專利名稱：孢子特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及孢子特異性的抗體。本發(fā)明提供該抗體相關(guān)的組合物與方法以及產(chǎn)生它們的雜交瘤。與細胞的營養(yǎng)形式相比，本發(fā)明的抗體對炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)孢子具有相對特異性。與其它芽孢桿菌孢子和細胞相比，這些抗體也(只)對(炭疽芽孢桿菌)孢子具有相對特異性。采用本文提供的方法可用這些抗體檢測是否存在炭疽芽孢桿菌孢子。本發(fā)明還涉及可用于本發(fā)明檢測方法中含有這些抗體的制品以及試劑盒。
背景技術(shù)：
炭疽芽孢桿菌(炭疽的致病因子)是一種能形成孢子、革蘭陽性、不溶血桿狀細菌。炭疽主要是食草動物的人獸互通?。蝗欢?，人類通過與受感染的食草動物接觸直接獲得此病，或者通過它們的產(chǎn)物，例如毛發(fā)、羊毛和皮革間接獲得此病。孢子是常見的感染形式。取決于感染途徑，炭疽在臨床上存在三種不同的綜合征皮膚、胃腸和吸入性疾病。皮膚炭疽是人類最常見的天然形式。然而，雖然只是在天然獲得性感染中罕見到吸入性炭疽，但它是涉及氣霧化孢子排放情形中最令人關(guān)注的。1979年前在蘇聯(lián)Sverdlovsk，氣霧化孢子的意外排放(Meselson等，1994)和2001年10月在美國，遭受炭疽信襲擊中氣霧化孢子的有意排放(Jernigan等，2001)證明了這一點。在接觸(孢子)24-48小時內(nèi)給予合適的抗生素可緩解吸入性炭疽的高死亡率。然而，在接觸(孢子)超過24-48小時后給予抗生素通常導致接受致死劑量孢子的個體死亡。
炭疽芽孢桿菌的孢子外被膜和外壁曾是研究的焦點。當炭疽芽孢桿菌營養(yǎng)細胞的基本營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(“饑餓”)，觸發(fā)其開始合成內(nèi)生孢子(“孢子”)。當營養(yǎng)細胞饑餓時依次發(fā)生以下情況1)饑餓的營養(yǎng)細胞發(fā)生不對稱分離，形成母細胞和前孢子；2)母細胞吞食前孢子，用相對的兩層細胞膜圍繞前孢子；3)在兩層細胞膜之間合成一厚層修飾的肽聚糖(“皮質(zhì)”)；和4)母細胞中合成的蛋白質(zhì)形成包被皮質(zhì)的多層孢子外被膜。
孢子外被膜形成一些種類的芽孢桿菌，例如枯草芽胞桿菌(B.subtilis)孢子的最外層。然而，在其它種類，例如炭疽芽孢桿菌中，孢子由稱為外壁的額外一層所包圍，這是一種含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物的松散球狀層。Charlton等(“蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)外壁的特征鑒定”(Characterization of theexosporium of Bacillus cereus)，J.App.Microbiol.，87241-245，1999)描述了對蠟狀芽孢桿菌的外壁的研究。關(guān)系密切的蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)的孢子也有外壁。許多學者曾鑒定了炭疽芽孢桿菌的孢子外被膜和外壁抗原。Lai等(“枯草芽胞桿菌和炭疽芽孢桿菌的孢子外被膜的蛋白質(zhì)組學分析”(Proteomic analysis of the spore coats of Bacillus subtilis andBacillus anthracis)，J.Bact.，185(4)1443-1454，2003)采用SDS-PAGE分離和2-維電泳分離相聯(lián)合的蛋白質(zhì)組學分析，然后用襯質(zhì)輔助激光解吸與電離-飛行時間(MALDI-TOF)鑒定到38種枯草芽胞桿菌的孢子蛋白(其中12種是已知的孢子外被膜蛋白)和11種炭疽芽孢桿菌的孢子蛋白(其中6種鑒定為候選外被膜或外壁蛋白)。Lai等從他們比較枯草芽胞桿菌和炭疽芽孢桿菌孢子蛋白的研究中得出結(jié)論“枯草芽胞桿菌和炭疽芽孢桿菌外被膜具有大致相似數(shù)量的蛋白質(zhì)，此二種微生物之間共有一組核心的外被膜蛋白質(zhì)種類，包括主要的形態(tài)發(fā)生蛋白”。然而，對每種細菌而言，外被膜蛋白的數(shù)量顯然可能是獨特的(加了下劃線；參見Lai等的摘要)。
Steichen等(“鑒定炭疽芽孢桿菌外壁的免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)”(Identification of the immunodominant protein and other proteins of theBacillus anthracis exosporium)，J.Bact，185(6)1903-1910，2003)在純化的炭疽芽孢桿菌外壁中鑒定到5種主要的蛋白質(zhì)，包括膠原樣糖蛋白Bc1A，他們將該蛋白描述為外壁毛發(fā)樣絨毛的結(jié)構(gòu)組分。這些學者得出結(jié)論Bc1A是炭疽芽孢桿菌孢子表面的免疫優(yōu)勢抗原，因為針對孢子或純化的外壁所產(chǎn)生的20種單克隆抗體中有12種能與Bc1A反應(yīng)。Steichen等鑒定的另四種蛋白質(zhì)是丙氨酸銷旋酶、過氧化物岐化酶與和其它蛋白質(zhì)明顯不相似的稱為BxpA和BxpB的兩種蛋白質(zhì)。
