專利名稱：采用水凝膠的微陣列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及制造微陣列的方法和所得產(chǎn)品，更具體涉及通過(guò)用可聚合的水凝膠層基本均勻地涂布合適基材區(qū)域而在該基材或芯片上制造微陣列的方法。
背景技術(shù)：
微陣列被用于生物測(cè)定以檢測(cè)生物樣品中靶材料的存在情況和/或含量；它們構(gòu)成了一個(gè)正在成長(zhǎng)的有時(shí)稱為表面試驗(yàn)的領(lǐng)域，其中的靶材料或代表性靶材料分子被捕獲在固體支持物上然后檢測(cè)。由于這種DNA微陣列能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)大量基因，因此現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛接受用于研究基因表達(dá)和其它基因型功能。例如，大量不同探針序列可結(jié)合于微陣列表面的不連續(xù)空間位置或微斑點(diǎn)(microspot)，每個(gè)這種微斑點(diǎn)可各含有不同的探針。當(dāng)這種微陣列與含有標(biāo)記的樣品材料的溶液雜交時(shí)，若存在靶物質(zhì)，它就會(huì)與陣列各種不同微斑點(diǎn)上的互補(bǔ)DNA鏈雜交。洗滌除去未結(jié)合的材料之后，可利用特征標(biāo)記物，例如熒光，然后被用來(lái)確定各微斑點(diǎn)上標(biāo)記材料的強(qiáng)度；這種成像能夠?yàn)闃悠分写嬖诘奶囟ò形镔|(zhì)含量提供量度。
已經(jīng)制造了可提供其它分子的這種陣列，如用來(lái)結(jié)合靶材料的蛋白質(zhì)，包括抗體、半抗原或適體。這些基于表面的試驗(yàn)也可用于ELISA?？傊?，這種微量試驗(yàn)芯片已經(jīng)代替凝膠電泳成為生物試驗(yàn)的備選方法，據(jù)信，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，這種傾向很可能繼續(xù)下去。
為使微量試驗(yàn)芯片可有效用于這種生物試驗(yàn)，它應(yīng)該能夠固定要從有關(guān)樣品分離的令人滿意量的分析物或靶材料；這樣在隨后閱讀芯片時(shí)才能提供滿意數(shù)量級(jí)的信號(hào)。當(dāng)然，芯片還應(yīng)該能夠高度均勻地制造以便在試驗(yàn)之間產(chǎn)生可重現(xiàn)的結(jié)果。
過(guò)去十年間已經(jīng)開發(fā)了許多微陣列芯片，其中，探針被固定在修飾的玻璃基材、硅基材等的不連續(xù)空間位置上，以形成代表大量不同探針的陣列。最初開發(fā)的微陣列是二維形式，其中的探針直接結(jié)合在基材表面。最近已經(jīng)用水凝膠材料開發(fā)出了三維微陣列，其中的微斑點(diǎn)可以類似于微小的半球，其多孔結(jié)構(gòu)提供了三維框架或基質(zhì)。這種類型的微陣列描述于美國(guó)專利No.6,174,683和已公開的國(guó)際申請(qǐng)WO02/059372。
美國(guó)公開申請(qǐng)2003/0124371公開了使用水可溶脹的親水性水凝膠，認(rèn)為這種水凝膠特別適用于將多肽分析物固定到吸收層上，所述吸收層是通過(guò)改變水凝膠中親水部分和疏水部分的比例而構(gòu)造的。構(gòu)成水凝膠的親水和疏水單體交聯(lián)形成所需聚合物。一個(gè)例子是，用二氧化硅涂布鋁基材，然后用烷基硅烷處理，之后將單體施加到多個(gè)可尋址位置(微斑點(diǎn))，然后通過(guò)輻射照射交聯(lián)。使用結(jié)合緩沖劑將探針加到芯片的各微斑點(diǎn)上，并將加載好的芯片孵育30分鐘。然后洗滌并將芯片用于試驗(yàn)。
