專利名稱：△－9－四氫大麻酚檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于生物基質、環(huán)境組合物中和表面處的大麻素檢測的競爭性免疫測定技術，特別涉及Δ-9-四氫大麻酚(大麻；THC)和相關代謝物。特別地，本發(fā)明提供了在即時診斷(point-of-care)和現場測試中所用裝置的THC的高靈敏度檢測的程序。
背景技術：
現在大麻是世界上最廣泛濫用的違禁藥物(Journal of ChromatographyB，卷733，第119-126頁)并且在許多國家它被歸為1類或2類禁止的藥物。大麻檢測由法庭科學家、毒理學家、藥物康復臨床常規(guī)地進行并且作為藥物濫用的工作場所測試的部分。近來，根據影響力測試它已經成為針對駕駛的主要違禁藥物。
Δ-9-四氫大麻酚(THC，見

圖1中的結構圖I)是植物大麻(Cannabissativa)的開花的或水果的頂端、葉子和樹脂中主要的影響精神活動的分析物。THC在人體中廣泛地代謝成兩種主要產物，11-去甲-9-羧基-Δ-9-THC(THC-COOH，見圖1中的結構圖II)和11-羥基-Δ-9-THC(THC-OH，見圖1中的結構圖III)。在這兩種代謝物中，只有所述羥基代謝物具有影響精神活動的效果。
已知的THC檢測方法和已知的大麻檢測方法一般可以歸為三組。金標準技術采用GS/MS、級聯(lián)GC/MS/MS、LC/MS和級聯(lián)LC/MS/MS(GC＝氣相色譜法；LC＝液相色譜法；MS＝質譜法)。這些技術是嚴格基于實驗室的并且需要專門的訓練和設備，這使它們不適合即時診斷測試。
大麻檢測的定量方法在本領域中也是已知的。美國專利3715189、4196167、4771005、4816415和5457054，還有英國專利號1426177和其中的參考文獻，描述了基于涉及顏色改變化學反應的大麻檢測方法。然而，化學方法趨于是非特異性的并且缺乏對于生物基質中藥品檢測所需要的靈敏度水平。
第三組已知的大麻素檢測方法采用免疫技術。例如，針對綴合到載體大分子的多種大麻素衍生物產生抗體并且然后利用這些抗體和它們的標記衍生物建立免疫測定法，例如在放射性免疫測定法和熒光免疫測定法中使用的放射性標記的或熒光的衍生物和在多種形式的酶免疫測定法中使用的酶標記的衍生物。這樣的酶免疫測定法包括，例如，利用固定化的藥物衍生物和酶標記抗體的直接的ELISA法。作為一種備選的形式，標記的抗-大麻素抗體，例如，這樣的用乳膠顆粒或膠體金(collodial gold)標記的抗體，已經通過側向流動免疫色譜法(lateral flow immunochromatography)被用于大麻素檢測。使用的藥物衍生物一般基于母體分子Δ-9-四氫大麻酚(THC)和它的主要代謝物THC-COOH。對于THC修飾，通常將交聯(lián)的試劑在C2、C5’或苯酚基C1位置連接到所述化合物(例如，見專利GB1364925、EP0276732、EP0279308、US5237057、US5747352和NatureNew Biology(1972)236卷216-217頁)。也可以用與THC同樣方式將THC-COOH衍生化。另外，在THC-COOH的C9的羧基的可用性使其可以利用碳二亞胺交聯(lián)反應直接交聯(lián)到載體分子的氨基。預期針對通過C1、C2和C5’偶聯(lián)的THC或THC-COOH產生的抗體對于這兩種化合物顯示不同的交叉反應性，原因分別在于C9的羧基是不存在和存在的。因此，為了實現THC和THC-COOH可比較的交叉反應性，許多已知的用于這些化合物檢測的免疫測定法采用針對通過羧基在C9偶聯(lián)到載體分子的THC-COOH產生的抗體。
許多用于THC的免疫測定是可商購的。Roche Diagnostics放射性免疫測定(美國專利號4438207)和熒光極化免疫測定(歐洲專利號0392332)使用針對通過苯酚基在C1偶聯(lián)到載體蛋白的THC-COOH和類似放射性標記的或熒光標記的THC-COOH產生的抗體。正如所料，這個測定顯示優(yōu)異的所述酸的檢測而與母體藥物THC只有5％的交叉反應性。Abbott熒光極化免疫測定法(歐洲專利號0279308)使用針對通過羧酸酯基在C9連接到載體蛋白質的THC-COOH和在同樣位置具有熒光部分的THC-COOH而產生的抗體。這個測定法顯示了和母體藥物以及11-羥基衍生物(圖1，化合物III)更佳的交叉反應性。許多用于大麻素檢測的酶免疫測定也是可商購的，其包括由Cozart Bioscience Limited制造提供的一種。
