包含利用第二特異結(jié)合、抗免疫球蛋白抗體的測定方法。這種情況下，上述a)-d)中任意的抗體可作為游離抗體、第二特異結(jié)合物質(zhì)或與第二特異結(jié)合對象結(jié)合的抗體等使用。
本發(fā)明的測定方法可以是夾層免疫測定法的非競爭法或競爭法，另外，也包含通過免疫色譜法或流透法進行的測定。
本發(fā)明的測定方法的原理并不限于夾層免疫測定法，其它例子有凝聚法、固相結(jié)合法和溶液反應(yīng)法等。
詳細的測定方法的優(yōu)選例子如本發(fā)明第五方案的試劑盒所述。
本發(fā)明第七方案是與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體。其中也包含本中請優(yōu)先權(quán)主張日之后公布的國際公開WO2004/44005號的實施例中所記載的下述a)-d)的抗體，它們有一部分重復(fù)。因此，與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體可以包含下述a)-d)抗體的一部分。為了明確區(qū)別本發(fā)明第二方案的抗體和下述a)-d)的抗體，可以從本發(fā)明第二方案的抗體中除掉下述a)-d)的抗體。
a)以含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，b)以含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸殘基的肽作為抗原制備的多克隆抗體，c)F1031-8-3抗體，以及d)F1106-13-3抗體。
國際公開WO2004/44005號中對與含有SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸殘基的肽結(jié)合的抗體，以含有選自SEQ ID No.6氨基酸序列的連續(xù)8-30個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體進行了說明，與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體可以包含這些抗體的一部分，為了明確區(qū)分，可以從與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體中除掉這些抗體。
本發(fā)明第七方案的“與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合的抗體”優(yōu)選基本上不與人血液中的全長可溶型CD14蛋白質(zhì)或rsCD14(1-356)結(jié)合，而與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體。還優(yōu)選為單克隆抗體的抗體。
本發(fā)明的抗體以本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原作為抗原進行制備。
可以使用本發(fā)明第七方案的抗體測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原，可以構(gòu)成本發(fā)明第五方案的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定試劑盒”。
本發(fā)明第八方案是與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體。也包含本申請優(yōu)先權(quán)主張日后公布的國際公開WO2004/44005號的實施例中記載的下述a)-d)的抗體，一部分重復(fù)。因此，與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體可以含有下述a)-d)抗體的一部分。為了明確區(qū)分本發(fā)明第二方案的抗體和下述a)-d)的抗體，可以從本發(fā)明第二方案的抗體中除掉下述a)-d)的抗體。
a)以含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，b)以含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸殘基的肽作為抗原制備的多克隆抗體，c)F1031-8-3抗體，以及d)F1106-13-3抗體。
國際公開WO2004/44005號中對與含有SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸殘基的肽結(jié)合的抗體，以含有選自SEQ ID No.6氨基酸序列的連續(xù)8-30個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體進行了說明，與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體也可包含這些抗體的一部分，但為了明確區(qū)分，可以從與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體中除掉這些抗體。
本發(fā)明第八方案的“與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體”優(yōu)選為基本上不與人血液中的全長可溶型CD14蛋白質(zhì)或rsCD14(1-356)結(jié)合、而與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體。還優(yōu)選該抗體為多克隆抗體。
本發(fā)明的抗體可以以本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原進行制備。
特別優(yōu)選的抗體是F1237-3-4抗體。生產(chǎn)F1237-3-4抗體的雜交瘤于2005年4月27日國際保藏于日本國茨城縣筑波市東1-1-1中央第6獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(保藏號FERMABP-10330)。
使用本發(fā)明第八方案的抗體，可以測定本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原，也可以構(gòu)成本發(fā)明第五方案的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定試劑盒”。
本發(fā)明第五方案的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定試劑盒”不測定高分子量CD14。因此這成為優(yōu)選實質(zhì)不與人血液中的全長可溶型CD14蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體的理由。用于測定試劑盒，因此單克隆抗體成為優(yōu)選的理由。并且，實質(zhì)不與人血液中的全長可溶型CD14蛋白質(zhì)或rsCD14(1-356)結(jié)合的抗體可以不采用夾層免疫測定法，不使用第二結(jié)合物質(zhì)，可以使用單獨的抗體。
如上所述，國際公開WO2004/44005號中對與含有SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5氨基酸殘基的肽結(jié)合的抗體，以含有選自SEQ ID No.6氨基酸序列的連續(xù)8-30個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，以及抗CD14抗體F1031-8-3抗體和F1106-13-3抗體進行了說明。其有用性可以應(yīng)用于對敗血癥的診斷有效的低分子量CD14測定試劑盒中。不過，這并不能證明國際公開WO2004/44005號中的抗體與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原有直接關(guān)系，只是涉及在以該肽或CD14作為抗原制備時，可用作對敗血癥的診斷有效的低分子量CD14測定試劑盒的發(fā)明。
另一方面，本發(fā)明的抗體可以應(yīng)用在本發(fā)明第五方案的“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定試劑盒”中?！氨景l(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段”與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的免疫學性質(zhì)類似，如果不是與該片段結(jié)合的抗體(即本發(fā)明的抗體)，則無法應(yīng)用在“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的測定試劑盒中。
目前在公知的抗體中，可以應(yīng)用于“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的測定試劑盒中的抗體只有國際公開WO2004/44005號中記載的上述抗體，另外，與“本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段”結(jié)合的抗體也只有上述抗體，已經(jīng)明確各種抗CD14抗體不與“本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段”結(jié)合。
即，本發(fā)明的抗體是概括性地發(fā)明了可應(yīng)用于“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定試劑盒”中的抗體并予以公布。并且，以“本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段”作為抗原制備的抗體與“發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”的免疫學反應(yīng)性高，特別有用。
本發(fā)明第九方案是與本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明第九方案的抗體可以以本發(fā)明第三方案的重組型可溶性CD14片段作為抗原進行制備。
本發(fā)明第九方案的抗體的優(yōu)選例子與本發(fā)明第八方案所述相同，其有用性、其它描述均相同。
本發(fā)明第十方案為可用于本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原測定的抗體的篩選方法，該方法包含下述步驟
1)制備與含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個任意個數(shù)的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體的步驟，2)制備含有CD14的測定對象液的步驟，3)使用1)中制備的抗體或2)中制備的測定對象液，構(gòu)成免疫測定系統(tǒng)的步驟，4)通過3)中構(gòu)成的免疫測定系統(tǒng)，測定與測定對象液中的1)中所制備的抗體特異性結(jié)合的物質(zhì)的步驟，以及5)通過4)所得的測定結(jié)果，對可用作本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原測定的抗體進行評價、選擇的步驟。
本發(fā)明第十方案的篩選方法是抗體的篩選方法，該抗體可用作本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定，所述抗原可作為敗血癥診斷的標志。即，是對可用作本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的抗體進行選別的方法，所述抗原可作為敗血癥診斷的標志。還是選別可用于本發(fā)明第五方案的試劑盒的抗體的方法。
本發(fā)明第十方案的篩選方法的特征在于以上述1)步驟中制備的“與含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個任意個數(shù)的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”作為篩選對象檢體。要制備的篩選對象檢體只要是“與含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個任意個數(shù)的氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”即可，沒有特別限定。另外，只要具有與抗原之間產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)的功能即可，也可以將該抗體片段作為篩選對象檢體。(以下關(guān)于抗體的說明也包含關(guān)于抗體片段的說明)2)的測定對象液只要是含有CD14的液體即可，沒有特別限定，優(yōu)選至少含有高分子量CD14的液體。
3)中構(gòu)成的免疫測定系統(tǒng)只要是可以測定作為篩選對象檢體的抗體是否與測定對象液中所含的CD14特異性反應(yīng)即可。例如有抗原固相法、夾層法或生物體分子間相互作用分析法等。也可以是本發(fā)明第五方案或第六方案中所說明的免疫學測定法的任何系統(tǒng)，對此并沒有特別限定。
4)的步驟只要是按照3)的步驟中構(gòu)成的免疫測定方法，以測定對象液為對象，測定與1)中制備的抗體特異性結(jié)合的物質(zhì)即可。
5)的步驟是通過4)的步驟測定的結(jié)果，評價作為篩選對象檢體的抗體是否可用于在對敗血癥的診斷有用的免疫測定法中應(yīng)用，如果有用則選擇該抗體的步驟。并沒有特別限定指標。
如上所述，本發(fā)明第六方案的篩選方法具有如下特征以上述1)步驟中制備的“與含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”作為篩選對象檢體，對于其它步驟則沒有特別的限定。
上述1)步驟中制備的抗體優(yōu)選為以下抗體與下述的肽特異性結(jié)合的抗體，該肽含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中N末端1位-314位的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基；以含有選自SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列的連續(xù)8-30個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體；或者以下述肽作為抗原制備的抗體，該肽含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中N末端1位-314位的氨基酸序列的連續(xù)8-30個氨基酸殘基。
上述1)步驟中，可以制備并使用下述<1>-<4>的抗體代替“與含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合的抗體”。<1>根據(jù)CD14全長序列，按照常規(guī)方法合成肽，制備免疫抗原，制備抗體。<2>將血清中的純化可溶性CD14進行純化，以其作為免疫原制備抗體。<3>使用COS細胞或大腸肝菌，制備重組CD14蛋白質(zhì)，以其作為免疫原制備抗體。<4>將制備的各種CD14抗原通過熱變性或DNP化等處理，以其作為免疫原制備抗體。
以下進一步說明本發(fā)明3)中構(gòu)成的免疫測定法為抗原固相法時的例子。
這種情況下，需要進一步制備上述1)步驟中制備的抗體的標記抗體，例如標記抗免疫球蛋白抗體。
上述2)步驟中，優(yōu)選所制備的測定對象液的檢體為正常人的體液或人高分子量CD14的標準品。人高分子量CD14的標準品例如可以制備正常人的體液中3C10抗體親和柱吸附組分等。
還可以在不溶性載體上例如形成“測定對象液中的高分子量CD14”-“1)步驟中制備的抗體”-“標記抗免疫球蛋白抗體”的復(fù)合物，由此構(gòu)成免疫測定系統(tǒng)，通過標記測定“1)步驟中制備的抗體”與“測定對象液中的高分子量CD14”的特異結(jié)合性。例如，在3)的步驟中，使測定對象液與不溶性載體結(jié)合進行構(gòu)成，在4)的步驟中，可使1)中制備的抗體和上述“標記抗免疫球蛋白抗體”依次與在3)中構(gòu)成的斑點印跡法系統(tǒng)反應(yīng)。然后通過標記的強度，測定上述復(fù)合物的形成比例，即測定與對象液與1)中制備的抗體特異性結(jié)合的物質(zhì)。
5)的步驟中，例如，標記強度弱或不顯示強度的1)中制備的抗體被評價為與正常人的體液或人高分子量CD14標準品中的高分子量CD14特異性結(jié)合性弱或沒有，可以選擇作為敗血癥診斷有用的免疫測定法中使用的抗體。例如，在使用可評價為與血液中的高分子量CD14特異性結(jié)合性強的抗體，測定與人體液中的該抗體特異性結(jié)合的物質(zhì)時，所測定的主要蛋白質(zhì)是高分子量CD14。這種情況下，在測定比高分子量CD14更微量的蛋白質(zhì)——本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原時，可以選擇不與高分子量CD14特異性結(jié)合的抗體。
抗原固相法中，如果用酶標記，則形成抗原固相EIA法；如果上述不溶性載體使用膜時，則形成斑點印跡法。
下面進一步對本發(fā)明的在3)中構(gòu)成的免疫測定法為夾層測定法時的例子進行說明。
關(guān)于夾層免疫測定法的說明如本發(fā)明第五方案的試劑盒或本發(fā)明第五測定法所述。
這種情況下，還要制備另外一種抗體或抗CD14抗體(可稱為第二抗體)，所述抗體或抗CD14抗體與含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基的肽特異性結(jié)合。
上述2)步驟中制備的測定對象液優(yōu)選正常人的體液或敗血癥患者的體液。其中，更優(yōu)選兩種體液的來源相同。即，更優(yōu)選例如都為正常人的血液樣本和敗血癥患者的血液樣本、或者是正常人的尿液樣本或敗血癥患者的尿液樣本等，使其兩種體液的來源相同，進一步優(yōu)選為血液樣本。特別優(yōu)選血清。
然后，在不溶性載體上形成例如“1)的步驟中制備的抗體”-“本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原”-“第二抗體”的復(fù)合物，由此構(gòu)成夾層免疫系統(tǒng)。
例如在3)的步驟中，使“1)的步驟中制備的抗體”或“第二抗體”其中之一與不溶性載體結(jié)合，對另一方進行標記，構(gòu)成夾層免疫系統(tǒng)。
在4)的步驟中，使測定對象液、標記的抗體依次與3)中構(gòu)成的夾層免疫系統(tǒng)反應(yīng)，進行測定。
5)的步驟中，將正常人體液的測定結(jié)果和敗血癥患者體液的測定結(jié)果進行比較，根據(jù)所比較的測定結(jié)果的不同，評價可用作對敗血癥的診斷有用的本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原測定的抗體，并選擇。
3)中構(gòu)成的免疫測定法為夾層測定法時，所選擇的抗體優(yōu)選選擇1)中制備的抗體和“第二抗體”的抗體組合。即，優(yōu)選為對用于測定可作為敗血癥診斷的標志的血液蛋白質(zhì)的抗體、可用作對敗血癥的診斷有用的夾層免疫測定法中使用的抗體的組合進行篩選的方法。
本發(fā)明的篩選方法中所使用的抗體的制備可按照本發(fā)明第五方案的測定試劑盒的說明進行。材料等的說明也按照該說明進行。
生物體分子間相互作用分析法并沒有特別限定，其例子有表面等離子體共振法。例如可使用Biacore裝置(Biacore制造)進行。