美國(guó)公開申請(qǐng)2003/0138649傳授了制造特別適合結(jié)合蛋白質(zhì)作為探針或捕獲劑、采用明膠基材的微陣列的方法。用IV型明膠溶液涂布諸如玻璃、硅或照相紙等的基材；例如，將明膠涂布到反射照相紙上然后冷凍(chill-set)并干燥。然后在整體用明膠涂布的平板上點(diǎn)微斑點(diǎn)以結(jié)合雙官能化合物，例如山羊抗小鼠抗體IgG，該化合物的一個(gè)基團(tuán)將結(jié)合明膠，第二個(gè)基團(tuán)能夠以高特異性與蛋白質(zhì)反應(yīng)。在相關(guān)美國(guó)公開申請(qǐng)No.2003/0170474中，硅膠片或玻璃板首先用烷基硅烷處理，再浸入明膠溶液中。然后將明膠涂布的基材浸入聚乙烯亞胺(PEI)溶液中。據(jù)報(bào)道，這種表面對(duì)蛋白質(zhì)具有相對(duì)低的非特異性結(jié)合容量，并可用作微陣列基材，將蛋白質(zhì)捕獲劑固定在表面相間隔的微斑點(diǎn)上。
美國(guó)公開申請(qǐng)2003/0096257傳授了通過(guò)用氨基烷基硅烷涂布玻璃載玻片然后通過(guò)結(jié)合到氨基將乙烯基磺?；郊拥秸麄€(gè)表面來(lái)制造DNA芯片的方法。然后將具有接頭的寡核苷酸點(diǎn)到反應(yīng)性平板上并適當(dāng)孵育以確保連接，從而制成可用于雜交分析的DNA芯片。
盡管這些制造生物芯片等的方法可能有許多優(yōu)點(diǎn)，但它們都有缺點(diǎn)。因此將繼續(xù)研究以得到制造這種微陣列的更好的方法，而重點(diǎn)通常集中于在這種微陣列中使用水凝膠。
發(fā)明概述我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，通過(guò)提供上表面被有機(jī)分子官能化的基材并用可聚合的水凝膠層涂布該表面可制造微陣列，所述水凝膠層含有均勻分布于其中的錨定分子從而覆蓋將作為微陣列的連續(xù)表面區(qū)域。固化涂布的基材以聚合所述涂布的水凝膠層，通過(guò)將探針連接到存在于所述固化的水凝膠層內(nèi)的錨定分子從而將多種不同探針固定到表面的不連續(xù)空間位置以形成微斑點(diǎn)。需要的話可遮蓋微斑點(diǎn)周圍區(qū)域。然而，當(dāng)所述水凝膠基于PEG或PPG(或其共聚物)和聚異氰酸酯交聯(lián)接頭，以及當(dāng)所用錨定分子是有機(jī)螯合劑時(shí)，非特異性結(jié)合應(yīng)該不高因此無(wú)需遮蓋。
在一具體方面，本發(fā)明提供了一種制造微陣列的方法，該方法包括以下步驟提供上表面用有機(jī)分子官能化的基材；用可聚合水凝膠層涂布所述表面以便完全覆蓋所述表面的陣列區(qū)域，所述水凝膠層包含均勻分散于其中的錨定分子；固化所述涂布的基材以聚合所述水凝膠層；和然后通過(guò)將所述探針連接到存在于所述固化的水凝膠層內(nèi)的錨定分子從而將多種不同探針固定到所述涂布表面的不連續(xù)空間位置上。
在另一具體方面，本發(fā)明提供了一種微陣列，其包括上表面用有機(jī)分子官能化的基材；完全覆蓋所述表面陣列區(qū)域的聚合的水凝膠層，所述水凝膠層包含均勻分散于其中的錨定分子；和固定在所述水凝膠涂層所述表面的不連續(xù)空間位置上的多種不同探針，所述探針連接到所述聚合的水凝膠層內(nèi)的所述錨定分子，且所述不連續(xù)位置周圍的所述涂層區(qū)域基本上不含探針。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述用來(lái)形成平板的基材可由化學(xué)實(shí)驗(yàn)室通常使用的任何合適材料制成；其例子包括玻璃、石英、硅、二氧化硅、不銹鋼和惰性聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸、聚碳酸酯等，這些都是本領(lǐng)域熟知的。平板可任選用反射層涂布，這也是本領(lǐng)域熟知的。反射層應(yīng)優(yōu)選覆蓋該基材基本全部將固定探針的的表面區(qū)域，即陣列區(qū)域；然而，為便于制造，反射涂層通常覆蓋基材的整個(gè)上表面。反射層可以是反光金屬，例如鋁、銀、金、銠等，它可提供鏡面層。反光金屬是指能反射至少90％感興趣波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的入射光(通常是可見光(400-800nm))并可能包括近紅外區(qū)域的較長(zhǎng)波長(zhǎng)(如800-1100nm)和極少(或接近0％)折射如介質(zhì)的光的金屬?？捎贸Ｒ?guī)的蒸汽涂布法或本領(lǐng)域熟知的提供這種鏡面涂層的涂布方法來(lái)提供這種薄金屬層。這種層的厚度并不特別重要，只要連續(xù)即可，但包括這種層時(shí)其厚度通常約為0.01-15微米。