這些采用針對通過羧基酯基連接到載體蛋白質的THC-COOH而產生的抗體和辣根過氧化物酶(HRP)-標記的THC-COOH(通過所述酸的羧酸酯基連接的標記)。
幾乎全部所述的免疫測定法適于檢測THC-COOH，使它們適合于利用基質(matrice)例如尿和血液檢測大麻的使用。然而，來自大麻使用者的口腔流體(唾液)不顯示或顯示微量的THC-COOH和THC-OH。因而，主要的影響精神活動組分THC的測定在利用口腔流體樣品(推薦作為路邊測試濫用藥物的最佳基質)路邊測試在此藥物影響下的駕駛的情況下是必要的。檢測少量的母體藥物THC的能力也是必需的以能夠發(fā)現這個藥物的最近使用。本發(fā)明通過提供新的競爭性免疫測定技術用于THC檢測解決了該問題，所述競爭性免疫測定技術也可以提供對THC-COOH和THC-OH兩者都表現高交叉反應性的優(yōu)點。
發(fā)明概述已經發(fā)現通過使用THC生物合成中的中間體的載體綴合物，更具體而言是通過其羥基綴合到大分子載體例如牛血清白蛋白的5-戊基間苯二酚(見圖2)，即使在非常低水平如可以在口腔流體樣品中發(fā)現的例如≤20ng/ml的THC也可以被競爭性免疫測定法檢測。出乎意料地，發(fā)現自由溶液中的5-戊基間苯二酚不干擾可商購的抗-THC抗體(從East CoastBiologics，USA得到的小鼠單克隆抗-THC抗體)對固定化的5-戊基間苯二酚-大分子綴合物的結合。而且，可以利用這樣一種綴合物和抗體組合以對所述母體藥物可比較的靈敏度檢測THC-OH，而可以以低到約1.0ng/ml的遠遠更高的靈敏度檢測THC-COOH。
因此，本發(fā)明在一個方面提供了在液體樣品中檢測THC的方法，該方法包含(a)將所述樣品與(i)5-戊基間苯二酚/大分子載體綴合物，其中5-戊基間苯二酚是通過它的苯環(huán)上的羥基或其衍生物綴合到所述載體，和(ii)能夠結合THC和所述綴合物兩者的抗-THC抗體相接觸；和(b)測定所述抗體與所述綴合物的結合是否在所述樣品的存在下減少。
理想地，所述抗-THC的抗體將另外同時結合THC-COOH和THC-OH，例如將采用針對通過羧酸酯基連接到載體蛋白質的THC-COOH而產生的抗體，舉例說明是上面提到的商業(yè)的抗-THC抗體。那么所述抗體對本發(fā)明中綴合物結合的減少將用來指示所述樣品含有一種或多種等于或大于最小檢測限的THC、THC-COOH和THC-OH。
本發(fā)明的測定方法可以符合任何常規(guī)的競爭性免疫測定的形式。例如，它可以采用常規(guī)的競爭性ELISA的形式，其中將所述抗體或5-戊基間苯二酚/載體綴合物固定在固體載體上。然而，對于現場測試例如路邊測試最便利是，本發(fā)明的方法采用多孔測試條的側向流動免疫色譜測定的形式。還在這個情況下，用于分析物檢測的固定化試劑可以是固定化的抗體或固定化的5-戊基間苯二酚/載體綴合物。
在進一步的方面中，本發(fā)明也提供了用于實施本發(fā)明的免疫測定的試劑盒，該試劑盒包含(i)如上所述的5-戊基間苯二酚/載體綴合物和(ii)能夠同時結合所述綴合物和THC的抗體，更優(yōu)選能夠結合THC、THC-COOH和THC-OH的全部的抗體。
在更進一步的方面中，本發(fā)明提供了通過它的苯環(huán)上的羥基或其衍生物綴合到載體的5-戊基間苯二酚以便它能夠結合抗體，所述抗體也結合THC、THC-COOH和THC-OH的全部，這樣一種標記的或固定在固體載體上的綴合物，制造這樣綴合物的方法和這樣的綴合物作為抗體生產的免疫原的用途。
附圖簡述圖1THC(I)、THC-COOH(II)和THC-OH(III)的結構25-戊基間苯二酚的結構圖和將這個化合物通過羥基偶聯(lián)到牛血清白蛋白的圖解。