此外，Todd等(“蠟狀芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌編碼外壁蛋白質(zhì)的基因”(Genes of Bacillus cereus and Bacillus anthracis encoding proteins of theexosporium)，J.Bact.，185(11)3373-3378，2003)評估了蠟狀芽孢桿菌的外壁蛋白質(zhì)。蠟狀芽孢桿菌是蠟狀芽孢桿菌家族的一員，該家族包括蘇云金芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌，它們均具有外壁而且是近親。其它相關(guān)的芽孢桿菌包括枯草芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌(B.globigii)、短小芽孢桿菌(B.pumilis)、蕈狀芽孢桿菌(B.mycoides)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)。Todd等鑒定了10株蠟狀芽孢桿菌的外壁蛋白。根據(jù)蠟狀芽孢桿菌蛋白質(zhì)序列與從炭疽芽孢桿菌基因組序列預測的蛋白質(zhì)序列的比較分析，他們得出結(jié)論“從可得到的但尚未完成的序列看，蠟狀芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌之間的大多數(shù)新Exs蛋白是緊密保守的，但有兩個例外，即炭疽芽孢桿菌可能不表達ExsB的一個局部區(qū)域和整個ExsC蛋白”(參見第3378頁，整個第一段)。他們還指出他們“鑒定到的基因絕非代表了所有的外壁蛋白質(zhì)組分；三分之一的蛋白質(zhì)留在不可溶組分中，17個條帶的7個未產(chǎn)生清晰的N-末端數(shù)據(jù)”(參見第3378頁，整個第四段)。
在有關(guān)炭疽芽孢桿菌的孢子外被膜或外壁蛋白的文獻中，所開發(fā)的唯一單克隆抗體針對炭疽的免疫優(yōu)勢芽孢桿菌膠原樣蛋白質(zhì)，Bc1A(參見，Sylvestre等，“膠原樣表面糖蛋白是炭疽芽孢桿菌外壁的結(jié)構(gòu)組分”(A collagen-likesurface glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracisexosporium)，Molec.Microbiol.，45(1)169-178，2002；和Steichen等)。本文所述的本發(fā)明孢子特異性單克隆抗體不與此蛋白質(zhì)反應(yīng)。Longchamp等(“炭疽芽孢桿菌孢子抗體的分子識別特異性”(Molecular recognitionspecificity of Bacillus anthracis spore antibodies)，J.App.Microbiol.，87246-249，1999)描述了能識別與相關(guān)種類芽孢桿菌起交叉反應(yīng)的廣泛孢子表面表位的多克隆血清的特征。他們還描述了兩種不與孢子表面表位反應(yīng)的單克隆抗體。Lee等(WO 01/49823)描述了針對炭疽芽孢桿菌表面陣列蛋白的抗體，而下文所述的本發(fā)明23a-14G9單克隆抗體不與此蛋白反應(yīng)。
本文引用的文件并非承認它們是現(xiàn)有技術(shù)。所有關(guān)于日期的陳述或關(guān)于文件內(nèi)容的表示是根據(jù)申請人可得到的信息，并非承認這些日期或文件內(nèi)容的正確性。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及與炭疽芽孢桿菌的營養(yǎng)或活躍生長形式以及相關(guān)種類芽孢桿菌相比，對炭疽芽孢桿菌孢子具有特異性的單克隆抗體或多克隆抗體。這些抗體可以精確和特異的方式優(yōu)選用于快速檢測和鑒定炭疽芽孢桿菌的方法、工藝、試驗或檢驗中。
第一方面，本發(fā)明提供能與炭疽芽孢桿菌孢子特異性抗原相結(jié)合，鑒定為23a-14G9的小鼠單克隆抗體。與細胞的營養(yǎng)形式相比，此抗體對炭疽芽孢桿菌的孢子具有相對特異性。與其它芽孢桿菌孢子和細胞相比，這些抗體也對孢子具有相對特異性。
本發(fā)明也提供單克隆抗體的其它形式，包括但不限于該抗體的能與炭疽芽孢桿菌的孢子相結(jié)合的結(jié)合片段以及該抗體的雜合、嵌合、改變的、重組或人源化形式?？贵w片段的非限制性例子包括二價F(ab′)2片段，例如用胃蛋白酶消化所產(chǎn)生的那些片段和單價Fab片段，例如用木瓜蛋白酶消化所產(chǎn)生的那些片段。
