專利名稱：富集精細胞群的方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及富集精細胞群。具體而言，本發(fā)明一般涉及不物理分選細胞而對活精細胞群的富集。
背景技術：
通過人工授精(AI)使動物受精以及體外受精后的胚胎移植已經是一項成熟的操作。在家畜產業(yè)中，能夠對繁殖結果施加影響而使其后代具有一種或多種期望特征有明顯的優(yōu)勢。例如，乳制品產業(yè)中如能預先選擇后代有利于雌性以保證奶牛的產量，則會帶來經濟效益。將精子分離為富集的帶有X和Y染色體的細胞群，即稱作的性別富集精子或性別富集精液，便是實現(xiàn)預選后代的方法之一。
Johnson等人(美國專利號5,135,759)描述了使用流式細胞儀/細胞分選儀根據DNA內容物將帶有完整X和Y染色體的精子群分離為帶有X和Y染色體精子富集的細胞群。如所述，將精子與DNA選擇性標記物在30℃到39℃的溫度下混合1小時(39℃)到1.5小時(30℃)。接著使用流式細胞儀測量當精子通過激光束時發(fā)出的熒光量。由于帶有X染色體的精子比帶有Y染色體的精子含有更多的DNA(由物種決定約為3％到5％)，帶有X染色體的精子比帶有Y染色體的精子產生更大的熒光光強。使含有預定熒光強度的單個精子的液滴帶上電荷并使其靜電偏離至收集容器中。接著將收集的性別富集的精子群用于顯微注射或人工授精。顯然，這一方法需要物理分選精細胞以獲得性別富集的精子群。根據Johnson的物理分選是費時且高成本的。
發(fā)明概述本發(fā)明的多方面之一是關于一種特征富集的精子分散體(有時稱為懸浮液)的制備方法。在一個實施方案中，例如，將本發(fā)明的方法用于制備關于X或Y染色體精子富集的精子分散體。
簡言之，因此，本發(fā)明涉及選擇性降低精細胞分散體中精細胞的亞群使卵受精的能力。該方法包括在液體中形成標記的精細胞的分散體，所述液體包含誘導精子不運動性的化學劑或具有誘導精子不運動性的溫度，其中與精細胞結合的標記的存在、缺少或數(shù)量指示分散體中精細胞亞群的遺傳、蛋白質組學、結構或功能特征。該方法還包括光學檢測分散體以鑒定作為亞群成員的個體精細胞；確定分散體中亞群成員的位置；和向分散體內不同位置遞送能量劑量以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力而不類似地影響在分散體中其它位置的精細胞。
本發(fā)明還涉及使用富集的精細胞群授精雌性哺乳動物的方法。該方法包括在液體中形成標記的精細胞的分散體，所述液體包含誘導精子不運動性的化學劑或具有誘導精子不運動性的溫度，其中與精細胞結合的標記的存在、缺少或數(shù)量指示分散體中精細胞亞群的遺傳、蛋白質組學、結構或功能的特征。該方法還包括光學檢測分散體以鑒定作為亞群成員的個體精細胞；確定分散體中亞群成員的位置；向分散體內不同位置遞送一定的能量以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力而不類似地影響在分散體中其它位置的精細胞；和其后使用該分散體或其衍生物授精雌性哺乳動物。
本發(fā)明還涉及體外受精的方法。該方法包括在液體中形成標記的精細胞的分散體，所述液體包含誘導精子不運動性的化學劑或具有誘導精子不運動性的溫度，其中與精細胞結合的標記的存在、缺少或數(shù)量指示分散體中精細胞亞群的遺傳、蛋白質組學、結構或功能的特征。該方法還包括光學檢測分散體以鑒定作為亞群成員的個體精細胞；確定分散體中亞群成員的位置、向分散體內不同位置遞送能量劑量以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力而類似地影響在分散體中其它位置的精細胞；和其后使用所述分散體或其衍生物使卵體外受精?？梢栽谄浜髮⑹芫褜氪菩圆溉閯游锏淖訉m。
本發(fā)明還涉及形成冷凍的精子分散體的方法。該方法包括在液體中形成標記的精細胞分散體，所述液體包含誘導精子不運動性的化學劑或具有誘導精子不運動性的溫度，其中與精細胞結合的標記的存在、缺少或數(shù)量指示分散體中精細胞亞群的遺傳、蛋白質組學、結構或功能的特征。該方法還包括光學檢測分散體以鑒定作為亞群成員的個體精細胞；確定分散體中亞群成員的位置；向分散體內不同位置遞送能量劑量以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力而不類似地影響在分散體中其它位置的精細胞；和其后冷凍保藏該分散體。
本發(fā)明的其它方面和特征部分是顯而易見的，部分將于下文說明。
發(fā)明詳述有利的是，不使用物理分選細胞可以關于根據本發(fā)明的一種特征富集活的精細胞群。這一特征可以是，例如，精細胞帶有X還是Y染色體。備選地，該特征可以是另一遺傳特征，例如單核苷酸多態(tài)性(“SNP”)的存在，所述多態(tài)性編碼提高的動物生育力(例如，提高的奶產量)，或編碼改善所選細胞的冷藏的脂質。該特征還可以是蛋白質組特征，例如提高精子性能的蛋白質，例如將會通過改善有益的頂體特征而提高在子宮內的性能的蛋白質。該特征還可以是結構特征(例如頂體完整性)，或功能特征(例如前向運動性)。
可以關于遺傳、蛋白質組、結構或功能特征實現(xiàn)精細胞群的富集，其通過，例如標記群體中具有(或，備選地，缺少)該特征的精細胞，使精細胞基本不動和選擇性地向不動的精細胞施加一定能量以降低所施用的細胞的存活力或至少降低所施用的細胞在體外或體內使卵受精的能力(即，授精之后)。因為分散體(有時稱為懸浮液)中的精細胞基本不運動并且被選擇性標記，所以可以將能量束傳遞到分散體中的特定位置來向個體精細胞施用；通過重復這一方法步驟，即個別地向分散體中不同位置上不運動的精細胞施用，可以有效富集分散體中具有期望特征的精細胞亞群，例如就具有所期望特征的亞群細胞的百分比而論；就由于用精細胞受精而產生的具有某種遺傳或蛋白質組特征的子代的百分數(shù)而論或就這兩者而論有效富集。
在任意事件中，可以不用物理分離具有期望特征的細胞與缺少期望特征的細胞(即，不用分離施用的細胞和未施用的細胞)而富集精細胞群的特定亞群。任選地，可以根據下述方法通過物理分離施用的和未施用的細胞成分開的亞群，另外地純化所述細胞以獲得細胞的進一步富集。
精細胞分散體精細胞密度一般而言，可以用寬范圍精細胞密度制備具有可以以某種特征富集的群體的精細胞分散體。然而，通常精細胞密度在至少約1×103個精子/ml，并且通常不超過約5×1010個精子/ml，且更優(yōu)選地不超過約5×108個精子/ml分散體。例如，在一個實施方案中，分散體中可含有“相對低”密度的精子，即精子密度少于約1×107個精子/ml，優(yōu)選少于約1×106個精子/ml，更優(yōu)選約1×103至約5×106個精子/ml，還更優(yōu)選約1×103至約1×106個精子/ml，甚至更優(yōu)選約1×104至約1×105個精子/ml，和最優(yōu)選約1×105個精子/ml分散體。在備選的實施方案中，分散體中可含有“中間”密度的精子，即密度為約1×107至約1×108個精子/ml分散體。在再一個實施方案中，分散體中可含有“相對高”密度的精子，即精子密度至少為約1×108個精子/ml，優(yōu)選約1×108至約5×1010個精子/ml，更優(yōu)選約1.5×108至約2×1010個精子/ml，甚至更優(yōu)選約1.5×108至約2×108個精子/ml，還更優(yōu)選約1.5×108個精子/ml分散體。