圖3抗-THC抗體對固定化的利用碳二亞胺偶聯(lián)方法獲得的THC--COOH/BSA綴合物的結合的滴定曲線。
圖4將抗-THC抗體結合到固定化的5-戊基間苯二酚/BSA綴合物(BSA-CAN)的滴定曲線。
圖5圖解根據本發(fā)明在進行側向流動免疫色譜測試中使用的側向流動條的圖，其中(1)是層壓到后撐上的硝化纖維素片的多孔測試條，(2)是提供固定化BSA-CAN的分析物檢測區(qū)，(3)是提供固定化抗體捕捉標記的抗體的控制區(qū)，(4)是將標記的抗體釋放到液體的標記釋放墊板，所述液體從樣品接收墊板(5)被吸引到標記釋放墊板中，和(6)是芯吸墊板。
發(fā)明詳述5-戊基間苯二酚綴合物在進行根據本發(fā)明的測定中使用的適合的5-戊基間苯二酚綴合物是任何這樣的綴合物，其中5-戊基間苯二酚經由羥基連接到大分子載體以便能夠結合抗體，所述抗體結合THC、THC-COOH和THC-OH的全部。如上所指出，這個可以是通過用作為所述免疫原的經由其羧酸酯基連接到載體蛋白質的THC-COOH而獲得的抗體，如由上面已經提及的商業(yè)的小鼠單克隆抗THC抗體所例舉。
應當理解，5-戊基間苯二酚到所選載體的綴合可以通過其苯環(huán)上的兩個羥基的任一個并且可以采用含有這樣綴合物的混合物的綴合物制劑，可以預期其在本發(fā)明的測定中在功能上相同。(通過脂族側鏈經過如圖2中所示的5-戊基間苯二酚的結構畫一條線那么所述苯環(huán)產生兩個對稱的具有兩個相同OH基團的等分)。然而，也可以設計，為了載體偶聯(lián)，5-戊基間苯二酚的羥基可以是衍生化的，更具體而言，例如，轉化為羧酸酯基。在這個情況下，偶聯(lián)到所述載體可以通過已知的碳二亞胺方法。
在一個實施方案中，所述載體可以是蛋白質。為了例舉，發(fā)現使用牛血清白蛋白(BSA)是便利的，但是可以采用其它蛋白質例如卵清蛋白、γ-球蛋白和甲狀腺球蛋白。適合的載體蛋白質可以是酶，例如辣根過氧化物酶。在這個情況下，預計所述載體也可以在本發(fā)明的測定中用作可檢測的標記。也可以預計，連接到5-戊基間苯二酚的載體可以是含有氨基酸側鏈的均聚物或雜聚物例如聚賴氨酸、聚鳥氨酸或聚(谷氨酰胺，賴氨酸)。
所述5-戊基間苯二酚綴合物也可以是用可檢測標記直接或間接標記的，所述標記不是所述載體。在這個情況下，所述標記可以結合到所述綴合物的任何部分，由此保持結合適合的抗體例如載體蛋白質的能力。適合的標記包括，例如，放射性同位素例如125I、32P或35S，顆粒標記例如膠體金，熒光標記例如熒光素和生物素。
為了例舉的目的，利用交聯(lián)試劑將5-戊基間苯二酚直接連接到載體。下面描述了兩種這樣的方法，二甲基氨基吡啶/二琥珀酰亞胺基碳酸酯(disuccinimyidyl carbonate)方法的使用和乙烯基砜的使用。然而，已知用于將羥基結合到氨基的其它方法是已知的并且可以發(fā)現同樣是適合的(對于綜述見“Bioconjugate Techniques”by G. T.Hermanson，1996，Academic Press)。在形成適合的5-戊基間苯二酚綴合物中，可以采用間隔團分子，例如氨基己酸間隔團。
抗體如上所指出，適用于本發(fā)明方法中的抗體將能夠特異地結合到如上所述的5-戊基間苯二酚綴合物并且也將能夠特異地結合到THC。理想地，采用的抗體將能夠另外特異地同時結合THC-COOH和THC-OH。最理想地，所述抗體將顯示與側向流動免疫色譜法測試中這兩種代謝物大約至少相等或更高的交叉反應性，所述測試采用如下面例舉的固定化5-戊基間苯二酚綴合物。理想地，這樣一種抗體將能夠在該測試中檢測≤20ng/ml的THC。雖然已經在上面提及了用于這個目的的可商購抗體，應當理解利用常規(guī)技術和通過其羧酸酯基偶聯(lián)到載體蛋白質的THC-COOH或其它結合到載體分子的THC衍生物作為免疫原可以產生同樣適合的其它抗體(多克隆的或單克隆的)。
設想適合的抗體也可以如上述通過用作免疫原的5-戊基間苯二酚綴合物而產生。據推測這種5-戊基間苯二酚通過其羥基到蛋白質，例如，BSA的連接引起化合物構型以這樣一種方式改變，以便抗-THC抗體能夠特異地識別所述構型。
