專利名稱：紫杉醇免疫測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫測定法領(lǐng)域，該測定法用于確定人類生物流體中紫杉醇的存在和/或?qū)θ祟惿锪黧w中的紫杉醇進行定量，以快速確定化學療法期間最佳的藥物濃度。
背景技術(shù)：
癌癥是用于描述一組惡性腫瘤的術(shù)語，所述惡性腫瘤都具有共同的發(fā)展性狀，此時身體的部分中的細胞開始失去控制地生長。多數(shù)癌癥形成腫瘤，但是還可以在血液中呈現(xiàn)和循環(huán)穿過它們生長處的其它組織。最通常用手術(shù)、化學療法和/或放射療法組合治療癌癥惡性腫瘤。用于治療特定癌癥的治療的類型取決于幾種因素，包括癌癥惡性腫瘤的類型和它們被診斷時所處的階段。
紫杉醇(taxol)也稱作紫杉醇(paclitaxel)，是用于治療乳腺癌(Holmes等人Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，10，60，1991)、卵巢癌(Einzig等人Proc.Am.Assoc.Cancer Res.，31，1114，1990)和非小細胞肺癌的最常用的細胞毒性劑之一。紫杉醇具有下面的結(jié)構(gòu)式 該化合物已與使人虛弱的副作用關(guān)聯(lián)起來，所述副作用例如骨髓密度減小、過敏反應(yīng)、嗜中性粒細胞減少、低血壓、心動過緩(bardycardia)、惡心和嘔吐。通過監(jiān)視身體中紫杉醇水平和調(diào)節(jié)劑量，可以更好地控制和限制患者中的這些副作用。
同時，在紫杉醇劑量和所產(chǎn)生的影響治療效果的血清藥物濃度之間通常存在高度可變的關(guān)系。紫杉醇的個體內(nèi)和個體間藥物代謝動力學可變性程度可以高達5倍(Gurney等人，J.Clin.Oncol.14，pp 2590-2611，1996)并且受到許多因素的影響，這些因素包括○器官功能○遺傳調(diào)節(jié)○疾病狀態(tài)○年齡○藥物-藥物相互作用○藥物攝入時間○藥物施用方式，和○與技術(shù)相關(guān)的施用。
作為該可變性的結(jié)果，不同個體中相等劑量的同一藥物可以導致顯著不同的臨床結(jié)果(Hon等人Clinical Chemistry 44，pp 388-400，1998)。相同紫杉醇劑量的有效性基于患者中的最終血清藥物濃度和個體藥物清除率而顯著不同。治療性藥物處理將為臨床醫(yī)生提供在口服和靜脈內(nèi)藥物施用中對患者差異的了解。使用治療性藥物管理，藥物劑量可以為患者個體化，并且有效治療癌癥而沒有不想要的副作用的機會將高得多。
此外，紫杉醇的治療性藥物管理將作為極好的工具來確保用實際處方劑量施用化學治療中的依從性(compliance)和獲得有效的血清濃度水平。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血清濃度的可變性不僅是由于生理因素，而且還可以由施用技術(shù)的變化導致。
紫杉醇的常規(guī)治療性藥物管理將需要能獲得可改造為適于一般實驗室設(shè)備的簡單自動化測試。最好地滿足這些標準的測試是免疫測定法。已經(jīng)報道了針對紫杉醇的免疫測定法和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測定法(Erlanger等人，美國專利5,756,301，1998年5月26日)。然而，用于該測定法的衍生物和免疫原會賦予相應(yīng)抗體與紫杉醇和紫杉醇代謝物(特別是6-α-羥基紫杉醇)的寬范圍的交叉反應(yīng)活性。為了最有效于檢測藥物水平，抗體應(yīng)該對活性化合物最特異并且對非活性代謝物顯示出極低的交叉反應(yīng)活性或者不顯示交叉反應(yīng)活性。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)產(chǎn)生了一類新的抗體，它們與紫杉醇高度選擇性地反應(yīng)，從而結(jié)合紫杉醇，而與紫杉醇代謝物，尤其是6-α-羥基紫杉醇和3’-對-羥基紫杉醇沒有實質(zhì)的交叉反應(yīng)活性。選擇性地反應(yīng)是指該抗體僅與紫杉醇分子反應(yīng)并且不與其它化合物實質(zhì)性反應(yīng)，所述其它化合物為諸如紫杉醇代謝物，最重要的阻斷代謝物是6-α-羥基紫杉醇和3’-對-羥基紫杉醇。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用下述免疫原，產(chǎn)生對紫杉醇特異并且不與其它化合物如紫杉醇的代謝物或者相關(guān)化合物(如漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇和6-α-羥基紫杉醇)實質(zhì)性反應(yīng)或者結(jié)合的抗體，所述免疫原是免疫原性多胺聚合物與下式化合物 其中A是 或＝N-O-；Y是有機間隔基團；X是能夠與多胺聚合物結(jié)合的末端官能團；p是從0到1的整數(shù)；Ph是苯基；或者下式化合物
其中Ph、p、Y和X如上并且B是-CH2-或者 或者它們的混合物的綴合物(conjugate)。這些與紫杉醇高度選擇性反應(yīng)并且不與6-α-羥基紫杉醇和3’-對-羥基紫杉醇交叉反應(yīng)的抗體的提供，使得可以產(chǎn)生下述免疫測定法，該測定法能特異性檢測和監(jiān)測用紫杉醇治療的患者的流體樣品中的紫杉醇。本發(fā)明還包括用于所述免疫測定法的試劑和試劑盒。作為紫杉醇代謝物的6-α-羥基紫杉醇和3’-對-羥基紫杉醇的存在是過去紫杉醇免疫測定法中假陽性讀數(shù)的主要原因。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供了一類新的抗體，其與紫杉醇高度選擇性反應(yīng)并且不與上面提到的紫杉醇代謝物實質(zhì)性反應(yīng)或者交叉反應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用式II-A的9-羰基紫杉醇和式II-B的7-羥基紫杉醇的這些衍生物或者它們的混合物作為免疫原，提供了本發(fā)明的這類新的抗體。通過使用這些抗體，已經(jīng)開發(fā)了一種免疫測定法，包括用于該免疫測定法的試劑和試劑盒，所述免疫測定法用于檢測和/或定量血液、血漿或者其它體液樣品中的紫杉醇。通過使用該免疫測定法，可以檢測和/或定量體液樣品(優(yōu)選血樣或者血漿樣品)中紫杉醇的存在和量。以這種方式，可以在治療期間監(jiān)測用紫杉醇治療的患者并且根據(jù)所述監(jiān)測調(diào)節(jié)對他的治療。通過本發(fā)明，在用紫杉醇作為化學治療劑治療的癌癥患者中獲得了對紫杉醇的治療性藥物管理。
用于本發(fā)明的該測定法中的試劑是式II-A和II-B的化合物或者其混合物與聚合物載體的綴合物。這些綴合物是樣品中存在的紫杉醇與本發(fā)明抗體結(jié)合的競爭性結(jié)合配偶體。因此，與抗體結(jié)合的綴合物試劑的量將與樣品中紫杉醇的量成反比。根據(jù)本發(fā)明，該測定法利用任何傳統(tǒng)測量手段檢測和測量結(jié)合或未結(jié)合所述抗體的所述綴合物的量。通過使用所述手段，可以測定結(jié)合或未結(jié)合的綴合物的量。一般而言，通過將樣品中紫杉醇產(chǎn)生的結(jié)合的或未結(jié)合的綴合物的量的測量值與從含有已知量的紫杉醇的樣品得到的標準或者校準曲線確定的結(jié)合或未結(jié)合的綴合物的值相關(guān)聯(lián)，來測定樣品中紫杉醇的量，所述已知量在待測試的樣品的預(yù)期范圍內(nèi)。使用與用于樣品相同的免疫測定步驟確定用于產(chǎn)生校準曲線的這些研究。
從是II-A或者II-B的化合物或者其混合物制備綴合物以及免疫原。載體的綴合物或者免疫原連接到多胺聚合物配體部分，其具有下式 其中Y、A和p如上所述；以及x’是-CH2-或者官能連接基團； 其中x’、A、B和p如上所述。
這些配體部分可以連接免疫原的載體或者多胺聚合物上的一個或多個活性位點。
定義在該說明書全文中，下述定義將被這樣理解本申請全文所用的術(shù)語“Ph”表示苯基。術(shù)語“亞烷基”表示含有1到10個碳原子的二價飽和的直鏈或者支鏈烴取代基。