本發(fā)明第十一方案是可用作本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原測定的抗體的篩選方法，該方法包含下述步驟1)制備作為篩選對象檢體的抗體的步驟，2)制備本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段的步驟，3)使1)中制備的抗體與2)中制備的片段進行反應(yīng)，對1)中制備的抗體與2)中制備的片段的特異性結(jié)合進行評價的步驟，以及4)在3)中，選擇與2)中制備的片段特異性結(jié)合的抗體作為可用于本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原測定的抗體。
本發(fā)明第十一方案的篩選方法是抗體的篩選方法，該抗體可用作本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的測定，所述抗原可作為敗血癥診斷的標志。即，是對可用作本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原的抗體進行選別的方法，所述抗原可作為敗血癥診斷的標志。還是選別可用于本發(fā)明第五方案的試劑盒的抗體的方法。
本發(fā)明第十一方案的篩選方法的特征在于使作為篩選對象檢體的抗體與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段反應(yīng)，評價兩者是否特異性結(jié)合、即，是否顯示抗原抗體反應(yīng)。本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段如本發(fā)明第二方案的說明所述，不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合，而與以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合。與本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原具有相同的免疫學性質(zhì)。由此，對作為篩選對象檢體的抗體與本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段的反應(yīng)進行評價，這可以選別可用作本發(fā)明第一方案的可溶性CD14抗原測定的抗體。
在1)的步驟中，所制備的篩選對象檢體只要是抗體即可，沒有特別限定。只要具有與抗原之間發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的功能即可，也可以將抗體的片段作為篩選對象檢體。(以下關(guān)于抗體的說明也包括關(guān)于抗體片段的說明)為了提高篩選效率，特別優(yōu)選制備“與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體，該蛋白質(zhì)含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-356個任意個數(shù)的氨基酸殘基”作為篩選對象檢體。更優(yōu)選制備“與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體，該蛋白質(zhì)含有選自SEQ ID No.3的53位-68位的連續(xù)至少7個氨基酸殘基”。
在2)的步驟中，所制備的本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段只要是本發(fā)明第二方案的說明中所描述的重組型可溶性CD14片段即可，沒有特別限定。
3)的步驟中，對于使1)中制備的抗體與2)中制備的片段反應(yīng)，對1)中制備的抗體和2)中制備的片段的特異性結(jié)合進行評價的方法，只要是可以評價兩者是否特異性結(jié)合、即是否發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的方法即可，沒有特別限定。其例子有抗原固相法、夾層測定法、或生物體分子間相互作用分析法。關(guān)于這些方法，如本發(fā)明第十方案的說明所述。如果可通過使用第二抗體的夾層免疫測定法評價其特異性結(jié)合，則可以對夾層測定法中的抗體的組合進行評價。
本發(fā)明的第十二方案是具有下述5)-7)序列的本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段的生產(chǎn)方法5)為具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者為在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，6)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，以及7)C末端為SEQ ID No.3的59位-70位其中之一；該方法包含下述<1>-<3>的步驟<1>制備具有下述1)-4)序列的重組型可溶性CD14片段的步驟1)為具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者為在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段、
2)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一、3)C末端為SEQ ID No.3的134位-356位其中之一、4)在SEQ ID No.3的59位-70位的后面被取代或插入了規(guī)定的蛋白質(zhì)分解酶的切斷部位序列，<2>將1中制備的重組型可溶性CD14片段用該規(guī)定的蛋白質(zhì)分解酶切斷的步驟，以及<3>將在<2>中切斷的片段的N末端一側(cè)的片段回收的步驟。
根據(jù)本發(fā)明第十二方案的“本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段的生產(chǎn)方法”，可以生產(chǎn)具有規(guī)定的氨基酸序列的本發(fā)明第二方案的重組型可溶性CD14片段。詳細的生產(chǎn)方法如本發(fā)明第二方案的說明所述。
例如規(guī)定的蛋白質(zhì)分解酶為ProScission Protease時，<1>步驟的4)中，切斷部位的序列為Leu、Glu、Val、Leu、Phe、Gln、Gly、Pro。
規(guī)定的蛋白質(zhì)分解酶為凝血酶時，<1>步驟的4)中，切斷部位的序列為Leu、Val、Pro、Arg、Gly、Ser。
實施例以下，根據(jù)實施例進一步具體說明本發(fā)明，但這些實施例只是例舉，本發(fā)明并不受其任何限定。以下描述中所使用的簡略符號均依據(jù)本領(lǐng)域常用的簡略符號。
以下實施例中使用的正常人血清和敗血癥患者血清購自ProMedDx公司、Samplex公司和Sera Care Life Science公司。
(實施例1)以合成肽作為抗原的多克隆抗體的制備1-(1)作為抗原的肽的制備為了將具有SEQ ID No.2的序列(相當于SEQ ID No.3的53位-68位的序列)的肽(以下稱為S68肽)在N末端經(jīng)由SH基團與載體蛋白結(jié)合，向N末端插入半胱氨酸。即，使用肽合成儀ABI433A(Applied)，根據(jù)氨基酸序列排列氨基酸柱，在N末端設(shè)置半胱氨酸的氨基酸柱，進行自動合成。合成的肽按照規(guī)定方法由樹脂中切取，用乙醚沉淀并回收，然后再次用蒸餾水溶解，冷凍干燥。將所得粗純化肽溶解，用C18反相HPLC(CAPCELL-PAK、資生堂)、以5-70％乙腈濃度的線性梯度洗脫，回收含有目標肽的組分。將回收的組分冷凍干燥，得到2-3mg純化肽。
1-(2)使用合成肽制備肽載體抗原將1-(1)中制備的肽用蒸餾水溶解為10mg/mL，與10mg/mL的馬來酰亞胺化匙孔血藍蛋白(KLH)(PIERCE)等量混合。在室溫下反應(yīng)2小時，然后用生理鹽水平衡NAP-10柱(Amersham Bioscience)，用該柱進行脫鹽，得到1mg S68肽載體抗原(以下稱為S68肽-KLH)。以下實施例中所述蛋白質(zhì)濃度是將所使用的KLH量除以溶液總量所得數(shù)值。
1-(3)以合肽作為抗原制備多克隆抗體為了制備1-(2)中制備的S68肽-KLH的多克隆抗體，使用S68肽-KLH對兔進行免疫。即，將各100μg S68肽-KLH用500μL生理鹽水稀釋，與500μL的氟氏完全佐劑(DIFCO)等量混合，然后給予2.1-2.2kg雌性新西蘭白兔(北山ラベス)的背部皮下。2周后，將各100μg S68肽-KLH用500μL生理鹽水稀釋，與500μL氟氏不完全佐劑(DIFCO)等量混合，給予背部皮下。再過2周后，將100μg S68肽-KLH用1mL生理鹽水稀釋，給予耳靜脈內(nèi)。
給予結(jié)束1周后，由耳靜脈采血，按照規(guī)定方法分離抗血清，純化抗體。首先向抗血清中添加硫酸銨，使最終飽和濃度為33％，在4℃攪拌1小時，然后將析出的沉淀離心。接著將沉淀用76mM磷酸緩沖液(以下稱為PBS(pH6.4))溶解，透析過夜。將透析液過濾，然后過蛋白A柱(Procep-A Millipore)，用0.1M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH 3.0)洗脫所結(jié)合的IgG組分，得到純化抗體。用PBS(pH 6.4)透析，然后由280nm的吸光度計算蛋白濃度(換算值0.533mg/mL)。以下，將所得抗體稱為S68肽多克隆抗體。
1-(4)特異性純化多克隆抗體的制備為了從S68肽多克隆抗體中只純化S68肽的抗體，按照以下方法進行特異性純化。首先，為了經(jīng)由SH基團使插入了半胱氨酸的S68肽(以下稱為C-S68肽)與載體結(jié)合，按照說明書，將1mL SulfoLinkCoupling Gel(PIERCE)與200μg C-S68肽混合，反應(yīng)。反應(yīng)終止后，將殘余的活性基團封閉，制備結(jié)合有S68肽的親和柱。接著，將7.92mg1-(3)的純化IgG組分過柱，用磷酸緩沖液(pH 7.4)(Dulbecco、以下稱為D-PBS(pH7.4))洗滌柱，接著，用0.1M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH 3.0)洗脫所結(jié)合的抗S68肽抗體。洗脫后將pH值恢復(fù)為中性，用PBS透析，由280nm的吸光度計算蛋白質(zhì)的濃度(換算值0.533mg/mL)，得到0.52mg抗S68肽抗體(以下稱為S68抗體)。
(實施例2)以合成肽作為抗原的單克隆抗體的制備將20μg實施例1-(2)中制備的S68肽-KLH溶解于100μL生理鹽水中，與氟氏完全佐劑(DIFCO)等量混合，分別對8周齡雌性Wistar大鼠的各后爪墊給予100μL。2周后摘除髂骨淋巴結(jié)，進行細胞融合。細胞融合按照安東民衛(wèi)、千葉丈著“單克隆抗體實驗操作入門”83頁、1991年(講談社)進行。即，使用細胞篩網(wǎng)(Falcon)，由淋巴結(jié)中分離淋巴細胞，以5∶1與骨髓瘤細胞(Sp2/0-Ag14)混合，使用聚乙二醇進行細胞融合。將融合的細胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，選別雜交瘤，然后對生產(chǎn)目標抗體的雜交瘤進行篩選。
篩選采用將rsCD14(1-307)S286C直接固相化于板上的ELISA法。即，用0.1M磷酸緩沖液(pH 7.4)將rsCD14(1-307)S286C稀釋為1μg/mL，向免疫板(Maxisorb、NUNC)的各孔中添加50μL，在37℃靜置1小時。接著將板用離子交換水洗滌5次，向各孔中添加100μL含有0.1％BSA的PBS(pH6.4)，在室溫下靜置1小時進行封閉。向各孔中添加從所得雜交瘤中采集的培養(yǎng)上清，在37℃反應(yīng)1小時，然后用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌3次。
接著，將過氧化物酶標記抗大鼠免疫球蛋白抗體(DAKO)用含有10％兔血清的PBS稀釋為1000倍，將該溶液以50μL添加到各孔中。在37℃反應(yīng)1小時，然后同樣洗滌5次，將四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB、BioFix)添加到各孔中。在室溫下反應(yīng)10分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)。用讀板儀(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)測定450nm下的吸光度，選擇含有產(chǎn)生與rsCD14(1-307)S286C結(jié)合的抗體雜交瘤的孔。
接著，按照安東民衛(wèi)、千葉丈著“單克隆抗體實驗操作入門”83頁、1991年(講談社)，通過有限稀釋法，由所選擇的孔進行克隆。10天后，以對rsCD14(1-307)S286C的反應(yīng)性為指標同樣地進行篩選，選擇了6種雜交瘤。將所選擇的雜交瘤在10％FCS/RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma制備)中培養(yǎng)，然后用雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen制備)培養(yǎng)，使其產(chǎn)生抗體，用蛋白G柱(Prosep-G)純化抗體。用大鼠分型試劑盒(ZYMED)確定所純化的F1146-17-2抗體的亞型，亞型為大鼠IgG2b·κ。
rsCD14(1-307)S286C是采用WO01/72993號實施例9中記載的方法制備的。
(實施例3)對夾層EIA法測定系統(tǒng)的研究使用實施例1和實施例2的抗體，研究夾層EIA法的測定系統(tǒng)。
3-(1)重組人CD14的制備首先，為了制備夾層ELISA法中作為第二抗體的rsCD14(1-285)的單克隆抗體，在大腸肝菌中制備其免疫原rsCD14(1-285)。為了使rsCD14(1-285)在大腸肝菌中表達，按照以下方法構(gòu)建表達質(zhì)粒pTrp1659。
首先，合成寡聚體8，linkS(5’-agc tta gga att t-3’)(SEQ ID No.7)和寡聚體8，linkA(5’-cta gaa att cct a-3’)(SEQ ID No.8)。
將這些寡聚體等量混合，在99℃加熱1分鐘，然后緩慢冷卻至室溫，進行退火。再通過T4多核苷酸激酶，使5末端磷酸化，制備接頭。
接著，合成有義引物A(5’-aca tct aga tga cca cgc cag aac ct-3’)(SEQ ID No.9)和反義引物(5’-ttt gga tcc tta cta gag atc gag cac tct-3’)A(SEQ ID No.10)，以WO01/72993號公報實施例8中的質(zhì)粒pM1659為模板，使用Pyrodest DNA聚合酶進行PCR。
將反應(yīng)液在90℃加熱2分鐘，然后將98℃10秒、55℃30秒、72℃1分鐘的循環(huán)重復(fù)進行30次。
將所得約900bp的擴增產(chǎn)物用XbaI和BamHI進行雙消化，回收DNA片段。將日本特開平06-025289號公報中實施例10的載體pM710用HindIII和BamHI進行雙消化，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，并回收。將上述磷酸化接頭、PCR擴增DNA片段/XbaI+BamHI消化片段以及載體/HindIII+BamHI片段進行三元連接(tree-way ligation)，然后轉(zhuǎn)化大腸肝菌感受態(tài)細胞(JM109(TOYOBO))，得到含有目標質(zhì)粒的克隆。通過規(guī)定方法制備質(zhì)粒DNA。
接著，通過電穿孔法制備用于生產(chǎn)rsCD14(1-285)的JE7924轉(zhuǎn)化株。
首先，將大腸桿菌JE7924(J.Bacteriol 173，4799頁(1991))從甘油儲液中恢復(fù)，在LB培養(yǎng)基、37℃培養(yǎng)過夜。接種于50mL的LB培養(yǎng)基中，持續(xù)培養(yǎng)至600nm的吸光度為0.5-0.6，然后將培養(yǎng)瓶進行30分鐘的冰冷卻。接著收集大腸肝菌，用冰冷卻的無菌蒸餾水洗滌2次，用冰冷卻的10％甘油溶液洗滌一次，然后懸浮于100μL冰冷卻的10％甘油溶液中。各以50μL分注到兩支試管中，在液氮下驟冷，制備感受態(tài)細胞(JE7924)，使用之前一直保持在-80℃。
接著，用電穿孔法向50μL JE7924感受態(tài)細胞中導(dǎo)入約30ngpTrp1659。儀器使用BIO-RAD公司的Gene Pulser。此時的設(shè)定如下電壓2.5kV、電阻200Ω、電容25μF。然后，在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜，得到導(dǎo)入了pTrp1659的轉(zhuǎn)化細胞株。將該克隆在LB培養(yǎng)基中、37℃培養(yǎng)過夜。然后接種于新的培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)5小時。確認600nm下的吸光度為2-3，添加3β-吲哚丙烯酸(Sigma制備)，使終濃度為100μg/mL的濃度，在37℃培養(yǎng)4小時，使rsCD14(1-285)誘導(dǎo)表達。接著，回收大腸肝菌，使用Bug Buster蛋白質(zhì)提取試劑(Novagen制備)制備包含體。然后用SDS-PAGE緩沖液溶解，進行SDS-PAGE，通過抗CD14抗體的蛋白質(zhì)印跡測定，確認了rsCD14(1-285)的表達。
用作免疫原的rsCD14(1-285)同樣是將JE7924轉(zhuǎn)化細胞株在1L的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)制備。首先將培養(yǎng)液離心，收集大腸肝菌，然后將菌體用D-PBS洗滌，向收集的菌體中加入50mL Bug Buster蛋白質(zhì)提取試劑(Novagen制備、以下稱為BugBuster)，使其懸浮，在室溫下放置30分鐘。菌體溶解后，進行10分鐘的超聲處理(US-3、井內(nèi)盛榮堂)，以10000×g、4℃進行20分鐘離心，除去上清。再次同樣進行超聲處理，將所得沉淀懸浮于50mL BugBuster。向懸浮液中加入1mL 10mg/mL溶菌酶(生化學工業(yè))，緩慢攪拌，然后在室溫下放置10分鐘，接著加入200mL 1/10量的高濃度BugBuster，攪拌，同樣進行離心，除去上清。向所得沉淀中加入200mL 1/10濃度的BugBuster，使其懸浮，同樣進行離心，將該操作重復(fù)數(shù)次。最終向所得沉淀中加入100mL D-PBS，得到內(nèi)含體。
rsCD14(1-285)的制備是首先將內(nèi)含體溶解于含有1％TritonX100的TE緩沖液(pH 8.0、Nippon Gene)，進行三次凍融，離心并回收沉淀。再次溶解于含有1％TritonX100的TE緩沖液(pH 8.0、Nippon Gene)，冰冷卻后，以250μA、以10秒的間隔進行12分鐘超聲波處理，離心后回收沉淀。將沉淀溶解于含有1％TritonX100、0.2M氫氧化鈉的TE緩沖液(pH 8.0、Nippon Gene)中，在37℃下處理10分鐘，離心，再溶解，重復(fù)進行三次，然后回收沉淀。將所得沉淀溶解于含有6M胍基鹽酸的水溶液中，制備純化rsCD14(1-285)。以BSA為標準品，通過Bradford蛋白質(zhì)測定法計算濃度。
3-(2)抗CD14單克隆抗體的制備[1] F1106-13-3抗體的制備以上述來自大腸桿菌的rsCD14(1-285)作為給予抗原制備單克隆抗體。首先，將20μg純化rsCD14(1-285)與氟氏完全佐劑(DIFCO)等量混合，將200μL給予6周齡雌性ddy小鼠的腹腔內(nèi)。2周后，將20μg純化rsCD14(1-285)與氟氏不完全佐劑(DIFCO)等量混合，將200μL給予腹腔內(nèi)。進行細胞融合的三天前，將50μg抗原給予小鼠腹腔。三天后無菌摘除脾臟，由脾臟分離淋巴細胞，按照安東民衛(wèi)、千葉丈著“單克隆抗體實驗操作入門”83頁、1991年(講談社)，以10∶1與骨髓瘤細胞(P3×63-Ag.8.U·1)混合，用聚乙二醇進行細胞融合。通過HAT培養(yǎng)基選擇雜交瘤，然后通過ELISA法進行生成與rsCD14(1-285)結(jié)合的抗體的雜交瘤篩選。