第二方面，本發(fā)明提供能與23a-14G9所識別的相同孢子特異性抗原相結(jié)合的其它單克隆和多克隆抗體。可用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備這些其它抗體而無需了解孢子特異性抗原的身份。一種方式是采用含有孢子特異性抗原和與23a-14G9形成復合物作為免疫原來制備其它抗體。這些原始抗體可用于制備表達各單克隆抗體的雜交瘤細胞。然后可篩選或選擇雜交瘤中經(jīng)鑒定表達能結(jié)合/識別孢子特異性抗原而不是23a-14G9的單克隆抗體的那些雜交瘤。所鑒定的抗體應(yīng)對孢子特異性抗原具有特異性，它們可以和本文所述23a-14G9相同的方式使用或應(yīng)用。也可單獨用所鑒定的抗體與孢子特異性抗原形成的其它復合物來產(chǎn)生其它抗體，然后再篩選或選擇這些抗體中對該抗原而非復合物中所用抗體的特異性抗體。
另一方面，本發(fā)明也提供含有單克隆和多克隆抗體以及它們的其它形式的組合物。這些組合物包括含有一種或多種抗體和它們的其它形式的制品以及試劑盒。這些組合物還可含有檢測炭疽芽孢桿菌或其它芽孢桿菌種的一種或多種其它試劑。所述制品的非限制性例子包括檢驗裝置，如檢測炭疽芽孢桿菌的板、碟和孔。本發(fā)明的試劑盒包括含有用于檢測炭疽芽孢桿菌的其它試劑的那些(試劑盒)。非限制性例子包括適合用于本發(fā)明檢測方法的那些(制品)。
在還有另一方面，本發(fā)明提供利用本文所述抗體和它們的其它形式來檢測是否存在炭疽芽孢桿菌孢子的方法。本發(fā)明方法不限于形式或構(gòu)思。這些方法可定量或定性檢測炭疽芽孢桿菌。本發(fā)明的一示范性實施方案提供檢測樣品中，例如取自某對象的醫(yī)學材料樣品(包括該對象的皮膚或衣物)中是否存在炭疽芽孢桿菌孢子的方法?；蛘?，所述樣品可以是環(huán)境樣品，例如土壤或空氣樣品，或懷疑含有孢子的材料樣品，例如可疑的粉末。該方法包括檢測本發(fā)明抗體或其其它形式與所述樣品的組分結(jié)合所形成的結(jié)合復合物。所述抗體或其其它形式與所述組分(與該抗體結(jié)合的炭疽芽孢桿菌抗原)接觸將導致結(jié)合。
本發(fā)明還提供能產(chǎn)生23a-14G9抗體的雜交瘤細胞。細胞由ATCC于2004年5月19日保藏，ATCC登錄號為PTA-6004?？稍隗w外培養(yǎng)該雜交瘤以產(chǎn)生抗體，經(jīng)任選純化或分離步驟后可如本文所述使用?；蛘?，可將雜交瘤注入動物體內(nèi)產(chǎn)生腹水，進而獲得抗體液。得到的抗體經(jīng)任選的純化或分離步驟后可如本文所述使用。
附圖簡述

圖1顯示與營養(yǎng)細胞相比，23a-14G9在捕獲ELISA測定中對炭疽芽孢桿菌孢子具有相對特異性。
圖2顯示與其它芽孢桿菌孢子相比，23a-14G9對炭疽芽孢桿菌孢子具有相對特異性。
圖3顯示23a-14G9對蘇云金芽孢桿菌的一種分離物(亞種.Kurstaki ATCC33679)的孢子具有部分交叉反應(yīng)性。用23a-14G9檢測炭疽芽孢桿菌時所產(chǎn)生的信號一般至少是Kurstaki分離物的兩倍。
圖4說明產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法。A部分顯示利用23a-14G9抗體和孢子特異性抗原(SSA)的復合物免疫動物。然后動物產(chǎn)生了如本文所述的本發(fā)明抗體。代表性抗體包括能與23a-14G9和SSA某確定區(qū)域結(jié)合的Ab1，能與23a-14G9不結(jié)合的SSA的第一部分結(jié)合的Ab2，能與23a-14G9不結(jié)合的SSA的第二部分結(jié)合的Ab3。B部分顯示將含Ab3和SSA的復合物作為免疫原注入動物體內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的其它抗體。代表性的抗體包括在沒有23a-14G9抗體時能與可得到的SSA某區(qū)域結(jié)合的Ab4；以及與Ab1相同，能與SSA一部分結(jié)合的Ab5。如B部分所示的方法當然也可能產(chǎn)生23a-14G9抗體或產(chǎn)生能結(jié)合23a-14G9同樣表位的另一種抗體。
本發(fā)明實施方式詳述本發(fā)明涉及能結(jié)合與識別炭疽芽孢桿菌孢子特異性抗原的抗體。本發(fā)明的抗體包括能識別孢子特異性抗原而不識別炭疽芽孢桿菌孢子中存在的其它炭疽芽孢桿菌抗原的多克隆和單克隆抗體。這些抗體也能識別結(jié)合該抗原的其它抗體所識別的抗原。本發(fā)明也提供含有與孢子特異性抗原相結(jié)合的抗體的復合物。該復合物可以如本文所述分離或固定。
本發(fā)明也提供與炭疽芽孢桿菌細胞的營養(yǎng)形式相比，對炭疽芽孢桿菌孢子具有相對特異性，鑒定為23a-14G9的小鼠單克隆抗體。因此，可用該抗體及其與炭疽芽孢桿菌抗原的結(jié)合形式來區(qū)分性檢測炭疽芽孢桿菌孢子和營養(yǎng)細胞。與蘇云金芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的孢子相比，該抗體對炭疽芽孢桿菌的孢子具有相對特異性。因此，本發(fā)明也利用該抗體及其其它形式來區(qū)分性檢測炭疽芽孢桿菌孢子和其它芽孢桿菌孢子。