在本發(fā)明的方法中使用的抗體可以被直接或間接標記，例如，通過次級標記的抗體。用于此目的的適合標記是在免疫測定中常規(guī)采用的任何標記，其包括放射性標記、熒光標記、顆粒標記如膠體金、酶標記例如辣根過氧化物酶和生物素。
這里所用術語“抗體”將被理解成延伸到抗體片段，例如Fab、Fab′和Fv片段，其保持抗體的結合能力并可以利用在本發(fā)明的方法中。
競爭性測定也如上所指出，本發(fā)明的方法可以采用進行競爭性免疫測定的任何形式。藥物-抗體結合可以發(fā)生在溶液中，隨后是結合的配合標記的分離。備選地并優(yōu)選地，抗-THC抗體和5-戊基間苯二酚綴合物的一種可以結合到固體載體，例如，包含硝化纖維素或塑料的固體載體，例如塑料孔表面，或固體珠，例如塑料或玻璃珠。因而，本發(fā)明的方法可以，例如，與常規(guī)競爭性ELISA形式一致，采用直接或間接標記的抗-THC抗體或5-戊基間苯二酚/載體綴合物。在這個情況下，可以將5-戊基間苯二酚/載體綴合物或者抗-THC抗體固定在微量滴定板的孔中或者固定在固體珠上。然而，備選地，可以將抗-THC抗體或5-戊基間苯二酚/載體綴合物固定在多孔測試條或片上而可以由側向流動免疫色譜測定便利地進行現場藥物測試，例如包含硝化纖維素的測試條或片。這樣一種測試條或片，例如，可以是結合到后撐(backing support)的硝化纖維素形式，例如塑料片。這樣一種條或片可以是硝化纖維素卡片。根據本發(fā)明的優(yōu)選側向流動免疫色譜測試在緊接的下面將更充分地討論并且通過舉例說明。
側向流動方法根據本發(fā)明的側向流動免疫色譜測試可以利用任何已知的側向流動裝置形式進行并且依賴于用于分析物檢測的競爭性抗體結合。這樣的測試可以利用在Cozart Bioscience Limited的英國專利2339615，相應公布的國際申請WO 00/04831和Journal of Forensic Science 2001，46卷，1214-1220頁中描述的操作法進行。
分析物檢測用側向流動裝置的共同特征是提供包含干燥多孔材料例如硝化纖維素的測試條或片，液體樣品可以通過其被吸引到達一個或多個空間上獨立的分析物檢測區(qū)。每一個這樣的區(qū)域提供一種固定化的特異性結合試劑。為此目的的根據本發(fā)明的側向流動免疫色譜測試，將提供至少一個這樣的分析物檢測區(qū)，其提供適合的5-戊基間苯二酚/載體綴合物或者適合的抗-大麻素抗體。這樣一種測試條或片也將具有連接到那里或者結合到那里的標記釋放區(qū)，所述標記釋放區(qū)能夠將下列兩種物質之一釋放到吸引到那個區(qū)域中的液體中或者是標記的抗體，如果所述分析物檢測區(qū)提供固定化的綴合物，或者是可檢測的綴合物，如果所述分析物檢測區(qū)提供固定化的抗-大麻素抗體。
因而，通過本發(fā)明也提供一種用于進行根據本發(fā)明的側向流動免疫色譜測試的測試條或片，其具有下列特征(i)包含干燥多孔材料、優(yōu)選硝化纖維素的條或片，在分析物檢測區(qū)中具有固定于其上的如上所述適合的5-戊基間苯二酚/載體綴合物或者適合的抗-THC抗體；和(ii)被連接到或整合到提供所述分析物檢測區(qū)的所述條或片的單獨的標記釋放區(qū)，所述標記釋放區(qū)能夠將下列兩種物質之一釋放到吸引到那個區(qū)域中的液體中或者是標記形式的所述抗體，如果所述分析物檢測區(qū)提供固定化的5-戊基間苯二酚綴合物，或者是如上所述的可檢測的5-戊基間苯二酚綴合物，如果所述分析物檢測區(qū)提供固定化的抗體。這樣的可檢測的綴合物可以是，例如，用金或有色乳膠顆粒標記的5-戊基間苯二酚綴合物。
實施例更加詳述了根據本發(fā)明的采用固定化5-戊基間苯二酚綴合物和標記的抗-THC抗體的側向流動免疫色譜測試，更具體而言標記的抗體能夠結合THC并表現與THC-COOH和THC-OH的高交叉反應性。舉例說明的是金顆粒標記的抗體的優(yōu)選使用，盡管可以采用其它的標記，例如，還是有色的乳膠顆粒。利用這個方法和如上所述的金-標記的可商購抗-THC抗體，發(fā)現THC和THC-OH兩者在≤20ng/ml都是可檢測的，而THC-COOH是以更大的靈敏度可檢測的(約1.0ng/ml)。