首先，將rsCD14(1-285)用PBS(pH 6.4)稀釋為0.4μg/mL，向免疫板(Maxisorb、NUNC)的備孔中添加50μL。在4℃反應(yīng)過夜，然后用離子交換水洗滌5次。將100μL含有0.5％BSA的PBS(pH 6.4)添加到各孔中，進行封閉。將采集的培養(yǎng)上清添加到各孔中，在37℃反應(yīng)1小時，然后用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次。接著將過氧化物酶標記抗小鼠免疫球蛋白抗體(DAKO)用含有10％兔血清的PBS稀釋為1000倍，將所得溶液以50μL添加到各孔中。在37℃反應(yīng)1小時，然后同樣地洗滌5次，將四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB、BioFix)添加到各孔中。在室溫下反應(yīng)10分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)。用讀板儀(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)測定450nm的吸光度，選擇含有雜交瘤的孔，所述雜交瘤生成與rsCD14(1-285)結(jié)合的抗體。接著，按照安東民衛(wèi)、千葉丈著“單克隆抗體實驗操作入門”83頁、1991年(講談社)，通過有限稀釋法，由所選擇的孔進行克隆。10天后，以對rsCD14(1-285)的反應(yīng)性作為指標，同樣地進行篩選，選擇雜交瘤，結(jié)果得到了12種抗rsCD14(1-285)單克隆抗體生成雜交瘤。
將所選擇的雜交瘤在10％FCS/RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma制備)中培養(yǎng)，然后用雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen制備)培養(yǎng)，使其生成抗體，用蛋白A(Prosep-A)純化抗體。
通過IsoStrip小鼠單克隆抗體亞型分型試劑盒(Roche)確定反應(yīng)性高的抗體F1106-13-3抗體的亞型，結(jié)果亞型為IgG2b·κ。
F1031-8-3抗體的制備F1031-8-3抗體使用WO01/22085號公報實施例7的方法制備。簡單地說，將20μg人血液中的CD14蛋白質(zhì)溶解于生理鹽水，與氟氏完全佐劑(DIFCO)等量混合，初次和兩周后的第二次免疫是給予小鼠腹腔內(nèi)，一周后，與WO01/22085號公報實施例5同樣，通過ELISA法確認血清中的抗體滴度上升，確認與重組人CD14蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。向小鼠腹腔給予100μG抗原，進行最終給予，3天后摘除脾臟。由脾臟分離淋巴細胞，以10∶1與骨髓瘤細胞(P3×63-Ag.8.U.1)混合，用聚乙二醇進行細胞融合。通過HAT培養(yǎng)基選擇雜交瘤。一周后通過上述ELISA法進行生成目標抗體的雜交瘤的篩選。通過有限稀釋法對與固相化可溶性CD14抗原反應(yīng)的雜交瘤進行克隆，10天后同樣地進行篩選，得到抗CD14蛋白質(zhì)單克隆抗體。以其作為代表性的抗體，使用IsoStrip小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒(Roche)確定亞型，得到了亞型為IgG2b·κ的F1031-8-3抗體。
3-(3)夾層EIA系統(tǒng)的研究為了制備可特異性地檢測較多存在于敗血癥患者體內(nèi)的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，使用實施例1、2、3-(2)的抗體制備夾層ELA系統(tǒng)。
過氧化物酶標記抗體的制備過氧化物酶標記抗體按照中根等人的方法(J.HistochemCytochem.，22卷、1084頁、1974年)，將4mg過氧化物酶(東洋紡)溶解于蒸餾水中，添加100mM的高碘酸，在25℃反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)終止后，加1.5％乙二醇，在25℃反應(yīng)10分鐘，用1mM乙酸緩沖液(pH4.4)進行透析。將純化的F1031-8-3抗體和F1106-13-3抗體分別用10mM碳酸緩沖液(pH 9.5)透析，相對于4mg，添加70μL 0.2M碳酸緩沖液(pH 9.5)，將活化的4mg過氧化物酶與抗體等量混合，在25℃反應(yīng)2小時。接下來，添加4mg/mL的氫化硼鈉，繼續(xù)在4℃下反應(yīng)2小時。接著將反應(yīng)液用PBS透析，得到過氧化物酶標記F1031-8-3抗體(以下可稱為F1031-8-3-HRP)和過氧化物酶標記F1106-13-3抗體(以下可稱為F1106-13-3-HRP)。測定液量，由所使用的抗體量計算抗體濃度。
夾層EIA系統(tǒng)的制備使用實施例1中制備的S68抗體作為固相抗體，使用實施例3-(2)[1]和[2]中制備的抗體作為標記抗體，制備兩步夾層EIA系統(tǒng)。即，將S68抗體用D-PBS(pH 7.4)稀釋為10μg/mL，將50μL添加到免疫板(Maxisorb、NUNC)的各孔中。在4℃反應(yīng)過夜，然后用離子交換水洗滌五次，將100μL含有0.1％StabilGuard(SurModics制備)和0.1％吐溫20的D-PBS添加到各孔中，進行封閉。接著，以含有1％正常人血清(使用3C10除去了可溶性CD14抗原的血清，以下稱為CD14吸收血清，3C10由取自AmericanTypeCultureCollection的ATCC228-TIB雜交瘤制備)、0.1％BSA的PBS(pH 7.4)作為稀釋液，將正常人血清和人敗血癥患者血清稀釋為20倍，制備稀釋檢體。每孔中添加50μL稀釋檢體，在37℃反應(yīng)2小時。
反應(yīng)終止后，用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次，用含有5％大鼠血清、1％小鼠血清、0.1％吐溫20的76mM PBS(pH 8.0)將F1031-8-3-HRP或F1106-13-3-HRP稀釋為0.6μg/mL，向各孔中添加50μL。在37℃反應(yīng)2小時，然后同樣洗滌5次，向各孔中添加四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB、BioFix)。在室溫下反應(yīng)20分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)，用讀板儀(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)測定450nm的吸光度。結(jié)果如表1所示，在來自S68肽的抗體組合而成的系統(tǒng)中，正常人的結(jié)果并未上升，敗血癥患者則特異性上升，由此可以測定血液中的可溶型蛋白質(zhì)。
夾層EIA系統(tǒng)的制備<2>
使用實施例2中制備的F1146-17-2抗體作為固相抗體，使用實施例3-(2)[2]中制備的抗體作為標記抗體，制備兩步夾層EIA系統(tǒng)。即，將F1146-17-2抗體用PBS(pH 6.4)稀釋為120μg/mL，將50μL添加到免疫板(Maxisorb、NUNC)的各孔中。在56℃反應(yīng)30分鐘，然后用離子交換水洗滌五次，將100μL含有0.1％StabilGuard(SurModics制備)和0.1％吐溫20的PBS添加到各孔中，進行封閉。接著，以含有1％BSA的PBS(pH 6.4)作為稀釋液，將人正常血清和人敗血癥患者血清稀釋為10倍，制備稀釋檢體。每孔中添加50μL稀釋檢體，在25℃反應(yīng)2小時。
反應(yīng)終止后，用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次，用含有5％大鼠血清、1％小鼠血清、0.1％吐溫20的76mM磷酸緩沖液(pH 8.0)將過氧化物酶標記F1031-8抗體稀釋為0.5μg/mL，向各孔中添加50μL。在25℃反應(yīng)2小時，然后同樣洗滌5次，向各孔中添加四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB、BioFix)。在室溫下反應(yīng)20分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)，用讀板儀(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)測定450nm的吸光度。結(jié)果如表1所示，S68肽特異性單克隆抗體與S68抗體同樣，在正常人血清中幾乎沒有，在敗血癥患者血清中可以測定到顯示高數(shù)值的血液蛋白。即，與S68肽結(jié)合的抗體不管是多克隆抗體還是單克隆抗體，均可以通過夾層測定系統(tǒng)測定。
表1中的++表示其450nm的吸光度為稀釋液單獨吸光度的4倍或以上，+表示2倍或以上，-表示與稀釋液同等的吸光度。
表1

(實施例4)S68抗體的特異性為了對實施例1中制備的S68抗體的特異性進行確認，研究在與實施例3-(3)同樣的測定中是否受到肽的抑制。即，向25μL敗血癥患者血清和正常人血清的50倍稀釋溶液中分別添加25μL稀釋為0、0.1、1、10μg/mL的S68肽(氨基酸序列53位-68位)、與實施例1同樣制備的合成肽(氨基酸序列53位-58位、氨基酸序列57位-62位、氨基酸序列59位-64位)或負對照用肽(Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu SerArg Glu Ala Cys)，與S68抗體混合，使其進行競爭反應(yīng)，然后測定未被抑制地與S68抗體結(jié)合的敗血癥患者血清和正常人血清中該可溶型蛋白質(zhì)量。
結(jié)果如圖1所示，顯示低數(shù)值的正常人血清和顯示高數(shù)值的敗血癥患者血清中，S68肽抑制了S68抗體與血清中該可溶型蛋白質(zhì)的結(jié)合，其它的部分肽(各6個氨基酸)和負對照用肽則未抑制。由以上結(jié)果表明通過S68抗體在血清中檢測的蛋白質(zhì)是S68抗體特異性識別的蛋白質(zhì)。另外，S68肽的部分肽——三種合成肽(氨基酸數(shù)為6個)未見抑制，由此表明抗體的識別序列最少需要7個氨基酸或以上的長度。
(實施例5)所制備的抗體的反應(yīng)速度常數(shù)使用Biacore3000(Biacore制造)對實施例1中制備的S68抗體和實施例2中制備的F1146-17-2抗體的特異性和反應(yīng)速度常數(shù)進行分析。首先，與實施例1的方法同樣地，使用馬來酰亞胺化BSA(PIERCE)制備固定的S68肽-BSA。接著，使用胺偶聯(lián)試劑盒，將S68肽-BSA固定在傳感器芯片CM5(Biacore制造)上。測定使用HBS-EP(Biacore制備)作為起始緩沖液，通過將F1146-17-2抗體的稀釋系列(50、100、150、200、300nM)注射到流式細胞分選儀中進行。數(shù)據(jù)分析是使用biaevaluatin soft wear 3.0版(Biacore制造)，由S68肽-BSA的流式細胞分選儀測定數(shù)據(jù)中減去背景細胞數(shù)據(jù)實施。計算解離常數(shù)(KD)，結(jié)果，F(xiàn)1146-17-2抗體為4.8×10-9M，顯示高親和性。同樣測定的特異性純化兔S68肽多克隆抗體的KD為2.2×10-10M。
(實施例6)抗CD14單克隆抗體的特異性6-(1)F1106-13-3抗體的分析為了明確F1106-13-3抗體的結(jié)合區(qū)(表位)，使用將CD14的氨基酸序列由N末端一側(cè)以10個氨基酸為一組合成的肽文庫膜(CustomSPOTs、Genosys)對CD14的氨基酸序列進行分析。即，按照說明對膜進行封閉，然后與F1106-13-3抗體反應(yīng)，洗滌后與β-半乳糖苷酶結(jié)合抗小鼠抗體反應(yīng)。洗滌膜后，使用X-gal檢測抗體所結(jié)合的肽的序列。肽文庫膜的肽序列是將1位-154位的氨基酸序列以將C末端的兩個氨基酸重疊的形式，每10個氨基酸一組地合成，共對19個肽進行分析。肽按照與實施例1-(1)同樣的方法制備。
結(jié)果得知，F(xiàn)1106-13-3抗體是與相當于高分子量CD14的N末端的17-26位的氨基酸序列(CNFSEPQPDW)的區(qū)域結(jié)合的。
6-(2)F1031-8-3抗體的分析<1>
為確認F1031-8-3抗體的特異性，使用實施例3-(1)的來自大腸肝菌的rsCD14(1-285)和WO01/72993號公報實施例8和實施例9的方法，使用由COS細胞制備的rsCD14(1-356)、rsCD14(1-307)S286C，進行結(jié)合活性測定。
首先，將各250ng/斑點的rsCD14(1-356)、rsCD14(1-307)S286C、rsCD14(1-285)或BSA固定在Hybond-C extra(Amersham Biosciences)上，干燥后用含有0.05g/mL的脫脂乳(明治乳業(yè))的0.05％吐溫20、PBS(pH 6.4)進行封閉。在室溫下靜置1小時，然后加入F1031-8-3抗體，該抗體用含有0.5％BSA的0.05％吐溫20、PBS(pH 6.4)稀釋為3μg/mL，在室溫下反應(yīng)1小時，用0.05％吐溫20、PBS(pH 6.4)洗滌。
接著，添加過氧化物酶標記抗小鼠免疫球蛋白抗體(DAKO)，該抗體用含有10％兔血清的0.05％吐溫20、PBS(pH 6.4)稀釋成500倍的在37℃反應(yīng)30分鐘，然后同樣地進行洗滌，通過ECL試劑盒(AmershamBiosciences)確認結(jié)合活性。結(jié)果如表2所示，F(xiàn)1031-8-3抗體與來自大腸肝菌的rsCD14(1-285)、rsCD14(1-307)S286C、rsCD14(1-356)結(jié)合，但不與BSA結(jié)合，由此可以明確其特異性識別全部類型的CD14蛋白質(zhì)。表2的+表示通過ECL檢測出薄膜上的斑點，-號表示未檢測出斑點。
表2

6-(3)F1031-8-3抗體的分析<2>
對F1031-8-3抗體的結(jié)合區(qū)(表位)進行分析。即，在固相上通過使用F1031-8-3-HRP作為標記抗體的實施例3-(3)[2]的夾層ELA系統(tǒng)，進行F1106-1-3抗體對S68抗體的抑制實驗。
首先，與實施例3-(3)[2]同樣地，向S68抗體固相板中添加100ng/mL標準品并使其反應(yīng)。洗滌板，在添加F1031-8-3-HRP之前，添加25μL 6μg/mL的F1106-13-3抗體、小鼠IgG抗體或不含抗體的緩沖液，然后添加25μL F1031-8-3-HRP，與實施例3-(3)[2]同樣地進行測定。
如表3所示，在小鼠IgG抗體添加系統(tǒng)中并沒受到抑制，而F1106-13-3抗體則抑制了F1031-8-3與標準品的結(jié)合。由此可認為在F1031-8-3抗體所識別的區(qū)域的至少一部分存在F1106-13-3抗體所識別的區(qū)域。表3的“抑制率”是以只有緩沖液時的吸光度為100％，由各減少的吸光度計算得出。
表3

(實施例7)可溶型蛋白質(zhì)測定試劑盒7-(1)夾層EIA系統(tǒng)測定試劑盒的構(gòu)成例在實施例3-(3)中，給出了使用固相抗體、標記抗體組合的可溶型蛋白質(zhì)試劑盒，該組合對于敗血癥患者的測定顯示高值、對于正常人的測定顯示低數(shù)值。
<1>固相抗體將S68抗體固相化的板<2>標記抗體過氧化物酶標記F1031-8-3抗體<3>底物溶液(四甲基聯(lián)苯胺溶液)其它附屬品板系統(tǒng)的構(gòu)成例<4>板洗滌液(0.9％NaCl、0.05％吐溫20溶液)<5>試樣稀釋液(含有0.1％BSA的PBS溶液)<6>反應(yīng)中止液(0.5M硫酸溶液)<7>標準品(CD14(1-307)S286C)使用上述測定試劑盒進行測定時的測定儀器<參考例>
<8>讀板儀(例如E-Max(Molecular Devices Corporation制造))
7-(2)-(11)夾層EIA系測定試劑盒的構(gòu)成例除7-(1)之外，表4中又給出了夾層EIA系統(tǒng)的測定試劑盒構(gòu)成例。<1>表示固定在板上的結(jié)合物質(zhì)。<2>表示標記的結(jié)合的物質(zhì)。構(gòu)成要素<3>-<7>和參考例的測定儀器<8>與7-(1)相同。<9>表示第二特異結(jié)合物質(zhì)所結(jié)合的抗體?！?”表示未記載。
表4

7-(12)夾層EIA系統(tǒng)的測定試劑盒的標準曲線按照與實施例3-(3)[2]同樣的方法，用(1)的測定試劑盒進行了測定。即，將S68抗體用D-PBS(pH 7.4)稀釋為10μg/mL，以50μL添加到免疫板的各孔中。在4℃反應(yīng)過夜，用離子交換水洗滌五次，將100μL含有0.1％StabilGuard(SurModics制備)和0.1％吐溫20的D-PBS添加到各孔中進行封閉。接著以含有1％CD14吸收血清、0.1％BSA的76mM PBS(pH 7.4)作為稀釋液，制備0、3、25、60、100、150ng/mL的CD14(1-307)S286C蛋白質(zhì)標準品稀釋系列。每孔中添加50μL標準品稀釋系列，在37℃反應(yīng)2小時。反應(yīng)終止后，用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次，用含有0.1％吐溫20的76mM PBS(pH 8.0)將5％大鼠血清、1％小鼠血清、過氧化物酶標記F1031-8-3抗體稀釋為0.6μg/mL，向各孔中添加50μL稀釋的標記抗體。在37℃反應(yīng)2小時，然后同樣洗滌五次。向各孔中添加四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB、BioFix)，在室溫下反應(yīng)20分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)，用讀板儀(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)測定450nm的吸光度。圖2表示所制備的標準曲線?？梢詫崿F(xiàn)測定靈敏度達到0.6ng/mL(空白+3SD)的高靈敏度、簡便的測定系統(tǒng)。
7-(13)夾層EIA系的特異性為了研究存在于人血清中的高分子量CD14對于所制備的測定系統(tǒng)的影響，將0-4μg/mL濃度的來自正常人血清的可溶性CD14抗原添加到CD14(1-307)S286C標準品中，與(12)同樣地進行測定，結(jié)果如圖3所示，來自正常人血清的可溶性CD14抗原即使為4μg/mL，對于測定值也沒有影響。由該結(jié)果可知在該夾層EIA系統(tǒng)中，與高分子量CD14的交叉反應(yīng)性為0.3％或以下。即，該系統(tǒng)不檢測人血清高分子量CD14，對于在敗血癥患者的血清中顯示高數(shù)值的可溶型蛋白質(zhì)具有特異性。
7-(14)對夾層EIA系的測定試劑盒的評價對于(1)的試劑盒的測定結(jié)果再現(xiàn)性進行評價。與(12)同樣地，使用三種檢體進行的同時再現(xiàn)性的變動系數(shù)(CV)為5.8、3.6、3.5％，測定期間的再現(xiàn)性為6.2、5.2、5.1％，獲得了良好的結(jié)果。另外，添加回收實驗的回收率為88-109％，良好，未見抗凝固劑(肝素、檸檬酸、EDTA)的影響。以上結(jié)果顯示本試劑盒具有充分的性能可以測定血液中該可溶型蛋白質(zhì)。