因此，例如，在一個實施方案中，分散體中可含有至少約0.04×106、在另一個實施方案中至少約1×106、在另一個實施方案中至少約1.5×106、在另一個實施方案中至少約2×106、在另一個實施方案中至少約3×106、在另一個實施方案中至少約0.5×107、在另一個實施方案中至少約1×107、在另一個實施方案中至少約1.25×107、在另一個實施方案中至少約2×107、在另一個實施方案中至少約3×107、在另一個實施方案中至少約4×107、在另一個實施方案中至少約5×107、在另一個實施方案中至少約6×107、在另一個實施方案中至少約7.0×107、在另一個實施方案中至少約8×107、在另一個實施方案中至少約9×107、在另一個實施方案中至少約10×107、在另一個實施方案中至少約11×107、在另一個實施方案中至少約12×107、在另一個實施方案中至少約1.0×108、在另一個實施方案中至少約1.25×108、在另一個實施方案中至少約1.5×108、在另一個實施方案中至少約1.75×108、在另一個實施方案中至少約2.0×108、在另一個實施方案中至少約2.25×108、在另一個實施方案中至少約2.5×108、在另一個實施方案中至少約2.75×108、在另一個實施方案中至少約3×108、在另一個實施方案中至少約5×108、在另一個實施方案中至少約7.0×108、或甚至至少約8×108個精子/ml分散體。在備選的實施方案中，分散體可以含有少于約9×105、少于約7×105、少于約5×105、少于約2×105、少于約1×105、少于約1×104，或甚至少于約1×103個精子/ml分散體。
精子的密度可以基于許多因素改變，所述因素包括，例如哺乳動物不同物種之間的差異、哺乳動物單個物種之中的差異和甚至在單個哺乳動物不同的，(一次射出的)精液中的差異。例如，牛精子可以高密度，但通常較小的體積存在于分散體中，例如在約0.5ml到約25ml的體積中0.5×106個精子/ml到約8×107個精子/ml。然而，豬精子可以較低密度，但通常較大的體積存在于分散體中，例如在約50ml到約250ml的體積中0.04×106個精子/ml到約1×107個精子/ml。
精子分散體中的精子密度還取決于精細胞隨后被富集或分選的方法。例如，可以如在美國專利申請公開號US 2005/0112541(其內容在此被完整引入作為參考)所述使用流式細胞儀分選精細胞。在這類情況下，分散體可以通常為“中間”或“相對高”密度的精子。使用標記物(例如本文所述的染料和標記物)標記的較低密度的精子，如相對低”密度的精子可適用于如下文更詳細描述的其它的分選或富集技術。
還可以人工地操作精子分散體中的精子密度以獲得特定精子密度的分散體。精子分散體中(例如包含在授精吸管中的)精子密度的操作可以基于如下因素，如分散體可儲存的溫度、儲存時間長度、精子在精子分散體中是分選的或未分選的、從其收集精子的雄性哺乳動物的物種、從其收集精子的哺乳動物的生育力以及將被授精的雌性哺乳動物的物種。
還可以通過簡單地濃縮精子(例如通過離心)影響精子分散體中精子的密度。在這類情況下，所述分散體將被基本分成(通常稱為)沉淀(含有少量液體的細胞團)和上清液(可溶的液體級分)。接著可以不破壞沉淀地倒掉上清液，由此產生含有少量抑制劑的精細胞相對致密的沉淀，該作用減少分散體體積而不改變分散體的組分。結果，沉淀的精細胞保持在不運動狀態(tài)。
精細胞的不運動性精細胞分散體含有相當大程度上減少運動性的精細胞。精細胞分散體中精細胞運動性的相當大程度上的減少可通過多種方式獲得，其包括例如，通過將精細胞與運動性抑制劑接觸、通過降低精細胞或精細胞周圍緊鄰環(huán)境(即精子分散體)的溫度、或通過兩者的組合。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的精子分散體中精細胞在某些方面表現(xiàn)出附睪精子特征性方式的行為，例如，群體中的精細胞基本不運動，和/或相對于洗滌或剛射出的精子而言，其內源呼吸速率更低。有利地，不運動的精細胞(有時稱為靜止精細胞)在從抑制劑分離或暴露于升高的溫度中時，其運動性能夠表現(xiàn)出射出的精子的特征性行為，而在一個實施方案中，其運動性和呼吸都可表現(xiàn)出射出精子的特征性行為。
在一個實施方案中，例如，通過HTM-IVOS精子分析(Hamilton-Thorne HTM-IVOS計算機輔助精子分析系統(tǒng)，Hamilton-Thorne Research，Beverly MA)測量，抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的路徑速度(有時稱為運動性或路徑運動性)、前向速度(有時稱為前向運動性)或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時，降低至少約50％。優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運動抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時，降低至少約60％。更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運動抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時，降低至少約70％。還更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運動抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時，降低至少約80％。甚至更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運動抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時，降低至少約90％。甚至更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運動抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時，降低至少約95％。最優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運動抑制劑可使分散體中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的路徑速度、前向速度或兩者同時，降低至少約99％。
可以使用運動抑制劑在相當大程度上降低精細胞分散體中精細胞的運動性。抑制劑可以為對精子運動性具有抑制作用的一系列組合物中的任意一種。此類組合物包括如鈉通道抑制劑，如毒毛花苷G；包含鉀離子的組合物；以及包含鉀離子和鈉離子的組合物。例如，分散體中相對高濃度的鉀離子會抑制精子運動性。因此一般而言，優(yōu)選分散體包含鉀離子源且分散體中的鉀濃度為至少約0.05mol/L。更優(yōu)選鉀離子濃度為至少約0.05mol/L至約0.5mol/L。還更優(yōu)選鉀離子濃度為至少約0.1mol/L至約0.3mol/L。最優(yōu)選鉀離子濃度為約0.173mol/L。此類分散體通常(但非必須)也包含鈉離子源。當存在鈉時，鉀和鈉的摩爾比一般分別等于或大于1∶1，但摩爾比一般不超過8∶1。優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約1.25∶1。還更優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約1.5∶1。還更優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約1.75∶1。還更優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約1.78∶1。在一個具體實施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約2∶1。而在另一實施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約3∶1。在另一實施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約4∶1。在另一實施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約5∶1。在另一實施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約6∶1。在另一實施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約7∶1。在另一實施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約8∶1。