當(dāng)用該基材來(lái)產(chǎn)生用于微量試驗(yàn)的微陣列時(shí)，采用能自發(fā)光或?qū)ぐl(fā)光反應(yīng)而發(fā)光的標(biāo)記或標(biāo)簽，例如熒光、發(fā)光標(biāo)記或磷光標(biāo)記，這些不同標(biāo)記發(fā)射的光將具有已知波長(zhǎng)。2003年9月16日提交的待批美國(guó)專利序列號(hào)10/664,248教導(dǎo)到，在反光金屬層上施加能夠基本上除去特定波長(zhǎng)的絕緣層可以非常充分地降低微斑點(diǎn)位置或其它此類探針位置的背景偽像(artifact)發(fā)射。可采用由諸如一氧化硅和/或二氧化硅等材料制成的透明絕緣層，其厚度通常約為0.1-5微米。如果基材的上表面被均勻涂布上這種金屬鏡面薄層，則整個(gè)上表面宜涂布上這種均勻的絕緣層。從蒸汽沉積這種非常薄的二氧化硅、氧化鋁、氟化鎂等的絕緣膜是本領(lǐng)域熟知的。
一旦施加了這種薄的絕緣層，則優(yōu)選用化學(xué)方法處理該絕緣層的上表面以促進(jìn)水凝膠的強(qiáng)附著而提供探針或捕獲劑陣列。絕緣表面優(yōu)選用諸如PEI、聚賴氨酸或氨基烷基硅烷等合適試劑衍生，這些覆蓋整個(gè)表面的試劑具有懸垂(pendent)的氨基，如本領(lǐng)域所熟知的，氨基然后可用于牢固結(jié)合反應(yīng)性分子。這種硅烷偶聯(lián)劑的例子包括氨基丙基三乙氧基硅烷、N-β-(氨基乙基)-α-氨基丙基三甲氧基硅烷和N-β-(氨基乙基)-α-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷。
用水凝膠三維微斑點(diǎn)作為探針或捕獲劑固定點(diǎn)的微陣列，描述于美國(guó)專利No.6,174,683和已經(jīng)公開的題為“三維形式生物芯片(Three Dimensional Format Biochips)”的國(guó)際申請(qǐng)WO 09/059372和題為“捕獲活細(xì)胞和有機(jī)分子的方法和凝膠組合物(Methods and Gel Compositions For Encapsulating Living Cells and Organic Molecules)”的WO 02/081662中。
精選的可聚合的水凝膠涂層優(yōu)選是用異氰酸酯官能化的前聚合物(prepolymer)制備的，這種前聚合物是將聚氧化烯二醇或多元醇與雙官能和/或多官能(即三官能或多官能)異氰酸酯化合物反應(yīng)制備的。優(yōu)選的前聚合物是從聚氧化烯二醇或多元醇制備的，其中包括環(huán)氧乙烷單元的均聚物或含有環(huán)氧乙烷單元和環(huán)氧丙烷或環(huán)氧丁烷單元的混合物的嵌段或隨機(jī)共聚物。就這種嵌段或隨機(jī)共聚物而言，至少75％的單元優(yōu)選是環(huán)氧乙烷單元。這種聚氧化烯二醇或多元醇的分子量?jī)?yōu)選約500-10,000道爾頓，更優(yōu)選約1,000-6,000道爾頓，有時(shí)最優(yōu)選的分子量是5,000-6,000道爾頓。合適的前聚合物可將所選聚氧化烯二醇或多元醇與聚異氰酸酯反應(yīng)制備，這樣可使幾乎所有的羥基被聚異氰酸酯加帽，如下文更加詳細(xì)描述的。通常優(yōu)選聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)或其共聚物。異氰酸酯官能化前聚合物優(yōu)選含有一定量的活性異氰酸酯，所述含量約為0.1-1meq/g，更優(yōu)選約為0.2-0.8meq/g。如果使用分子量較低的前聚合物，例如小于2,000道爾頓，優(yōu)選它們具有相對(duì)高的異氰酸酯含量(約1meq/g或更高)。然而，可能需要更加精確地控制這種較小前聚合物的聚合速度以避免過(guò)于迅速的聚合。此外，具有較高異氰酸酯含量的前聚合物在聚合之后可能具有相對(duì)高含量的游離胺，中性pH時(shí)，這種胺官能度上的正電荷可能會(huì)增加負(fù)電荷生物分子的非特異性結(jié)合，從而可能導(dǎo)致較高水平不需要的背景信號(hào)。因此，含有相對(duì)低異氰酸酯含量的分子量較高的前聚合物通常是優(yōu)選的。