除如上所述的分析物檢測區(qū)之外，根據本發(fā)明的側向流動測試用測試條或片也可具有一個或多個另外的分析物檢測區(qū)用于檢測一種或多種另外的藥物或藥物種類或組。
應當理解，在側向流動裝置中，考慮到液體流動的方向，所述標記釋放區(qū)將處于所述分析物檢測區(qū)的近端。它可以以墊板形式，例如包含玻璃纖維的墊板，連接到提供所述分析物檢測區(qū)的條或片。在這樣一種條或片中提供整體標記釋放區(qū)的方法也是眾所周知的。例如，硝化纖維素條的區(qū)域可以通過沉積糖或纖維素的水溶液而磨光，并且因而將磨光的區(qū)域與標記的試劑接觸(見，例如，歐洲專利號0291194和相關的歐洲專利0560410和0560411)。
本發(fā)明的側向流動方法中使用的測試條或片也可以另外包含標記釋放區(qū)近端的樣品接收構件或墊板。這樣一種樣品接收構件或墊板可以由任何能夠快速吸收液體的吸水材料制造。
典型地，這樣一種測試條或片，在沿所述條預期的液體流動方向上的分析物檢測區(qū)之外，即，在分析物檢測區(qū)的遠端，將還具有提供固定化特異結合試劑的檢測區(qū)以便提供控制區(qū)(control zone)。所述控制區(qū)起指示樣品的液體已經在適于分析物檢測的條件下穿過在前的分析物檢測區(qū)的作用。例如，在由標記釋放區(qū)提供標記抗體時，控制區(qū)可以提供能夠結合所述標記抗體的固定化抗體。
在期望的液體流動方向上的檢測區(qū)的遠端，本發(fā)明的測試條或片還可以包含吸收絨墊(waste pad)(末端或芯吸墊板)。
本發(fā)明也延伸到結合測試條或片的側向流動裝置用于進行本發(fā)明的方法，例如便攜式篩選裝置，如Cozart Bioscience Limited的WO 00/04381中所描述。
樣品適合的測試樣品將以液體形式存在以使其與所述抗大麻素抗體相互作用。如上所指出，本發(fā)明的方法特別有利于口腔流體(oral fluid)(唾液)樣品，所述樣品可以首先用緩沖液例如Cozart Oral Fluid DilutionBuffer(Cozart Bioscience產品CR-BUFF)稀釋。這樣的樣品特別有利于大麻的現場測試，例如路邊測試，使用目視讀取測試或采用如上所述的便攜的側向流動讀取裝置。然而，應當理解本發(fā)明的方法可以應用到通常用于測試藥物濫用的任何形式的液體樣品。因而，所述樣品可以是組成自或衍生自任何口腔流體、尿、血、眼部流體(ocular fluid)、汗或毛發(fā)的流體樣品。適合的樣品可以來源于環(huán)境來源或藥簽，例如與口中的口腔液體或懷疑大麻沾污的表面接觸的藥簽。所述樣品可以通過將待測試大麻存在的材料例如固體樹脂或粉末溶解在緩沖溶液中而獲得。對于樣品制備可以引用的參考文獻包括Clinical Pharmacokinetics 1996，30卷，211-228頁中的“DrugMonitoring in Nonconventional Biological Fluids and Matrices”和ForensicScience Review 1997，9卷，23-25頁中的“Testing for Drugs of Abuse inHair”。
試劑盒如上所述，本發(fā)明也另外延伸到用于實施本發(fā)明方法的試劑盒，其包含如上描述的適合的5-戊基間苯二酚/大分子載體綴合物和抗-THC抗體?？梢杂每蓹z測的標記將5-戊基間苯二酚綴合物或者抗-THC抗體直接標記。在5-戊基間苯二酚綴合物的情況中，如上面已經指出的，所述綴合物的載體部分可以用作可檢測的標記。備選地，可以提供將所述綴合物或者抗-THC抗體間接標記的方法，例如，次級標記的抗體?；蛘?-戊基間苯二酚綴合物或者抗-THC抗體可以被固定在固體載體上。例如，所述試劑盒可以包含用于進行側向流動免疫色譜的如上所述測試條或片上固定化的綴合物或者抗-THC抗體。這樣一種測試條或片可以插入箱(housing)中，所述箱在和這樣一種箱一起的分析物檢測區(qū)上提供一個窗口或多個窗口。
本發(fā)明的試劑盒可以包含其它組分。例如，當從測試對象收集試樣時，所述試劑盒還可以含有流體收集設備，例如，口腔流體收集裝置或藥簽，容器例如適于收集血或尿的容器。用于側向流動方法中的試劑盒可以包括便攜式讀取裝置和結果的數字顯示器，可以將上面描述箱安裝到所述便攜式讀取裝置內用于檢測在檢測區(qū)中結合的標記。