(實施例8)血液中可溶型蛋白質(zhì)的鑒定8-(1)凝膠過濾色譜<1>
為了對實施例7-(1)的測定試劑盒所檢測出的敗血癥患者血清中的物質(zhì)進行分析，通過凝膠過濾色譜柱Superdex 200PC3.2/30(Amersham Biosciences)、通過SMART SYSTEM(AmershamBiosciences)、以D-PBS作為展開溶劑，分離敗血癥患者的血清，使用實施例7-(1)的測定試劑盒和市售CD14-EIA試劑盒(IBL-Hamburg)測定各組分。分子量的計算使用LMW校正曲線試劑盒和HMW校正曲線試劑盒(Amersham Biosciences)中的醛縮酶(158kDa)、BSA(67kDa)、卵清蛋白(43kDa)、胰凝乳蛋白酶(25kDa)，校正柱進行。
結(jié)果如圖4所示。在市售CD14-EIA試劑盒中，檢測出分子量約57kDa的可溶性CD14抗原，判斷其為以往報道的49-55kDa的高分子量可溶性CD14抗原。而通過實施例7-(1)的試劑盒，在分子量35-45kDa附近檢測出峰，在57kDa附近未檢測出峰，因此可以確認實施例7-(1)的試劑盒只特異性地檢測存在于血液中的該可溶型蛋白質(zhì)。
8-(2)凝膠過濾色譜<2>
與(2)-<1>同樣地，通過凝膠過濾色譜柱Superdex 75 10/300GL(Amersham Biosciences)、使用200mM乙酸銨(pH6.8)作為展開溶劑分離50μL敗血癥患者的血清，使用各試劑盒進行測定。分子量的計算是使用LMV校正試劑盒和HMW校正試劑盒(Amersham Biosciences)中的BSA(67kDa)、卵清蛋白(43kDa)、胰凝乳蛋白酶原(25kDa)和核糖核酸酶A(13.7kDa)對柱進行校正進行。
結(jié)果如圖5所示。通過實施例7-(1)的試劑盒，在分子量25-35kDa附近檢測出來自該可溶型蛋白質(zhì)的峰。
8-(3)F1025-3-1抗體親和柱層析將(2)-<2>中所得的、來自該可溶型蛋白質(zhì)的峰的組分(例如組分12)供給F1025-3-1抗體親和柱層析，則來自該可溶型蛋白質(zhì)的峰被洗脫到親和柱未吸附成分中。F1025-3-1抗體親和柱的調(diào)節(jié)以及實施可按照WO01/220385號公報實施例10記載的方法進行。
(實施例9)由敗血癥患者血清中純化血液中的可溶型蛋白質(zhì)9-(1)F1024-1-3-瓊脂糖4B載體的制備將55mg根據(jù)WO01/72993號實施例2中記載制備的F1024-1-3抗體(如上所述，雜交瘤以保藏號FERM BP-7511保藏)添加到20mLECH-Scpharose 4B(Amersham Biosciences制備)中，加入水溶性碳二亞胺((株)同仁化學研究所)，使終濃度為0.1M，在4℃實施偶聯(lián)反應(yīng)過夜。接著用0.1M乙酸鈉(pH 5.0)洗滌，然后回收未反應(yīng)的F1024-1-3抗體。分別測定偶聯(lián)反應(yīng)前的抗體溶液和洗液在280nm下的吸光度，求出偶聯(lián)效率(換算值0.714mg/mL)。結(jié)果，F(xiàn)1024-1-3抗體的偶聯(lián)效率為55％，1mL載體可結(jié)合1.5mg F1024-1-3抗體。
接著添加1M乙醇胺(pH7.4)，在室溫下進行1小時封閉反應(yīng)，用100mL 0.1M乙酸鈉/0.5M NaCl(pH 4.0)、接著用100mL 0.1M Tris-HCl/0.5M NaCl(pH 8.0)洗滌載體。再將該操作實施兩次，制備20mLF1024-1-3瓊脂糖4B載體。
9-(2)S68-瓊脂糖4FF載體的制備使用具有10kDa截止分子量的透析膜(Spectrum制備)，以2.5L含有0.5M NaCl的0.2M碳酸氫鈉(pH 8.3)作為透析液，在4℃對18mg實施例1-(4)中制備的S68抗體透析過夜。透析液更換三次。接著，將預(yù)先用含有0.5M氯化鈉的0.2M碳酸氫鈉(pH 8.3)平衡的8mL NHS-活化瓊脂糖4Fast Flow(Amersham Biosciences)添加到經(jīng)透析的S68抗體溶液中，在4℃下進行偶聯(lián)反應(yīng)過夜。偶聯(lián)反應(yīng)終止后，用含有0.5M氯化鈉的0.2M碳酸氫鈉(pH 8.3)洗滌未反應(yīng)的S68抗體并回收。分別測定偶聯(lián)反應(yīng)前的抗體溶液和偶聯(lián)反應(yīng)后的抗體溶液在280nm下的吸光度，求出偶聯(lián)效率(換算值0.714mg/mL)。結(jié)果，S68抗體的偶聯(lián)效率為79％，表明1mL載體可以結(jié)合1.8mg S68抗體。接著，將含有0.5M氯化鈉的0.5M一甲醇胺(pH 8.3)加入到載體中，在4℃下進行封閉反應(yīng)過夜。封閉反應(yīng)終止后，用300mL含有0.5M氯化鈉的0.1M乙酸鈉(pH 4)洗滌載體，然后用300mL含有0.5M氯化鈉的0.2M碳酸氫鈉(pH 8.3)洗滌載體。再將該操作重復(fù)兩次，制備8mL S68-瓊脂糖4Fast Flow。
9-(3)SDS-PAGESDS-PAGE使用12.5％凝膠，按照Laemmli的方法(Laemmli UKCleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4.nature.1979 Aug 15；227(259)680-5)，在非還原條件下實施。即，向2容量試樣中添加1容量的Tris-SDS-Seprasol(第一化學藥品(株))，在100℃加熱處理5分鐘，然后過12.5％的ePAGEL凝膠(ATTO Corporation)，通過Laemmli的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，以25mA進行90分鐘定電流電泳。電泳結(jié)束后，用銀染試劑盒2D銀染試劑·II“第一”(第一化學藥品株式會社)，對凝膠進行染色。計算分子量時，使用Precision plus proteinTM雙色標準品(Bio-Rad)作為分子量標志。
9-(4)蛋白質(zhì)印跡預(yù)先將切成SDS-PAGE凝膠大小的濾紙浸泡在5％甲醇/25mMTris/40mMε氨基己酸溶液中，放置在鉑電極半干轉(zhuǎn)印BE330(BiocraftLtd.)的陰極電極盤上，接著，按照上述(3)實施SDS-PAGE，然后將凝膠浸泡在相同的溶液中，與濾紙重疊，注意中間不要混入氣泡。然后，將預(yù)先用5％甲醇/25mM Tris平衡的硝基纖維素膜(轉(zhuǎn)移印跡的轉(zhuǎn)印介質(zhì)、Bio-Rad)重疊在凝膠上面，注意不要有氣泡混入。再將預(yù)先浸泡在相同溶液中的濾紙重疊其上，注意不要有氣泡混入，最后，將浸泡在5％甲醇/300mM Tris的濾紙重疊其上，注意不要有氣泡混入。在其上放置陽極電極，以2mA/cm2、在室溫下轉(zhuǎn)印2小時。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將硝基纖維素膜浸泡在Block-Ace封閉液(大日本制藥株式會社)中，在37℃進行1小時的封閉操作。然后在37℃下、使硝基纖維素膜與10mL 6.8μg/mL F1031-8-3抗體反應(yīng)2小時，用0.05％吐溫20/PBS洗滌，然后在37℃與抗小鼠IgG抗體-HRP共軛物(DAKO A/S)反應(yīng)1小時。反應(yīng)終止后，用0.05％吐溫20/PBS洗滌硝基纖維素膜。洗去未反應(yīng)的共軛物，然后浸泡在50mL用蒸餾水稀釋為2倍的TMB-H(Moss制備)，在4℃下、在暗處使其發(fā)光過夜。
9-(5)由敗血癥患者血清中純化血液中可溶型蛋白質(zhì)將1mL 9-(1)中制備的F1024-1-3-瓊脂糖4FF填充內(nèi)徑為1cm的econo-columm柱(Bio-Rad)，用含有0.05％吐溫20的D-PBS(pH 7.4)平衡。同時，將1mL實施例9-(2)中制備的S68-瓊脂糖4FF同樣地填充內(nèi)徑為1cm的econo-columm(BIO-RAD)，用含有0.05％吐溫20的D-PBS(pH 7.4)平衡。接著將兩根柱串聯(lián)連接，在S68-瓊脂糖TM4FF柱的前端配置F1024-1-3-瓊脂糖TM4B柱。將18mL敗血癥患者血清以0.02mL/分鐘的流速供給該串聯(lián)柱。用含有0.05％吐溫20的D-PBS(pH7.4)洗滌未吸附在柱上的蛋白質(zhì)，然后撤去S68-瓊脂糖4FF柱，將與S68-瓊脂糖4FF柱吸附的蛋白質(zhì)通過含有0.05％吐溫20的10mM鹽酸、以0.2mL/分鐘的流速洗脫，取到10支分離管中，每支管中取2mL。向各分離容器中預(yù)先添加200μL 500mM碳酸氫銨，使洗脫液的pH值立即恢復(fù)中性。測定各組分中通過實施例7-(1)試劑盒檢測出的血液中可溶型蛋白質(zhì)的濃度，收集含有該蛋白質(zhì)的組分，進行冷凍干燥。
冷凍干燥結(jié)束后，向凍干粉末中加入0.2mL含有0.05％吐溫20的150mM乙酸銨溶液，使其溶解，以3,500×g離心10分鐘，然后用Superdex 75 10/300GL(Amersham Biosciences制造)，將該上清進行凝膠過濾。使用含有0.05％吐溫20的150mM乙酸銨溶液作為展開溶液，將0.2mL試樣過柱，以0.8mL/分鐘的流速添加，添加試樣后，在7.8分鐘之后取到40支分離管中，各取0.45mL。
通過實施例7-(1)的試劑盒和市售CD14-EIA試劑盒(IBL-Hamburg制造)測定各組分。結(jié)果，由實施例7-(1)的試劑盒檢測出的血液中可溶型蛋白質(zhì)是在組分12中具有峰的組分11-13，由18mL敗血癥患者血清中得到了1.1μg血液中可溶型蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的峰在29±5kDa的位置。分子量標志使用Gel Filtration LMV校正曲線試劑盒(AmershamBiosciences制造)中的BSA(67.0kDa)、卵清蛋白(43.0kDa)、胰凝乳蛋白酶原A(25.0kDa)和核糖核酸A (13.7kDa)。
接著，將這些凝膠過濾組分進行實施例9-(4)的蛋白質(zhì)印跡分析，使用Precision plus proteinTM雙色標準品(Bio-Rad制備)，進行由實施例7-(1)的試劑盒檢測出的血液中可溶型蛋白質(zhì)的鑒定和分子量的測定。結(jié)果，上述凝膠過濾組分與實施例7-(1)試劑盒的測定結(jié)果一致地增減，組分12中具有峰的血液中可溶型蛋白質(zhì)檢測出分子量為13±2kDa的條帶。(圖6、圖7)(實施例10)由正常人血清純化血液中可溶型蛋白質(zhì)10-(1)由正常人血清中純化血液中可溶型蛋白質(zhì)通過實施例7-(1)的試劑盒，對購自日本Biotest(株)的人正常血清進行定量，結(jié)果得到了61ng/mL的值。
將20mL實施例9-(1)制備的F1024-1-3-瓊脂糖4B載體填充XK柱26/20柱(Amersham Biosciences制造)，用含有0.05％吐溫20的D-PBS(pH 7.4)平衡。將8mL實施例9-(2)中制備的S68-瓊脂糖4FF載體填充XK柱16/20柱(Amersham Biosciences制造)，同樣的用含有0.05％吐溫20的D-PBS(pH 7.4)平衡。
接著將兩根柱串聯(lián)連接，在S68-瓊脂糖4FF柱的上端配置F1024-1-3-瓊脂糖4B柱。將1.3L上述人正常血清以0.5mL/分鐘的流速供給該串聯(lián)柱。用含有0.05％吐溫20的D-PBS(pH7.4)洗滌未吸附的蛋白質(zhì)，然后撤去連接的柱，將與S68-瓊脂糖4FF柱吸附的蛋白質(zhì)通過含有0.05％吐溫20的10mM鹽酸、以1mL/分鐘的流速洗脫160分鐘，取到10支分離管中，每支管中取20mL。向各制備容器中預(yù)先添加2mL 500mM碳酸氫銨，使洗脫液的pH值立即恢復(fù)中性。測定各組分中由實施例7-(1)試劑盒檢測出的血液中可溶型蛋白質(zhì)的濃度，收集含有該蛋白質(zhì)的組分，進行冷凍干燥。
向凍干粉末中加入1mL含有0.05％吐溫20的150mM乙酸銨溶液，使其溶解，用孔徑為0.22μm的濾器(Mylex GV13、Millipore)過濾，然后供給使用Superdex 75 10/300GL(Amersham Biosciences制造)柱的凝膠過濾。使用含有0.05％吐溫20的150mM乙酸銨溶液作為展開溶液，將0.5mL試樣過柱，以0.8mL/分鐘的流速實施凝膠過濾。添加試樣后，在7.8分鐘之后取到40支分離管中，各取0.45mL。將該凝膠過濾實施2次。
通過實施例7-(1)的試劑盒和市售CD14-EIA試劑盒(IBL-Hamburg制造)測定各組分。結(jié)果，由實施例7-(1)的試劑盒檢測出的血液中可溶型蛋白質(zhì)是在組分12中具有峰的組分11-13。于是實力9-(4)同樣地求出的該蛋白質(zhì)的峰在29±5kDa的位置。
接著，將這些凝膠過濾組分進行實施例9-(4)的蛋白質(zhì)印跡分析，使用Precision plus proteinTM雙色標準品(Bio-Rad制備)，進行由實施例7-(1)的試劑盒檢測出的血液中可溶型蛋白質(zhì)的鑒定和分子量的測定。結(jié)果，上述凝膠過濾組分與實施例7-(1)試劑盒的測定結(jié)果一致地增減，組分12中具有峰的血液中可溶型蛋白質(zhì)檢測出分子量為13±2kDa的條帶。(圖8)收集上述組分，進行冷凍干燥。向所得冷凍干燥標準品中添加100μL含有0.05％吐溫20的150mM乙酸銨溶液使其溶解，通過實施例7-(1)的試劑盒求出該血液中可溶型蛋白質(zhì)的回收量。結(jié)果，由1.3L人正常血清中得到了19μg血液中可溶型蛋白質(zhì)。
10-(2)氨基酸序列的鑒定[1]電印跡通過實施例9-(3)的SDS-PAGE，將實施例10-(1)中冷凍干燥的由實施例7-(1)的試劑盒檢測的血液中可溶型蛋白質(zhì)在丙烯酰胺凝膠上展開，然后向聚偏氟乙烯(以下稱為PVDF)膜上進行電印跡。即，在轉(zhuǎn)印裝置——鉑電極半干轉(zhuǎn)印儀(Biocraft Ltd.)的陰極上放置浸泡有20％甲醇/25mM Tris/40mMε氨基己酸溶液的濾紙，在其上重疊放置電泳后的丙烯酰胺凝膠、再放置PVDF(clear Blot Membrane P(ATTOCorporation))膜。再將浸泡于20％甲醇/25mM Tris的濾紙和浸泡于20％甲醇/0.3M Tris的濾紙依次重疊，最后放置陽極裝置。轉(zhuǎn)印以約2mA/cm2的定電流進行1小時。
轉(zhuǎn)印蛋白的檢測電印跡后，將PVDF膜在0.1％考馬斯亮藍G250/10％乙酸/30％乙腈溶液中浸泡約5分鐘，然后用10％乙酸/30％乙腈溶液適當脫色，檢測蛋白質(zhì)。
氨基酸序列分析用干凈的切刀將在PVDF膜上檢測出的分子量為13±2kDa的蛋白質(zhì)條帶切出，轉(zhuǎn)移到1.7mL微量離心管中。將切出的PVDF膜片段用0.1％三氟乙酸/50％甲醇溶液洗滌三次，再用甲醇洗滌，使其完全干燥。氨基酸序列分析使用蛋白質(zhì)測序儀Procise494cLC(AppliedBiosciencesJapan)。將洗凈后的PVDF膜片段設(shè)置在蛋白質(zhì)測序儀上，設(shè)定必要的分析周期進行分析。結(jié)果可以確認N末端具有Thr Thr Pro Glu ProXaa Glu Leu Asp Asp Glu氨基酸序列作為主要序列。
由蛋白質(zhì)測序儀的性質(zhì)看，Xaa可能是Cys、Asn、Ser、Thr或其它改性氨基酸，考慮到分析的蛋白質(zhì)是來自CD14的蛋白質(zhì)，可以認為它是Cys。另外，通過還原烷基化法進行的氨基酸分析中，也可以求出Xaa為Cys。
由上述結(jié)果可知對于凝膠過濾組分，在非還原下12.5％DSD-PAGE下得到的分子量為13±2kDa的組分純度好，實施例7-(1)的試劑盒檢測的血液中可溶型蛋白質(zhì)得到了純化。
由實施例7-(1)的試劑盒檢測出的血液中可溶型蛋白質(zhì)是在N末端具有由CD14的第一個殘基開始的氨基酸序列Thr Thr Pro Glu ProCys Glu Leu Asp Asp Glu、在非還原條件下的SDS-PAGE中為分子量13±2kDa的新型蛋白質(zhì)。由實施例7-(1)的試劑盒檢測出來，表明可以與以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合。
由實施例9和10的結(jié)果可知在敗血癥患者血清中確認的、由實施例7-(1)的試劑盒檢測出的血中可溶型蛋白質(zhì)也存在于人正常血清中。該蛋白質(zhì)在敗血癥患者血清中可以以更多的比例回收。
使用用標記的3C10作為標記抗體、用MEM-18(Monosan制備)作為固相抗體的夾層測定系統(tǒng)代替實施例8-10中使用的IBL-試劑盒，也可以得到與IBL-試劑盒同樣的結(jié)果。
標記按照實施例3-(3)進行，夾層測定系統(tǒng)按照實施例7-(1)構(gòu)成。
(實施例11)各種疾病患者的測定敗血癥患者血清使用已經(jīng)鑒定了分離菌的10例病例(表5)。使用實施例7-(1)的測定試劑盒，對正常人52例(男性31例、女性21例)、和各種疾病患者(20種疾病、60例)進行測定。
表5

血清中通過實施例7-(1)的試劑盒檢測的可溶型蛋白質(zhì)的濃度在正常人中以0.008-0.100μg/mL分布，平均值為0.04μg/mL。在敗血癥患者中以0.190-7.260μg/mL分布，平均值為2.0μg/mL。該可溶型蛋白質(zhì)濃度在敗血癥患者中比正常人和各種疾病患者中均顯示高的數(shù)值，與正常人相比較，在各種疾病患者中并未發(fā)現(xiàn)顯示高數(shù)值的疾病。
(實施例12)與市售的血液中可溶型CD14蛋白質(zhì)ELISA試劑盒的比較12-(1)各種疾病患者血液中可溶型CD14蛋白質(zhì)的測定使用市售的CD14-EIA試劑盒(IBL-Hamburg)對實施例11的檢體進行測定。血清中的可溶型CD14蛋白質(zhì)濃度在正常人中以5.6-11.2μg/mL分布，在敗血癥患者中可見高數(shù)值的例子。但是，在各種疾病患者血清中可見很多可溶型CD14蛋白質(zhì)顯示高數(shù)值的例子，與敗血癥患者血清之間未見差異。
12-(2)與使用S68抗體的試劑盒進行的比較與實施例11中測定的該可溶型蛋白質(zhì)的測定值進行了比較研究。如表6所示，使用市售CD14-EIA試劑盒，則在正常、各種疾病、敗血癥之間只有最大1.7倍左右的差異，而在實施例7-(1)的測定試劑盒中，正常人和各種疾病之間未見差異，但正常人與敗血癥之間有50倍的差異，由此表明實施例7-(1)的測定試劑盒的測定值在敗血癥中特異性上升。
表6 以正常人的平均值+3S.D.作為閾值(實施例7-(1)的測定試劑盒0.134μg/mL、市售CD14-EIA11.14μg/mL)，分為陽性例(敗血癥)和陰性例(正常、各種疾病)進行分析，結(jié)果如表7所示。根據(jù)該結(jié)果計算兩試劑盒的一致率((EIA 陽性一致數(shù)-EIA 陽性一致數(shù))/總數(shù)×100)、靈敏度(EIA 陽性一致數(shù)/陽性例×100)、特異度(EIA 陰性一致數(shù)/陰性例×100)，結(jié)果如表8所示，對于實施例7-(1)的試劑盒，一致率為94.3％、靈敏度為100.0％、特異度為93.8％，可知通過設(shè)定閾值，可以用作敗血癥的鑒別診斷.另一方面，對于市售的CD14-EIA，靈敏度、特異度均未見其可以診斷敗血癥的特異性和有用性。
表7
表8

(實施例13)重組型可溶性CD14片段的制備為了使實施例10中制備的血液中可溶型蛋白質(zhì)(以下可稱為可溶性CD14亞型、或者以其簡略符號稱為低分子sCD14-ST)作為重組蛋白質(zhì)表達而進行制備。
13-(1)CD14C末端缺失變異體表達質(zhì)粒的構(gòu)建為了制備重組型可溶性CD14片段(以下稱為重組型可溶性CD14亞型、或者以簡略符號稱為rsCD14-ST)，構(gòu)建質(zhì)粒，該質(zhì)粒生產(chǎn)CD14的C末端缺失的蛋白質(zhì)。