這種高分子量前聚合物通常用兩種常用方法中的任何一種制備，但也可采用本領(lǐng)域已知的其它方法(1)將分子量至少2000道爾頓的多元醇(三元醇或更高)與聚異氰酸酯如異氟爾酮二異氰酸酯反應(yīng)，或(2)將分子量至少2000道爾頓的二元醇與聚異氰酸酯和交聯(lián)劑反應(yīng)，所述交聯(lián)劑諸如甘油、三羥甲基丙烷、三羥甲基乙烷、三乙醇胺或有機(jī)三胺反應(yīng)。
可使用芳族、脂族或環(huán)脂族聚異氰酸酯；所用聚異氰酸酯包括雙和多(官能)異氰酸酯。高分子量脂族異氰酸酯加帽的前聚合物通常在約20-90分鐘內(nèi)膠凝成水合聚合物狀態(tài)，而用芳族聚異氰酸酯加帽的前聚合物更加迅速地膠凝。合適的雙官能或多官能異氰酸酯的例子如下4，4’-亞甲基雙-(苯基(phyenyl)異氰酸酯)(MDI)、甲苯-2，4-二異氰酸酯、甲苯-2，6-二異氰酸酯(其同分異構(gòu)體的混合物作為TDI出售)、異氟爾酮二異氰酸酯(IPDI)、乙烯基二異氰酸酯、亞乙基二異氰酸酯、丙烯-1，2-二異氰酸酯、亞環(huán)己基(cyclobexylene)-1，2-二異氰酸酯、亞環(huán)己基-1，4-二異氰酸酯、苯二異氰酸酯、3，3”-二苯基-4，4”-二苯二異氰酸酯、1，6-六亞甲基二異氰酸酯、1，4-四亞甲基二異氰酸酯、1，10-十亞甲基二異氰酸酯、枯烯-2，4-二異氰酸酯、1，5-萘二異氰酸酯、亞甲基二環(huán)己基二異氰酸酯、1，4-亞環(huán)己基二異氰酸酯、對(duì)-四甲基苯二甲基二異氰酸酯、對(duì)-苯二異氰酸酯、4-甲氧基-1，3-苯二異氰酸酯、4-氯-1，3-苯二異氰酸酯、4-溴-1，3-苯二異氰酸酯、4-乙氧基-1，3-苯二異氰酸酯、2，4-二甲基-1，3-苯二異氰酸酯、2，4-二甲基-1，3-苯二異氰酸酯、5，6-二甲基-1，3-苯二異氰酸酯、1，4-二異氰酸根合二苯基醚、4，4’-二異氰酸根合二-苯基醚、聯(lián)苯胺二異氰酸酯、4，6-二甲基-1，3-苯二異氰酸酯、9，10-蒽二異氰酸酯、4，4’-二異氰酸根合二-苯基、3，3’-二甲基-4，4’-二異氰酸根合二苯基甲烷、1，6-二甲基-4，4’-二異氰酸根合二苯基、2，4-二異氰酸根合芪(stibene)、3，3’-二甲氧基-4，4’-二異氰酸根合二苯基、1，4-蒽(antracene)二異氰酸酯、2，5-熒光酮二異氰酸酯、1，8-萘二異氰酸酯、2，6-二異氰酸根合苯并呋喃(benzluran)、2，4，6-甲苯三異氰酸酯、p，p’，p”-三苯基甲烷三異氰酸酯、異氟爾酮二異氰酸酯的三官能三聚體(異氰脲酸酯)、六亞甲基二異氰酸酯的三官能縮二脲、六亞甲基二異氰酸酯的三官能三聚體(異氰脲酸酯)、聚合4，4’-二苯基甲烷二異氰酸酯、苯二甲基二異氰酸酯和間-四甲基苯二甲基二異氰酸酯。
采用化學(xué)計(jì)量量的反應(yīng)物可有效地用聚異氰酸酯加帽選擇的二醇或多元醇形成前聚合物。如本領(lǐng)域已知的，異氰酸酯與羥基的比例是可變的，但優(yōu)選約為1-3，更優(yōu)選約為1.2-2.2。加帽反應(yīng)可采用任何合適條件進(jìn)行，如在約20℃-150℃在干燥氮?dú)庀路磻?yīng)約2小時(shí)至約14天，優(yōu)選不使用催化劑。優(yōu)選的溫度是約60-100℃，當(dāng)異氰酸酯濃度接近理論值時(shí)終止反應(yīng)。
優(yōu)選的前聚合物包含末端用甲苯二異氰酸酯加帽的聚乙二醇；環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷(任選含有三羥甲基丙烷)以及甲苯二異氰酸酯的共聚物；甲苯二異氰酸酯-聚乙二醇-三羥甲基丙烷(trimethylopropane)，亞甲基二異氰酸酯-亞甲基均聚物；聚合的亞甲基二異氰酸酯-聚乙二醇；環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷三羥甲基丙烷和異氟爾酮二異氰酸酯的聚合物，以及聚乙二醇三乳酸鹽和甲苯二異氰酸酯。合適的上述類型的前聚合物購(gòu)自Dow Chemical Company，名為HYPOL PreMAG-50、HYPOL2000、HYPOL3000、HYPOL4000和HYPOL5000；這些制劑通常包含聚氧化乙烯和少量分子量約6,000道爾頓的聚氧化丙烯的共聚物。其它可以商品名Urepol購(gòu)自EnviroChemTechnologies，也可從市售原料制備類似前聚合物。