下面的實施例闡明了本發(fā)明。
實施例I.牛血清白蛋白-THC(BSA-THC)綴合物的制備利用碳二亞胺偶聯(lián)方法將THC-COOH綴合到BSA。將所述藥物的羧酸基團如下連接到賴氨酸殘基的側鏈ε-氨基1.將5.0mg的Δ9-THC酸(Helena，目錄號DR021)溶解在1ml乙醇中。
2.加入1.0ml的二甲基甲酰胺(DMF)。
3.加入10μl的N-甲基嗎啉(NMM，Sigma Co.，目錄號67869)。
4.加入N-羥基琥珀酰亞胺(N-HS)，50μl的二甲基甲酰胺(DMF)中的6.3mg。在室溫下黑暗中將混合物攪拌24小時。
5.在棕色瓶中稱出30mg牛血清白蛋白。溶解在4ml的0.1M 碳酸氫鈉中。
6.向所述BSA溶液中逐滴加入活化的藥物。在室溫下黑暗中攪拌過夜。
7.加入100μl的2M Tris并繼續(xù)攪拌另外60分鐘。
8.對pH 7.3含有0.1％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖鹽水透析過夜。
9.利用Lowry蛋白質測定法確定蛋白質濃度并且在PBS/疊氮化物中調節(jié)到1mg/ml。將等分部分保存在-20℃。
利用酶免疫吸附測定測試所述綴合物。將96-孔微量滴定板用所述綴合物以5μg/ml、100μl/孔在50mM、pH 9.6碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液中在室溫下過夜包被。然后將所述孔用pH 7.4、含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖鹽水(洗滌緩沖液)洗(4次，330μl/孔)并在相同緩沖液中封閉30分鐘。將含有5mg/ml BSA的洗滌緩沖液(測定緩沖液)中3-倍稀釋的小鼠單克隆抗-THC抗體(East Coast Biologics，USA)加入到所述孔(100μl/孔)。在室溫下保溫1小時后如前將孔板用洗滌緩沖液洗4次并將辣根過氧化物酶-標記的山羊抗-小鼠IgG加入到測定緩沖液中(1/2000稀釋，100μl/孔)并將孔板繼續(xù)保溫另外30分鐘。然后如前洗滌所述孔板并將底物溶液四甲聯(lián)苯胺加入到所述孔(100μl/孔)。在保溫30分鐘后，通過加入1M硫酸(100μl/孔)停止顯色并且在450nm讀取光密度。圖3表示了典型的滴定曲線。
II.牛血清白蛋白-5-戊基間苯二酚綴合物(BSA-CAN)的制備利用二甲基氨基吡啶(DMAP)/二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)方法或乙烯基砜，通過它的羥基將5-戊基間苯二酚偶聯(lián)到牛血清白蛋白，如下(i)利用二甲基氨基吡啶/二琥珀酰亞胺基碳酸酯的偶聯(lián)1.將10mg的5-戊基間苯二酚溶解在1ml異丙醇中。
2.將88mg的DSC溶解在0.4ml DMF中。
3.將42mg of DMAP溶解在0.4ml丙酮中。
4.將DSC溶液逐滴加入到5-戊基間苯二酚溶液。
5.將DMAP溶液緩慢并逐滴加入。在室溫下黑暗中攪拌過夜。
6.將活化的藥物加入到在4ml的0.1M碳酸氫鈉中的70mg的BSA。在室溫下攪拌過夜。
7.將所述綴合物對pH 7.3的含有0.1％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)透析三天，更換三次、每次1升。
8.利用Lowry蛋白質測定法確定蛋白質濃度并且調節(jié)到1mg/ml。將等分部分保存在-20℃。
用具有氨基己酸間隔團的BSA替換這個方法中的BSA得到同樣適合的綴合物。
(ii)利用乙烯基砜的偶聯(lián)1.將10mg的BSA溶解在pH 10.0的1ml的0.1M碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液中。緩慢加入0.1ml的乙烯基砜并在室溫下將所述混合物攪拌過夜。將活化蛋白對0.15M氯化鈉在室溫下透析6小時。