精子分散體中還可另外含有能夠促進運動性下調的離子或二氧化碳源。在該實施方案中，二氧化碳的來源可以為，例如一種或多種碳酸鹽。在目前優(yōu)選的一個實施方案中，精子分散體含有NaHCO3和KHCO3(由此提供鉀和鈉離子源)以及增加的二氧化碳分壓(相對于周圍大氣)。例如，在目前優(yōu)選的一個實施方案中，精子分散體含有NaHCO3和KHCO3的水溶液，優(yōu)選NaHCO3、KHCO3和C6H8O7·H2O的水溶液；一般而言，分散體系中KHCO3的濃度可為至少約0.05mol/L。更優(yōu)選KHCO3的濃度為至少約0.05mol/L至約0.5mol/L。還更優(yōu)選KHCO3的濃度為至少約0.1mol/L至約0.3mol/L。在特別優(yōu)選的實施方案中，如Salisbury & Graves，J.Reprod.Fertil.，6351-359(1963)中公開的那樣，使用含0.097mol/LNaHCO3、0.173mol/L KHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O的水溶液的運動抑制劑形成分散體。只要精細胞暴露于運動抑制劑，它們一般都會保持靜止。
當分散體中含有C6H8O7·H2O時，KHCO3與NaHCO3間的摩爾比可如上所述。KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比一般分別等于或大于1∶1，但一般不會超過摩爾比8∶1。優(yōu)選KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約1.25∶1。還更優(yōu)選KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約1.5∶1。還更優(yōu)選KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約1.75∶1。在一個具體實施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約1.78∶1。在另一具體實施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約2∶1。在再一實施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約3∶1。又在另一實施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約4∶1。又在另一實施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約5∶1。又在另一實施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約6∶1。又在另一實施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約7∶1。又在另一實施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約8∶1。在特別優(yōu)選的實施方案中，如Salisbury & Graves，J.Reprod.Fertil.，6351-359(1963)中所公開的那樣，使用含0.097mol/L NaHCO3、0.173mol/L KHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O的水溶液的抑制性緩沖液形成分散體。只要精細胞暴露于運動抑制劑，它們一般都會保持靜止。
迄今為止的實驗證據還提示，如果將精細胞分散體保存在降低或防止氧氣向該分散體擴散的大氣中，可以改善精細胞的整體健康和其他重要特征。通過用如二氧化碳、氮氣或其他惰性氣體分壓比周圍空氣增高的氣體來代替精子分散體上方的大氣，可以達到這一目的。在具體的實施方案中，分散體維持在具有比周圍空氣高的二氧化碳分壓的大氣下。在優(yōu)選實施方案中，分散體上方空氣的二氧化碳分壓為至少約0.0001atm，但一般小于約5atm大氣壓。在一個實施方案中，二氧化碳分壓為約0.5atm至約2atm大氣壓；在另一實施方案中，二氧化碳分壓為約0.9atm至約2atm大氣壓；在另一實施方案中，二氧化碳分壓為約0.95atm至約2atm大氣壓。在特別優(yōu)選的實施方案中，分散體上方大氣的二氧化碳分壓為至少0.9atm；更優(yōu)選至少約0.95atm。
除使用運動抑制劑之外或可替代之的是，可以改變精細胞或分散體的溫度以引起精細胞變得不運動。誘導精子不運動性的溫度可以被誘導，例如通過降低精細胞或分散體的溫度到約0℃至約15℃，優(yōu)選從約1℃至約10℃；更優(yōu)選從約2℃至約8℃；還更優(yōu)選從約3℃至約6℃；甚至更優(yōu)選為約4℃至約5℃；更優(yōu)選約5℃。然而，優(yōu)選不將精細胞暴露于會對細胞存活力造成實質不良影響或顯著影響精細胞結合或攝取標記物能力的溫度下。
在另一實施方案中，可以改變精細胞或精子分散體的溫度使其介于約4℃至約50℃范圍內；優(yōu)選從約7℃至約43℃；更優(yōu)選從約10℃至約39℃；還更優(yōu)選從約15℃至約30℃；且最優(yōu)選從約17℃至約25℃的溫度。在特別優(yōu)選的實施方案中，精細胞或其周圍分散體的溫度為約4℃。
在任何時間一旦從源哺乳動物獲得精細胞，可以將其暴露于降低的溫度從而使其基本不運動。例如，可以在從源哺乳動物收集細胞時、在將細胞與緩沖液混合時、在形成標記混合物時(包括標記過程之前、期間或之后)、或在形成標記細胞的分散體時降低精細胞的溫度，由此引起精子不運動性。然而，通常在先于分散體的光學檢測之前通過降低溫度誘導精子不運動性。
例如，可以在標記細胞之后降低精細胞溫度(即，誘導精子不運動性)，從而允許在下文討論的更優(yōu)選的溫度下進行標記。在優(yōu)選的實施方案中，可以在標記后和在光學檢測細胞之前降低精細胞或周圍分散體的溫度。
將精細胞暴露于抑制劑、降低的溫度或兩者的組合誘導精細胞不運動。在一個實施方案中，例如，運動抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的運動性、前向運動性或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的運動性、前向運動性或兩者同時，降低至少60％。優(yōu)選地，運動抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的運動性、前向運動性或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的運動性、前向運動性或兩者同時，降低至少70％。更優(yōu)選地，運動抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的運動性、前向運動性或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的運動性、前向運動性或兩者同時，降低至少80％。優(yōu)選地，運動抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的運動性、前向運動性或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的運動性、前向運動性或兩者同時，降低至少90％。優(yōu)選地，運動抑制劑、溫度的降低或兩者的組合可使分散體中精細胞的運動性、前向運動性或兩者同時相對于相同物種剛射出精液中精細胞的運動性、前向運動性或兩者同時，降低至少99％。