使SEQ ID No.3的人CD14分子的1)由66位至C末端缺失的分子(以下稱為CD14(1-65)，以下相同)、2)由71位至C末端缺失的分子(CD14(1-70))、3)由76位至C末端缺失的分子(CD14(1-75))、
4)由81位至C末端缺失的分子(CD14(1-80))、5)由86位至C末端缺失的分子(CD14(1-85))、6)由91位至C末端缺失的分子(CD14(1-90))、7)由96位至C末端缺失的分子(CD14(1-95))、8)由101位至C末端缺失的分子(CD14(1-100))、9)由106位至C末端缺失的分子(CD14(1-105))、10)由111位至C末端缺失的分子(CD14(1-110))在哺乳細胞中表達的質(zhì)粒、pCAG65、pCAG70、pCAG75、pCAG80、pCAG85、pCAG90、pCAG95、pCAG100、pCAG105和pCAG110按照以下方法構(gòu)建。分別設(shè)計并合成下述引物有義引物1(5’-TTT CCT ACA GCT CCT GGG-3’)(SEQ ID No.11)和反義引物1(5’-GG GGT ACC TTA GTC AGC ATA CTG CCG CGGGTC-3’)(SEQ ID No.12)、反義引物2(5’-GG GGT ACC TTA GAGAGC CTT GAC CGT GTC AGC-3’)(SEQ ID No.13)、反義引物3(5’-GG GGT ACC TTA GAG CCG CCG CAC GCG GAG AGC-3’)(SEQ ID No.14)、反義引物4(5’-GG GGT ACC TTA TGC GGC TCC CAC TGT GAGCCG-3’)(SEQ ID No.15)、反義引物5(5’-GG GGT ACC TTA CTGAGC AGG AAC CTG TGC GGC-3’)(SEQ ID No.16)、反義引物6(5’-GG GGT ACC TTA GGC GCC TAC CAG TAG CTG AGC-3’)(SEQ ID No.17)、反義引物7(5’-GG GGT ACC TTA CGC TAG CAC ACG CAG GGCGCC-3’)(SEQ ID No.1 8)、反義引物8(5’-GG GGT ACC TTA CTTGAG GCG GGA GTA CGC TAG-3’)(SEQ ID No.1 9)、反義引物9(5’-GG GGT ACC TTA CTC GAG CGT CAG TTC CTT GAG-3’)(SEQ ID No.20)和反義引物10(5’-GG GGT ACC TTA GGT TAT CTT TAG GTCCTC GAG-3’)(SEQ ID No.21)接著，以pCAG356為模板，以有義引物1和反義引物1、有義引物1和反義引物2、有義引物1和反義引物3、有義引物1和反義引物4、有義引物1和反義引物5、有義引物1和反義引物6、有義引物1和反義引物7、有義引物1和反義引物8、有義引物1和反義引物9、或有義引物1和反義引物10的引物對，分別進行PCR。PCR的反應(yīng)條件是在90℃加熱2分鐘，然后將<1>98℃10秒、<2>50℃30秒、<3>72℃1分鐘的循環(huán)重復(fù)30次。將所得產(chǎn)物用限制酶EcoRI和KpnI雙消化，分別回收0.4kb-0.5kb的片段。將pCAG356用限制酶EcoRI和KpnI切斷，將所得的約4.8kb片段與上述擴增產(chǎn)物片段連接，按照規(guī)定方法轉(zhuǎn)化E.coli JM109，得到各表達質(zhì)粒。pCAG356是在pCGAAS(GENE，15卷，269-277頁(1989))中插入WO98/39438中記載的來自質(zhì)粒pUCH14P-4的CD14基因得到的質(zhì)粒。
13-(2)插入了蛋白分解酶的切斷序列的CD14表達質(zhì)粒的構(gòu)建在使用實施例13-(1)的質(zhì)粒進行的rsCD14-ST的生產(chǎn)方法中，生產(chǎn)量非常低，因此可以判斷使用實施例1-(1)的質(zhì)粒生產(chǎn)rsCD14-ST的生產(chǎn)方法中，以所表達的片段作為標準品，無法純化至很純的純度。因此，插入蛋白分解酶的切斷序列，該蛋白分解酶的切斷序列特異性切斷具有356長度的CD14的64位，然后使其以全長表達，然后用蛋白分解酶特異性切斷，分離純化SEQ ID No.3的1位-64位部分和余下的部分，由此制備rsCD14-ST。蛋白分解酶的切斷序列使用ProScissionProtease識別序列和凝血酶識別序列兩種。
13-(2)-1rsCD14-ST(PSP64/356)表達質(zhì)粒的構(gòu)建使在SEQ ID No.3人CD14的64位Ala和65位Ast氨基酸之間插入了ProScission Protease識別序列(LEVLFQGP共8個氨基酸殘基、用單字母表示)的rsCD14(以下稱為rsCD14-ST(PSP64/356))表達的質(zhì)?？砂凑找韵路椒?gòu)建。分別設(shè)計并合成下述引物有義引物1 (5’-TTT CCT ACA GCT CCT GGG-3’)、有義引物2 (5’-GCT CTG GAA GTTCTG TTC CAG GGG CCC GAC ACG GTC AAG GCT CTC CGC GTG CGG-3’)(SEQ ID No.22)、反義引物11 (5’-GTCGGG CCC CTG GAA CAG AAC TTC CAG AGC ATA CTG CCG CGG GTC GGC GTC CGC-3’)(SEQ ID No.23)和反義引物12(5’-TCT CCA TTC CTG TGT TGC GC-3’)(SEQ ID No.24)以插入了SEQ ID No.3的可溶型人CD14結(jié)構(gòu)基因序列的質(zhì)粒pCAG356為模板，使用A有義引物1和反義引物11、B有義引物2和反義引物12進行PCR。PCR的反應(yīng)條件為A在90℃加熱2分鐘，然后將<1>98℃10秒、<2>50℃30秒、<3>72℃1分鐘的循環(huán)重復(fù)30次；B在90℃加熱2分鐘，然后將<1>98℃10秒、<2>46℃30秒、<3>72℃1分鐘的循環(huán)重復(fù)30次?；厥账肞CR擴增產(chǎn)物A約0.5kb、B約0.5kb，接著，以這兩種混合物為模板，使用有義引物1和反應(yīng)引物12進行PCR。PCR反應(yīng)條件與上述A相同?；厥账眉s0.9kb的PCR擴增產(chǎn)物，用限制酶EcoRI和XhoI切斷。將pCAG356用限制酶EcoRI和XhoI切斷，將所得約5.2kb的片段與上述片段連接，按照規(guī)定方法轉(zhuǎn)化E.coli JM109。所得表達質(zhì)粒為pCAG356(PSP64/356)。再將pCAG356用限制酶EcoRI和KpnI消化，回收約1.3kb的片段。將具有人EF-1α啟動子的哺乳細胞表達載體pTK-2043用EcoRI和KpnI消化，將所得約4.4kb的片段與上述片段連接，按照規(guī)定方法轉(zhuǎn)化E.coliJM109，得到pTK356(PSP64/356)。
13-(2)-2rsCD14-ST(2ST64/356)表達質(zhì)粒的構(gòu)建使在SEQ ID No.3人CD14第64位Ala和第65位Asp氨基酸之間插入了凝血酶識別序列(LVPRGS共6個氨基酸殘基)的rsCD14(以下可稱為rsCD14-ST(2ST64/356))表達的質(zhì)?？砂凑杖缦路椒?gòu)建。分別設(shè)計并合成下述引物有義引物3(5’-CTG GTT CCG CGT GGT TCC GACACG GTC AAG-3’)(SEQ ID No.25)、反義引物13(5’-GAA CCA CGC GGA ACC AGA GCA TAC TGC CGC-3’)(SEQ IDNo.26)、反義引物14 (5’-CGC GAT CCT CAA TGA TGATGA TGA TGA TGG-3’)(SEQ ID No.27)以pCAG356-His為模板，使用A有義引物1和反義引物13、B有義引物3和反義引物14進行PCR。其中所述pCAG356-His是在質(zhì)粒pCAG356的可溶型人CD14的C末端附加有His標志物(His×6個)分子的結(jié)構(gòu)基因序列。PCR的反應(yīng)條件是在96℃加熱2分鐘，然后將<1>96℃30秒、<2>55℃30秒、<3>72℃1分鐘的循環(huán)重復(fù)25次?；厥账肞CR擴增產(chǎn)物A約0.5kb、B約0.9kb，接著，以這兩種混合物作為模板，使用有義引物1和反義引物4進行PCR。PCR反應(yīng)條件與上述A同樣?；厥账眉s1.4kb的PCR擴增產(chǎn)物。插入到pT7-Blue(T)載體中，確認堿基序列。然后用限制酶EcoRI和BamHI切斷，得到約1.3kb片段。將pTK-2043用EcoRl和BamHI消化，將所得約4.4kb的片段與上述所得的約1.3kb的片段連接，按照規(guī)定方法轉(zhuǎn)化E.coliJM109，得到pTK356H(TB64)。
13-(3)rsCD14-ST的制備13-(3)-1rsCD14-ST的制備使用Fugene6(Roche)，將(1)中的各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-1細胞(ATTCCRL-1650)。即，按照使用說明，將1.7μL/mL轉(zhuǎn)染試劑和4μg/mL質(zhì)?；旌?，添加到培養(yǎng)基中，然后添加到COS-1細胞中，在37℃培養(yǎng)。72小時后回收培養(yǎng)上清，將培養(yǎng)上清離心，然后用0.22μm的濾器過濾。
13-(3)-2rsCD14的制備使用Fugene6(Roche)，將質(zhì)粒(pTK356(PSP64/356)和pTK356H(TB64))轉(zhuǎn)染COS-1細胞，所述質(zhì)粒分別含有編碼(2)-1和(2)-2的rsCD14-ST序列的基因。即，根據(jù)使用說明，將1.7μL轉(zhuǎn)染試劑和4μg/mL質(zhì)?；旌希砑拥脚囵B(yǎng)基中，然后添加到COS-1細胞中，在37℃培養(yǎng)。72小時后回收培養(yǎng)上清，添加新的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)96小時，也回收該培養(yǎng)上清。培養(yǎng)上清離心后，用0.22μm的濾器過濾，用于純化。
13-(3)-3rsCD14-ST的制備(2)由(3)-2中生產(chǎn)的各培養(yǎng)上清純化rsCD14-ST(PSP64/356)、rsCD14-ST(2ST64/356)，用蛋白分解酶切斷，然后純化rsCD14-ST。
<1>rsCD14-ST(2ST64)的純化以下的操作如無特別說明，均在4℃下實施。
向Chelating-瓊脂糖FF(Amersham Biosciences)載體上等容量通入0.1M硫酸鎳水溶液，接著加入3容量的蒸餾水沖洗，洗去未反應(yīng)的鎳，制備鎳-瓊脂糖載體。
將1000mL(3)-2所得的COS-1培養(yǎng)上清以8mL/分鐘的流速添加到經(jīng)PBS平衡的40mL鎳-瓊脂糖柱中，用PBS洗滌未吸附的蛋白質(zhì)。接著，用含有20mM咪唑的PBS洗脫非特異性吸附的蛋白質(zhì)，然后用含有500mM咪唑的PBS洗脫目標蛋白質(zhì)。用PBS對該洗脫液透析過夜。
可按照后述實施例15-(3)所示的方法測定透析液的蛋白濃度。根據(jù)該結(jié)果，添加凝血酶蛋白酶(Amersham Biosciences)，使酶∶底物＝1∶50(U∶μg)，在22℃靜置過夜，實施凝血酶切斷反應(yīng)。
添加1/10容量的100mM芐脒水溶液，中止酶促反應(yīng)，接著添加2倍容量的含8M尿素的50mM Tris-HCl(pH8.5)緩沖液。將該溶液以3mL/分鐘的流速供給預(yù)先用含有8M尿素的50mM Tris-HCl(pH8.5)緩沖液平衡的3mL Q-瓊脂糖HP柱(Amersham Biosciences)。用該緩沖液洗滌未吸附的蛋白質(zhì)，通過0-500mM氯化鈉直線濃度梯度(50分鐘)洗脫吸附的蛋白質(zhì)。將洗脫液分別取3mL，通過實施例7-(3)的試劑盒測定各組分中相當于將rsCD14-ST(2ST64/356)65位以后被切斷得到的rsCD14-ST(以下可稱為rsCD14-ST(2ST64))組分的含量。
收集含有rsCD14-ST(2ST64)的組分，用150mM碳酸氫銨水溶液透析過夜，然后冷凍干燥。將所得冷凍干燥標準品用含有8M尿素的PBS溶解，以0.4mL/分鐘的流速過預(yù)先用該緩沖液平衡的Superdex 7510/300GL柱(Amersham Biosciences)。將柱溶液各取0.45μL取40組，通過SDS-PAGE確認各組分中rsCD14-ST(2ST64)的純度，然后收集。即，向各組分中添加等容量的Tris-SDS-Seprasol(第一化學藥品株式會社)，在100℃加熱處理5分鐘，然后供給5-20％的e-PAGEL凝膠(ATTOCorporation)，按照Laemmli的方法，在非還原條件下，以25mA進行90分鐘電泳。電泳結(jié)束后，使用銀染試劑盒2D銀染試劑·II“第一”(第一化學藥品株式會社)對凝膠進行染色。將該2ST64標品用蒸餾水透析過夜，得到最終純化標準品。按照后述實施例15-(3)所示的方法，測定最終純化標準品的蛋白濃度。通過以上操作，由1000mL COS-1培養(yǎng)上清得到452μg rsCD14-ST(2ST64)。通過SDS-PAGE確認所得純化標準品的純度，如圖9所示，檢測出單一條帶。
<2>rsCD14-ST(PSP64)的純化以下操作如無特別說明，均在4℃下進行。
將(3)-2所得COS-1培養(yǎng)上清以9mL/分鐘的流速過預(yù)先經(jīng)PBS平衡的3C10-瓊脂糖4FF柱，用PBS洗滌未吸附的蛋白質(zhì)，然后用10mMHCl洗脫吸附蛋白質(zhì)。向洗脫組分中添加1/10容量的500mM重碳酸氫銨，使pH值恢復(fù)為中性，然后冷凍干燥。3C10-瓊脂糖4FF柱如下制備。使用具有10kDa截止分子量的透析膜，以2.5L含有0.5M氯化鈉的0.2M碳酸氫鈉(pH 8.3)作為透析液，在4℃下對3C10抗體透析過夜。透析液更換三次。接著，將預(yù)先用含有0.5M氯化鈉的0.2M碳酸氫鈉(pH 8.3)平衡的NHS-活化瓊脂糖4Fast Flow(AmershamBiosciences)添加到透析過的3C10抗體溶液中，在4℃進行偶聯(lián)反應(yīng)過夜。接著，向載體中加入含有0.5M氯化鈉的0.5M一甲醇胺(pH 8.3)，在4℃進行封閉反應(yīng)過夜。封閉反應(yīng)結(jié)束后，用含有0.5M氯化鈉的0.1M乙酸鈉(pH 4)洗滌載體，然后用含有0.5M氯化鈉的0.2M碳酸氫鈉(pH 8.3)洗滌載體。
將所得冷凍干燥標準品溶解于含有1mM EDTA和150mM氯化鈉的50mM Tris-HCl(pH 7)緩沖液中，按照后述實施例15-(3)所示方法測定蛋白濃度。然后添加PreScission Protease(AmershamBiosciences)，使酶∶底物比＝1∶3(U∶μg)，在4℃下實施切斷反應(yīng)過夜。反應(yīng)終止后，添加2倍容量的含有8M尿素的50mM Tris-HCl(pH8.5)緩沖液，以1mL/分鐘的流速過2mL Q-瓊脂糖HP柱。用相同的緩沖液洗滌未吸附的蛋白質(zhì)，然后通過0-500mM氯化鈉的直線濃度梯度(100分鐘)洗脫吸附的蛋白質(zhì)。各取3mL洗脫液，通過實施例7-(3)的試劑盒測定各組分中相當于將rsCD14-ST(PSP64-356)從65位以后切斷得到的rsCD14-ST(以下可稱為rsCD14-ST(PSP64))的組分的含量。
收集含有rsCD14-ST(PSP64)的組分，用150mM碳酸氫銨水溶液透析過夜，然后冷凍干燥。將所得冷凍干燥標準品溶解于含有8M尿素的PBS中，以0.4mL/分鐘的流速過預(yù)先用相同緩沖液平衡的Superdex 75 10/300GL柱(Amersham Biosciences)。各取0.45mL共40組分，通過<1>中所示的SDS-PAGE確認各組分的rsCD14-ST(PSP64)純度，然后收集。將該rsCD14-ST(PSP64)標準品用蒸餾水透析過夜，得到最終純化標準品。按照后述實施例15-(3)所示方法測定最終純化標準品的蛋白濃度。通過以上操作，由13,000mL的COS-1培養(yǎng)上清中得到368μg PSP64。通過SDS-PAGE確認所得純化標準品的純度，如圖9所示，檢測出單一條帶。
(實施例14)rsCD14-ST的評價14-(1)使用實施例7-(3)的試劑盒進行濃度測定為了確認在實施例13-(3)-1中制備的培養(yǎng)上清中產(chǎn)生了rsCD14-ST，使用實施例7-(3)的試劑盒，測定各培養(yǎng)上清中的rsCD14-ST濃度。結(jié)果如表9所示。通過實施例9-(4)的方法，對各培養(yǎng)上清進行蛋白質(zhì)印跡分析，結(jié)果完全未檢測出條帶。由此可以判斷，產(chǎn)生了rsCD14-ST，用可高靈敏度檢測的試劑盒可以檢測，但是實際蛋白量非常少。
表9

缺失體標記例1-65表示SEQ ID No.3的1位-65位的片段(rsCD14(1-65))14-(2)蛋白質(zhì)印跡法檢測rsCD14-ST確認實施例10-(1)中制備的rsCD14-ST和實施例13-(3)-3中制備的rsCD14-ST(PSP64)對F1106-13-3、F1031-8-3抗體和S68抗體的反應(yīng)性。即，SDS-PAGE使用12.5％凝膠，按照Laemmli的方法，在非還原條件下實施。向試樣中加入等容量的Tris-SDS-Seprasol(第一化學藥品株式會社)，在4℃進行SDS處理過夜，然后過12.5％的e-PAGEL凝膠(ATTO Corporation)，通過Laemmli的不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)，以40mA電泳40分鐘。
將預(yù)先切成SDS-PAGE凝膠大小的濾紙浸泡在5％甲醇/25mMTris/40mMε氨基己酸溶液中，放置在鉑電極半干轉(zhuǎn)印BE330(BiocraftLtd.)的陰極電極盤上，接著，將凝膠浸泡在相同的溶液中，與濾紙重疊，注意中間不要混入氣泡。然后，將預(yù)先用5％甲醇/25mM Tris平衡的硝基纖維素膜(轉(zhuǎn)移印跡的轉(zhuǎn)印介質(zhì)、Bio-Rad)重疊在凝膠上面，注意不要有氣泡混入。再將預(yù)先浸泡在相同溶液中的濾紙重疊其上，注意不要有氣泡混入，最后，將浸泡在5％甲醇/300mM Tris的濾紙重疊其上，注意不要有氣泡混入。在其上放置陽極電極，以2mA/cm2、在室溫下轉(zhuǎn)印2小時。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將硝基纖維素膜浸泡在Block-Ace封閉液(大日本制藥株式會社)中，在37℃進行80分鐘的封閉操作。然后在37℃下、使硝基纖維素膜與6.8μg/mL F1106-13-3抗體、6.8μg/mLF1031-8-3抗體或6.8μg/mL S68抗體反應(yīng)80分鐘，用0.05％吐溫20/PBS洗滌，然后在37℃下、與F1106-13-3抗體和F1031-8-3抗體反應(yīng)的硝基纖維素膜與抗兔IgG抗體-HRP共軛物(DAKO)、與S68抗體反應(yīng)的硝基纖維素膜與抗兔IgG抗體-HRP共軛物(DAKO)分別反應(yīng)1小時。反應(yīng)終止后，將硝基纖維素膜用0.05％吐溫20/PBS洗滌。洗去未反應(yīng)的共軛物，然后加入4mL ECL(Plus)(Amersham Biosciences)，在室溫下反應(yīng)5分鐘，然后重疊在HyperfilmTM ECL (AmershamBiosciences)上，曝光90秒。
結(jié)果，sCD14-ST和PSP64隊三種抗體均顯示大致同等的反應(yīng)性。