術(shù)語“免疫原”和“免疫原性”指能夠在生物中引起、產(chǎn)生和生成免疫應(yīng)答的物質(zhì)。
術(shù)語“綴合物”指從兩個部分連接在一起形成的任何物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的代表性綴合物包括通過量小分子(如式II-A和II-B的化合物)與大分子(如載體或者多胺聚合物，尤其蛋白質(zhì))連接在一起形成的綴合物。在綴合物中，小分子可以結(jié)合在大分子的一個或多個活性位點。術(shù)語綴合物包括術(shù)語免疫原。
“半抗原(hapten)”是部分或者不完全的抗原。它們是無蛋白質(zhì)的物質(zhì)，多數(shù)是低分子量物質(zhì)，它們不能刺激抗體形成，但是與抗體反應(yīng)。通過將半抗原偶聯(lián)到高分子量免疫原載體上然后向人或者動物受試者注射該偶聯(lián)的產(chǎn)物，即免疫原，可以形成抗體。本發(fā)明的半抗原是紫杉醇。
本文所用的“間隔基團”或者“間隔臂(spacer)”指化學結(jié)構(gòu)的一部分，其通過CH2或者官能連接基團連接兩個或多個亞結(jié)構(gòu)，如半抗原、載體、免疫原、標記或者示蹤劑。這些間隔基團將在本申請的下文中列舉。間隔基團的原子和間隔基團內(nèi)鏈的原子本身通過化學鍵連接。優(yōu)選的間隔臂是直鏈或支鏈、飽和或不飽和的碳鏈。這些碳鏈還可以在鏈內(nèi)或者鏈的末端包括一個或多個雜原子?！半s原子”指不同于碳的原子，其選自氧、氮和硫構(gòu)成的組。間隔基團還可以包括環(huán)狀或者芳族基團作為鏈的一部分或者作為鏈中一個原子上的取代。
通過對不是氫的原子計數(shù)確定間隔基團中原子數(shù)。通過對沿著所連接的結(jié)構(gòu)之間最短路徑的不是氫的原子計數(shù)，確定鏈中間隔基團內(nèi)的原子數(shù)。官能連接基團可以用于激活半抗原或者間隔基團，例如，在半抗原或者間隔基團上提供可利用的官能位點，用于合成半抗原與標記或者載體或者多胺聚合物的綴合物。
如本文所用的術(shù)語“免疫原性載體”是免疫原性物質(zhì)，通常是蛋白質(zhì)，所述免疫原性物質(zhì)可以結(jié)合半抗原(在本發(fā)明的情況中為紫杉醇或者紫杉醇衍生物)，從而使得這些半抗原衍生物誘導免疫應(yīng)答和引起可以特異結(jié)合這些半抗原的抗體的產(chǎn)生。免疫原性載體和連接基團將在本申請的下文中列舉。在免疫原性載體物質(zhì)中包括被識別為外來的從而引起宿主免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)、糖蛋白、復(fù)雜聚氨基-多糖、顆粒和核酸?？梢允褂靡阎糜谠撝苽涞娜我粋鹘y(tǒng)方法從多糖制備聚氨基-多糖。
多種蛋白質(zhì)類型也可以用作聚(氨基酸)免疫原性載體。這些類型包括白蛋白、血清蛋白、脂蛋白，等等。闡明性蛋白質(zhì)包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍蛋白(KLH)、卵卵白蛋白、牛甲狀腺球蛋白(BTG)等等。備選地，可以利用合成的聚(氨基酸)。
免疫原性載體還可以包括聚氨基-多糖，其是通過單糖的反復(fù)縮合制備的高分子量聚合物。多糖的實例是淀粉、糖原、纖維素、糖膠，如阿拉伯樹膠、瓊脂，等等。多糖還可以含有聚氨基酸殘基和/或脂類殘基。
免疫原性載體還可以是單獨存在的聚(核酸)或者綴合到上述聚(氨基酸)或者多糖之一的聚(核酸)。
免疫原性載體還可以包括固體顆粒。顆粒直徑通常為至少約0.2微米(μm)并且不大于約100μm，通常約0.05μm到10μm。顆?？梢允怯袡C或無機的、可膨脹的或不可膨脹的、多孔或無孔的，最好具有接近水的密度，通常為約0.7到1.5g/mL，并且由可以是透明的、部分透明的或者不透明的材料組成。顆?？梢允巧锊牧希缂毎臀⑸?，包括下述非限制性的例子，如紅細胞、白細胞、淋巴細胞、雜交瘤、鏈霉菌(Streptococcus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(E.coli)和病毒。顆粒還可以包含有機和無機聚合物、脂質(zhì)體、乳膠、磷脂小泡或者脂蛋白。
“聚(氨基酸)”或者“多肽”是由氨基酸形成的聚酰胺。聚(氨基酸)將一般在從約2,000道爾頓的分子量至沒有分子量上限的范圍內(nèi)，通常小于10,000,000，并且通常不超過約600,000道爾頓。取決于免疫原性載體還是酶參與，通常具有不同的分子量范圍。
“肽”是通過酰胺(肽)鍵連接兩個或多個氨基酸形成的任何化合物，通常是α-氨基酸的聚合物，其中每個氨基酸殘基(除了NH2末端)的α-氨基連接到線性鏈的下一個殘基的α-羧基上。術(shù)語肽、多肽和聚(氨基酸)在本文中同義地使用，指這類化合物而大小沒有限制。該類的最大的成員稱作蛋白質(zhì)。
“標記”、“檢測分子”或者“示蹤劑”是產(chǎn)生或者可以誘導而產(chǎn)生可檢測的信號的任何分子。標記可以綴合到分析物、免疫原、抗體，或者另一分子，如受體或者可以結(jié)合受體的分子，如配體，尤其半抗原。標記的非限制性例子包括放射性同位素、酶、酶片段、酶底物、酶抑制劑、輔酶、催化劑、熒光團、染料、化學發(fā)光劑、熒光劑，或者感光劑；非磁性或者磁性顆粒、固體支持物、脂質(zhì)體、配體或者受體。
術(shù)語“抗體”指抗原的特異蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體，并且是對抗原而非其它物質(zhì)具有特異結(jié)合親和力的任何物質(zhì)，或者一組物質(zhì)。通用術(shù)語抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體和抗體片段。
術(shù)語“衍生物”指通過一種或多種化學反應(yīng)從親本化合物制備的化合物或者分子。
術(shù)語“載體”指固體顆粒和/或聚合性聚合物，如免疫原性聚合物，如上面提到的免疫原性聚合物。當載體是固體顆粒時，固體顆?？梢越Y(jié)合或者附著到多胺聚合物上，或被多胺聚合物包被，以提供一個或多個反應(yīng)活性位點用于結(jié)合式II-A和II-B的化合物中的末端官能團X。
術(shù)語“試劑試劑盒”或者“測試試劑盒”指用于進行測定法的一組物質(zhì)。試劑可以以處于相同或分開容器中的被包裝組合的形式提供，這取決于它們的交叉法反應(yīng)活性和穩(wěn)定性，并且其可以為液體或者凍干的形式?？梢赃x擇試劑盒中提供的試劑的量和比例從而為特定應(yīng)用提供最佳結(jié)果。體現(xiàn)本發(fā)明的特征的試劑試劑盒包含對紫杉醇特異的抗體。試劑盒可以還包含分析物的配體和校準和對照物質(zhì)。試劑可以保持為液體形式或者可以是凍干的。
短語“校準和對照物質(zhì)”指含有已知量的待測藥物的標準或者參比物質(zhì)。通過比較從未知樣品得到的結(jié)果與從標準品得到的結(jié)果計算藥物的濃度。這通常通過構(gòu)建校準曲線來進行。
術(shù)語“生物樣品”包括，但不限于，來自活體或者曾經(jīng)是活體的任意量的物質(zhì)。此類活體包括但不限于，人、小鼠、猴、大鼠、兔、馬和其它動物。此類物質(zhì)包括但不限于，血液、血清、血漿、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髓、淋巴、淋巴結(jié)、滑液組織、軟骨細胞、滑液巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和皮膚。
試劑和免疫原在免疫測定法的構(gòu)建中，構(gòu)建紫杉醇的綴合物與樣品中的紫杉醇競爭抗體上的結(jié)合位點。在本發(fā)明的免疫測定法中，試劑是式III-A化合物的9-取代的紫杉醇衍生物和式III-B的7-紫杉醇衍生物。在式III-A和III-B的化合物中，接頭間隔臂組成該分子的-CH2-(Y)p-X’-或-B-(Y)p-X’部分。這些接頭X’和間隔臂-CH2-(Y)p-X’-或-B-(Y)p-X’是傳統(tǒng)用于制備綴合物和免疫原的。用于制備用于免疫測定法的綴合物和免疫原的傳統(tǒng)間隔臂連接基團之一可以用于式III-A和III-B的化合物中。此類傳統(tǒng)接頭和間隔臂公開于美國專利5,501,987和美國專利5,101,015中。