2.加入在0.2ml異丙醇中的1.5mg的5-戊基間苯二酚并將所述混合物在室溫下保溫過夜。
3.將所述綴合物對PBS/疊氮化物透析3天，更換3次每次2升。
4.利用Lowry蛋白質測定法確定蛋白質濃度并且稀釋到1mg/ml。將等分部分保存在-20℃。
也通過對BSA-THC綴合物描述的酶免疫測定法測試BSA-CAN綴合物。圖4表示典型的滴定曲線。
III.對大麻的側向流動免疫色譜測試將BSA-THC和BSA-CAN用于建立大麻的側向流動測試。圖5表示這個測試的形式。將所述綴合物在含有3％乙醇的PBS中稀釋到1mg/ml。將BSA-THC或BSA-CAN利用噴墨或直接接觸方法固定在硝化纖維素條上。也將綿羊抗-小鼠IgG抗體(作為控制線(3))以0.5mg/ml固定在所述硝化纖維素條(2)上。在37℃過夜干燥所述條。將含有金-標記的小鼠單克隆抗-THC抗體(從East Coast Biologics，USA獲得的未標記抗體)的玻璃纖維墊板(4)樣品墊板(5)和芯吸墊板(6)層壓到所述硝化纖維素條上，如圖5中所示。利用Cozart樣品收集墊板(產品號MANU018)收集口腔流體樣品(1ml)并用2ml的Cozart口腔流體稀釋緩沖液(產品號CR-BUFF)稀釋。將120μl稀釋的口腔流體緩慢加入到所述樣品墊板。通過毛細作用所述液體移動經過所述條而水合所述金-標記的抗體。
如果所述樣品不含大麻，那么標記的抗體結合到固定化的BSA-藥物綴合物而得到微紅/棕色線。所述控制線捕捉過量的標記抗體。如果稀釋的口腔流體含有大麻，那么這優(yōu)先于固定化的BSA-藥物綴合物結合到所述金-標記的抗體導致BSA-藥物線的顏色強度減小。利用CozartRapiscan閱讀器(德國專利號2339615，對應公開的國際專利申請WO 00/04831和Journal ofForensic Science 2001，46卷，1214-1220頁，產品號CR200S-UK)讀出每一個測試的結果。閱讀器測量所述BSA-藥物線的顏色強度，其與稀釋的口腔流體樣品中的藥物濃度負相關，報告所述測試結果為對于預設截止值為陽性或陰性。用THC(I)或THC-COOH(III)或THC-OH(III)以不同濃度摻入不含藥物的口腔流體并且然后利用BSA-THC或BSA-CAN側性流動條測試。表1中列出了在閱讀器上給出陽性信號的藥物的最低濃度。顯然利用新的BSA-CAN綴合物將THC檢測的靈敏度增加了約10倍。
表權利要求
1.一種檢測液體樣品中Δ-9-四氫大麻酚(THC)的方法，該方法包含(a)將所述樣品與(i)5-戊基間苯二酚/大分子載體綴合物和(ii)能夠結合THC和所述綴合物兩者的抗體接觸，其中在所述5-戊基間苯二酚/大分子載體綴合物中5-戊基間苯二酚是通過它的苯環(huán)上的羥基或其衍生物綴合到所述載體；和(b)測定所述抗體與所述綴合物的結合是否在所述樣品的存在下減少。
2.如權利要求1要求保護的方法，其中所述抗體能夠結合Δ-9-四氫大麻酚(THC)和它的代謝物11-去甲-9-羧基-Δ-9-THC(THC-COOH)和11-羥基-Δ-9-THC(THC-OH)的全部，由此可以檢測液體樣品中的一種或多種THC、THC-COOH和THC-OH。
3.如權利要求2要求保護的方法，其中所述抗體是針對通過THC-COOH的羧酸酯基偶聯(lián)到載體蛋白質的THC-COOH產生的抗體。
4.如權利要求1至3任一項要求保護的方法，其中所述5-戊基間苯二酚/載體綴合物的載體是蛋白質。
5.如權利要求4要求保護的方法，其中所述蛋白質選自牛血清白蛋白、辣根過氧化物酶、卵清蛋白、γ-球蛋白和甲狀腺球蛋白。
6.如在前權利要求任一項要求保護的方法，其中所述抗體被直接或間接標記。
7.如權利要求1至5任一項要求保護的方法，其中所述5-戊基間苯二酚綴合物被直接或間接標記或者所述綴合物的載體也用作可檢測的標記。
8.如在前權利要求任一項要求保護的方法，其中所述綴合物是通過利用二甲基氨基吡啶/二琥珀酰亞胺基碳酸酯或乙烯基砜將5-戊基間苯二酚經由它的羥基偶聯(lián)到所述載體的氨基上的綴合物。
9.根據在前權利要求任一項的方法，其中5-戊基間苯二酚通過間隔團分子偶聯(lián)到所述載體。