也檢驗了23a-14G9抗體對全世界不同地理區(qū)域(美國、加拿大、中國、德國、南非、英國、巴西、土耳其、澳大利亞和納米比亞)的12種毒性炭疽芽孢桿菌分離物孢子的作用。這些分離物源自人或動物，列于表1。所有毒性孢子制備物利用23a-14G9作為檢測抗體，家兔多克隆抗-炭疽芽孢桿菌IgG作為捕獲抗體檢驗呈強烈陽性反應(yīng)。
表1
本發(fā)明的單克隆抗體可稱為對炭疽芽孢桿菌孢子具有“特異性”或“特異免疫反應(yīng)性”。這些術(shù)語指該抗體在結(jié)合反應(yīng)中能與炭疽芽孢桿菌孢子，或者這些孢子中發(fā)現(xiàn)的同源抗原反應(yīng)。該反應(yīng)可測定其它蛋白質(zhì)、孢子或細胞中是否存在炭疽芽孢桿菌孢子或其含量。在技術(shù)人員所需的試驗條件下(包括本文所述的非限制性條件)，該抗體擇優(yōu)與炭疽芽孢桿菌孢子，或在該孢子中發(fā)現(xiàn)的同源抗原相結(jié)合，而不以顯著或可檢測的方式與樣品中其它因子相結(jié)合。本發(fā)明優(yōu)選實施方案中所采用的條件應(yīng)使該抗體或其其它形式選擇性結(jié)合，所產(chǎn)生的信號是背景信號或噪聲的至少兩倍、優(yōu)選至少10倍到100倍。所述背景信號或噪聲包括與其它孢子，例如蘇云金芽孢桿菌庫爾斯塔克亞種孢子低水平交叉反應(yīng)所產(chǎn)生的信號。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供能識別或結(jié)合23a-14G9抗體所結(jié)合的炭疽芽孢桿菌孢子特異性抗原的抗體。就一些抗體而言，這種結(jié)合可以是該抗原特異性的。而其它抗體可與23a-14G9抗體所結(jié)合的孢子特異性抗原復合物中存在的某表位相結(jié)合。或者，這些抗體可以只與23a-14G9抗體相結(jié)合，但是當然不能根據(jù)它們能與孢子特異性抗原相結(jié)合而使用，而是根據(jù)它們能檢測出結(jié)合的23a-14G9抗體而使用。因此，這種23a-14G9結(jié)合性抗體可用作結(jié)合23a-14G9的二抗來檢測是否存在23a-14G9，例如檢測具有其同源炭疽芽孢桿菌孢子特異性抗原的復合物中是否存在23a-14G9。
采用本領(lǐng)域已知的方法不難制備本發(fā)明其它形式的孢子特異性抗原結(jié)合抗體和IgG類的23a-14G9單克隆抗體。(本領(lǐng)域)熟知能制備抗體的抗原結(jié)合片段，并可為本文所述應(yīng)用產(chǎn)生二價F(ab′)2和單價Fab片段。本文所用的“Fab”指至少含有功能性完整的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體雙鏈結(jié)合片段。此外，本領(lǐng)域也已知產(chǎn)生雜合。嵌合。改變、重組(包括單鏈)或人源化形式抗體的方法?？烧J為這些抗體形式是本文所述單克隆抗體的衍生物。
其它衍生形式包括與其它化學部分偶聯(lián)的本發(fā)明抗體及其其它形式。非限制性例子包括標記的抗體或其其它形式。術(shù)語“標記”、“可檢測標記”或“用可檢測標志來標記”指能產(chǎn)生表明存在該標記分子的可檢測信號的抗體組合物。合適的標記包括放射性同位素、染料、膠體金或類似的可檢測標志、核苷酸生色團、酶、底物、熒光分子、化學發(fā)光成分、磁性顆粒、生物發(fā)光成分等，包括適合于間接檢測的標記，例如生物素。例如，標記物是可通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法檢測的任何組合物?？衫没瘜W接頭連接標記物。示范性標記是能產(chǎn)生可目測檢測的可見信號的標記。
也可通過已知的方法和裝置使本發(fā)明抗體及其其它形式與固相支持物相偶聯(lián)，例如但不限于玻璃、塑料、合成膜相偶聯(lián)。其它非限制性例子包括珠、顆粒、浸漬片、纖維、濾膜、培養(yǎng)皿、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)板、微滴定板、硅烷或硅酸鹽支持物，例如載玻片和碟、孔或容器以及它們的側(cè)壁。抗體的這種固定形式可用于本文所述的檢測方法中。它們也可用于炭疽芽孢桿菌蛋白質(zhì)或孢子的免疫親和層析。
本發(fā)明抗體及其其它形式也可配制成組合物。這些組合物還可含有檢測炭疽芽孢桿菌或其它種類芽孢桿菌的一種或多種其它試劑。非限制性例子包括抗體與其同源炭疽芽孢桿菌孢子特異性抗原相結(jié)合的復合物，與該抗體和用于抗體檢測方法中其它試劑的混合物。其它例子包括含有其它炭疽芽孢桿菌結(jié)合抗體或檢測試劑的混合物。該抗體及其其它形式和其它檢測試劑的組合也可構(gòu)成用于檢測炭疽芽孢桿菌的制品，例如檢驗裝置的一部分。