優(yōu)選的間隔臂基團包括此前提及的間隔臂基團。尤其優(yōu)選的間隔臂基團是諸如含有1到10個碳原子的亞烷基的基團， 或 或 其中n和o是0到6的整數(shù)，m是1到6的整數(shù)，亞烷基是特別優(yōu)選的間隔基團。
在式III-A和III-B的化合物中，X’是-CH2-或者官能團，其連接間隔臂，優(yōu)選連接聚合物載體上的胺基團?；鶊FX’是式II-A和II-B的化合物中末端官能團X的結(jié)果，其能夠結(jié)合用作載體或者免疫原的多胺聚合物中的氨基。能夠與胺反應(yīng)的任何末端官能團可以用作式II-A和II-B的化合物中官能團X。這些優(yōu)選包括在X中的末端官能團是
-N＝C＝R4，或 其中R3是氫或者與它連接的氧原子一起形成反應(yīng)活性酯，R4是氧或者硫?；鶊F-N＝C＝R4可以是異氰酸酯或者異硫氰酸酯。通過OR3形成的活性酯包括亞氨基酯，如N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑和對-硝基苯基酯。然而，可以使用可以與胺基團反應(yīng)的任何活性酯。
通過傳統(tǒng)方法將羧基和活性酯偶聯(lián)到載體或免疫原性聚合物。多胺聚合物(如蛋白質(zhì))上的胺基團產(chǎn)生酰胺基團，其將間隔臂連接到本發(fā)明的聚合物、免疫原或者載體和/或綴合物。
在本發(fā)明的免疫原和綴合物中，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法建立含有羧基的紫杉醇半抗原和載體或者免疫原上多胺聚合物氨基之間的化學鍵。通常優(yōu)選形成酰胺鍵。通過將羧基與離去基團試劑(例如，N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑、對-硝基苯酚等等)反應(yīng)，首先活化式II-A或者II-B的化合物中紫杉醇半抗原的羧酸部分來形成酰胺鍵。可以使用活化試劑，如二環(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺等等。然后將式II-A或II-B的紫杉醇半抗原中的羧基的活化形式與含有蛋白質(zhì)載體的緩沖液反應(yīng)。
對于式II-A或II-B的紫杉醇衍生物含有伯氨基或者仲氨基以及羧基的情況，必須在活化和偶聯(lián)反應(yīng)中使用胺保護基團以防止它們自身反應(yīng)形成綴合物。典型地，通過形成對應(yīng)的N-三氟乙酰胺、N-叔丁氧基羰基尿烷(N-t-BOC尿烷)、N-碳苯氧基尿烷或者類似的結(jié)構(gòu)來保護綴合物上的胺。一旦與免疫原性聚合物或者載體的偶聯(lián)反應(yīng)已經(jīng)完成(如上所述)，就可以使用不改變免疫原或者綴合物的結(jié)構(gòu)的試劑除去胺保護基團。此類試劑和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且包括弱或者強的含水或者無水酸、弱或者強的含水或者無水堿、含有氫化物的試劑，如硼氫化鈉或者氰基硼氫化鈉和催化加氫。綴合半抗原和載體的多種方法也公開在美國專利3,996,344和美國專利4,016,146，通過引用將它們并入本文。
另一方面，當X是式II-A或者II-B的化合物中的末端異氰酸酯或者硫代異氰酸酯基時，這些基團與多胺聚合物的游離胺反應(yīng)時產(chǎn)生其中X’是 ，其中R4如上述的III-A或者III-B的綴合物或者免疫原，，其功能性地連接多胺載體或者免疫原性多肽上的氨基，其中在式II-A和II-B的化合物中，X是醛時，這些化合物可以通過還原胺化形成的酰胺聯(lián)接(linkage)，連接到多胺多肽或者載體的胺基。將醛與胺例如通過還原胺化縮合的任何傳統(tǒng)方法可以用于形成該鍵。在該情況中，式III-A和III-B的配體部分中的X’是-CH2-。
式I化合物的紫杉醇和其9-酮基可以由下式表示 其中 代表具有其所示的9-酮基的紫杉醇。9-酮基紫杉醇可以連接到其中A是＝N-O-的式II-A的化合物，這可以通過下述方法來實現(xiàn)將紫杉醇與下式的甲氧胺反應(yīng)NH2-O-CH2-(Y)p-x V-A以產(chǎn)生下式化合物 其中p、Y和X如上文所述。
通過將甲氧胺與羰基縮合形成式VI-A的氧基胺(oxylamine)的傳統(tǒng)方法(如美國專利4,039,385中公開的)，將式I的化合物在其9-氧代基團與式V-A的甲氧胺反應(yīng)形成式VI-A的化合物。如果式V-A的化合物含有任何反應(yīng)活性氨基或者其它官能取代基，那么紫杉醇與V-A的化合物反應(yīng)之前，這些取代基可以與傳統(tǒng)保護基團反應(yīng)。產(chǎn)生了式VI-A的化合物后，通過本領(lǐng)域公知的用于除去此類保護基團的方法除去這些保護基團而保留式VI-A化合物中的氧基胺聯(lián)接。
其中A是 的式II-A的化合物可以這樣制備首先將紫杉醇上的9-氧代基團轉(zhuǎn)化成9-氨基，然后將該9-氨基紫杉醇與下式的酰鹵縮合 其中Y、p和X如上文所述。
利用氯化銨和還原劑(如氰基硼氫化鈉)通過還原胺化可以將紫杉醇上的9-氧代基團轉(zhuǎn)化成9-氨基。
可以用還原胺化中的任何傳統(tǒng)條件將紫杉醇上的9-氧代基團轉(zhuǎn)化成胺基。9-氨基紫杉醇與酰鹵通過縮合反應(yīng)形成式II-A的酰胺，其中A是 。將酰鹵與胺縮合形成酰胺的任何方法可以用于進行該縮合。
按照下文所述形成其中B是-CH2-的式II-B的7-取代的化合物，將紫杉醇的7-羥基與下式的鹵化物反應(yīng)halo-CH2-(Y)p-XV-C其中Y、p和X如上文所述。
在從紫杉醇形成式II-B化合物的過程中，用醇進行反應(yīng)以形成醚的任何傳統(tǒng)方法都可用于將式V-C的化合物與紫杉醇上的7-羥基位縮合。式V-C化合物中鹵化物的使用提供了通過與醇縮合形成這種醚的有效方法。另一方面，當式V-C的化合物含有官能團時(其可以干擾該反應(yīng)形成式II-B的化合物)，可以通過如上述的合適的保護基團保護這些官能團，在該反應(yīng)后可以除去所述保護基團。
按照下述方法產(chǎn)生7-取代的式II-B的化合物，其中B是 將紫杉醇上的7-羥基與下式的氨基化合物反應(yīng)NH2-CH2-(Y)p-XVI其中X、Y和p如上文所述。
首先將紫杉醇上的7-羥基轉(zhuǎn)化成氯代甲酸基 后，可以使用將羥基轉(zhuǎn)化成氯代甲酸基的任何傳統(tǒng)方法。形成氯代甲酸酯后，氯代甲酸酯上的鹵基與式VI化合物中的胺基縮合。該反應(yīng)前，按上文所述用傳統(tǒng)的保護基團保護紫杉醇上和/或式VI的化合物上的反應(yīng)活性基團。
在該鹵化物縮合后，可以通過如前述的傳統(tǒng)方法除去這些保護基團。
式II-A和II-B的化合物可以轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的免疫原和/或綴合試劑，這是通過將這些化合物與多胺或者多肽反應(yīng)來實現(xiàn)的。相同的多肽可以用作本發(fā)明免疫原中的載體以及用作免疫原性多肽，條件是多胺或多肽是免疫活性的。然而，為了形成綴合物，這些多肽不必像免疫原一樣產(chǎn)生免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，式II-A和II-B的化合物中X所代表的多種官能團可以綴合到聚合物物質(zhì)，這可以通過將官能團連接到聚合物內(nèi)所含的胺基的傳統(tǒng)方法來實現(xiàn)。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，在式II-A和II-B的化合物中，X是羧酸基團。
抗體本發(fā)明還涉及利用前述免疫原產(chǎn)生的針對紫杉醇的新的抗體，包括單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的這些抗體與紫杉醇選擇性反應(yīng)，并且與現(xiàn)有技術(shù)的抗體不同，它們不與將干擾紫杉醇的免疫測定的代謝物反應(yīng)。這些紫杉醇代謝物的最有問題的是6-α-羥基紫杉醇和3’-對-羥基紫杉醇。本發(fā)明的抗體不與這些6-α-羥基紫杉醇和3’-羥基紫杉醇代謝物反應(yīng)的能力使得這些抗體在提供紫杉醇的測定法中尤其有價值。