無論所使用的方法，優(yōu)選使細胞不運動，從而允許充分的時間進行分散體的光學檢測、確定亞群成員細胞的位置和將能量源施用于亞群的成員細胞。如果期望物理地分離被施用的細胞與未施用的細胞，還可以優(yōu)選在這一過程步驟中維持精細胞在不運動狀態(tài)。同樣地，如果要冷藏精細胞，可以在冷藏步驟中使其維持在不運動狀態(tài)(無論在冷藏之前施用的細胞是否與未施用的細胞分離)。在優(yōu)選的實施方案中，冷藏步驟過程始終保持細胞不運動。
可以通過將細胞與運動性抑制劑分離，將其暴露于空氣，升高細胞或細胞分散體的溫度(優(yōu)選至剛射出精液的典型溫度)，通過使用生理鹽水(Salisbury等人，1963)或諸如TCA緩沖液或PBS的緩沖液稀釋，或通過以上任意的組合(其取決于誘導不運動性所用的方法)將不運動細胞恢復到活性狀態(tài)(即剛射出精液的行為特征)。一般而言，根據HTM-IVOS精子分析測量，至少約20％、優(yōu)選至少約50％、更優(yōu)選至少約60％、還更優(yōu)選至少約70％、甚至更優(yōu)選至少約80％、甚至更優(yōu)選至少約90％、還更優(yōu)選至少約95％、最優(yōu)選至少約99％恢復活性狀態(tài)的細胞(即再活化細胞)具有這樣的路徑速度、前向性速度或兩者同時即其為與運動性抑制劑混合前的精細胞(即剛射出的精細胞)的路徑速度、前向性速度或兩者同時的至少約50％，優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約70％，還更優(yōu)選至少約80％，甚至更優(yōu)選至少約90％，甚至更優(yōu)選至少約95％，最優(yōu)選至少約99％。
從哺乳動物收集細胞已知多種收集活精子的方法。這類方法包括，例如，手握法、使用人工陰道以及電刺激射精。
在收集時，或在其后，可以將收集的精液與適合精子的許多不同緩沖液中的任意一種混合，所述緩沖液為，諸如TCA、HEPES、PBS或在美國專利申請公布號US 2005/0003472(其內容在此處被完整地引入作為參考)中公開的任何其它的緩沖液。例如，可以將通常每毫升含有約5億至約100億精細胞的牛精液樣品直接從源哺乳動物收集至含有緩沖液的容器中以形成精子懸浮液。備選地，可以將精液樣品收集至空的容器并隨即在收集后的數(shù)分鐘至數(shù)小時之內使之與緩沖液接觸以形成精子懸浮液。
備選地，可以收集精細胞并且使之與代替緩沖液或緩沖液之外的運動抑制劑接觸，從而形成精子分散體?？梢詫⒕毎苯訌膭游锸占梁羞\動抑制劑的容器中以形成精子分散體，或備選地，將其收集至空容器中并隨即在收集的數(shù)分鐘(或甚至數(shù)小時)之內使之與運動抑制劑接觸以形成精子分散體。
精子分散體還可以含有一系列其它添加劑以提高精子存活力。例示性的添加劑包括蛋白質源、抗生素、生長因子以及調節(jié)細胞內和/或細胞外氧化/還原反應的組合物。這些添加劑的各種實例是本領域眾所周知的，如在，例如美國申請系列號60/557,407和11/092,313的公開(其各自內容在這里被引入作為參考)中所證明。
細胞的標記可以使用多種不同標記物的任意一種標記精細胞，所述標記物包括結合至細胞外部的標記物(例如熒光標記的抗體)以及跨細胞膜并結合至細胞內容物的標記物(例如，熒光DNA選擇性染料)。一般而言，標記方法包括在允許快速和有效結合或攝取標記物的溫度或pH下，將精細胞與一定濃度的標記物接觸(從而形成標記混合物，有時稱為染色混合物)，使時間足夠長以獲得期望的標記程度而不實質影響細胞的生存力。
精子可以是純精液形式，或備選地，含有精子的精液衍生物(其通過離心或使用其它方法分離精液為級分而獲得)。接著將精細胞與標記物接觸或另外混合以形成標記混合物；任選地，該標記物可以是固體或溶液的形式。然而，一般而言，標記物、精細胞或兩者同時是在介質，例如緩沖液中。
在一個實施方案中，將精細胞與緩沖液混合以形成精子懸浮液?？梢允褂眠m合精子的許多不同緩沖液的任何一種，諸如TCA、HEPES、PBS或在美國專利申請公布號US 2005/0003472中公開的緩沖液。一旦形成精子懸浮液，可將其與標記物源混合以形成標記混合物；任選地，所述標記物可以是固體或液體的形式并且，作為進一步選擇，可以另外地包含任一種上述緩沖液。
在另一實施方案中，標記物可與緩沖液相混合形成標記懸浮液并且該標記懸浮液與精子源混合形成標記混合物，所述精子源是純精液、含有精子的精液衍生物或精子懸浮液的形式。
在優(yōu)選的實施方案中，使用含有運動性抑制劑的緩沖液形成標記混合物。例如，運動性抑制劑可以包含在用于形成精子懸浮液(其接著與標記物混合)或標記懸浮液(其接著與精子源混合)的緩沖液中以形成標記混合物。在任一事件中，產生含有運動性抑制劑和標記物的精子分散體。
可以通過使用多種標記物的任何一種，如以前在美國專利號5,135,759和WO 02/41906中所述(均在此處引用作為參考)，一種或多種可經UV或可見光激發(fā)的DNA選擇性染料形成標記混合物。例示性的UV光激發(fā)的DNA選擇性染料包括Hoechst 33342和Hoechst 33258，二者均可從Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)商購。例示性的可見光激發(fā)的染料包括可從Molecular Probe，Inc.(Eugene，OR)商購的SYBR-14，以及WO 02/41906中所述的雙苯甲亞胺-BODIPY綴合物6-{[3-((2Z)-2-{[1-(二氟硼烷基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2H-吡咯-5-基)丙酰基]氨基}-N-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，3’H-2，5’-雙苯并咪唑-2’-基]苯氧基}乙?；?氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺(“BBC”)。這些染料中的每一種都可以單獨使用或者組合使用；備選地，也可以單獨使用其它細胞通透性的UV和可見光激發(fā)的染料或將其與前述染料組合使用，只要所述染料在可進行別處所述分選的濃度下使用時不會對精細胞的存活力產生不良影響至不可接受的程度。
備選地，可使用熒光聚酰胺形成標記混合物，更具體地綴合有熒光標記物或報道分子的聚酰胺。此類標記物在結合于核酸時會發(fā)出熒光。連接有熒光標記物或報道分子的聚酰胺的實例包括，如Best等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100(21)12063-12068(2003)；Gygi等人，Nucleic Acids Res.，30(13)2790-2799(2002)；美國專利號5,998,140；美國專利號6,143,901以及美國專利號6,090,947中公開的那些，其中每一篇的內容均在此處引入作為參考。