用于檢測是否存在炭疽芽孢桿菌的方法不受構(gòu)思的限制。非限制性例子包括利用本文所述的本發(fā)明抗體和它們的其它形式，基于以下原理的方法Western印跡或其它免疫印跡、ELISA、側(cè)流裝置(lateral flow devices)、夾心試驗、顯微鏡觀察、競爭性和非競爭性免疫測定、免疫酶試驗、免疫熒光法、免疫磁性選擇和流式細胞術(shù)(包括通過多種顏色色流式細胞術(shù)(polychromatic flow cytometry)檢測)。其它免疫測定形式描述于Harlow和Lane，(1988)，《抗體，實驗室手冊》(Antibodies，A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Publications，New York。本發(fā)明方法可用于定性或定量檢測樣品或“測試樣品”中是否存在炭疽芽孢桿菌孢子。
本文所用“樣品”或“測試樣品”指從感染或懷疑感染了炭疽芽孢桿菌孢子的個體分離的樣品，或懷疑含有炭疽芽孢桿菌孢子的環(huán)境樣品?；蛘撸@些術(shù)語指已知含有炭疽芽孢桿菌孢子，在本發(fā)明的檢測方法中用作對照或用于所述檢測方法中以證實存在炭疽芽孢桿菌孢子或定量測定其含量的樣品?？赏ㄟ^任何合適的方法收集樣品，包括收集動物或人外層皮膚或頭發(fā)以及衣物的樣品；收集環(huán)境樣品，如從空氣、紙張、土壤或其它固體的樣品，例如從懷疑含有炭疽芽孢桿菌孢子的部位取樣。醫(yī)學樣品也包括收集對象體表，包括但不限于收集鼻腔和口腔的樣品或擦拭液。其它樣品形式包括水或食物樣品。樣品也可以是懷疑含有炭疽芽孢桿菌孢子的粉末或顆粒狀物質(zhì)。本發(fā)明的樣品也可以是炭疽芽孢桿菌孢子的提取物或含有孢子或懷疑含有炭疽芽孢桿菌孢子的物質(zhì)的提取物。在本發(fā)明的一些實施方案中，在測定之前可用樣品稀釋劑稀釋樣品。稀釋劑可以是技術(shù)人員所需的任何合適溶劑。
對于空氣或氣體樣品，非限制性的例子是用氣旋收集裝置收集的樣品。這種裝置收集一定體積的空氣或氣體，將其中所含的顆粒物沉積到潮濕的表面上或液體介質(zhì)中。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供的檢測方法根據(jù)利用能與炭疽芽孢桿菌孢子相結(jié)合并與其形成復合物的捕獲試劑。捕獲試劑可以是本文所述的單克隆抗體或其其它形式?；蛘?，試劑可以是能與炭疽芽孢桿菌孢子相結(jié)合的另一種抗體，包括但不限于能與多種芽孢桿菌的孢子和細胞結(jié)合的多克隆或重組抗體。在另一實施方案中，該捕獲試劑至少能與除炭疽芽孢桿菌以外的蘇云金芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌和巨大芽孢桿菌的孢子結(jié)合。如在本發(fā)明抗體(部分)所述的，可將該捕獲試劑固定于固相支持物，然后與炭疽芽孢桿菌孢子接觸。該試劑無需與本發(fā)明23a-14G9抗體所結(jié)合的同一表位結(jié)合。當然，可與孢子(或孢子特異性抗原)和孢子特異性抗體形成的復合物，而非只與抗體結(jié)合的捕獲捉試劑也可用于實施本發(fā)明。
無論是否與捕獲試劑聯(lián)用，本發(fā)明也提供能與炭疽芽孢桿菌孢子結(jié)合從而直接或間接顯示它們的存在或含量的檢測試劑。檢測試劑優(yōu)選能與23a-14G9所結(jié)合的孢子特異性抗原相結(jié)合的本發(fā)明抗體或其其它形式。結(jié)合時，該檢測試劑與其結(jié)合伴侶形成結(jié)合復合物。該檢測試劑可以用可檢測標記物標記從而在其結(jié)合后可通過該標記物發(fā)出的信號顯示同源結(jié)合伴侶，如炭疽芽孢桿菌孢子的存在或含量?；蛘?，該檢測試劑本身能與可檢測標記物標記的第二試劑相結(jié)合。在該檢測物質(zhì)是23a-14G9的非限制性例子中，用可檢測標記物標記的抗-小鼠IgG抗體可用于檢測23a-14G9和進而檢測炭疽芽孢桿菌孢子。
當與捕獲試劑聯(lián)用時，形成了含有該試劑、炭疽芽孢桿菌孢子或孢子提取物組分和該檢測試劑的夾心復合物。此夾心復合物的形成是先形成含有捕獲試劑和炭疽芽孢桿菌孢子或孢子提取物組分的復合物，該復合物再與檢測物質(zhì)接觸形成夾心復合物?；蛘?，此夾心復合物的形成是先形成含有檢測試劑和炭疽芽孢桿菌孢子或孢子提取物組分的復合物，該復合物再與捕獲試劑接觸形成夾心復合物。捕獲試劑、檢測試劑或二者導致夾心復合物以及其它形式復合物的特異性。因此，本發(fā)明的實施方案包括利用以下混合物
本發(fā)明方法(無論是否用夾心形式)優(yōu)選用于檢測是否存在濃度至少在0.02μg/ml以上的炭疽芽孢桿菌孢子或23a-14G9抗體的同源結(jié)合伴侶。在其它實施方案中，這些方法可檢測的濃度(μg/ml)在0.08以上、0.30以上、0.5以上、1以上或1.25以上?；蛘撸捎帽景l(fā)明方法分析含以下濃度的孢子的等份樣品，或其稀釋液來檢測是否存在濃度(cfu/ml)至少為1010、至少為109、至少為108、至少為107、至少為106或至少為105的炭疽芽孢桿菌孢子。所述等份樣品體積的非限制性例子包括500μl、450μl、400μl、350μl、300μl、250μl、200μl或150μl樣品體積。