本發(fā)明涉及針對紫杉醇的新的抗體和單克隆抗體。通過用本發(fā)明的免疫原免疫宿主動物可以方便地產(chǎn)生本發(fā)明的抗血清。合適的宿主動物包括嚙齒動物，如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等等，或者高等哺乳動物，如山羊、綿羊、馬等等。根據(jù)用于在動物中引起免疫應(yīng)答的公認方案，可以給予初始劑量、取血(bleeding)和強化注射，例如，在一種優(yōu)選的實施方案中，小鼠接受腹膜內(nèi)100μg免疫原/小鼠的初始劑量并在6個月期限內(nèi)進行兩次和多次50到100μg免疫原/小鼠的后續(xù)強化注射。通過周期性取血，利用傳統(tǒng)免疫測定法觀察到經(jīng)免疫的小鼠的血樣產(chǎn)生針對紫杉醇結(jié)合的免疫應(yīng)答。這些方法提供了篩選產(chǎn)生具有所需活性的抗血清的宿主的方便方法。還針對紫杉醇的主要代謝物對抗體進行篩選，抗體顯示出與這些化合物沒有實質(zhì)性結(jié)合。
通過根據(jù)上面的方案免疫Balb/c小鼠，然后從細胞融合前四天開始的三個連續(xù)日內(nèi)用100μg免疫原腹膜內(nèi)或者靜脈內(nèi)注射小鼠，方便地產(chǎn)生單克隆抗體?？贵w領(lǐng)域中的其它公知方案當然也可以利用。本文詳述的完整免疫方案提供了用于針對紫杉醇的抗體的血清抗體應(yīng)答的最佳方案。
從宿主的脾、外周血、淋巴結(jié)或者其它組織得到的B淋巴細胞可以用作產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。最優(yōu)選的是從脾得到的B淋巴細胞。能夠產(chǎn)生本發(fā)明的所希望的單克隆抗體的雜交瘤可按照如下所述來獲得將此類B淋巴細胞與永生細胞系融合，所述細胞系是對雜交(hybrid)細胞賦予長期組織培養(yǎng)穩(wěn)定性的細胞系。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，永生細胞可以是淋巴樣干細胞或者漿細胞瘤細胞，如骨髓瘤細胞，其自身是產(chǎn)生抗體的細胞而且也是惡性的。通過將小鼠骨髓瘤細胞與來自對紫杉醇蛋白質(zhì)綴合物免疫的小鼠的脾細胞融合，形成產(chǎn)生紫杉醇單克隆抗體的鼠雜交瘤。嵌合和人源化的單克隆抗體可以如下方法產(chǎn)生克隆來自雜交瘤細胞的抗體表達基因，使用本領(lǐng)域現(xiàn)在公知的重組DNA方法將小鼠可變區(qū)的亞序列連接到人恒定區(qū)，或者將人構(gòu)架(framework)區(qū)與來自供體小鼠或者大鼠免疫球蛋白的互補性決定區(qū)(CDR)組合。用于人源化鼠單克隆抗體的改進方法在國際專利申請WO 92/11018中提出，所述方法提供了具有增強的親和力的抗體。
可以產(chǎn)生包含一級抗體結(jié)構(gòu)的僅一部分的多肽片段，所述片段具有一種或多種免疫球蛋白活性。這些多肽片段可以按照如下所述來產(chǎn)生通過本領(lǐng)域公知的方法進行對完整抗體的蛋白酶剪切，或者使用定點誘變在含有抗體基因的表達載體中所希望的位置插入終止密碼子以產(chǎn)生Fab片段或者(Fab’)2片段?？梢酝ㄟ^將VL和VH區(qū)用DNA接頭(linker)連接來產(chǎn)生單鏈抗體(見Huston等人，Proc.Natl.Acad.SciU.SA.，855879-5883(1988)和Bird等人，Science，242423-426(1988))。
本發(fā)明的抗體選擇性針對紫杉醇，而與紫杉醇的代謝物(如上文提到的代謝物)沒有實質(zhì)的交叉反應(yīng)活性。沒有實質(zhì)的交叉反應(yīng)活性是指本發(fā)明的抗體相對于紫杉醇而言與這些代謝物的交叉反應(yīng)活性小于10％。本發(fā)明的抗體可以與其它紫杉醇類似化合物如多西他賽(docetaxel)反應(yīng)。
免疫測定法根據(jù)本發(fā)明，從式II-A和II-B的這些化合物或者其混合物的免疫原產(chǎn)生的綴合物和抗體可以用作為測定患者樣品中紫杉醇的試劑。通過免疫測定法進行該測定。下述任何免疫測定法可用于確定患者樣品中紫杉醇的存在，所述測定法中，從式II-A和II-B的的化合物形成的試劑綴合物與樣品中的紫杉醇針對根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的抗體上的結(jié)合位點發(fā)生競爭。對懷疑含有紫杉醇的樣品進行針對紫杉醇的測定的方式包括組合下述物質(zhì)(a)水性介質(zhì)樣品，(b)根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的針對紫杉醇的抗體和(c)從式II-A和II-B的化合物或者其混合物形成的綴合物?？梢酝ㄟ^測量對加入到樣品和抗體混合物中的已知量綴合物與特異抗體的結(jié)合的抑制，來測定樣品中紫杉醇的量。未知樣品對已知量綴合物的這種結(jié)合的抑制的結(jié)果與利用紫杉醇的已知標準溶液在相同測定中得到的結(jié)果進行比較。在測定未知樣品中紫杉醇的量的過程中，樣品、從式II-A和II-B的化合物形成的綴合物和抗體可以以任何順序加入。
多種方法可以用于測量與抗體結(jié)合的從式II-A和II-B的化合物形成的綴合物的量。一種方法是其中綴合物與抗體的結(jié)合導致熒光綴合物旋光度的降低。液體混合物中熒光團綴合物旋光度降低的量可以通過熒光偏振技術(shù)(如美國專利4,269,511和美國專利4,420,568中公開的)來檢測。
另一方面，抗體可以被包被或者吸收到納米微粒上從而當這些微粒與從式II-A和II-B的化合物形成的紫杉醇綴合物反應(yīng)時，這些納米微粒形成聚集體(aggregate)。然而，當包被或者吸收有抗體的納米微粒與樣品中的紫杉醇反應(yīng)時，結(jié)合這些納米微粒的來自樣品的紫杉醇不會導致抗體納米微粒的聚集?？梢酝ㄟ^吸光度測量來測定混合物中聚集或者凝集(agglutination)的量。
另一方面，通過將抗體或者紫杉醇綴合物附著到固體支持物如微滴定板或者任何其它傳統(tǒng)固體支持物(包括固體顆粒)，可以進行這些測定法。將抗體和蛋白質(zhì)附著到此類固體顆粒是本領(lǐng)域公知的。任何傳統(tǒng)方法可以用于進行此類附著。在許多情況中，為了幫助測量，可以在抗體、綴合物和固體顆粒上放置標記，如放射性標記和酶標記，以幫助檢測從式II-A和II-B的化合物形成的、與抗體結(jié)合或未結(jié)合的綴合物的量。其它合適的標記包括生色團、熒光團等等。
為方便起見，本發(fā)明的測定組分可以在試劑盒中提供，試劑盒是經(jīng)包裝的組合，含有用于測定紫杉醇的預(yù)定量的新試劑。這些試劑包括本發(fā)明的抗體，以及從式II-A和II-B的化合物或者其混合物形成的綴合物。如果利用了從式II-A的化合物形成的綴合物，那么在給定的免疫測定中通常優(yōu)選通過從式II-A的化合物形成的免疫原產(chǎn)生抗體。類似地，如果利用了從式II-B的化合物形成的綴合物，那么抗體是通過從式II-B的化合物形成的免疫原產(chǎn)生的。然而，并不必須是這樣的情況，在給定測定法中，抗體和綴合物可以來自這些綴合物和免疫原的任一種或者兩種。
除這些必要的試劑之外，還可以包括添加劑，如輔助試劑，如穩(wěn)定劑、緩沖劑等等。多種試劑的相對量可以非常寬廣地變化，以提供能實質(zhì)性優(yōu)化測定法靈敏度的試劑溶液中濃度。試劑可以提供于溶液中或者作為干燥粉劑提供，通常為凍干的，包括賦形劑，溶解時其將提供具有用于進行測定的合適濃度的試劑溶液。
實施例在實施例中，Ph代表苯基。在實施例中，下面的縮寫用于表示下面的含義THF四氫呋喃EA 乙醇EtOAc 乙酸乙酯DCM二氯甲烷DMAP 二甲基氨基吡啶NHSN-羥基琥珀酰亞胺EDC1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽TLC薄層色譜ANS8-苯胺基-1-萘磺酸i.p. 腹膜內(nèi)HRP辣根過氧化物酶TMB3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺TRIS 三(羥基甲基)氨基甲烷鹽酸鹽BSA牛血清白蛋白BTG牛甲狀腺球蛋白PBS磷酸緩沖鹽水di 去離子水在實施例中，下面的方案1和方案2給出了所制備的具體化合物，這些化合物在實施例中通過編號指出。這方案如下