熒光核苷酸序列也可用于標記精細胞。此類核苷酸序列在與含有靶序列或互補序列的核酸雜交時會發(fā)出熒光，但在非雜交狀態(tài)時則不會發(fā)出熒光。此類核苷酸公開見于如美國專利中請公開號2003/0113765(此處引入作為參考)。
性別特異性抗體也可用于標記標記混合物中的精細胞。例如，在該實施方案中，性別特異性抗體可綴合熒光部分(或等價報道分子)。由于抗體結合只存在于帶有X染色體或，備選地，帶有Y染色體的細胞上的抗原，根據其熒光(相對于未標記細胞的無熒光)能夠選擇性地鑒定此類細胞。此外，可以同時使用一種以上的性別特異性抗體，每種抗體連接不同的熒光部分。從而能根據帶有X染色體或Y染色體的細胞間的不同熒光，對它們進行區(qū)分。
也可使用發(fā)光的顏色選擇性納米晶體標記標記混合物中的精細胞。這些顆粒也稱為量子點，正如美國專利號6,322,901和美國專利號6,576,291所述為本領域所公知(均在此處引用作為參考)。這些納米晶體已被綴合于多種生物材料，包括如肽、抗體、核酸、鏈霉親和素及多糖(見如美國專利號6,207,392、6,423,551、5,990,479和6,326,144，均在此處引用作為參考)，且已用于檢測生物學靶標(見如美國專利號6,207,392和6,247,323，兩者均在此處引用作為參考)。
標記混合物中標記物的優(yōu)選濃度為一系列變量的函數(shù)，所述變量包括，例如，標記物是否結合于細胞外部或它是否必須跨細胞膜；細胞對于所選標記物的透性(如果標記物必須跨細胞膜)；標記混合物的溫度；進行標記的時間量以及期望的選擇性程度。一般而言，優(yōu)選的標記物濃度足以在適度短的時間內達到細胞的所期望的標記程度，而不會對精子存活力產生實質的不良影響。例如，Hoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14或BBC在標記混合物中的濃度一般在約0.1μM至約1.0M之間，優(yōu)選為從約0.1μM至約700μM，更優(yōu)選為約100μM至約200μM。在特別優(yōu)選的實施方案中，Hoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的濃度一般在約400μM至約500μM，最優(yōu)選為約450μM。因此，在一種標記條件設置下，Hoechst 33342的濃度優(yōu)選為約100μM。在另一種標記條件設置下，Hoechst 33342的濃度為約150μM。又在另一種標記條件設置下，濃度優(yōu)選為約200μM。而在另一種標記條件設置下，Hoechst33342的濃度最優(yōu)選為約450μM。
又例如，熒光聚酰胺的濃度(例如美國申請公開號2001/0002314中所述的那些)一般為約0.1μM至約1mM之間，優(yōu)選從約1μM至約1mM，更優(yōu)選約5μM至約100μM，甚至更優(yōu)選約10μM。
標記混合物一旦形成，可以在一系列溫度范圍中的任意溫度下保存；例如，使用Hoechst 33342或Hoechst 33258標記通常在約4℃至約50℃范圍內進行。例如，可以將標記混合物保存于“相對低”的溫度下，即溫度為約4℃至約30℃；在該實施方案中，溫度優(yōu)選從約20℃至約30℃，更優(yōu)選從約25℃至約30℃，最優(yōu)選為約28℃。備選地，可將標記混合物保存于“中間”溫度范圍內，即溫度為約30℃至約39℃；在該實施方案中，溫度優(yōu)選在約34℃至約39℃，更優(yōu)選為約37℃。此外，還可將標記混合物保存于“相對高”的溫度范圍內，即溫度為約40℃至約50℃；在該實施方案中，溫度優(yōu)選從約40℃至約45℃，更優(yōu)選從約40℃至約43℃，最優(yōu)選為約41℃。對于優(yōu)選溫度的選擇一般取決于一系列變量，包括如標記物是否結合于細胞外部或它是否必須跨細胞膜、細胞對于所選標記物的透性(如果標記物必須跨細胞膜)、標記混合物中標記物的濃度、進行標記的時間量以及期望的選擇性程度。
標記混合物的pH可以保持在任何的pH值范圍內。例如，使用Hoechst33342或Hoechst 33258標記一般在約5.0至約9.0的pH范圍進行。例如，可使標記混合物保持在“微酸性”pH下，即從約5.0至約7.0。在該實施方案中，優(yōu)選pH從約6.0至約7.0，更優(yōu)選從約6.0至約6.5，最優(yōu)選為約6.2。備選地，還可使標記混合物保持在“微堿性”pH下，即從約7.0至約9.0。在該實施方案中，優(yōu)選pH從約7.0至約8.0，更優(yōu)選從約7.0至約7.5，而最優(yōu)選為約7.3。然而，一般而言，如果在除了約7.0之外的pH形成標記，一旦完成足以進行期望程度的標記所需要的時間，就將標記混合物調節(jié)為約7.0的pH。
任選地，標記混合物還含有添加劑以提高精子存活力。例示性的添加劑包括如上文對于細胞樣品收集討論過的抗生素、生長因子或調節(jié)細胞內和/或細胞外氧化/還原反應的組合物?？梢該藢⑦@些添加劑加入標記混合物。
精細胞攝取或結合標記混合物中的標記物可以持續(xù)足夠長的一段時間，以得到所期望程度標記的精細胞的分散體。所述時間一般足以使標記物結合于精細胞或精細胞的DNA，從而能鑒定細胞的亞群成員并確定其在分散體中的位置。優(yōu)選時間的選擇通常取決于一系列變量，包括例如標記物是否結合于細胞外部或它是否必須跨細胞膜、細胞對于所選標記物的透性(如果標記物必須跨細胞膜)、標記混合物中標記物的濃度、標記混合物的溫度以及期望的選擇性程度。例如，所述時間可以是足以使熒光DNA選擇性染料結合于帶有X和Y染色體的精細胞DNA的時間，從而能根據兩者之間不同的且可測量的熒光強度，將兩者分選開來。例如，當使用Hoechst 33342或Hoechst 33258標記時，一般而言，這一標記時間將不超過約160分鐘，優(yōu)選不超過約90分鐘，還更優(yōu)選不超過約60分鐘，最優(yōu)選從約5分鐘至約40分鐘。
某些標記物，并且特別是某些染料，能夠滲透精細胞并特異性結合DNA而不用另外地干預以增加細胞的透性。然而，使用其它的標記物可以期望先于標記前處理精細胞以增加滲透速率而不會不可接受地降低生存力或運動性?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的任何合適的方法。這類方法包括電穿孔、使用促進細胞滲透的溶液(如溫和的表面活性劑)或化學休克。其中使用其它的或更嚴格的技術是所期望的或有利時，這類處理可以包括使用脂質體或許多本領域技術人員使用將染色劑、染料、基因或載體導入活細胞的技術。這些方法包括，但不限于顯微注射(如Gordon等人所用(Proc.Natl.Acad.ScI.USA1 77(12)7380-4(1980))，并且自此擴展至兔、綿羊、牛和豬)、DEAE-葡聚糖介導的轉移、使用磷酸鈣的共沉淀和其它技術，這些技術均為本領域技術人員熟知的。在另一情況下，可期望離心精子并在另一介質中重懸浮離心的精子(盡管是基于相同或基本相同的緩沖液體系)，以移去可能干擾后期操作步驟的某些組分(其可能在先前被加入精子分散體)。
增加精細胞對標記物的透性的一個特別優(yōu)選的方法是眾所周知的光注射(optoinjection)法，如在美國專利號6,753,161所公開，其內容在此處引用作為參考。一般而言，光注射法是通過使用輻射脈沖接觸細胞瞬時地透化細胞的方法?；诩毎斩鹊臋z測來照亮、鑒定和定位細胞，并使用足以瞬時透化細胞的輻射脈沖照射細胞。例如，如本發(fā)明所應用的，可以使用光注射瞬時透化精細胞從而使結合至細胞內容物的標記物(例如，結合至DNA或RNA的標記物)更容易和有效地進入細胞。因此，例如，可以使用光注射減少使用熒光DNA選擇性染料(如Hoechst 33342、Hoechst 33258)或使用熒光聚酰胺充分標記精細胞所需時間。