本發(fā)明的檢測方法也包括競爭性結(jié)合試驗作為實施方案。這些方案包括利用競爭與本文所述檢測試劑和/或捕獲試劑相結(jié)合的炭疽芽孢桿菌孢子或孢子提取物組分的標記形式，和類似于本領(lǐng)域已知的競爭性測定方法。本發(fā)明提供的這些方法也可完全或部分自動(進行)。
用于本發(fā)明方法的物質(zhì)可理想地適用于制備按熟知方法制備的試劑盒。因此，本發(fā)明提供的試劑盒裝有檢測和/或定量測定本文所述樣品中炭疽芽孢桿菌孢子或其提取物或裂解形式的試劑。這種試劑盒任選裝有(檢測)試劑和/或(捕獲)試劑以及關(guān)于試劑盒在本發(fā)明方法中的應(yīng)用、或適用性的鑒定書或標簽或使用說明書。這種試劑盒可裝有容器，每個容器含有(本發(fā)明)方法所用的各種(檢測)試劑和/或(捕獲)試劑的一種或多種(任選以濃縮的形式)，這些試劑包括，例如檢測試劑和/或預固定形式的捕獲試劑。一般也包括一套使用說明書或試劑標識符。為實施本發(fā)明，其它示范性試劑盒裝有裝置或固相支持物，例如但不限于側(cè)流裝置、檢測條帶、珠、膜，或容器、碟或孔的包被表面。
這些試劑盒也可任選裝有對照樣品，例如免疫反應(yīng)性炭疽芽孢桿菌孢子，或與檢測試劑和/或捕或試劑相結(jié)合的同源抗原的已知樣品。對照(樣品)的含量已知，從而可用稀釋樣品的樣品稀釋劑來稀釋，并用作外部對照；或者可將其加入實際樣品并用作內(nèi)部對照，任選用于測定該試驗對所檢驗樣品的靈敏度。這些試劑盒可裝有一次試驗或多次試驗(所需)的材料。
本發(fā)明還提供能產(chǎn)生23a-14G9抗體的雜交瘤細胞。此細胞由ATCC于2004年5月19日保藏，ATCC登錄號為PTA-6004?？稍隗w外培養(yǎng)該雜交瘤以產(chǎn)生抗體，所述抗體經(jīng)任選的分離步驟后可如本文所述使用?；蛘撸蓪⒃撾s交瘤注入動物體內(nèi)產(chǎn)生腹水，再從腹水中制備抗體液。得到的抗體經(jīng)任選的分離步驟后可如本文所述使用?！胺蛛x”指制備主要含有該抗體的組合物，該抗體以摩爾計在組合物中的含量比其它非溶劑物質(zhì)更豐富。以摩爾計，相對于其它非溶劑物質(zhì)，“分離的抗體”優(yōu)選含有至少約50、至少約60、至少約70、至少約80或至少約90％的抗體。通過除去污染性分子實體，可將抗體分離純化為接近，或基本上均質(zhì)。
可采用制備23a-14G9的方式制備其它單克隆抗體。簡言之，使小鼠與炭疽芽孢桿菌孢子接觸而產(chǎn)生免疫應(yīng)答和產(chǎn)生抗體。分離表達抗體的細胞，與所選擇的無限增殖細胞相融合，然后篩選表達炭疽芽孢桿菌孢子特異性抗體的細胞。用有限稀釋法克隆陽性細胞群，然后選擇以獲得產(chǎn)生23a-14G9的雜交瘤細胞系。
可利用與23a-14G9抗體所識別的炭疽芽孢桿菌孢子特異性抗原相結(jié)合的抗體復合物來產(chǎn)生其它抗體。圖3，A部分所示的一個非限制性例子是利用與其同源孢子特異性抗原相結(jié)合的23a-14G9抗體復合物免疫動物(例如聯(lián)用本領(lǐng)域已知的合適佐劑)來產(chǎn)生針對該復合物的抗體。動物可以是本領(lǐng)域已知用于產(chǎn)生抗體的動物，包括小鼠、大鼠、家兔和山羊。在一些實施方案中，用含23a-14G9的復合物(免疫)BALB/C小鼠，有利于降低或消除只與23a-14G 9相結(jié)合的抗體產(chǎn)生，因為它(23a-14G9)是BALB/C小鼠產(chǎn)生的。因此，23a-14G9在BALB/C小鼠中可視作“自身物質(zhì)”。這有利于提高針對孢子特異性抗原而非針對23a-14G9抗體的抗體產(chǎn)生。
得到的抗體可用作與該復合物結(jié)合的多克隆抗體。因此，在一些實施方案中，這些多克隆抗體可用作復合物的“捕獲抗體”。這種多克隆抗體是異質(zhì)群體，至少包括1)與23a-14G9抗體某表位相結(jié)合的抗體；2)與該復合物中外露的孢子特異性抗原某表位相結(jié)合的抗體；和3)與該復合物中但在23a-14G9抗體或抗原中沒有發(fā)現(xiàn)的某表位相結(jié)合的抗體?？筛鶕?jù)異質(zhì)性將此異質(zhì)群體(抗體)分成(上述)三組分。一個非限制性例子是，可將針對23a-14G9的抗體作親和純化以產(chǎn)生與抗原或復合物的表位而非23a-14抗體本身相結(jié)合的多克隆抗體。
也可篩選產(chǎn)生該異質(zhì)(抗體)群的細胞來選出能與上述三組分之一結(jié)合的抗體。一個非限制性例子是，可用本領(lǐng)域已知方法利用這些細胞來制備雜交瘤，然后用23a-14G9抗體篩選，從表達與孢子特異性抗原相結(jié)合或與該復合物相結(jié)合的抗體的雜交瘤中選出產(chǎn)生能與23a-14G9抗體相結(jié)合抗體的雜交瘤。類似地，可篩選這些雜交瘤來鑒定表達能與炭疽芽孢桿菌的孢子而非用于產(chǎn)生異質(zhì)(抗體)群的23a-14G9抗體或復合物相結(jié)合的抗體的那些雜交瘤。用此法獲得的雜交瘤表達的抗體是23a-14G9所結(jié)合的孢子特異性抗原的特異性抗體。當然，這種抗體可以和本文所述23a-14G9相同的方式使用，包括用于產(chǎn)生其它抗原結(jié)合性抗體。參見圖4，B部分。