總的看來(lái)，水凝膠聚合物的主鏈優(yōu)選由聚乙二醇、聚丙二醇或者聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物構(gòu)成。聚乙二醇和聚丙二醇水凝膠的非離子親水特性能夠使分析物與水凝膠低水平非特異性結(jié)合，并能夠?yàn)橐潭ǖ纳锓肿犹峁┝己孟嗳菪?，從而可維持其天然構(gòu)象和生物反應(yīng)性。這種常規(guī)類型的基于聚氨基甲酸酯(polyurethane)的異氰酸酯官能化水凝膠描述于美國(guó)專利Nos.3,939,123(Mathews等)、4,110,286(Vandegaer等)和4,098,645(Hartdegan等)。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，微陣列的基材是用異氰酸酯官能化水凝膠制造的，所述水凝膠基于高分子量聚氧化乙烯、聚氧化丙烯或者聚氧化乙烯和聚氧化丙烯共聚物的二元醇或三元醇，用水活化二異氰酸酯加帽，并任選用合適的交聯(lián)劑輕微交聯(lián)。如上所述，前聚合物中存在的活性異氰酸酯的量?jī)?yōu)選約為0.1-1meq/g。通常優(yōu)選的二異氰酸酯包括芳族二異氰酸酯甲苯二異氰酸酯(TDI)和亞甲基二苯基-異氰酸酯(MDI)，以及脂族二異氰酸酯異氟爾酮二異氰酸酯。前聚合物中約0.01-15％的反應(yīng)性異氰酸酯通常被用來(lái)連接涂層和基材，這為固定錨定的分子(entity)留下了充足夠位點(diǎn)。前聚合物可在可與水混溶的有機(jī)溶劑中預(yù)先配制，且聚合通常通過(guò)簡(jiǎn)單加水形成脲鍵而發(fā)生。
所施加的水凝膠涂層含有均勻分散于其中的錨定分子，該部分被用來(lái)直接或間接錨定探針作為微陣列的一部分。它們可被溶于水溶液并與前聚合物混合以啟動(dòng)聚合反應(yīng)。合適的錨定分子的例子包括有機(jī)螯合劑和有機(jī)接頭，所述有機(jī)接頭可以是一對(duì)互補(bǔ)接頭(如鏈霉親和素和生物素)的一半，而另一半然后可連接到感興趣的探針上。當(dāng)將有機(jī)螯合劑作為可聚合層的一個(gè)組分混合時(shí)(因此可均勻分散在固化層中)，在其固化之后用水溶性金屬離子的水溶液處理該涂層從而金屬陽(yáng)離子可結(jié)合到有機(jī)螯合劑，通常在3或4個(gè)位點(diǎn)結(jié)合。當(dāng)采用該系統(tǒng)時(shí)，也可將探針連接到將與這些金屬離子絡(luò)合的有機(jī)分子上，而這些金屬離子已經(jīng)活化固化涂層內(nèi)的螯合劑。
固化的水凝膠層或板的厚度可以約為1-1000微米；優(yōu)選至少約5微米厚。例如，當(dāng)使用三配位或四配位有機(jī)螯合劑(如亞氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA))時(shí)，它們?cè)谕繉咏M合物中的濃度可以約為50mM-1mM，這樣的量足以使這些錨定分子均勻分布在整個(gè)涂層中從而覆蓋陣列區(qū)域。
一旦施加了水凝膠層或板就可以固化直到該制備物基本上完全交聯(lián)。由于施加和固化可以是封閉條件下進(jìn)行，因此可以基本排除溶劑蒸發(fā)的問(wèn)題(不同于常規(guī)方法中在平板上施加微斑點(diǎn))；因此可以采用許多溶劑和水凝膠制備物而不會(huì)遇到環(huán)境難題或其它制造難題。同時(shí)，由于鑄造/模壓/涂布步驟可以非常一致，且可以一次涂布大量平板，因此涂布平板之間的差異將會(huì)很小，同時(shí)可避免機(jī)械打點(diǎn)的許多固有限制。