方案1
方案2 實施例1紫杉醇衍生物[5]的制備(方案1)在持續(xù)氬氣流下，將紫杉醇1(1.685g)置于三頸燒瓶中26mL新鮮蒸餾的二氯甲烷中。在該加入期間，溫度保持于-15℃，還加入二異丙胺(1當量)和氯代甲酸烯丙酯(1.1當量)。將反應(yīng)混合物溫度恢復(fù)到室溫并攪拌4小時。該時間后，加入40mL二氯甲烷并用0.1N HCl(60mL)洗滌反應(yīng)混合物，用Na2SO4干燥并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮得到產(chǎn)物2，其中紫杉醇上的2’羥基受到保護。將該產(chǎn)物在干燥器上放置2天，然后不進行進一步純化直接用于下一步和實施例2。
然后將產(chǎn)物2溶于氬氣下40mL THF中，溫度保持于-15℃。然后向該溶液首先加入NaH(2當量)，10分鐘后加入5-溴代戊酸(溶解在3mLTHF中的1.1當量，并緩慢加入)以產(chǎn)生產(chǎn)物3作為反應(yīng)混合物中的產(chǎn)物。TLC證實產(chǎn)物3后，向該反應(yīng)混合物逐滴加入4.4mL2NHCl。將含有產(chǎn)物3的反應(yīng)混合物用水洗滌，在Na2SO4上干燥，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮然后純化。將產(chǎn)物3在硅膠柱上純化，用15％EtOAc:DCM到20％EtOAc:DCM洗脫，得到1.1611g純產(chǎn)物3。
將純化的產(chǎn)物在氬氣下溶于40mL二氯甲烷中，然后向該溶液加入PhSiH3(6.25當量)與Pd(PPh3)4(0.05當量)。讓所得反應(yīng)混合物靜置1小時。該時間后，向反應(yīng)混合物加入12mL MeOH并將所得反應(yīng)混合物攪拌10分鐘。蒸發(fā)該反應(yīng)混合物至干，以產(chǎn)生具有去保護的2’羥基的產(chǎn)物4。
使用30％EtOAc:DCM作為溶劑系統(tǒng)，在硅膠柱上從反應(yīng)混合物純化的產(chǎn)物4，并分離為乳白色粉末(817mg，從原料計算產(chǎn)率按重量計為43.4％)。將純化的產(chǎn)物4(355mg，0.37mmol)溶解在15mL二氯甲烷中。然后在氬氣下加入N-羥基琥珀酰亞胺(2當量)和EDC(2當量)并過夜攪拌所得反應(yīng)混合物。用0.1N HCl洗滌含有產(chǎn)物5的反應(yīng)混合物，然后盡可能快地用H2O洗滌。將含有產(chǎn)物5的反應(yīng)混合物在Na2SO4上干燥，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上高真空下濃縮得到401mg(99.9％純度)產(chǎn)物5。
實施例2紫杉醇衍生物[8]的制備(方案2)向烯丙醇(14mL，過量)中6-氨基己酸(3g，22.87mmol)的懸浮液中緩慢加入亞硫酰氯。室溫下過夜攪拌反應(yīng)混合物產(chǎn)生4-氨基己酸烯丙基酯6。除去過量烯丙醇后，在高真空下干燥產(chǎn)物4-氨基己酸烯丙基酯(3.9g，白色結(jié)晶固體)。
在氮氣下向?qū)嵤├?中產(chǎn)生的、烯丙基受保護的紫杉醇產(chǎn)物2(400mg，0.43mmol)和DMAP(191.5mg，1.57mmol)在DCM(10mL)的溶液中加入三乙胺(1.57mmol)，然后加入氯甲酸對-硝基苯酯(103mg，0.51mmol)。然后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物5.5小時，加入按照上文所述制備的作為白色結(jié)晶固體的胺6(1.1當量)溶于DCM(2mL)的溶液，以形成產(chǎn)物7。讓所得混合物在室溫下過夜攪拌。在真空下從該所得反應(yīng)混合物中除去DCM，并用15％EtOAc/DCM作為溶劑系統(tǒng)在硅膠柱上純化粗產(chǎn)物7，得到純化的產(chǎn)物7(320mg，66.1％)，其為乳白色固體。將按照上文所述制備的純化的產(chǎn)物7在氬氣下溶解在30mL二氯甲烷中，然后加入PhSiH3(6.25當量)與Pd(PPh3)4(0.05當量)。1.5小時后，加入12mL MeOH并額外攪拌10分鐘。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，得到衍生的7-羥基紫杉醇產(chǎn)物8。在硅膠柱(10％MeOH:EtOAc作為溶劑系統(tǒng))上純化該產(chǎn)物8，并將其分離為乳白色膠(236mg，82.8％)，從原料計算產(chǎn)率為54-73％。
實施例3紫杉醇免疫原的制備向溶于50mM磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.5)中的6.8mL BTG(36.4mg/mL)中逐滴加入二甲亞砜(DMSO)(13.8mL)以形成溶液。向16.6mL該溶液中逐滴加入實施例1中制備的純化的活化N-羥基琥珀酰亞胺酯紫杉醇衍生物5(1.26mL，DMSO溶液中50mg/mL)。讓所得混合物在室溫下過夜攪拌以將BTG綴合到純化的紫杉醇衍生物5。然后通過透析純化該免疫原性綴合物，并根據(jù)以前描述的方法對其進行分析(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)。
實施例4紫杉醇抗體的制備用在完全弗氏佐劑中乳化的紫杉醇-BTG(實施例3中制備)以100μg/小鼠的劑量對雌性BALB/c小鼠進行腹膜內(nèi)免疫。最初注射后4周，用在不完全弗氏佐劑中乳化的紫杉醇-BTG以100μg/小鼠的劑量對小鼠進行強化。強化后10天，通過眼窩放血從每只小鼠得到測試血。從這些測試血得到的抗血清含有在實施例7、8a和9中評估的紫杉醇抗體。對于單克隆抗體，從融合前四天開始，在連續(xù)三天內(nèi)用溶于PBS的100μg紫杉醇-BTG對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。從所選的小鼠分離脾細胞并根據(jù)Coligan，J.E.等人編著的Current Protocols in Immunology，2.5.1-2.5.8，(1992)，Wiley & Sons，NY的方法用50％聚乙二醇1500將脾細胞與2×107個骨髓瘤細胞SP2/0融合。將融合的細胞涂布到10塊96孔板上的DMEM/F12中，其中補充有20％FetalClone I、2％L-谷氨酰胺(100mM)和2％50X HAT。2周后，通過ELISA(實施例8b)測定雜交瘤上清液中抗-紫杉醇-BTG抗體的存在。將孔中得到陽性ELISA結(jié)果(實施例8)的細胞擴大到24孔板。ELISA根據(jù)Coligan，J.E.等人，eds.，Current Protocols in Immunology，2.5.8-2.5.17，(1992)，Wiley&Sons，NY中公開的方法，通過有限稀釋對陽性克隆進行一次或兩次亞克隆。通過競爭性ELISA(實施例8a和9)，針對紫杉醇的結(jié)合對含有來自所選亞克隆的單克隆抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清液加以驗證。按實施例9中所述，通過間接競爭性微滴定板測定法，針對與紫杉醇的結(jié)合和與紫杉醇代謝物的交叉反應(yīng)性，對這些單克隆抗體加以測試。
實施例5用衍生物5制備紫杉醇-BSA綴合物向20mL磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.5)中的BSA(50mg/mL)溶液逐滴加入20mL二甲亞砜(DMSO)。向18mL該溶液中滴加按照實施例1制備的活化的N-羥基琥珀酰亞胺酯紫杉醇衍生物5(0.316mL，DMSO溶液中50mg/mL)。將該混合物在室溫下過夜攪拌，產(chǎn)生活化酯5和BSA的綴合物。然后通過透析純化該綴合物并根據(jù)以前描述的方法對其進行分析(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp821-826，1998)。