此外，可用檢測到交叉反應(yīng)性的任何芽孢桿菌或孢子或其它分子篩選這些抗體和/或雜交瘤。相對于能與所述交叉反應(yīng)性菌株或其它分子起反應(yīng)的其它抗體而言，此法能選出對炭疽芽孢桿菌特異、或特異性更強的抗體。在本發(fā)明的一些實施方案中，可選擇相對于蘇云金芽孢桿菌庫爾斯塔克亞種，例如ATCC33679的孢子的抗體或雜交瘤，這些孢子與23a-14G9抗體的交叉反應(yīng)性水平低。也可相對于ATCC 35866進行選擇。
也可根據(jù)與所述復合物結(jié)合而不與23a-14G9和炭疽芽孢桿菌孢子結(jié)合來選出能與該復合物相結(jié)合的抗體。這種抗體優(yōu)選用于結(jié)合或檢測所述復合物，例如當用作捕獲試劑來固定所述復合物時。
現(xiàn)已對本發(fā)明作了整體描述，參考以下實施例更易于理解本發(fā)明，除非另有指定，這些實施例是為說明目的而提供而非限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例123a-14G9識別孢子特異性抗原材料與方法(1)抗原制備孢子使炭疽芽孢桿菌在TSA板上中生長3天成為匯合培養(yǎng)物以使營養(yǎng)細胞有足夠時間消耗培養(yǎng)基中的基本營養(yǎng)從而形成孢子。用無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)將細菌/孢子從板上洗下，在水浴中于60℃培養(yǎng)1小時殺死剩余的營養(yǎng)細胞，而不影響孢子。然后在4℃，3400rpm離心10分鐘洗滌孢子兩次。用孔雀綠染色制備物的等份試樣來觀察孢子，證實該制備物主要含孢子，幾乎不存在營養(yǎng)細胞。
營養(yǎng)細胞抗原在通氣液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)炭疽芽孢桿菌營養(yǎng)細胞過夜。離心沉淀營養(yǎng)細胞，然后用含有高鹽和洗滌劑的TRIS-EDTA緩沖液裂解。用PBS透析上清液。
(2)捕獲ELISA為進行捕捉ELISA，利用以炭疽芽孢桿菌孢子和營養(yǎng)細胞免疫的家兔的經(jīng)蛋白G純化的兔多克隆IgG作為捕獲抗體，以10μg/ml濃度包被在ELISA板上。根據(jù)標準方法用含有5％脫脂奶的封閉溶液封閉ELISA板。將孢子或營養(yǎng)細胞抗原的兩倍連續(xù)稀釋液與ELISA板一起溫育1小時。充分洗滌板，然后加入10μg/ml的單克隆抗體(mAb)23a-14G9，溫育1小時。充分洗滌板。加入偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的山羊抗-小鼠IgG抗體，然后加入底物ABTS來顯色ELISA反應(yīng)。用ELISA板讀數(shù)儀讀取該板的OD405nm值。
結(jié)果結(jié)果見圖1，該圖明確顯示23a-14G9與炭疽芽孢桿菌孢子抗原強烈反應(yīng)，但根本不與炭疽芽孢桿菌營養(yǎng)細胞中存在的抗原反應(yīng)。因此，23a-14G9是識別炭疽芽孢桿菌的孢子特異性抗原的單克隆抗體。
實施例223a-14G9的特異性炭疽芽孢桿菌孢子特異性單克隆抗體23a-14G9的特異性如下所述。利用家兔多克隆IgG作為捕獲抗體，炭疽芽孢桿菌孢子特異性單克隆抗體作為檢測抗體進行捕獲ELISA。以下芽孢桿菌的孢子用作抗原炭疽芽孢桿菌(B.anthracis Sterne)；蘇云金芽孢桿菌ATCC 35646；蠟狀芽孢桿菌ATCC33018；短小芽孢桿菌ATCC 72；枯草芽胞桿菌ATCC 6051和巨大芽孢桿菌ATCC 25833。
如圖2所示，單克隆抗體23a-14G9只與炭疽芽孢桿菌的孢子反應(yīng)。該抗體不與蘇云金芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌或枯草芽胞桿菌的孢子反應(yīng)。因此，單克隆抗體23a-14G9對炭疽芽孢桿菌特異，可用于檢測和區(qū)分炭疽芽孢桿菌孢子與其它芽孢桿菌孢子。
采用相同的條件，用以下芽孢桿菌分離物的孢子檢驗了23a-14G9抗體蠟狀芽孢桿菌ATCC 9620、蠟狀芽孢桿菌ATCC 14579(菌株類型)、蠟狀芽孢桿菌ATCC 49064、蠟狀芽孢桿菌ATCC 10702、蠟狀芽孢桿菌ATCC7004、蠟狀芽孢桿菌ATCC 33019、蘇云金芽孢桿菌ATCC 19267、蘇云金芽孢桿菌ATCC 10792、蘇云金芽孢桿菌以色列亞種ATCC 39152、，蘇云金芽孢桿菌庫爾斯塔克亞種ATCC 33679和蘇云金芽孢桿菌庫爾斯塔克亞種ATCC 35866。除了與ATCC 33679有部分交叉反應(yīng)性以外，該抗體對所有這些蠟狀芽孢桿菌分離物和蘇云金芽孢桿菌分離物均為陰性(參見圖3)。對ATCC 33679抗原濃度2.5μg/ml以上和對炭疽芽孢桿菌抗原濃度0.04μg/ml時該抗體陽性。
無論以前是否專門納入，本文引用的所有參考文獻，包括專利、專利申請和出版物全文納入本文作為參考。