一旦成功固化載玻片，即已經(jīng)基本完成交聯(lián)，便可洗滌載玻片以除去任何未與水凝膠結(jié)合的有機(jī)螯合劑或其它有機(jī)接頭，以及除去配制和/或施加涂層組合物期間使用的溶劑。當(dāng)錨定分子是有機(jī)螯合劑時(shí)，可將涂布的基材與諸如硝酸銅或硝酸鎳的溶液一起孵育。其結(jié)果是，這種溶液中的銅或鎳離子與螯合劑結(jié)合，這一過(guò)程在該領(lǐng)域被稱為螯合劑的活化。然后可任選干燥涂布的基材并儲(chǔ)存不定時(shí)間。如果進(jìn)行了這種干燥，宜在形成微陣列之前或者形成微陣列時(shí)進(jìn)行所有涂層或者至少微斑點(diǎn)位于區(qū)域的再水合。
被用作捕獲劑或探針的生物材料可以是本領(lǐng)域熟知的各種類型。它們可涉及從DNA序列和肽到許多大分子，如抗體；甚至可采用合適的互補(bǔ)接頭將活細(xì)胞固定到多孔水凝膠的不連續(xù)空間位置上。除這里提到的螯合劑和生物素-親和素外，許多其它此類結(jié)合對(duì)描述于上述專利和公開的國(guó)際申請(qǐng)中。
在常規(guī)試驗(yàn)中，微陣列在雜交/結(jié)合條件下接觸含有生物材料樣品的溶液，通常是水溶液；溶液中含有已經(jīng)用報(bào)告物質(zhì)或信號(hào)材料或用隨后可與報(bào)告材料螯合的接頭添加尾部或標(biāo)記的潛在靶物質(zhì)，和培育。標(biāo)記或尾部用來(lái)指可連接到靶物質(zhì)(如核酸序列)以使其能被檢測(cè)和/或定量的取代基。其例子包括放射性標(biāo)記，如32P、33P和35S；比色指示劑，如熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物或有色化合物；配體，如生物素；以及可通過(guò)質(zhì)譜或其它光譜性能進(jìn)行鑒別的化學(xué)基團(tuán)。更加具體的合適標(biāo)記的例子包括黃嘌呤染料、羅丹明染料、萘胺(naphtylamine)、苯并二唑(benzoxadiazole)、芪、芘、吖啶、花青3(Cy-3)和花青5(Cy-5)。當(dāng)靶是核酸時(shí)，優(yōu)選將標(biāo)記作為引物的一部分而直接摻入分析物核酸中；然而，可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)或酶反應(yīng)，或者也可將標(biāo)記與中間配體雜交或退火來(lái)間接加入。為了簡(jiǎn)便和有效，優(yōu)選在雜交步驟中簡(jiǎn)單采用在分析物樣品中的熒光、發(fā)光或磷光等發(fā)光標(biāo)記。盡管結(jié)合對(duì)如親和素-生物素可用來(lái)隨后添加標(biāo)記，但特別優(yōu)選用這些物質(zhì)來(lái)產(chǎn)生試驗(yàn)所用的微陣列，該陣列中的標(biāo)簽已經(jīng)與培育步驟所用樣品溶液中的靶生物材料共價(jià)結(jié)合。熒光標(biāo)記如Cy-3和Cy-5是這種常用標(biāo)記的例子。
將微陣列與樣品溶液孵育適當(dāng)時(shí)間后進(jìn)行洗滌，通常重復(fù)洗滌，這是本領(lǐng)域熟知的和常用的；然后通常將微陣列干燥，之后再進(jìn)行成像。當(dāng)采用發(fā)射(無(wú)論是自發(fā)的或是受激的)光的標(biāo)記時(shí)，各種市售光度計(jì)可用于成像。例如，美國(guó)專利No.5,672,880公開了一種熒光成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)用激光束激發(fā)熒光，聚集發(fā)出的熒光使聚集光照射光電檢測(cè)器，而產(chǎn)生信號(hào)。公布的美國(guó)專利2002/0109841公開了一種用于高通量熒光檢測(cè)的掃描分光光度計(jì)，其中，光線被收集并發(fā)送到光電倍增管(PMT)，再將信號(hào)反饋到處理單元。
以下實(shí)施例提供了目前已知的執(zhí)行本發(fā)明的最佳模式；然而，這些實(shí)施例只是為了闡述而不是要以任何方式限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由說(shuō)明書隨后出現(xiàn)的權(quán)利要求書限定。