實施例6用衍生物8制備紫杉醇-BSA綴合物向二氯甲烷(3mL)中的25mg實施例2中制備的紫杉醇衍生物8中加入EDC(28mg)和NHS(16.8mg)。將該溶液在氮氣室溫下攪拌24小時。向該混合物中加入7ml額外的二氯甲烷，然后加入2mL鹽酸(0.3N)。攪拌反應(yīng)混合物15分鐘并將有機層分離、干燥和蒸發(fā)得到不定形白色殘渣，其是紫杉醇衍生物8的NHS活化酯。將殘渣溶解在2mLDMSO中，并將1.25mL該溶液滴加到40mL BSA溶液(25mg/mL，20mL DMSO/20mL 50 mM磷酸鹽，pH7.5)中。室溫下攪拌溶液60小時，產(chǎn)生BSA和紫杉醇衍生物8的綴合物。根據(jù)以前描述的方法(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)通過透析純化該綴合物。
實施例7a用紫杉醇衍生物5進行微滴定板敏化步驟在針對蛋白質(zhì)結(jié)合進行過優(yōu)化、且每板含有96孔的聚苯乙烯微滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8 Immunomodules)中進行ELISA方法，以測定紫杉醇濃度。按下文所述用紫杉醇-BSA綴合物(實施例5中制備的)包被每孔加入300μL以10μg/ml溶于0.05M碳酸氫鈉(pH9.6)的紫杉醇-BSA綴合物，并在室溫下溫育3小時。用0.05M碳酸氫鈉(pH9.6)洗滌孔，然后用400μL5％蔗糖、0.2％酪蛋白酸鈉溶液在室溫下封閉30分鐘。除去包被后溶液后，在37℃過夜干燥滴定板。
實施例7b用紫杉醇衍生物8進行微滴定板敏化步驟在針對蛋白質(zhì)結(jié)合進行過優(yōu)化、且每板含有96孔的聚苯乙烯微滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8 Immunomodules)中進行ELISA方法，以測定紫杉醇濃度。按下文所述用紫杉醇-BSA綴合物(如實施例6中制備的)包被每孔加入300μL以10μg/ml溶于0.05M碳酸氫鈉(pH9.6)的紫杉醇-BSA綴合物，并在室溫下溫育3小時。用0.05M碳酸氫鈉(pH9.6)洗滌孔，然后用400μL5％蔗糖、0.2％酪蛋白酸鈉溶液在室溫下封閉30分鐘。除去包被后溶液后，在37℃過夜干燥滴定板。
實施例8a抗體篩選步驟-效價用實施例7所述的經(jīng)過紫杉醇-BSA敏化的微滴定板，進行用于篩選紫杉醇抗體(實施例4中產(chǎn)生的)的ELISA方法。通過用含有0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸緩沖鹽水將含有紫杉醇抗體的抗血清(實施例4的)稀釋到1∶100、1∶10000和1∶100,000，來進行抗體篩選測定法。為了評估單克隆抗體，用含有0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸緩沖鹽水將實施例4的雜交瘤上清液(通過8b步驟發(fā)現(xiàn)其在抗體存在的方面是陽性的)稀釋1∶2、1∶4、1∶8、1∶1 6，等等。向經(jīng)紫杉醇-BSA敏化的孔的每孔(實施例7中制備的)中加入100μL稀釋的抗體并在搖動下在室溫下溫育10分鐘。在該溫育期間，抗體結(jié)合孔中的紫杉醇-綴合物。以0.02M TRIS，0.9％NaCl，0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞(pH7.8)對滴定板上的孔洗滌三次，以除去任何未結(jié)合的抗體。為了檢測孔中結(jié)合到紫杉醇-BSA綴合物的紫杉醇抗體的量，向每孔加入100μL用含有0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS)稀釋到預(yù)定比活(約1/2000)的山羊抗-小鼠抗體-HRP酶綴合物(Jackson Immunoresearch)，所述綴合物能夠與鼠免疫球蛋白特異結(jié)合，并且當與底物溫育時產(chǎn)生有色產(chǎn)物。室溫搖動下溫育10分鐘后(在該期間二級-HPR綴合物結(jié)合孔中的紫杉醇抗體)，將滴定板再洗三次以除去未結(jié)合的二級綴合物。為了在孔中顯現(xiàn)可測量的顏色，洗滌后加入100μL TMB(TMB LiquidSubstrate，Sigma)(其是HPR的底物)以在搖動下室溫溫育10分鐘內(nèi)顯色。該用于顏色顯現(xiàn)的溫育后，向每孔加入50μL終止溶液(diH2O中的1.5％氟化鈉)以停止顏色顯現(xiàn)，并且搖動10秒后，在650nm測量吸光度(Molecular Devices Plate Reader)?？字锌贵w的量與所測得的吸光度成比例，其被表示為導致1.5的吸光度的稀釋度(效價)。通過將所測量的抗體的抗體稀釋度對數(shù)(x-軸)對650nm的吸光度(y軸)作圖，并外推在1.5吸光度時的效價來確定效價。該效價確定了用于實施例9所述間接競爭性微滴定板測定法中抗體的濃度(稀釋度)。
實施例8b抗體篩選步驟-單克隆篩選將經(jīng)實施例6所述的紫杉醇-BSA敏化的微滴定板進行用于篩選紫杉醇單克隆抗體(實施例4中產(chǎn)生的)的ELISA方法。向經(jīng)紫杉醇-BSA敏化的孔(實施例7b中制備的)的每孔中，加入含有0.1％BSA和0.01％硫柳汞的50μL磷酸緩沖鹽水，然后加入50μL單克隆培養(yǎng)上清液并在室溫搖動下溫育10分鐘。在該溫育期間，抗體結(jié)合孔中的紫杉醇綴合物。用0.02M TRIS，0.9％NaCl，0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞(pH7.8)對滴定板的孔進行三次洗滌，以除去任何未結(jié)合的抗體。為了檢測結(jié)合孔中的紫杉醇-BSA綴合物的紫杉醇抗體的量，向每孔加入100μL用含有0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS稀釋到預(yù)定比活(約1/2000)的山羊抗-小鼠抗體-HRP酶綴合物(JacksonImmunoresearch)，所述綴合物能夠與鼠免疫球蛋白特異結(jié)合，并且當與底物溫育時產(chǎn)生有色產(chǎn)物。室溫搖動下溫育10分鐘后(在該期間山羊抗小鼠抗體-HPR酶綴合物結(jié)合孔中的紫杉醇抗體)，對滴定板再洗滌三次，以除去未結(jié)合的山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物。為了在孔中顯現(xiàn)可測量的顏色，洗滌后加入100μL TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma)(其是HPR的底物)以在搖動下室溫溫育10分鐘內(nèi)顯色。該用于顏色顯現(xiàn)的溫育后，向每孔加入50μL終止溶液(diH2O中的1.5％氟化鈉)以停止顏色顯現(xiàn)，搖動10秒后，在650nm測量吸光度(MolecularDevices Plate Reader)?？字锌贵w的量與所測得的吸光度成比例。吸光度高于兩倍背景的樣品被指定為陽性的。
實施例9a間接競爭性微滴定板免疫測定步驟測定IC50和交叉反應(yīng)活性用實施例7a描述的經(jīng)紫杉醇-BSA敏化的微滴定板進行用于測量紫杉醇濃度的ELISA方法。用PBS或者用含有0.1％BSA和0.01％硫柳汞的PBS將紫杉醇、漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇、6-α-羥基紫杉醇和多西紫杉醇在0.01到10,000ng/mL的濃度范圍上稀釋10倍。通過將50μL待測量的分析物與稀釋到實施例8a中確定的效價的50μL抗體(實施例4中產(chǎn)生的)一起溫育來開展測定。在10分鐘溫育(室溫，搖動下)期間，孔中的紫杉醇綴合物和溶液中的分析物競爭抗體結(jié)合。該溫育后，用0.02M TRIS，0.9％NaCl，0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8對滴定板中的孔洗滌三次，以除去未結(jié)合的物質(zhì)。為了檢測與孔中紫杉醇-BSA綴合物結(jié)合的紫杉醇抗體的量，向每孔加入用含有0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS稀釋到預(yù)定比活(約1/2000)的100μL二級綴合物(其是山羊抗-小鼠抗球蛋白抗體-HRP酶綴合物(Jackson Immunoresearch))，所述綴合物能夠與鼠免疫球蛋白特異結(jié)合，并且當與底物溫育時產(chǎn)生有色產(chǎn)物。室溫搖動下溫育10分鐘后(在該期間二級HPR綴合物結(jié)合孔中的紫杉醇抗體)，將滴定板再次洗滌三次以除去未結(jié)合的二級綴合物。在室溫搖動下溫育10分鐘后(在該期間二級-HRP綴合物結(jié)合孔中的紫杉醇抗體)，對滴定板再洗滌三次以除去未結(jié)合的二級綴合物。