(實施例15)rsCD14-ST的物性分析對實施例13-(3)-3中制備的rsCD14-ST(2ST64)和rsCD14-ST(PSP64)的物性進行了分析。兩種片段在切斷時所使用的蛋白分解酶不同，除此之外最終純化品沒有差別，基本上均為rsCD14-ST，為同一物質(zhì)。
15-(1)N末端氨基酸序列分析N末端氨基酸序列分析使用蛋白質(zhì)測序儀Procise494cLC(AppliedBiosystems Japan Ltd.)。對rsCD14-ST(2ST64)純化標準品進行分析，結(jié)果確認從CD14第一個殘基開始的氨基酸序列(TTPEPCELDDG)(SEQ ID No.1)是主要成分。未見有CD14以外的氨基酸序列。
15-(2)質(zhì)量分析rsCD14-ST(2ST64)純化標準品是在20mM磷酸鈉緩沖液中添加N-葡糖苷酶F(Roche Diagnostics K.K.)，在37℃溫育4小時，除去糖鏈。所得到的除去了糖鏈的2ST64用ZipTip C18(Millipore)脫鹽，以此作為質(zhì)量分析用的試樣。質(zhì)量分析裝置使用autoflexII TOF(BrukerDaltonics Inc.)。底物溶液是將芥子酸用0.1％三氟乙酸∶乙腈＝2∶1混合溶液溶解，使其飽和。質(zhì)量分析用的試樣和底物溶液按1∶4的比例混合。使用1μL進行質(zhì)量分析。質(zhì)量分析的結(jié)果如下主峰檢測出與rsCD14-ST(2ST64)的肽部分的理論分子量7663.5一致的分子量峰。結(jié)合N末端氨基酸序列分析結(jié)果考慮，如所設(shè)計的那樣，如所設(shè)計，得到了具有一級結(jié)構(gòu)的分子(含有CD14的1位-64位的氨基酸序列的分子)。
15-(3)蛋白濃度的測定蛋白濃度的測定使用BRP測定試劑盒(Bio-Rad)，使用BSA(Bio-Rad)標準品，按照所符說明書進行測定。即，向BSA標準溶液和30μL用PBS稀釋成各種倍率的試樣中添加1.5mL用蒸餾水稀釋為5倍的Dye-Reagent，在室溫下靜置15分鐘，然后用分光光度計DU-7400(Beckmann)測定595nm下的吸光度，由BSA的校正曲線測定試樣中的蛋白濃度。
15-(4)分子量的計算為了確認實施例13-(3)-3中制備的rsCD14-ST與由敗血癥患者或正常人中純化得到的sCD14-ST是類似的蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)印跡法比較分子量。
由正常人血清得到的sCD14-ST的純化標準品是將實施例10-(1)所得到的凍干標準品溶解于100μL蒸餾水中使用。
使用Precision plus proteinTM雙色標準品(Bio-Rad制備)，通過實施例14-(2)所示的、使用F1031-8-3抗體的蛋白質(zhì)印跡法進行分子量比較，結(jié)果如圖10所示，來自人血清的sCD14-ST分子量為12.9kDa，rsCD14-ST(2ST64)為12.6kDa，rsCD14-ST(PSP64)為12.6kDa。
15-(5)與rsCD14(1-307)S286C標準品的比活性的比較使用實施例7-(1)的試劑盒和rsCD14(1-307)S286C標準品，測定實施例13-(3)-3中制備的rsCD14-ST(2ST64)的濃度，計算單位蛋白濃度的EIA值。即，用試劑盒的檢體稀釋液將rsCD14-ST(2ST64)稀釋為100pg/mL，然后再制備成50、25pg/mL，用試劑盒測定。結(jié)果，1pgsCD14-ST(2ST64)換算為rsCD14(1-307)S286C的換算值為352pg，顯示本試劑盒對rsCD14-ST(2ST64)的反應(yīng)性非常高。
15-(6)LPS結(jié)合能力以及對生成IL-6的影響對于rsCD14-ST是否與全長CD14同樣具有LPS結(jié)合能力、以及是否具有國際公開WO01/72993號的抑制IL-6生成的作用進行研究。
15-(6)-1 rsCD14-ST(PSP64)抑制IL-6生成的活性為了研究sCD14-ST(PSP64)抑制IL-6的生成的活性進行研究，進行了以下實驗。用含有2％失活FBS的RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma)，以2×104細胞/孔將人臍帶血管內(nèi)皮細胞HUVEC(三光純藥)接種于96孔板中，在5％二氧化碳、37℃培養(yǎng)過夜。第二天，制備含有2％人血清的RPMI1640培養(yǎng)基(以下稱為2％非FBS/RPMI)，用2％非FBS/RPMI將rsCD14-ST(PSP64)或抗CD14抗體3C10稀釋為目標濃度的2倍濃度，制備樣品。另外，用2％非FBS/RPMI將LPS(E.Coli 055B5、DIFCO)稀釋為20ng/mL。將培育過夜的HUVEC細胞的培養(yǎng)上清去掉，用含有0.1％HSA(Sigma)的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌兩次，分別以50μL/孔添加上述樣品和LPS稀釋液，再在5％二氧化碳、37℃下培養(yǎng)約18小時。然后，用人IL-6檢測試劑盒(Eli-PAIR hIL-6；Invitrogen)對培養(yǎng)上清中的IL-6的量進行定量。結(jié)果，3C10以約0.1μg/mL抑制50％的IL-6生成，而rsCD14-ST(PSP64)即使添加到10μg/mL濃度也完全不顯示抑制活性。
15-(6)-2rsCD14-ST(PSP64)與LPS的結(jié)合活性參考J.B.C 270卷No.3(1995)，1382-1387頁，“Soluble CD14Truncated at Amino Acid 152 Binds LPS and Enables Cellular Responseto LPS”，使用Endospecy試劑盒(生化學工業(yè))研究rsCD14ST(PSP64)與LPS的結(jié)合能力。即，用含有0.01％BSA的PBS-(以下稱為0.01％BSA/PBS)稀釋LPS(E.Coli 055B5、DIFCO)，制備0.6ng/mL的LPS溶液。用含有0.1％HSA的PBS-將rhLBP(R&D系統(tǒng))稀釋為100μg/mL，與上述LPS溶液混合，制備LPS/LBP溶液(LPS濃度約為0.6ng/mL、LBP濃度約為0.3nM)。接著，用0.01％BSA/PBS將rsCD14-ST(PSP64)或rsCD14(1-356)稀釋為目標濃度，與LPS/LBP溶液等量混合。在37℃反應(yīng)1小時，然后添加Endospecy C溶胞產(chǎn)物(EndospecyES-24S set；生化學工業(yè))，在室溫下靜置20分鐘。然后添加25％乙酸，終止反應(yīng)，用405nm測定吸光度，計算反應(yīng)液中的LPS濃度(以下稱為游離LPS濃度)。另外，校正曲線如下制作只將LPS稀釋溶液在37℃反應(yīng)1小時，然后與上述樣品同樣操作。結(jié)果，rsCD14(1-356)與添加濃度相關(guān)性地使游離LPS量低，可知rsCD14(1-356)與LPS結(jié)合，但是rsCD14-ST(PSP64)即使添加至100nM，游離LPS量也不變化，表明rsCD14-ST(PSP64)不具有與LPS結(jié)合的能力。
(實施例16)對rsCD14-ST標準品的研究16-(1)通過rsCD14-ST標準品制備標準曲線使用實施例13-(3)-3中制備的rsCD14-ST(2ST64)制作標準曲線。即，用實施例7-(12)的稀釋液將rsCD14-ST(2ST64)稀釋，制備成0.06、0.5、1.2、2、3ng/mL的濃度系列，使用實施例7-(1)的試劑盒測定?？瞻资褂孟♂屢骸Ｈ鐖D11所示，吸光度與濃度相關(guān)性地提高，可以將rsCD14-ST(2ST64)用作試劑盒的標準品。
16-(2)通過rsCD14-ST標準品制備標準曲線使用實施例7-(3)中制備的試劑盒，進行正常人血清中rsCD14-ST和含EDTA血漿中rsCD14-ST的測定，在含EDTA血漿中，sCD14-ST濃度與血清中的濃度相比，其數(shù)值約高2倍。原因可能是EDTA對于測定系統(tǒng)的影響，因此向稀釋液中添加EDTA，使?jié)舛葹?.2mg/mL，此時血清的測定值上升，與含EDTA的血漿沒有差別。不過，可知使用rsCD14(1-307)S286C標準品制作的標準曲線中，反應(yīng)性降低，EDTA的有無對其數(shù)值有影響。另一方面，以rsCD14-ST為標準品時，添加EDTA對于標準曲線沒有影響，由此可判斷rsCD14-ST更適合用作標準品。
(實施例17)使用rsCD14-ST制備抗體17-(1)rsCD14-ST特異性多克隆抗體的制備為了制備實施例13-(3)-3中制備的rsCD14-ST(PSP64)的多克隆抗體，對兔進行免疫。即，將20μg rsCD14-ST(PSP64)用500μL生理鹽水稀釋，與500μL的氟氏完全佐劑(DIFCO)等量混合，然后給予2.0-2.4kg雌性新西蘭白兔(北山ラベス)背部皮下。兩周后，將20μgrsCD14-ST(PSP64)用500μL生理鹽水稀釋，與500μL的氟氏不完全佐劑(DIFCO)等量混合，然后給予背部皮下。兩周后同樣地給予20μgrsCD14-ST(PSP64)。給予結(jié)束一周后，由耳靜脈采血，按照規(guī)定方法分離抗血清，純化抗體。首先，向抗血清中添加硫酸銨，使最終飽和濃度為33％，在4℃攪拌1小時，將析出的沉淀離心。接著將沉淀用Dulbecco-PBS緩沖液(以下稱為PBS(pH 7.4))溶解，透析過夜。將透析液過濾，過蛋白A柱(Procep-A Millipore)，通過0.1M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH 3.0)將所結(jié)合的IgG組分洗脫，得到純化抗體。用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm的吸光度計算蛋白濃度(吸光系數(shù)0.714mg/mL)。以下將所得抗體稱為抗PSP64多克隆抗體或抗PSP64抗體。
17-(2)sCD14-ST特異性單克隆抗體的制備為提高實施例13-(3)-3中制備的rsCD14-ST(PSP64)的抗原性，向rsCD14-ST(PSP64)中添加二硝基氟化苯(和光純藥)，使終濃度為0.1％，在室溫下溫育1小時，然后用PBS(pH 7.4)透析，以此作為給予抗原(以下可稱為DNP-PSP64抗原)。將30μg DNP-PSP64抗原溶解于100μL生理鹽水中，與氟氏完全佐劑(DIFCO)等量混合，分別以100μL給予8周齡雌性Wistar大鼠各后爪墊。兩周后，摘除髂骨淋巴結(jié)，進行細胞融合。細胞融合按照安東民衛(wèi)、千葉丈著“單克隆抗體實驗操作入門”83頁、1991年(講談社)進行。即，使用細胞濾過器(Falcon)，由淋巴結(jié)分離淋巴細胞，與骨髓瘤細胞(Sp2/O-Ag14)以5∶1混合，用聚乙二醇進行細胞融合。將融合的細胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，選別雜交瘤，然后篩選生產(chǎn)目標抗體的雜交瘤。
篩選采用將rsCD14-ST(PSP64)直接固定于板上的ELISA法。即，用0.1M磷酸緩沖液(pH 7.4)將rsCD14-ST(PSP64)稀釋為2.5μg/mL，將50μL添加到免疫板的各孔中，在4℃下靜置過夜。接著用離子交換水將免疫板洗滌五次，然后向各孔中添加100μL含有2％StabilGuard(Surmodics)的PBS(pH 7.4)，在室溫下靜置1小時進行封閉。將由各雜交瘤采集得到的培養(yǎng)上清添加到各孔中，在37℃反應(yīng)1小時，然后用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次。接著將過氧化物酶標記抗大鼠免疫球蛋白抗體(DAKO)用含有10％兔血清的PBS(pH 7.4)稀釋為1000倍，將該溶液以50μL添加到各孔中。在37℃反應(yīng)1小時，然后同樣洗滌五次，向各孔中添加四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB、BioFix)。在室溫下反應(yīng)10分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)。用讀板儀(Multi-Scan JX Thermo Electron Corporation制造)測定450nm的吸光度，選擇含有雜交瘤的孔，該雜交瘤生成與2ST64蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。接著按照安東民衛(wèi)、千葉丈著“單克隆抗體實驗操作入門”83頁、1991年(講談社)，通過有限稀釋法，由選擇的孔進行克隆。10天后，以對2ST64蛋白質(zhì)的反應(yīng)性作為指標，同樣地進行篩選，選擇了6種雜交瘤，將選擇的雜交瘤用10％ FCS/RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma)培養(yǎng)，然后用雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)培養(yǎng)，生成抗體，用蛋白G柱(Prosep-G、Millipore)純化抗體。通過大鼠分型試劑盒(ZYMED)確定純化的F1237-3-4抗體和F1237-4-4抗體的亞型，亞型分別為大鼠IgG2a·κ、大鼠IgG2b·κ。
17-(3)與不高分子量CD14結(jié)合的rsCD14-ST特異性抗rsCD14-ST多克隆抗體的制備為了制備與存在于敗血癥患者體內(nèi)的sCD14-ST特異性結(jié)合、但不與高分子量CD14結(jié)合的多克隆抗體，將實施例13-(3)-3中制備的rsCD14-ST(PSP64)免疫兔。即，將20μg rsCD14-ST(PSP64)用500μL生理鹽水稀釋，與500μL氟氏完全佐劑(DIFCO)等量混合，然后給予2.0-2.4kg雌性新西蘭白兔(北山ラベス)的背部皮下。兩周后，將20μgrsCD14-ST(PSP64)用500μL生理鹽水稀釋，與500μL氟氏不完全佐劑(DIFCO)等量混合，然后給予背部皮下。兩周后，同樣給予20μgrsCD14-ST(PSP64)，給予結(jié)束一周后，由耳靜脈采血，按照規(guī)定方法分離抗血清，純化抗體。首先，向抗血清中加入硫酸銨，使最終飽和濃度為33％，在4℃下攪拌1小時，然后將析出的沉淀離心。接著將沉淀用Dulbecco-磷酸緩沖液(以下稱為PBS(pH 7.4))溶解，透析過夜，將透析液過濾，然后過蛋白A柱(Prosep-G、Millipore)，通過0.1M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH 3.0)洗脫所結(jié)合的IgG組分，得到純化抗體。用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm吸光度計算蛋白濃度(吸光系數(shù)0.714mg/mL)。使用結(jié)合有實施例22中制備的高分子量CD14或?qū)嵤├?中制備的rsCD14(1-356)的樹脂，對所得純化抗PSP64多克隆抗體進行特異性純化，得到只與rsCD14-ST結(jié)合的抗體。即，按照說明，使5mg高分子量CD14或rsCD14(1-356)與HiTrap NHS-活化HP柱(AmershamBioscience)結(jié)合，制備特異性純化用親和柱。接著，將用蛋白A柱純化的抗體過特異性純化用親和柱，回收不與高分子量CD14或rsCD14(1-356)結(jié)合的抗體。將所得抗體濃縮，用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm的吸光度計算蛋白濃度(吸光系數(shù)0.714mg/mL)。
17-(4)不與高分子量CD14結(jié)合的rsCD14-ST特異性抗rsCD14-ST單克隆抗體的制備為了提高實施例13-(3)-3中制備的rsCD14-ST(PSP64)的抗原性，向rsCD14-ST(PSP64)中添加二硝基氟化苯(和光純藥)，使終濃度為0.1％，在室溫下溫育1小時，然后用PBS(pH 7.4)透析，由此制成給予抗原(以下可稱為DNP-PSP64抗原)。將30μg DNP-PSP64抗原溶解于100μL生理鹽水中，與氟氏完全佐劑(DIFCO)等量混合，分別以100μL給予Wistar大鼠或8周齡雌性ddY小鼠各后爪墊。兩周后摘除髂骨淋巴結(jié)進行細胞融合。細胞融合按照安東民衛(wèi)、千葉丈著“單克隆抗體實驗操作入門”83頁、1991年(講談社)進行。即，使用細胞篩網(wǎng)(Falcon)，從淋巴結(jié)中分離淋巴細胞，以5∶1與骨髓瘤細胞(Sp2/O-Ag14)混合，使用聚乙二醇進行細胞融合。將融合的細胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，選別雜交瘤，然后篩選生產(chǎn)目標抗體的雜交瘤。
篩選采用將rsCD14-ST(PSP64)、高分子量CD14或rsCD14(1-356)直接固定于板上的ELISA法。即，用PBS(pH 7.4)將 rsCD14-ST(PSP64)、高分子量CD14或rsCD14(1-356)稀釋為2.5μg/mL，將50μL該稀釋液添加到免疫板的各孔中，在4℃下靜置過夜。接著用離子交換水將板洗滌五次，然后向各孔中添加100μL含有2％StabilGuard(Surmodics)的PBS(pH 7.4)，在室溫下靜置1小時，進行封閉。將由所得雜交瘤采集得到的培養(yǎng)上清添加到各孔中，在37℃反應(yīng)1小時，然后用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次。接著將過氧化物酶標記抗大鼠免疫球蛋白抗體(DAKO)或過氧化物酶標記抗小鼠免疫球蛋白抗體(DAKO)用含有10％兔血清的PBS(pH 7.4)稀釋1000倍，向各孔中添加50μL所得溶液。在37℃反應(yīng)1小時，然后同樣的洗滌五次，向各孔中添加四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB、BioFix)。在室溫下反應(yīng)10分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)。用讀板儀(Multi-Scan JX ThermoElectron Corporation制造)測定450nm的吸光度，選擇含有雜交瘤的孔，該雜交瘤生成與rsCD14-ST結(jié)合但不與高分子量CD14或rsCD14(1-356)結(jié)合的抗體。接著，按照安東民衛(wèi)、千葉丈著“單克隆抗體實驗操作入門”83頁、1991年(講談社)，通過有限稀釋法，由所選擇的孔進行克隆。10天后，以對2ST64的反應(yīng)性為指標同樣地篩選，選擇雜交瘤。將選擇的雜交瘤用10％FCS/RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma)培養(yǎng)，然后用雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)培養(yǎng)，生成抗體，使用蛋白G柱(Prosep-G、Millipore)或蛋白A柱(Prosep-A、Millipore)純化抗體。用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm吸光度計算蛋白濃度(吸光系數(shù)0.714mg/mL)。使用市售試劑盒對純化的抗體的亞型進行確定。
17-(5)與檢體的保存方法不相關(guān)的rsCD14-ST特異性抗rsCD14-ST單克隆抗體的選擇得到了保存狀態(tài)對測定結(jié)果沒有影響的試劑盒用單克隆抗體。即，由實施例17-(4)中制備的rsCD14-ST的單克隆抗體中測定sCD14-ST，以此作為實施例22的夾層系統(tǒng)的標記抗體，在選擇具有在敗血癥患者中上升的性能的抗體后，測定檢體中的sCD14-ST。測定冷凍保存的檢體和24小時室溫下保存的檢體兩者，選擇測定值差異小的抗體的組合。