10.如在前權利要求任一項要求保護的方法，其中將所述抗體和所述5-戊基間苯二酚/載體綴合物之一固定在固體載體上。
11.如權利要求10要求保護的方法，該方法是側向流動色譜測定法。
12.如權利要求11要求保護的方法，其中將所述5-戊基間苯二酚綴合物在用于所述測定法的測試條或片上的分析物檢測區(qū)中被固定化并且所述抗體是被標記的。
13.如權利要求12要求保護的方法，其中所述抗體是金顆粒標記的。
14.如在前權利要求任一項要求保護的方法，其中所述樣品組成自，或者衍生自尿、血、汗、眼部流體、口腔流體(唾液)或毛發(fā)。
15.如權利要求11至13任一項要求保護的方法，其中施加到所述測試條或片而進行側向流動免疫色譜法的樣品是緩沖液稀釋的口腔流體。
16.用于進行根據權利要求11至13任一項的側向流動免疫色譜測定法的側向流動分析裝置中使用的測試條或片，所述測試條或片具有下列特征(i)包含干燥多孔材料的條或片，其具有在分析物檢測區(qū)內固定其上的所述5-戊基間苯二酚/載體綴合物或者所述抗體，和(ii)被連接到或整合到提供所述分析物檢測區(qū)的所述條或片的單獨的標記釋放區(qū)，所述標記釋放區(qū)能夠將以下兩者之一釋放到吸引到那個區(qū)域內的液體中標記形式的所述抗體，如果所述分析物檢測區(qū)提供固定化的5-戊基間苯二酚/載體綴合物，或者是如權利要求7中定義的可檢測的5-戊基間苯二酚綴合物，如果所述分析物檢測區(qū)提供固定化的抗體。
17.根據權利要求16的測試條或片，其中所述干燥多孔材料是硝化纖維素。
18.根據權利要求16或17的測試條或片，其中將5-戊基間苯二酚綴合物在分析物檢測區(qū)內固定化。
19.根據權利要求16至18任一項的測試條或片，該測試條或片還包含在預期液體流動方向上位于所述分析物檢測區(qū)遠端的控制區(qū)。
20.根據權利要求16至19任一項的測試條或片，該測試條或片還包含在關于液體流動的預期方向上在所述標記釋放區(qū)域近端的樣品接收部件或墊板。
21.根據權利要求16至20任一項的測試條或片，該測試條或片還包含在預期的液體流動方向上所述分析物檢測區(qū)域的遠端的吸收絨墊。
22.被插入到箱中的權利要求16至21任一項中的測試條或片。
23.結合根據權利要求16至22任一項的測試條或片的側向流動裝置。
24.用于實施根據權利要求1至3任一項方法的試劑盒，其包含所述5-戊基間苯二酚/載體綴合物和所述抗體。
25.如權利要求24中要求保護的試劑盒，其中所述抗體是直接標記或提供次級標記的抗體用于標記所述抗體。
26.如權利要求24中要求保護的試劑盒，其中所述綴合物是如權利要求7中定義的可檢測綴合物。
27.如權利要求24至26任一項中要求保護的試劑盒，其中將所述抗體或所述綴合物在固體載體上固定化。
28.如權利要求27中要求保護的試劑盒，其包含根據權利要求16至22任一項的測試條或片。
29.一種綴合物，其中5-戊基間苯二酚是通過它的苯環(huán)上的羥基或其衍生物偶聯(lián)到大分子載體，由此所述綴合物能夠結合根據權利要求2或權利要求3的抗體。
30.如權利要求29要求保護的綴合物，該綴合物是被標記的或固定在固體載體上。
31.一種抗體生產方法，其中采用權利要求29中要求保護的綴合物作為免疫原。
32.一種制造根據權利要求29的綴合物的方法，其中5-戊基間苯二酚通過其羥基或這樣一種基團的衍生物偶聯(lián)到所述載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于Δ－9－四氫大麻酚(大麻THC)的高靈敏度檢測的競爭性免疫測定技術，它采用大麻生物合成中的中間體的載體綴合物，更具體而言是通過其羥基綴合到大分子載體的5－戊基間苯二酚。通過在側向流動免疫色譜測試裝置中采用這樣一種具有抗－THC抗體的綴合物，可以實現便利的用于液體樣品中低水平大麻的現場測試。這樣的測試特別有利于口腔流體樣品中大麻的路邊測試。
文檔編號G01N33/94GK1981193SQ200580022424
公開日2007年6月13日 申請日期2005年7月1日 優(yōu)先權日2004年7月2日
發(fā)明者A·M·T·杰漢里, C·W·漢德 申請人:考扎特生物科學有限公司