為了在孔中顯現(xiàn)可測量的顏色，洗滌后加入100μL TMB(TMBLiquid Substrate，Sigma)(其是HPR的底物)以在搖動下室溫溫育10分鐘內(nèi)顯色。該用于顏色顯現(xiàn)的溫育后，向每孔加入50μL終止溶液(diH2O中的1.5％氟化鈉)以停止顏色顯現(xiàn)，搖動10秒后，在650nm測量吸光度(Molecular Devices Plate Reader)?？字锌贵w的量與所測得的吸光度成比例，并且與樣品中紫杉醇的量成反比。將含分析物的孔中顏色的吸光度與沒有分析物的吸光度比較，產(chǎn)生標準曲線。給定分析物的IC50值被定義為抑制不含分析物的孔的50％的吸光度所需的分析物的濃度。將給定分析物的交叉反應(yīng)性計算為紫杉醇的IC50與漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇、6-α-羥基紫杉醇和多烯紫杉醇的IC50的比率，其以百分比表示。為了評估漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇、6-α-羥基紫杉醇和多烯紫杉醇與實施例4中產(chǎn)生的紫杉醇多克隆抗體的交叉反應(yīng)活性，從眼眶取血制備抗血清庫。該庫組合了四只小鼠的抗體，這些小鼠對于紫杉醇各自具有＜20ng/mL的IC50值。當用該抗體庫進行測量時，漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇和6-α-羥基紫杉醇相對于紫杉醇的交叉反應(yīng)活性小于10％。與6-α-羥基紫杉醇的交叉反應(yīng)活性小于60％。結(jié)果在表I給出。為了評估漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇、6-α-羥基紫杉醇和多烯紫杉醇與實施例4中產(chǎn)生的紫杉醇單克隆抗體的交叉反應(yīng)活性，使用來自所選的經(jīng)亞克隆的單克隆的雜交瘤培養(yǎng)物上清液。當用這些單克隆抗體中的兩種進行測量時，漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇和6-α-羥基紫杉醇相對于紫杉醇的百分比交叉反應(yīng)活性小于6％。結(jié)果在表II中給出。
實施例9b間接競爭性微滴定板免疫測定步驟測定IC50和交叉反應(yīng)性用實施例7b中描述的經(jīng)紫杉醇-BSA敏化的微滴定板進行用于測量紫杉醇濃度的ELISA方法。用PBS或含有0.1％BSA和0.01％硫柳汞的PBS將紫杉醇、漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇、6-α-羥基紫杉醇和多西紫杉醇在0.01到10,000ng/mL的濃度范圍上稀釋10倍。通過將50μL待測量的分析物與稀釋到實施例8a中確定的效價的50μL抗體(實施例4中產(chǎn)生的)一起溫育來進行測定。在10分鐘溫育(室溫，搖動下)期間，孔中的紫杉醇綴合物和溶液中的分析物競爭抗體結(jié)合。該溫育后，用0.02M TRIS，0.9％NaCl，0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8對滴定板的孔洗滌三次，以除去未結(jié)合的物質(zhì)。為了檢測與孔中的紫杉醇-BSA綴合物結(jié)合的紫杉醇抗體的量，向每孔加入用含有0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS稀釋到預(yù)定比活(約1/2000)的100μL二級抗體(其是山羊抗小鼠抗球蛋白抗體-HRP酶綴合物(Jackson Immunoresearch))。該二級抗體能夠與鼠免疫球蛋白特異結(jié)合，并且當與底物溫育時產(chǎn)生有色產(chǎn)物。室溫搖動下溫育10分鐘后(在該期間二級HPR綴合物結(jié)合孔中的紫杉醇抗體)，對滴定板再洗滌三次，以除去未結(jié)合的二級綴合物。
為了在孔中顯現(xiàn)可測量的顏色，洗滌后加入100μL TMB(TMBLiquid Substrate，Sigma)(其是HPR的底物)，以在搖動下室溫溫育10分鐘內(nèi)顯色。該用于顏色顯現(xiàn)的溫育后，向每孔加入50μL終止溶液(diH2O中的1.5％氟化鈉)，以停止顏色顯現(xiàn)，搖動10秒后，在650nm測量吸光度(Molecular Devices Plate Reader)?？字锌贵w的量與所測得的吸光度成比例，并且與樣品中紫杉醇的量成反比。將含分析物的孔中顏色的吸光度與沒有分析物的吸光度比較，產(chǎn)生標準曲線。給定分析物的IC50值被定義為抑制不含有分析物的孔的50％的吸光度所需的分析物的濃度。將給定分析物的交叉反應(yīng)性計算為紫杉醇的IC50與漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇、6-α-羥基紫杉醇和多烯紫杉醇的IC50的比率，其以百分比表示。為了評估漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇、6-α-羥基紫杉醇和多烯紫杉醇與實施例4中產(chǎn)生的紫杉醇抗體的交叉反應(yīng)活性，使用實施例9a的庫。當用該庫的抗體進行測量時，漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇、6-α-羥基紫杉醇和多烯紫杉醇(多西他賽)相對于紫杉醇的百分比交叉反應(yīng)活性小于2％.結(jié)果在表1中給出。當用所選的單克隆抗體進行測量(如實施例9a)時，漿果赤霉素III、3’-對-羥基紫杉醇和6-α-羥基紫杉醇相對于紫杉醇的百分比交叉反應(yīng)活性小于9％。結(jié)果在表II中給出。
表I使用針對紫杉醇的多克隆抗體進行的競爭性免疫測定的交叉反應(yīng)活性(實施例4)
表II使用針對紫杉醇的單克隆抗體進行的競爭性免疫測定的交叉反應(yīng)性(實施例4)
從上表可以看到出，本發(fā)明的抗體不與紫杉醇的主要代謝物反應(yīng)，但是與紫杉醇和類似紫杉醇的藥物反應(yīng)。當對被施用紫杉醇的患者不同時施用多西他賽時，這些抗體可以用于下述免疫測定，所述免疫測定可以特異性地檢測和監(jiān)測用紫杉醇治療的患者的液體樣品中的紫杉醇。
權(quán)利要求
1.用于檢測樣品中紫杉醇的免疫測定法，所述測定法包括提供樣品的混合物，含有與紫杉醇選擇性反應(yīng)并且不與6-α-羥基紫杉醇和3’-對-羥基紫杉醇實質(zhì)性交叉反應(yīng)的抗體以及載體與下式化合物 其中A是 或＝N-O-；Y是有機間隔基團；X是能夠與多胺聚合物結(jié)合的末端官能團；p是從0到1的整數(shù)；Ph是苯基；或者下式化合物 其中X、Y和p如上所述并且B是-CH2-或者 或者它們的混合物的綴合物，導致樣品中的紫杉醇和所述綴合物與所述抗體結(jié)合，之后測量所述混合物中結(jié)合或未結(jié)合所述抗體的所述綴合物的量，從而可以確定樣品中紫杉醇的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中樣品是人樣品。
3.權(quán)利要求2的免疫測定法，其中從下述免疫原產(chǎn)生所述抗體，所述免疫原包含連接到下式化合物 其中X、Y和A如上面定義；或者下式化合物 其中p、Y、X和B如上面定義；或者其混合物的免疫原性聚合物。
4.權(quán)利要求2的免疫測定法，其中所述抗體附著到固體支持物。