實(shí)施例1采用在反射鋁層之上涂有氧化硅薄層的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室玻璃載玻片，載玻片涂布有一層連續(xù)的其中分布錨定分子的水凝膠前聚合物溶液。將0.075克Hypol PreMaG-50(Dow Chemical Company)和0.225克乙腈和0.225克N-甲基-2-吡咯烷酮溶液混合制備溶液A。溶液B為50mM硼酸鹽緩沖水溶液(pH 8.2)中的0.5μM衍生的NTA螯合劑。該螯合劑的伯胺共價(jià)結(jié)合在交聯(lián)的水凝膠中。然后將200μL溶液A與50μL溶液B混合使聚合開始，所得組合物涂布在胺處理過(guò)的玻璃載玻片上。在室溫和約95％RH的濕度室中小心聚合含有螯合劑的水凝膠涂層以避免脫水。該制備物在室溫下在約2小時(shí)內(nèi)聚合。固化后的水凝膠板厚約50微米，它是物理穩(wěn)定牢固附著于玻璃載玻片。固化的載玻片然后用濃度約50μM的硝酸銅水溶液在室溫處理2小時(shí)以使銅陽(yáng)離子被均勻分散在多孔水凝膠板中的螯合劑分子螯合。用這種方式活化螯合劑之后，載玻片用含0.1M KNO3(pH 4)的50μM乙酸溶液洗滌1小時(shí)，然后用去離子水沖洗。然后將其干燥用于微打點(diǎn)(microspotting)以形成測(cè)試微陣列。
用5微升玻璃微毛細(xì)管進(jìn)行微打點(diǎn)以在活化的水凝膠板表面形成規(guī)則圖案的微斑點(diǎn)。出于測(cè)試目的，每管都含有綠色熒光蛋白以模擬探針，探針尾部是能與銅復(fù)合的富含組氨酸肽段。微打點(diǎn)的表面然后在室溫孵育約2小時(shí)以使這些探針依照微斑點(diǎn)的規(guī)則圖案有效連接到固化的水凝膠板表面。
洗滌微陣列以除去任何過(guò)量探針，然后用電荷耦合照相機(jī)掃描。圖象顯示均勻發(fā)光的微斑點(diǎn)以規(guī)則圖案貫穿陣列表面，微斑點(diǎn)之間的區(qū)域沒(méi)有發(fā)出顯著熒光；這說(shuō)明與水凝膠板的非特異性結(jié)合不是問(wèn)題，且這種基材非常適合制造高靈敏微陣列。
實(shí)施例2用類似的異氰酸酯加帽的聚氨基甲酸酯前聚合物重復(fù)實(shí)施例1所述的過(guò)程。然而此時(shí)，溶液B為50mM硼酸鹽緩沖水溶液(pH 8.2)中的0.5mM鏈霉親和素溶液。如上所述，再將約200μL溶液A與50μL溶液B混合，所得組合物涂布在胺處理過(guò)的玻璃載玻片上作為連續(xù)層并使其聚合。
固化后，再用5微升玻璃微毛細(xì)管進(jìn)行微打點(diǎn)以在水凝膠板表面形成規(guī)則圖案的微斑點(diǎn)，從而形成微陣列。該測(cè)試中，各管含有前列腺特異性抗原(PSA)的生物素化的抗體以用作探針，這是本領(lǐng)域熟知的。將微打點(diǎn)的表面在25℃孵育約60分鐘以使生物素-親和素以規(guī)則圖案有效連接到固化的水凝膠板表面上。
洗滌微陣列以除去任何過(guò)量探針，然后與PSA水溶液雜交，PSA用Cy-3標(biāo)記作為測(cè)試靶材料；標(biāo)記的PSA選擇性結(jié)合探針。在25℃孵育約60分鐘后洗滌陣列，然后用激光掃描儀(ScanArrayLite，Perkin Elmer)成像以獲得微陣列表面的熒光圖象。圖象顯示均勻發(fā)光的微斑點(diǎn)以規(guī)則圖案貫穿陣列表面，微斑點(diǎn)之間的區(qū)域沒(méi)有發(fā)出顯著熒光；這說(shuō)明與水凝膠板的非特異性結(jié)合不是問(wèn)題，且這種基材非常適合制造高靈敏微陣列。
由此可見，采用具有這種連續(xù)水凝膠板的基材可大大提高效率，從而可用均勻分散于其中的錨定分子制造微陣列。
盡管已經(jīng)就某些優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員顯然可作出各種變化和改進(jìn)而不超出本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍在附帶的權(quán)利要求中列出。
權(quán)利要求