(實施例18)抗sCD14-ST(PSP64)多克隆抗體的反應(yīng)性確認了實施例17-(1)中制備的抗PSP64多克隆抗體的反應(yīng)性。與實施例17-(2)同樣，固定rsCD14-ST(PSP64)。將含有實施例17-(1)中制備的抗PSP64多克隆抗體的抗血清和作為對照的正常兔血清用PBS(pH 7.4)稀釋500倍，然后翻倍稀釋，制備稀釋至32000倍的稀釋系列。將各稀釋液添加到封閉后的孔中，在37℃反應(yīng)1小時，然后用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次。接著將過氧化物酶標記抗兔免疫球蛋白抗體(DAKO)用含有10％山羊血清的PBS(pH 7.4)稀釋1000倍，向各孔中添加50μL所得稀釋溶液。在37℃反應(yīng)1小時，然后同樣地洗滌五次，向各孔中添加四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB、BioFix)。在室溫下反應(yīng)10分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)。用讀板儀(Multi-Scan JX Thermo Electron Corporation制造)測定450nm的吸光度，確認與rsCD14-ST(PSP64)的結(jié)合，如圖12所示，在給予了rsCD14-ST(PSP64)的兔中，吸光度與稀釋倍率相關(guān)性地提高，而在正常兔血清中則不上升，由此可確認生成了rsCD14-ST(PSP64)蛋白質(zhì)特異性抗體。
(實施例19)制備使用抗rsCD14-ST抗體的sCD14-ST測定系統(tǒng)將S68肽多克隆抗體用D-PBS(pH 7.4)稀釋為10μg/mL，向免疫板的各孔中添加50μL。在4℃反應(yīng)過夜，用離子交換水洗滌五次，向各孔中添加100μL含有0.1％Stabi1Guard(SurModics制備)和0.1％吐溫20的D-PBS，進行封閉。接著，以含有1％CD14吸收血清、1％BSA的76mM PBS(pH 7.4)作為稀釋液，制備0、0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1.2ng/mL rsCD14-ST(2ST64)蛋白質(zhì)標準品稀釋系列。向每孔中添加50μL標準品稀釋系列，在37℃反應(yīng)2小時，反應(yīng)終止后，用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次，添加50μL含有F1237-3-4抗體的1％胎牛血清/雜交瘤-SFM溶液。在37℃反應(yīng)1小時，然后同樣地洗滌三次，用含有10％兔血清的D-PBS(pH 7.4)將過氧化物酶標記抗大鼠免疫球蛋白抗體(DAKO)稀釋為干分之一，向各孔中添加50μL。在37℃反應(yīng)1小時，然后同樣地洗滌五次，向各孔中添加四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB、BioFix)，在室溫下反應(yīng)10分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)，用讀板儀(Multi-Scan JX Thermo Electron Corporation制造)測定450nm下的吸光度。圖13中給出了制備的標準曲線。
(實施例20)通過新型sCD14-ST測定系統(tǒng)測定血清使用實施例1 9中制備的夾層EIA系統(tǒng)，測定了5例正常人和5例敗血癥患者的血清。結(jié)果如表10所示，正常人血清中，sCD14-ST濃度為1ng/mL，而敗血癥患者為6.47ng/mL，濃度約高6倍，與實施例11同樣，顯示可以鑒別敗血癥患者。如實施例16所示，與實施例11濃度的不同是由于標準品的區(qū)別而引起的。
表10

(實施例21)對sCD14-ST蛋白質(zhì)特異性單克隆抗體的評價為了明確sCD14-ST抗體的特異性，測定了對各種CD14蛋白質(zhì)的親和性。通過抗原固相EIA系統(tǒng)測定對各種抗原的反應(yīng)性。
21-(1)使用BIACORE測定解離常數(shù)(KD)使用Biacore3000(Biacore)，分析與實施例17-(2)中制備的F1237-3-4抗體和作為抗CD14抗體的3C10抗體(ATCC TIB-228)的反應(yīng)速度常數(shù)。首先，分別使用胺偶聯(lián)試劑盒(Biacore)，將rsCD14-ST(2ST64)和rsCD14-ST(1-356)固定在傳感器芯片CM5(Biacore)上。測定使用HBS-EP(Biacore)作為起始緩沖液，通過將各抗體的稀釋系列(1.25nM-640nM，根據(jù)抗體改變濃度)注射到流式細胞分選儀中進行。數(shù)據(jù)分析是由固定各抗原的流式細胞分選儀的測定數(shù)據(jù)減去背景數(shù)據(jù)，再減去只有起始緩沖液的數(shù)據(jù)，使用biaevaluatin soft wear 4.1版(Biacore)實施。使用Bivalent分析儀計算解離常數(shù)(KD)，結(jié)果如表11所示。F1237-3-4抗體顯示對rsCD14-ST的高親和性，由于基本上不與rsCD14(1-356)結(jié)合，因此KD無法計算。3C10基本上不與rsCD14-ST結(jié)合，對rsCD14(1-356)顯示高親和性。
表11

21-(2)使用抗原固相EIA系統(tǒng)分析抗原特異性通過抗原固相EIA系統(tǒng)測定對實施例17-(2)中制備的F1237-3-4抗體和作為抗CD14抗體的3C10抗體與高分子量CD14的反應(yīng)性。即，與實施例13-(2)同樣的調(diào)節(jié)免疫板(Maxisorb、NUNC)，用D-PBS(pH 7.4)將高分子量CD14稀釋為2.5μg/mL，向各孔中添加50μL，在4℃下靜置過夜。接著將板用離子交換水洗滌五次，然后向各孔中添加100μL含有2％StabilGuard(Surmodics)的PBS(pH 7.4)，在室溫下靜置1小時，進行封閉。用PBS(pH 7.4)將F1237-3-4抗體、3C10抗體稀釋為1μg.mL，添加到各孔中，在37℃反應(yīng)1小時，然后用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次。接著對各抗體的過氧化物酶標記抗免疫球蛋白抗體(DAKO)用含有10％血清的PBS(pH 7.4)稀釋為1000倍，向各孔中添加50μL所得溶液。在37℃反應(yīng)1小時，然后同樣洗滌五次，向各孔中添加四甲基聯(lián)苯胺(TMB、BioFix)溶液。在室溫下反應(yīng)10分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)。用讀板儀(Multi-Scan JX ThermoElectron Corporation制造)測定450nm的吸光度。結(jié)果，3C10與高分子量CD14強力結(jié)合，而F1237-3-4抗體實質(zhì)不結(jié)合。
(實施例22)使用抗rsCD14-ST抗體的sCD14-ST測定系統(tǒng)的制備(2)22-(1)夾層EIA法按照實施例3-(3)的方法制備表12所示的由抗體的各種組合構(gòu)建的夾層EIA系統(tǒng)。如表12所示，對于使用實施例17中制備的單克隆抗體的sCD14測定系統(tǒng)，在正常人中均未上升，對敗血癥患者特異性上升。
表12

22-(2)競爭EIA法用PBS將F1237-3-4抗體稀釋為10μg/mL，添加到孔中。在4℃下靜置過夜，使其結(jié)合，接著用2％StabilGuard/PBS(pH 7.4)封閉。將25μL敗血癥患者血清和正常人血清添加到板中，接著用含有1％BSA、0.1％吐溫20的PBS(pH 7.4)將過氧化物酶標記sCD14-ST抗原稀釋為0.5μg/mL，添加到板中，在37℃反應(yīng)1小時，然后用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次。添加TMB溶液(BioFix)，使其顯色，再用0.5M硫酸水溶液終止反應(yīng)，以450nm測定吸光度。吸光度與血液中的sCD14-ST濃度相關(guān)性地降低，因此測定的值反應(yīng)了血液中sCD14-ST的量，可以確認sCD14-ST濃度在正常人中低，在敗血癥患者中特異性增高。另外，標記物可以使用其它酶、放射性化合物、熒光物質(zhì)、化學發(fā)光物質(zhì)、膠體金、染料或膠乳等。
(實施例23)用于測定該血液中可溶型蛋白質(zhì)的抗體的篩選方法為了制備在實施例9中純化并鑒定的血液中可溶型蛋白質(zhì)的測定系統(tǒng)，構(gòu)建了兩種可用于測定的篩選方法。
23-(1)制備作為篩選對象的抗體作為篩選對象的抗體可按照實施例1的記載，制備與含有選自SEQID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基的肽結(jié)合的抗體?？扇缦轮苽?。<1>根據(jù)CD14全長序列，按照常規(guī)方法合成肽，制備免疫抗原，制備抗體。<2>純化血清中的純化可溶性CD14抗原，以其作為免疫原制備抗體。<3>使用COS細胞或大腸桿菌制備重組CD14蛋白質(zhì)，以其作為免疫原制備抗體。<4>將制備的各種CD14抗原通過熱改性或DNP化等處理，以其作為免疫原制備抗體。
例如，P001抗體(以含有SEQ ID No.4氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體)、P002抗體(以含有SEQ ID No.5氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體)可如下制備通過實施例1的方法制備，使其與載體蛋白結(jié)合，然后給予，制備抗體。并且，實施例1-(4)中制備的S68抗體、實施例2中制備的F1146-17-2抗體、實施例3-(2)[2]中制備的F1031-8-3抗體、實施例3-(2)[1]中制備的F1106-13-3抗體、實施例17-(2)中制備的F1237-3-4抗體和實施例17-(1)中制備的抗PSP64抗體也可用作篩選檢體。如上所述，制備與含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基的肽結(jié)合的抗體，使用該抗體，按照以下順序，篩選可特異性檢測該血液中可溶型蛋白質(zhì)的抗體。
23-(2)抗原固相法這是用于測定血液中可溶型蛋白質(zhì)的抗體的篩選方法，其特征在于利用來自正常人的高分子量CD14蛋白質(zhì)與抗體的反應(yīng)性差異。通過抗原固相法對與高分子量CD14蛋白質(zhì)的反應(yīng)性的差異進行分析，由此篩選不與存在于正常人血清中的高分子量CD14結(jié)合、但與該血液中可溶型蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
高分子量CD14的制備首先，如下制備高分子量CD14蛋白質(zhì)。將人血清(日本Biotest)添加到3C10抗體結(jié)合樹脂柱(5mL)中，用PBS洗滌，然后用6M尿素水溶液洗脫。將洗脫液用PBS透析，然后冷凍干燥，接著用凝膠過濾柱(Superdex 75 10/300GL、Amershamバイオサイエンス)分組。用市售可溶性CD14蛋白質(zhì)試劑盒(IBL-試劑盒)鑒定所得各組分，收集與IBL-試劑盒反應(yīng)的高分子量CD14組分，冷凍干燥。將凍干物溶解，再次用IBL試劑盒測定，計算濃度。
抗原固相EIA法抗原固相EIA法如下進行。首先，將高分子量CD14以2.5μg/mL在免疫板上、在4℃下靜置過夜，使其與免疫板結(jié)合。接著，用2％StabilGuard/PBS(pH 7.4)進行封閉，用PBS將各抗體稀釋為1μg/mL。各抗原添加到固相化的各孔中。在37℃反應(yīng)1小時，然后用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次。接著用含有10％兔血清、0.05％吐溫20的PBS(pH 7.4)將各抗體的過氧化物酶標記抗γ球蛋白抗體(DAKKO制備)稀釋，在室溫下反應(yīng)1小時。同樣地洗滌五次，添加TMB溶液(BioFix)，使其顯色，再用0.5M硫酸水溶液終止反應(yīng)。接著，以450nm測定抗體的吸光度，選擇對于高分子量CD14吸光度不升高的抗體。通過上述方法選擇了F1237-3-4抗體。
如果使用sCD14-ST代替上述與板結(jié)合的抗體，則可以選擇不與sCD14-ST結(jié)合的抗體。
如下進行斑點印跡法。首先，在轉(zhuǎn)移印跡的轉(zhuǎn)印介質(zhì)上以約400ng/斑點進行高分子量CD14的點樣并干燥。接著使用100％Block-Ace(雪印乳業(yè))進行封閉。將兩種固定化CD14和用含有10％Block-Ace、0.05％吐溫20的PBS(pH 7.4)稀釋的各種抗CD14抗體在室溫下反應(yīng)1小時。接著用含有0.05％吐溫20的PBS(pH 7.4)洗滌5分鐘，共洗滌五次。接著用含有10％Block-Ace、0.05％吐溫20的PBS(pH 7.4)稀釋過氧化物酶標記抗兔免疫球蛋白抗體(DAKKO制備、P448)，將各膜在室溫下反應(yīng)1小時。同樣洗滌五次，使用ECL-PLUS(Amersham)，使用化學發(fā)光檢測裝置(CoolSaver AE-6955、ATTO)，以發(fā)光的形式檢測有無抗體結(jié)合。在用于篩選的抗體中，選擇在高分子量CD14處未檢測出斑點的抗體。
23-(3)夾層免疫測定法該方法是用于測定血液中可溶型蛋白質(zhì)的抗體的篩選方法，其特征在于利用正常人血清和敗血癥患者血清中檢測的量的差異。將兩種抗CD14抗體組合，制備夾層ELISA系統(tǒng)。測定正常人和敗血癥患者檢體。
過氧化物酶標記抗體的制備按照實施例3-(3)，對12-(1)中制備的抗體制備其過氧化物酶標記抗體。
夾層EIA系統(tǒng)的制備將作為篩選對象的各抗體用D-PBS(pH 7.4)稀釋為10μg/mL，向免疫板(Maxisorb、NUNC)的各孔中添加50μL。在4℃下反應(yīng)過夜，然后用離子交換水洗滌五次，向各孔中添加100μL含有2％StabilGuard(SurModics)的D-PBS，進行封閉。接著以含有0.1％BSA的PBS(pH 7.4)作為稀釋液，制備0、3.12、6.25、12.5、25、50、100、200ng/mL的CD14(1-307)S286C蛋白質(zhì)標準品稀釋系列和10倍稀釋的檢體。向各孔中添加50μL標準品稀釋系列和稀釋檢體，在37℃反應(yīng)1小時，反應(yīng)終止后，用含有0.05％吐溫20的生理鹽水洗滌三次，用含有2％大鼠血清、1％小鼠血清、0.1％吐溫20的PBS(pH 7.4)將過氧化物酶標記抗體稀釋為1μg/mL，向各孔中添加50μL。在37℃下反應(yīng)1小時，然后同樣洗滌五次。向各孔中添加四甲基聯(lián)苯胺(TMB、BioFix)溶液。在室溫下反應(yīng)20分鐘，然后用0.5M硫酸溶液終止反應(yīng)，用讀板儀(NJ-2100、NJ-2100，Japan Intermed)測定450nm的吸光度。
通過夾層EIA系統(tǒng)篩選抗體下面，對于在本系統(tǒng)中可制作標準曲線的組合，篩選其是否可以特異性檢測該血液中可溶型蛋白質(zhì)。通過[1]中制備的測定系統(tǒng)，對2例敗血癥患者和2例正常人血清進行測定，通過選擇在正常人中顯示低數(shù)值、在敗血癥患者中顯示高數(shù)值的測定系統(tǒng)的抗體組合，篩選了可特異性檢測敗血癥患者的抗體組合。結(jié)果選擇了實施例7-(1)-(8)和實施例12的抗體組合。預(yù)先通過IBL-試劑盒求出各血清中高分子量CD14的測定值，則可以選擇不能測定高分子量CD14的測定系統(tǒng)中的抗體組合。
(實施例24)使用rsCD14-ST進行的抗體篩選方法關(guān)于使用rsCD14-ST篩選抗體的方法，研究了兩種方法。
24-(1)抗原固相EIA法用于篩選可特異性檢測rsCD14-ST的抗體的方法可通過使用實施例17-(2)的抗體篩選方法、即、將rsCD14-ST(PST64)直接固定于板上的ELISA法進行。
表13中給出了各種抗體的篩選結(jié)果。其中，MY4(Colter制備)、MEM18(Monosan制備)、61D3(Southern Biotechnology Associates，Inc.)和各種γ球蛋白使用市售商品。
表13

24-(2)夾層EIA法用于篩選可特異性檢測sCD14-ST的抗體的方法，制備了實施例23-(2)的夾層EIA系統(tǒng)。即，將作為篩選對象檢體的各種抗體固定在板上，以rsCD14-ST(PSP64)作為抗原，再通過使用過氧化物酶標記F1106-13-3抗體或過氧化物酶標記F1031-8-3抗體的夾層ELISA法進行。
表14給出了各種抗體的篩選結(jié)果?？笻CG抗體采用市售商品。
表14

(實施例25)sCD14-ST的化學合成化學合成了具有人CD14的N末端1位-70位氨基酸的可溶性多肽(以下稱為sCD14(1-70))。
使用肽合成儀ABI433A(Applied)，按照氨基酸序列排列氨基酸柱，進行自動合成。合成的肽按照規(guī)定方法由樹脂切出，用乙醚沉淀并回收，然后再次用蒸餾水溶解，冷凍干燥。所得粗純化肽溶解后，用C18反相HPLC(CAPCELL-PAK、資生堂)、用5-70％的乙腈濃度線性梯度洗脫，回收含有目標肽的組分。回收的組分冷凍干燥，制成純化肽。使用實施例17-(12)的稀釋液溶解純化肽，通過實施例7-(3)的試劑盒測定，顯示與實施例7-(3)的試劑盒強烈反應(yīng)，顯示由化學合成制備的sCD14-ST也可以作為標準品。
(實施例26)由彈性酶處理的PHP-1細胞表達的sCD14-ST的測定將用維生素D3刺激的1×106個PHP-1細胞懸浮于含有0.1％BSA的RPMI1640培養(yǎng)基中，添加人白細胞彈性酶(Elastin Products制備)，終濃度為1μM，制備最終液量為200μL的反應(yīng)液。將反應(yīng)液在37℃溫育1、3、10、30或60分鐘，然后添加苯甲基磺酰氟，中止酶促反應(yīng)?；厥崭鞣磻?yīng)液的上清，通過實施例7-(1)的試劑盒測定上清中所含的sCD14-ST。結(jié)果，添加彈性酶3分鐘后，sCD14-ST濃度上升，之后緩慢減少。
產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明提供一種新型的抗原，該抗原具有存在于人血液中的CD14序列。本法明還提供敗血癥的診斷方法或敗血癥的檢測方法，該方法通過測定該抗原實現(xiàn)。
本發(fā)明還提供與該抗原的免疫功能類似的重組型可溶性片段。又提供生產(chǎn)該重組型可溶性片段的方法。還提供與該片段結(jié)合的新型抗體。
本發(fā)明還提供試劑盒和測定方法，所述試劑盒含有“與含有人全長可溶型CD14蛋白質(zhì)的特定氨基酸序列的肽結(jié)合的抗體”、“以含有人全長可溶型CD14的特定氨基酸序列的肽作為抗原制備的抗體”或“與該片段結(jié)合的抗體”或該抗體的片段作為構(gòu)成要素，可測定該抗原。
本發(fā)明又提供可用作該蛋白質(zhì)測定的抗體的篩選方法。
序列表<110>Mochida Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>新型可溶性CD14抗原<130>MD0734<160>27<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>11<212>PRT<213>人<400>1Thr Thr Pro Glu Pro Cys Gl u Leu Asp Asp Glu1 510<210>2<211>16<212>PRT<213>人<400>2Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys1 5 10 15<210>3<211>356<212>PRT<213>人