現(xiàn)對本發(fā)明作了完全的描述，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)該知道無需過多實驗就可用廣泛的等價參數(shù)、濃度和條件來實施相同的發(fā)明而不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍。
雖然已結(jié)合具體實施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解本發(fā)明可作進一步改進。本申請要覆蓋總體上根據(jù)本發(fā)明主旨對本發(fā)明作出的任何改變、應(yīng)用或適應(yīng)范圍并包括與本文內(nèi)容有差別的這些內(nèi)容，因為這些是本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)已知或慣常實施的，可應(yīng)用于上述基本特征。
權(quán)利要求
1.一種名為23a-14G9的單克隆抗體，
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體由ATCC于2004年5月19日保藏，ATCC登錄號為PTA-6004的雜交瘤細胞系產(chǎn)生。
3.一種含有如權(quán)利要求1所述單克隆抗體的組合物。
4.一種如權(quán)利要求1所述抗體的片段，其中所述片段與炭疽芽孢桿菌孢子相結(jié)合。
5.如權(quán)利要求4所述的片段，其特征在于，所述片段是二價F(ab′)2片段或單價Fab片段。
6.一種結(jié)合被權(quán)利要求1所述抗體結(jié)合的炭疽芽孢桿菌孢子特異性抗原的抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的抗體，其特征在于，所述抗體是單克隆的。
8.一種雜合、嵌合、改變的、重組或人源化形式的如權(quán)利要求7所述的單克隆抗體。
9.一種雜合、嵌合、改變的、重組或人源化形式的如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
10.一種檢測樣品中是否存在炭疽芽孢桿菌孢子的方法，所述方法包括使所述樣品與權(quán)利要求1、2和6-9中任一項所述的單克隆抗體接觸，然后檢測所述抗體與所述樣品組分結(jié)合所形成的結(jié)合復合物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述抗體能夠結(jié)合炭疽芽孢桿菌孢子。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述樣品被懷疑含有炭疽芽孢桿菌孢子。
13.如權(quán)利要求10或11或12所述的方法，其特征在于，所述組分與任選固定在固體支持物上的捕獲試劑相結(jié)合，所述單克隆抗體用可檢測標記物標記。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述捕獲試劑是抗體。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗體是與炭疽芽孢桿菌孢子相結(jié)合的多克隆抗體。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗體也與蘇云金芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌和巨大芽孢桿菌的孢子相結(jié)合。
17.如權(quán)利要求10-16中任一項所述的方法，其特征在于，該方法檢測濃度至少在0.02μg/ml以上的所述組分。
18.如權(quán)利要求10-17中任一項所述的方法，其特征在于，所述檢測還包括使結(jié)合復合物與結(jié)合所述組分或所述復合物的可檢測試劑相接觸。
19.一種檢測樣品中是否存在炭疽芽孢桿菌孢子的試劑盒，所述試劑盒含有如權(quán)利要求1、2和6-9中任一項所述的抗體。
20.一種含有如權(quán)利要求1、2和6-9中任一項所述的與炭疽芽孢桿菌孢子特異性抗原相結(jié)合的抗體的復合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及孢子特異性抗體。提供了這些抗體的相關(guān)組合物和方法以及產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤。與炭疽芽孢桿菌細胞的營養(yǎng)形式相比，這些抗體對孢子具有相對特異性。與其它芽孢桿菌孢子和細胞相比，這些抗體也只對炭疽芽孢桿菌孢子具有特異性。采用本文提供的方法可用這些抗體檢測是否存在炭疽芽孢桿菌孢子。本發(fā)明也涉及可用于本發(fā)明檢測方法中的含有這些抗體的制品以及試劑盒。
文檔編號G01N33/577GK101031587SQ200580020209
公開日2007年9月5日 申請日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月12日
發(fā)明者B·L·曼戈爾德, J·L·埃爾德瑞琪 申請人:泰樹公司