光注射還可用于在降低的溫度下標記細胞。先前，精細胞一般使用，例如熒光DNA選擇性染料在超過30℃和甚至40℃的溫度下標記(由于更高的溫度幫助增加染料攝取)。在這些溫度下標記當然是可行的，然而避免將精細胞暴露于較高的溫度下(特別是在延長的時間)是有益的。因此，光注射可以用于透化精細胞，由此允許在較低溫度下標記細胞而仍然保持或超過通常與更高溫度下標記相關的染色效率和速度。
因此，在一個實施方案中，形成含有精細胞、運動性抑制劑和濃度從約100μM至約200μM的染料的標記混合物，且將該染色混合物于約41℃的溫度保持一段時間。在另一個實施方案中，運動性抑制劑于每25ml純化水中含有0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3和0.473g C6H8O7·H2O(NaHCO30.097mol/L、KHCO30.173mol/L、C6H8O7·H2O 0.090mol/L的水溶液)。
在另一個實施方案中，形成含有精細胞、運動性抑制劑和濃度從約400μM至約500μM的染料的標記混合物，且將該染色混合物于約41℃的溫度保持一段時間。在另一個實施方案中，染料濃度為450μM。在另一個實施方案中，運動性抑制劑于每25ml純化水中含有0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3和0.473g C6H8O7·H2O(NaHCO30.097mol/L、KHCO30.173mol/L、C6H8O7·H2O 0.090mol/L的水溶液)。
在另一個實施方案中，形成含有精細胞、運動性抑制劑和濃度從約100μM至約200μM染料的標記混合物，且將該染色混合物于約28℃的溫度保持一段時間。在另一個實施方案中，運動性抑制劑于每25ml純化水中含有0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3和0.473g C6H8O7·H2O(NaHCO30.097mol/L、KHCO30.173mol/L、C6H8O7·H2O 0.090mol/L的水溶液)。
在再一個實施方案中，形成含有精細胞、運動性抑制劑和濃度從約400μM至約500μM的染料的標記混合物，且將該染色混合物于約28℃的溫度下保持一段時間。在另一個實施方案中，染料濃度為450μM。在另一個實施方案中，運動性抑制劑于每25ml純化水中含有0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3和0.473g C6H8O7·H2O(NaHCO30.097mol/L、KHCO30.173mol/L、C6H8O7·H2O 0.090mol/L的水溶液)。
標記細胞分散體的形成一旦形成標記混合物，該標記混合物用于形成標記細胞的分散體，其隨即被檢測和施用。這類分散體包括標記的精細胞和誘導精子不運動的化學劑。備選地，或另外地，分散體除標記的精細胞之外還可以包含液體，例如如上所述的緩沖液，并且其中細胞或液體的溫度誘導精子不運動。
標記的精細胞可以是多種形式的任意一種。例如，標記的細胞還可以是標記混合物的部分。在這樣情況下，標記細胞還可在多余的或未結合的標記物中?；蛘撸瑯擞浀募毎梢砸呀浥c任何多余的或未標記的標記物分離，例如通過洗滌細胞或通過旋轉下來細胞(例如通過離心)，并接著將細胞與未結合的標記物分離。在這類情況下，標記細胞通常與如上文細胞樣品的收集中討論過的緩沖液混合。在任何事件中，分散體中的精細胞被標記從而與一個或多個精細胞結合的標記物的缺少或其數(shù)量使能夠鑒定分散體中精細胞亞群的遺傳、蛋白質組、結構或功能特征。該精細胞可以維持在引起或增加精子不運動性的溫度下。
標記的細胞的分散體還可以含有誘導精子不運動性的化學劑，例如，如上討論過的運動性抑制劑?？梢栽诠鈱W檢測分散體之前的任何時間(例如，精細胞標記之前、期間或之后)將該化學劑加入標記混合物或標記細胞?？梢詫⒒瘜W劑與標記細胞混合，標記細胞為以上討論過的多種形式的任意一種(即，仍然在標記混合物中或從其移出)。在具體的實施方案中，形成的標記混合物包含精細胞和標記物，并隨即將標記混合物與誘導精子不運動性的化學劑混合。相對于化學劑備選地，或在此之外，可以如上討論過的降低標記混合物的溫度以引起或增加精子不運動性。
細胞的檢測、確定和施用一旦形成標記細胞的分散體，光學檢測該分散體以鑒定作為亞群成員的個體精細胞，確定在分散體中的亞群成員的位置和將能量束傳遞至分散體內的不同位置以選擇性地將能源施用于亞群成員，從而降低被施用細胞的生存力或至少它們的使卵受精的能力而不同時影響分散體中其它位置的精細胞。
這些步驟通常通過設備和以商業(yè)上稱為LEAP(激光激活的分析和加工)技術平臺(Cyntellect，Inc.，San Diego，CA)的方法進行。一般而言，這一方法需要使用標記物標記細胞以鑒定和定位在細胞混合物或更大群內細胞亞群的個體細胞。接著照亮細胞群，使能夠鑒定亞群的個體細胞的位置。繼之定位處理激光器使其能夠發(fā)生能量束以誘導亞群的鑒定細胞的改變。該誘導的改變通常為細胞死亡。這些方法和設備在美國專利號6,534,308、6,514,722、6,753,161和6,642,018中被進一步描述，均在此處引用作為參考。
本發(fā)明中使用的能源可以是任何來源，當將其以某種劑量用于精細胞時，可降低被施用細胞的生存力，或至少它們使卵受精的能力，而對分散體種其它位置的精細胞具有最小或沒有相似的影響。通常，能源是能量束的形式。合適的能源的實例包括激光、平行或聚焦的非激光光、射頻能量(RF energy)、加速的顆粒、聚焦的超聲能量、電子束或其它輻射束。然而，優(yōu)選的能量源是激光，由于激光具有在緊湊體積中提供高強度能量和相對有效的能量利用以及最小產熱的優(yōu)勢，從而允許向個體細胞施用而不顯著地不利影響周圍細胞。
可以將細胞置于任何適于對細胞進行光學檢測和施用的表面。一般而言，這類表面具有水平的表面(頂部、底部，或兩者同時)，其對于用于光學檢測細胞的能源和用于向亞群成員施用的能源是光學上可透過的。這類合適的表面包括，例如玻璃、塑料或其它相關的聚合物，和Pyrex，并且可以是平的載玻片、培養(yǎng)皿、單孔平板或多孔板的形式。實例在例如美國專利號6,534,308和6,514,722中被討論。
可以將精細胞的樣品分為幾個更小的個體樣品，例如通過分成許多個體樣品用于多孔板。可以富集相同特征的各種樣品(例如，在每個孔內)，由此產生各自由于一種特征而被富集的多個樣品。然而，最好可以富集不同特征的各種樣品。例如，可以將精細胞樣品分為更小的個體樣品，并且將每個個體樣品置于96孔平板的一個孔中。接著可以以與其它的每孔樣品不同的一種特征富集每孔的單獨樣品，產生各自以不同的特征富集的96個個體樣品。
一旦使用能源向亞群的成員細胞施用，可以通過純化未被施用的細胞(即沒有使用能量施用的精細胞)進一步富集細胞群?？梢酝ㄟ^從分散體移去被施用細胞或未被施用細胞進行未施用細胞的純化，產生含有由特定特征富集的未施用細胞的亞群。例如，如果該特定特征是帶有Y染色體的精細胞，可以純化未施用的細胞從而其含有至少約85％帶有Y染色體的精細胞；優(yōu)選至少約90％帶有Y染色體的精細胞；更優(yōu)選至少約95％帶有Y染色體的精細胞；甚至更優(yōu)選至少約97％帶有Y染色體的精細胞；和最優(yōu)選至少約99％帶有Y染色體的精細胞。備選地，如果該特定的期望特征是帶有X染色體的精細胞，可以純化未施用的細胞從而其含有至少約85％帶有X染色體的精細胞；優(yōu)選至少約90％帶有X染色體的精細胞；更優(yōu)選至少約95％帶有X染色體的精細胞；甚至更優(yōu)選至少約97％帶有X染色體的精細胞；和最優(yōu)選至少約99％帶有X染色體的精細胞。