5.權(quán)利要求4的免疫測定法，其中所述固體支持物是微滴定板。
6.權(quán)利要求4的免疫測定法，其中所述固體支持物是納米微粒。
7.抗體，其選擇性結(jié)合紫杉醇并且不與6-α-羥基紫杉醇和3’-對-羥基紫杉醇實質(zhì)性結(jié)合。
8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述抗體來自小鼠、兔或者大鼠。
9.權(quán)利要求7的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
10.權(quán)利要求8的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
11.權(quán)利要求11的抗體，其中所述抗體從下述免疫原產(chǎn)生，所述免疫原為多胺聚合物與選自由下式化合物 其中A是 或＝N-O-；Y是有機間隔基團；X是能夠與多胺聚合物結(jié)合的末端官能團；p是從0到1的整數(shù)；Ph是苯基；或者下式化合物 其中X、Y和p如上所述并且B是-CH2-或者 或者它們的混合物組成的組的化合物的綴合物。
12.權(quán)利要求11的抗體，其中所述抗體來自小鼠、兔或大鼠。
13.權(quán)利要求11的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
14.權(quán)利要求12的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
15.下式化合物 其中A是 或＝N-O-；Y是有機間隔基團；X是能夠與多胺多肽結(jié)合的末端官能團；p是從0到1的整數(shù)。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中p是0。
17.權(quán)利要求16的化合物，其中X是 -N＝C＝R4，或 其中R3是氫或者與它連接的氧原子一起形成具有反應(yīng)活性的酯，R4是氧或者硫。
18.權(quán)利要求17的化合物，其中X是 并且R3是氫。
19.權(quán)利要求17的化合物，其中X是 并且R3形成具有反應(yīng)活性的酯。
20.權(quán)利要求19的化合物，其中所形成的酯是低級烷基酯、亞氨基酯或者氨基酯(amidoester)。
21.權(quán)利要求15的化合物，其中p是1。
22.權(quán)利要求21的化合物，其中Y是含有1到10個碳原子的亞烷基、 或 或者 其中n和o是從0到6的整數(shù)，m是1到6的整數(shù)。
23.下式化合物 其中Y是有機間隔基團；X是能夠與多胺多肽結(jié)合的末端官能團；B是-CH2-或者 或者其混合物。
24.權(quán)利要求23的化合物，其中p是0。
25.權(quán)利要求24的化合物，其中X是 -N＝C＝R4，或 其中R3是氫或者與它連接的氧原子一起形成具有反應(yīng)活性的酯，R4是氧或者硫。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中X是 并且R3是氫。
27.權(quán)利要求26的化合物，其中X是 并且R3形成具有反應(yīng)活性的酯。
28.權(quán)利要求27的化合物，其中所形成的酯是低級烷基酯、亞氨基酯或者氨基酯。
29.權(quán)利要求23的化合物，其中p是1。
30.權(quán)利要求29的化合物，其中X是 -N＝C＝R4，或 其中R3是氫或者與它連接的氧原子一起形成具有反應(yīng)活性的酯，R4是氧或者硫。
31.權(quán)利要求30的化合物，其中Y是含有1到10個碳原子的亞烷基、 或 或者 其中n和o是從0到6的整數(shù)，m是1到6的整數(shù)。
32.載體與下式化合物 其中A是 或＝N-O-；Y是有機間隔基團；X是能夠與多胺多肽結(jié)合的末端官能團；p是從0到1的整數(shù)；的綴合物。
33.權(quán)利要求32的綴合物，其中p是0。
34.權(quán)利要求33的綴合物，其中X是 -N＝C＝R4，或 其中R3是氫或者與它連接的氧原子一起形成具有反應(yīng)活性的酯，R4是氧或者硫。
35.權(quán)利要求32的綴合物，其中p是1并且Y是含有1到10個碳原子的亞烷基、 或 或者 其中n和o是從0到6的整數(shù)，m是1到6的整數(shù)。
36.權(quán)利要求35的綴合物，其中所述載體含有通過 或 連接的一個或多個氨基基團，其中R4是氧或者硫。
37.下式化合物 其中X、Y和p如上所述并且B是-CH2-或者 或者它們的混合物。
38.權(quán)利要求37的化合物，其中p是0。
39.權(quán)利要求38的化合物，其中X是 -N＝C＝R4，或 其中R3是氫或者與它連接的氧原子一起形成具有反應(yīng)活性的酯，R4是氧或者硫。
40.權(quán)利要求37的化合物，其中p是1。
41.權(quán)利要求40的化合物，其中Y是含有1到10個碳原子的亞烷基、 或 或者 其中n和o是從0到6的整數(shù)，m是1到6的整數(shù)。
42.權(quán)利要求41的化合物，其中X是 -N＝C＝R4，或 其中R3是氫或者與它連接的氧原子一起形成具有反應(yīng)活性的酯，R4是氧或者硫。
43.免疫原，其包含連接到下式化合物 其中A是 或＝N-O-；Y是有機間隔基團；X是能夠與多胺多肽結(jié)合的末端官能團；p是從0到1的整數(shù)；的免疫原性多胺聚合物。
44.權(quán)利要求43的化合物，其中p是0。
45.權(quán)利要求43的化合物，其中p是1。
46.權(quán)利要求45的化合物，其中Y是含有1到10個碳原子的亞烷基、 或 或者 其中n和o是從0到6的整數(shù)，m是1到6的整數(shù)。
47.權(quán)利要求46的化合物，其中所述免疫原性聚合物含有通過 或 連接的一個或多個氨基基團，其中R4是氧或者硫。
48.免疫原，其包含連接到下式化合物 其中A是 或＝N-O-；Y是有機間隔基團；X是能夠與多胺多肽結(jié)合的末端官能團；p是從0到1的整數(shù)；的免疫原性多胺聚合物。
49.權(quán)利要求48的化合物，其中p是0。
50.權(quán)利要求49的化合物，其中所述免疫原性聚合物含有通過 或 連接的一個或多個氨基基團，其中R4是氧或者硫。
51.權(quán)利要求48的化合物，其中p是1。
52.權(quán)利要求51的化合物，其中Y是含有1到10個碳原子的亞烷基、 或 或者 其中n和o是從0到6的整數(shù)，m是1到6的整數(shù)。
53.權(quán)利要求52的化合物，其中所述免疫原性聚合物含有通過 或 連接的一個或多個氨基基團，其中R4是氧或者硫。
54.試劑盒，其用于測定患者樣品中紫杉醇的存在，該試劑盒包含分開的容器中的試劑，一種試劑是載體與選自由下式化合物 其中A是 或＝N-O-；Y是有機間隔基團；X是能夠與多胺聚合物結(jié)合的末端官能團；p是從0到1的整數(shù)；Ph是苯基；或者下式化合物 其中X、Y和p如上所述并且B是-CH2-或者 或者它們的混合物組成的組的化合物的綴合物；第二個容器含有與紫杉醇高度選擇性反應(yīng)并且不與6-α-羥基紫杉醇和3’-對-羥基紫杉醇實質(zhì)性交叉反應(yīng)的抗體。
55.權(quán)利要求54的試劑盒，其中所述綴合物以預(yù)定量存在于所述第一個容器中。
56.權(quán)利要求55的試劑盒，所述試劑盒用于測定所述樣品中紫杉醇的量。
57.權(quán)利要求54的試劑盒，其中所述抗體從免疫原產(chǎn)生，該免疫原是連接到選自由下式化合物 其中A、Y、X和p如上述；或下式化合物 其中p、Y、X和B如上述；或者其混合物組成的組的化合物的免疫原性多胺多肽。
全文摘要
紫杉醇的新的綴合物和衍生自紫杉醇的9和7位的新的免疫原和通過這些連接紫杉醇的免疫原產(chǎn)生的單克隆抗體可用于免疫測定法，以對生物流體中的紫杉醇進行定量和監(jiān)測。
文檔編號G01N33/531GK101019024SQ200580025440
公開日2007年8月15日 申請日期2005年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月29日
發(fā)明者S·薩拉蒙, J·B·庫爾特尼, D·斯托克 申請人:薩拉達克斯生物醫(yī)療公司