<400>3Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val1 5 10 15Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala Phe Gln Cys20 25 30Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu Asn Leu Glu35 40 45Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala50 55 60Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val Gly Ala Ala65 70 75 80Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val Leu Ala Tyr85 90 95Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile Thr Gly Thr100 105 110Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Ser Leu115 120 125Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp Leu Ala Glu130 135 140Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser Ile Ala Gln145 150 155 160Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Ala Phe Pro Ala165 170 175Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly Glu Arg Gly180 185 190Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile Gln Asn Leu195 200 205Ala Leu Arg Asn Thr Gly Ile Glu Thr Pro Thr Gly Val Cys Ala Ala
210 215 220Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu Ser His Asn225 230 235 240Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys Met Trp Ser245 250 255Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu Glu Gln Val260 265 270Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Cys Asn275 280 285Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu Val Asp Asn290 295 300Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr Ala Leu Pro305 310 315 320His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg Ser325 330 335Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu Gln Gly Ala340 345 350Arg Gly Phe Ala355<210>4<211>17<212>PRT<213>人<400>4Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val1 5 10 15Cys
<210>5<211>19<212>PRT<213>人<400>5Arg Cys Val Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala1 5 10 15Phe Gln Cys<210>6<211>68<212>PRT<213>人<400>6Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys Val1 5 10 15Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala Phe Gln Cys20 25 30Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu Asn Leu Glu35 40 45Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala50 55 60Asp Thr Val Lys65<210>7<211>13
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(Oligomer8linkS)<400>7agcttaggaa ttt 13<210>8<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(Oligomer8linkA)<400>8ctagaaattc cta 13<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(有義引物A)<400>9acatctagat gaccacgcca gaacct 26<210>10<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 A)<400>10tttggatcct tactagagat cgagcaatct 30<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(有義引物 1)<400>11tttcctacag ctcctggg 18<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 1)<400>12ggggtacctt agtcagcata ctgccgcggg tc 32<210>13<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA(反義引物 2)<400>13ggggtacctt agagagcctt gaccgtgtca gc 32<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 3)<400>14ggggtacctt agagccgccg cacgcggaga gc 32<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 4)<400>15ggggtacctt atgcggctcc cactgtgagc cg 32<210>16<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 5)<400>16ggggtacctt actgagcagg aacctgtgcg gc 32<210>17<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 6)<400>17ggggtacctt aggcgcctac cagtagctga gc 32<210>18<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 7)<400>18ggggtacctt acgctagcac acgcagggcg cc 32<210>19<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 8)
<400>19ggggtacctt acttgaggcg ggagtacgct ag 32<210>20<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 9)<400>20ggggtacctt actcgagcgt cagttccttg ag 32<210>21<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 10)<400>21ggggtacctt aggttatctt taggtcctcg ag 32<210>22<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(有義引物 2)<400>22
gctctggaag ttctgttcca ggggcccgac acggtcaagg ctctccgcgt gcgg 54<210>23<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 11)<400>23gtcgggcccc tggaacagaa cttccagagc atactgccgc gggtcggcgt ccgc 54<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 12)<400>24tctccattcc tgtgttgcgc20<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(有義引物 3)<400>25ctggttccgc gtggttccga cacggtcaag 30
<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 13)<400>26gaaccacgcg gaaccagagc atactgccgc 30<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的DNA(反義引物 14)<400>27cgggatcctc aatgatgatg atgatgatgg 30
權(quán)利要求
1.可溶性CD14抗原，該抗原具有下述1)-3)的性質(zhì)1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)N末端序列具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，以及3)與以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合。
2.重組型可溶性CD14片段，該片段具有下述1)-3)的性質(zhì)，由下述<1>-<3>的步驟獲得1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合，以及3)與以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合；<1>制備具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，其中被取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶切斷部位的序列；或者制備具有該部分序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)域有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，<2>將<1>中制備的重組型可溶性CD14片段用該規(guī)定的蛋白分解酶切斷的步驟，以及<3>回收<2>中切斷的片段的N末端一側(cè)的片段的步驟。
3.權(quán)利要求2的重組型可溶性CD14片段，其中，在上述<1>的步驟中，制備具有下述4)-7)的序列的重組型可溶性CD14片段4)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，5)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，6)C末端為SEQ ID No.3的134位-356位其中之一，以及7)在SEQ ID No.3的59位-90位的任一位置后取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位的序列。
4.權(quán)利要求2或3的重組型可溶性CD14片段，該片段具有下述8)-10)的序列8)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)域有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，9)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位的其中之一，以及10)C末端為SEQ ID No.3的59位-90位的其中之一。
5.重組型可溶性CD14片段，該片段具有下述1)-3)的性質(zhì)1)非還原條件下的SDS-PAGE中，分子量為13±2kDa，2)不與3C10和MEM-18特異性結(jié)合，以及3)與以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合。
6.敗血癥的診斷或檢測方法，其特征在于測定權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原。
7.權(quán)利要求6的敗血癥的診斷或檢測方法，其特征在于含有下述步驟1)對由受試者采集的血液中所含的權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原進行測定的步驟，2)將測定值與正常人的標準值進行比較的步驟，以及3)評價受試者是否為敗血癥的步驟。
8.可溶性CD14抗原測定試劑盒，其用于測定檢體中所含的權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原，該測定試劑盒含有至少一種與權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原結(jié)合的抗體或該抗體的片段。
9.權(quán)利要求8的可溶性CD14抗原的測定試劑盒，其特征在于其含有作為與權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原結(jié)合的抗體或該抗體的片段的、以下a)-d)任一項的抗體或該抗體的片段a)與含有SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基的肽結(jié)合的抗體，b)以含有選自SEQ ID No.2氨基酸序列的連續(xù)8-16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，c)以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體，d)與權(quán)利要求2的重組型可溶性CD14片段或權(quán)利要求5的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體。
10.權(quán)利要求8或9的可溶性CD14抗原測定試劑盒，其中，與上述權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原結(jié)合的抗體或該抗體的片段為d)與權(quán)利要求2的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合的抗體或該抗體的片段。
11.權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原的免疫學測定方法，其特征在于將至少一種與權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原結(jié)合的抗體或該抗體的片段與權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合。
12.抗體，該抗體與權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原特異性結(jié)合。
13.抗體，該抗體與權(quán)利要求2的重組型可溶性CD14片段特異性結(jié)合。
14.權(quán)利要求13的抗體，該抗體基本上不與人血液中的全長可溶型CD14蛋白質(zhì)結(jié)合，而與權(quán)利要求2的重組型可溶性CD14片段結(jié)合。
15.權(quán)利要求13的抗體，該抗體為F1237-3-4抗體。
16.可用于測定權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原的抗體的篩選方法，該方法包含下述步驟1)制備作為篩選對象檢體的與肽結(jié)合的抗體，所述的肽含有選自SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的連續(xù)6-20個氨基酸殘基，2)制備含有CD14的測定對象液，3)使用1)中制備的抗體或2)中制備的測定對象液，構(gòu)成免疫測定系統(tǒng)，4)通過3)中構(gòu)成的免疫測定系統(tǒng)，對測定對象液進行測定，以及5)根據(jù)4)中得到的測定結(jié)果，對可用于測定權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原的抗體進行評價、選擇。
17.可用于測定權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原的抗體的篩選方法，該方法包含以下步驟1)制備作為篩選對象檢體的抗體的步驟，2)制備權(quán)利要求2的重組型可溶性CD14片段的步驟，3)使1)中制備的抗體和2)中制備的片段反應(yīng)，評價1)中制備的抗體與2)中制備的片段的特異性結(jié)合的步驟，以及4)在3)中，選擇與2)中制備的片段特異性結(jié)合的抗體作為可用于測定權(quán)利要求1的可溶性CD14抗原的抗體的步驟。
18.權(quán)利要求4的重組型可溶性CD14片段生產(chǎn)方法，該方法包含以下步驟<1>制備具有下述1)-4)序列的重組型可溶性CD14片段的步驟1)具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的部分序列的片段，或者在具有該部分可序列的片段中的SEQ ID No.3的53位-68位以外的區(qū)有1-10個氨基酸缺失、附加或取代所得的片段，2)N末端為SEQ ID No.3的1位-17位其中之一，3)C末端為SEQ ID No.3的134位-356位其中之一，以及4)在SEQ ID No.3的59位-90位的任一位置后取代或插入了規(guī)定的蛋白分解酶的切斷部位的序列；<2>將<1>中制備的重組型可溶性CD14片段用該規(guī)定的蛋白分解酶切斷的步驟，以及<3>回收<2>中切斷的片段的N末端一側(cè)的片段的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物體內(nèi)的新型蛋白質(zhì)，可提供可用作敗血癥診斷標志的具有下述1)－3)性質(zhì)的可溶性CD14抗原、重組型可溶性CD14片段1)非還原條件下的SDS－PAGE中，分子量為13±2kDa，2)N末端序列具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，以及3)與以含有SEQ ID No.2的16個氨基酸殘基的肽作為抗原制備的抗體特異性結(jié)合。
文檔編號G01N33/53GK1968962SQ20058001986
公開日2007年5月23日 申請日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月11日
發(fā)明者古迫正司, 白川嘉門, 廣瀨二郎 申請人:持田制藥株式會社