1.一種制造微陣列的方法，所述方法包括以下步驟提供上表面用有機(jī)分子官能化的基材，用可聚合水凝膠層涂布所述表面以完全覆蓋所述表面的陣列區(qū)域，所述水凝膠層包含均勻分散于其中的錨定分子，固化所述涂布的基材以聚合所述水凝膠層，和然后通過(guò)將所述探針連接到存在于所述固化的水凝膠層內(nèi)的錨定分子從而將多種不同探針固定到所述涂布表面的不連續(xù)空間位置上。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述錨定分子是與所述可聚合水凝膠層組分混合的有機(jī)螯合劑。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述固化步驟之后，用水溶性金屬離子的水溶液處理所述螯合劑以活化所述螯合劑。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述探針是已用強(qiáng)烈結(jié)合所述金屬離子的化合物衍生的分子。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述探針用富含組氨酸的肽衍生。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針用在所述附加步驟中直接結(jié)合所述錨定分子的互補(bǔ)接頭衍生。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述接頭和所述錨定分子分別為生物素和鏈霉親和素。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述可聚合水凝膠包含PEG或PPG或其共聚物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述可聚合水凝膠包含聚異氰酸酯交聯(lián)劑。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑包括脂族或芳族聚異氰酸酯。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述涂布的基材在所述固化后被干燥，然后在連接所述探針的位置上再水合。
12.一種微陣列，其包括上表面用有機(jī)分子官能化的基材，完全覆蓋所述表面陣列區(qū)域的聚合的水凝膠層，所述水凝膠層包含均勻分散于其中的錨定分子，和連接在所述水凝膠涂層所述表面的不連續(xù)空間位置上的多種不同探針，所述探針連接于所述聚合的水凝膠層內(nèi)的所述錨定分子，以及所述不連續(xù)位置周圍的所述涂層區(qū)域基本上不含探針。
13.如權(quán)利要求12所述的微陣列，其特征在于，所述錨定分子是用金屬離子活化的有機(jī)螯合劑。
14.如權(quán)利要求13所述的微陣列，其特征在于，所述探針用富含組氨酸的肽衍生。
15.如權(quán)利要求12所述的微陣列，其特征在于，所述探針用直接結(jié)合所述錨定分子的互補(bǔ)接頭衍生。
16.如權(quán)利要求15所述的微陣列，其特征在于，所述探針是生物素化探針，所述錨定分子是鏈霉親和素。
17.如權(quán)利要求12-16中任一項(xiàng)所述的微陣列，其特征在于，所述聚合的水凝膠包含PEG或PPG或其共聚物的反應(yīng)產(chǎn)物。
18.如權(quán)利要求12-16中任一項(xiàng)所述的微陣列，其特征在于，所述聚合的水凝膠包含(a)分子量約為1,000-6,000道爾頓的PEG或PPG或其共聚物和(b)多官能異氰酸酯的反應(yīng)產(chǎn)物。
全文摘要
一種通過(guò)用含有均勻分散于其中的錨定分子的可聚合水凝膠層涂布平板基材來(lái)制造微陣列的方法。固化之后在基材的上表面安全附加貫穿其微陣列區(qū)域的厚度均勻的連續(xù)層。然后可通過(guò)將探針連接到固化的水凝膠內(nèi)的錨定分子從而固定多種不同探針以便在該板層表面的不連續(xù)空間位置形成微斑點(diǎn)。這種錨定分子可采用例如能用銅或一些其它金屬活化的有機(jī)螯合劑以及諸如親和素－生物素互補(bǔ)對(duì)的連接系統(tǒng)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101044401SQ200580028415
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月19日
發(fā)明者P·欽伯格 申請(qǐng)人:生物概念股份有限公司