可以通過本領域技術人員已知的多種方法的任意一種實現(xiàn)從施用的分散體(即從包含施用細胞和未施用細胞的更大的精細胞群)移去施用細胞或未施用細胞。這類方法包括，例如旋轉下整個分散體(例如通過離心)，并接著移去或通過燈芯效應除去含有施用細胞的上清液。另一方法包括向分散體加入高密度的介質?？梢约尤敕稚Ⅲw的高密度介質包括，例如Percoll和Isolate。一般而言，在高密度分離中，活細胞(即本申請的未施用細胞)能夠游動至高密度介質的上層并且可以在其后被從介質上層撇取，而受損細胞或死細胞(即施用細胞)將保持分散在高密度介質內，通常在體相之中。使用這類介質的方法是本領域眾所周知的。
最好標記細胞的分散體可以含有使用不同標記物標記的細胞亞群。每種標記物可以鑒定分散體中精細胞亞群的不同的遺傳、蛋白質組、結構或功能特征。此外，當結合于精細胞時，可以分別地檢測每種標記物，即能夠分別地檢測不同標記物。例如，標記物可以在不同波長各自發(fā)出熒光。
可以向標記混合物或標記細胞的分散體加入不同的標記物。備選地，可以在細胞的檢測、測定或施用步驟的任一步驟之后加入不同的標記物。然而，優(yōu)選在分散體的施用之后加入不同的標記物。例如，一旦已經向精細胞的亞群成員施用，被施用的分散體(包括施用細胞和未施用細胞)或純化的施用分散體(僅包括未施用細胞)可以被再次標記，但是要使用不同的標記物，并且通常如上文公開的，可以基于與精細胞結合的不同標記物的缺少或數(shù)量重復細胞的檢測、測定和施用。
一般而言，可以使用不同標記物鑒定未施用細胞的其它遺傳、蛋白質組、結構或功能特征，所述特征可以不同于先前鑒定向其遞送能量劑量的亞群成員所用的特征(即不同于先前確定是施用或未施用細胞所用的特征)。這提供了進一步富集已富集的細胞群的途徑。
例如，使用熒光DNA選擇性染料可以形成標記細胞的分散體。可以接著光學檢測該分散體以鑒定帶有X染色體的精細胞個體。可以繼之確定帶有X染色體的精細胞的位置，并接著將能量劑量遞送至一個或更多帶有X染色體的細胞，由此獲得富集的帶有Y染色體的活細胞群。其后，可以使用表明頂體完整性的另一標記物標記施用的分散體(包括施用的(帶有X染色體的)和未施用的(帶有Y染色體的)細胞)或純化的被施用分散體(僅包括未施用細胞)，例如藻紅蛋白綴合的花生凝集素(PE-PNA)，當其與具有反應或受損頂體的細胞接觸時，誘導細胞熒光，特別是頂體的熒光?？梢越又M行光學鑒定和確定PE-PNA熒光發(fā)生細胞位置的步驟，并向那些細胞施以能量。產生帶有Y染色體和具有未反應和未損傷(即完整的)頂體的未被施用細胞的亞群。見，例如Nagy等人，Biol Reprod，681828-1835(2003)。
細胞的冷凍延長(cryoextension)一旦使用能源向亞群的成員細胞施用之后，整個精細胞群(被施用的和未被施用的細胞)或該群的子集(僅未被施用的細胞)可以被冷卻或冷凍以備后用(例如在受精操作中)。在這種情況下，加入冷凍延長劑以最小化冷卻或冷凍對存活力或解凍后運動性的影響，對未被施用的精細胞是有益的。
一般而言，冷凍延長劑可包含蛋白質源、冷凍保護劑和運動性抑制劑。若含有蛋白質源，可將其加入以提供細胞支持。蛋白質源可為任何不會干擾未施用精細胞存活力并與運動性抑制劑相容的蛋白質源。常用蛋白質源的實例包括乳(包括熱勻漿和脫脂乳)、乳提取物、卵黃、卵黃提取物、大豆蛋白和大豆蛋白提取物。此類蛋白質的使用濃度可為約10％(v/v)至約30％(v/v)，優(yōu)選約10％(v/v)至約20％(v/v)，更優(yōu)選約20％(v/v)。
冷凍延長劑中優(yōu)選含有冷凍保護劑，以減輕或避免冷凍休克或保持未被施用的精細胞的生育力。本領域已知眾多冷凍保護劑。適于與給定的延長劑共同使用的冷凍保護劑可有多種選擇，取決于待冷凍精子來源的物種。適宜冷凍保護劑的實例包括如，甘油、二甲基亞砜、乙二醇、丙二醇、海藻糖、Triladyl以及它們的組合。若含有冷凍保護劑，則其在冷凍延長劑中的量一般為約1％(v/v)至約15％(v/v)，優(yōu)選其量為約5％(v/v)至約10％(v/v)，更優(yōu)選其量為約7％(v/v)，最優(yōu)選量為約6％(v/v)。
此外，冷凍延長劑可以含有如上文細胞樣品收集中討論過的運動性抑制劑?？梢該湎蚶鋬鲅娱L劑加入運動性抑制劑。
在一個具體實施方案中，冷凍延長劑包含運動性抑制劑、水、Triladyl、卵黃和丙酮酸。而在另一個實施方案中，冷凍延長劑包含0.097mol/LNaHCO3、0.173mol/L KHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O的水溶液和于每75ml水中含有25g Triladyl、25g卵黃和10mM丙酮酸。
在另一具體實施方案中，冷凍延長劑包含運動性抑制劑、水、Triladyl、和卵黃。而在另一具體實施方案中，冷凍延長劑包含0.097mol/L NaHCO3、0.173mol/L KHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O的水溶液和于每75ml水中含有25g Triladyl和25g卵黃。
冷凍延長劑中也可任選地含有如上文細胞樣品收集中討論過的抗生素或調節(jié)細胞內和/或細胞外氧化/還原反應的組合物?？蓳藢⒚糠N添加劑加入冷凍延長劑中。
整個精子群的冷藏(即經施用分散體的冷藏)使形成具有兩個亞群的冷凍分散體，每一亞群實質上彼此不同。然而，每一亞群由基本同質的細胞組成。也就是說，每一亞群由細胞組成，單一亞群的每一個體細胞具有與相同亞群中每一其它細胞共同的特征。在優(yōu)選的實施方案中，通過純化分散體在冷藏之前進一步富集分散體，所述純化是根據上述方法基于存在或缺少共同的特征進行。
因此，例如，可以使用本方法形成冷凍精子分散體，所述分散體包含被施用的細胞亞群(其中施用的亞群的全部細胞是帶有X染色體的細胞)，和未施用的細胞亞群(其中未施用的亞群的全部細胞是帶有Y染色體的細胞)。根據本發(fā)明的實施方案，未接受能量劑量的細胞(即，未經施用的帶有Y染色體的細胞)包含至少約85％的帶有Y染色體的精細胞；優(yōu)選至少約90％帶有Y染色體的精細胞；更優(yōu)選至少約95％帶有Y染色體的精細胞；甚至更優(yōu)選至少約97％帶有Y染色體的精細胞；最優(yōu)選至少約99％帶有Y染色體的精細胞。
備選地，可以使用本發(fā)明的方法形成冷凍精子分散體，所述分散體包含經施用的細胞亞群(其中施用的亞群的全部細胞是帶有Y染色體的細胞)，和未施用的細胞亞群(其中未施用的亞群的全部細胞是帶有X染色體的細胞)。根據本發(fā)明的實施方案，未施用的帶有X染色體的細胞會包含至少約85％的帶有X染色體的精細胞；優(yōu)選至少約90％帶有X染色體的精細胞；更優(yōu)選至少約95％帶有X染色體的精細胞；甚至更優(yōu)選至少約97％帶有X染色體的精細胞；最優(yōu)選至少約99％帶有X染色體的精細胞。
受精本發(fā)明還提供使卵受精或授精雌性哺乳動物的新方法，通常使用該新方法選擇性降低在如上所述的細胞分散體中精細胞亞群的生存力。
一旦向標記細胞的分散體施用，可以將經施用的分散體(包含經施用的和未經施用的細胞)用于使雌性哺乳動物受精?？梢愿鶕绢I域技術人員熟知的多種方法中的任意一種進行受精。這些方法包括，例如，顯微注射、人工授精和其它本領域技術人員熟知的方法。例如，可以將包含施用和未施用細胞的經施用分散體、僅包含未施用細胞的純化的分散體或兩者中任意一種的衍生物用于授精雌性哺乳動物(例如通過人工授精)。
備選地，一旦完成標記細胞分散體的施用，可以使用該分散體使卵受精，更具體而言為體外的卵。然后可通過多種本領域技術人員熟知方法中的任意一種，將受精卵導入雌性哺乳動物的子宮內，例如通過胚胎移植。例如，可以將施用的分散體、純化的分散體或兩者中任意一種的衍生物用于體外卵受精。接著可以將受精卵導入雌性哺乳動物的子宮內。
可以在完成分散體的施用之后不久，例如在約7天之內，優(yōu)選在約5天之內，更優(yōu)選在約3天之內，還更優(yōu)選在約2天之內，和在具體的實施方案中，在完成分散體的施用約1天之內進行雌性哺乳動物受精或卵的體外受精。在這類情況下，通常該分散體在受精雌性哺乳動物或體外受精卵之前可以未經冷凍保藏(即，該分散體是新鮮的或包含新鮮的精細胞)；作為代替它可以已經保持在運動性抑制劑中和/或冷藏于約2℃至約7℃，更優(yōu)選約3℃至約5℃，和最優(yōu)選約4℃的溫度。備選地，可以冷凍保藏分散體并繼之在受精雌性哺乳動物或體外受精卵之前解凍(即，該分散體被冷凍/解凍或包含冷凍/解凍的精細胞)。一般而言，在這類情況下，可以在雌性哺乳動物受精或卵的體外受精之前即刻解凍冷藏的分散體。
上文已經詳細描述了本發(fā)明，顯而易見的是，在不脫離所附權利要求定義的發(fā)明范圍內可對其進行修飾和改變。
權利要求
1.選擇性降低精細胞分散體中精細胞亞群使卵受精的能力的方法，該方法包括在液體中形成經標記的精細胞的分散體，該液體包含誘導精子不運動性的化學劑或具有誘導精子不運動性的溫度，其中與精細胞結合的標記物的存在、缺少或數(shù)量表明分散體中精細胞亞群的遺傳、蛋白質組、結構或功能特征；光學檢測分散體以鑒定個體精細胞為亞群成員；確定分散體中亞群成員的位置；和遞送能量劑量至分散體中不同的位置以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力，而不類似地影響分散體中其它位置的精細胞。
2.使用富集的精細胞群授精雌性哺乳動物的方法，該方法包括在液體中形成經標記的精細胞的分散體，該液體包含誘導精子不運動性的化學劑或具有誘導精子不運動性的溫度，其中與精細胞結合的標記物的存在、缺少或數(shù)量表明分散體中精細胞亞群的遺傳、蛋白質組、結構或功能特征；光學檢測分散體以鑒定個體精細胞為亞群成員；確定分散體中亞群成員的位置；遞送能量劑量至分散體中不同的位置以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力，而不類似地影響分散體中其它位置的精細胞；和其后使用所述分散體或其衍生物授精雌性哺乳動物。
3.體外受精的方法，該方法包括在液體中形成經標記的精細胞的分散體，該液體包含誘導精子不運動性的化學劑或具有誘導精子不運動性的溫度，其中與精細胞結合的標記物的存在、缺少或數(shù)量表明分散體中精細胞亞群的遺傳、蛋白質組、結構或功能特征；光學檢測分散體以鑒定個體精細胞為亞群成員；和確定分散體中亞群成員的位置；遞送能量劑量至分散體中不同的位置以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力，而不類似地影響分散體中其它位置的精細胞；和其后使用所述分散體或其衍生物使卵體外受精。
4.形成冷凍精子分散體的方法，該方法包括在液體中形成經標記的精細胞的分散體，該液體包含誘導精子不運動性的化學劑或具有誘導精子不運動性的溫度，其中與精細胞結合的標記物的存在、缺少或數(shù)量表明分散體中精細胞亞群的遺傳、蛋白質組、結構或功能特征；光學檢測分散體以鑒定個體精細胞為亞群成員；確定分散體中亞群成員的位置；遞送能量劑量至分散體中不同的位置以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力，而不類似地影響分散體中其它位置的精細胞；和之后冷藏分散體。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述液體包含誘導精子不運動性的化學劑。
6.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述液體具有誘導精子不運動性的溫度。
7.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述液體包含誘導精子不運動性的化學劑并且具有誘導精子不運動性的溫度。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中與精細胞結合的標記物的數(shù)量表明精細胞是帶有X染色體的精細胞。
9.權利要求1-7中任一項的方法，其中與精細胞結合的標記物的數(shù)量表明精細胞是帶有Y染色體的精細胞。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中標記物選自熒光染料、DNA選擇性染料、聚酰胺、寡核苷酸以及結合至精細胞表面特異性特征的多肽。
11.權利要求10的方法，其中標記物是DNA選擇性熒光染料。
12.權利要求11的方法，其中標記物是Hoechst 33342、Hoechst 33258或SYBR-14。
13.權利要求1-7中任一項的方法，其中能量劑量選自輻射束、激光束、平行的非激光光、聚焦的非激光光和聚焦的超聲能。
14.權利要求1-7中任一項的方法，其中所述方法還包括純化未接受能量劑量的精細胞，即未被施用的細胞。
15.權利要求14的方法，其中純化未被施用的細胞包括離心分散體并移去被施用的細胞。
16.權利要求14的方法，其中純化未被施用的細胞包括使分散體與高密度介質接觸。
17.權利要求1-12中任一項的方法，其中光學檢測分散體以鑒定個體精細胞為亞群成員包括光學檢測捕獲的細胞圖像。
18.權利要求1-12中任一項的方法，其中在光學檢測分散體之前將分散體分布在多孔板上。
19.權利要求18的方法，其中所述多孔板是96或384孔板。
20.權利要求1-12中任一項的方法，其中與未接受能量劑量的精細胞相比，所述能量劑量足以降低亞群成員的生存力。
21.權利要求1-12中任一項的方法，其中所述能量劑量足以引起亞群成員的死亡。
22.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述方法還包括在遞送能量劑量之后冷藏分散體。
23.權利要求2、3、5、6或7中任一項的方法，其中雌性哺乳動物是牛、馬或豬。
24.權利要求2或從屬于權利要求2時權利要求5-14中任一項的方法，其中雌性哺乳動物的授精在完成細胞的施用之后約7天、5天、3天、2天或1天之內進行。
25.權利要求3或從屬于權利要求3時權利要求5-14中任一項的方法，其中卵的體外受精在完成細胞的施用之后約7天、5天、3天、2天或1天之內進行。
26.權利要求3或從屬于權利要求3時權利要求5-14中任一項的方法，其中該方法還包括將受精卵導入雌性哺乳動物的子宮。
27.權利要求2或從屬于權利要求2時權利要求5-14中任一項的方法，其中所述分散體在授精雌性哺乳動物之前是未冷藏的。
28.權利要求2或從屬于權利要求2時權利要求5-14中任一項的方法，其中所述分散體在授精雌性哺乳動物之前是冷藏的。
29.權利要求3或從屬于權利要求3時權利要求5-14中任一項的方法，其中所述富集的分散體在卵的受精之前是未冷藏的。
30.權利要求3或從屬于權利要求3時權利要求5-14中任一項的方法，其中所述富集的分散體在卵的受精之前是冷藏的。
31.權利要求4、5、6或7中任一項的方法，其中未接受能量劑量的精細胞包含至少85％的帶有X染色體的精細胞。
32.權利要求4、5、6或7中任一項的方法，其中未接受能量劑量的精細胞包含至少85％的帶有Y染色體的精細胞。
33.權利要求4、5、6或7的方法，其中未接受能量劑量的精細胞包含至少90％的帶有X染色體的精細胞。
34.權利要求4、5、6或7的方法，其中未接受能量劑量的精細胞包含至少90％的帶有Y染色體的精細胞。
35.權利要求4、5、6或7的方法，其中未接受能量劑量的精細胞包含至少95％的帶有X染色體的精細胞。
36.權利要求4、5、6或7的方法，其中未接受能量劑量的精細胞包含至少95％的帶有Y染色體的精細胞。
37.權利要求4、5、6或7的方法，其中未接受能量劑量的精細胞包含至少97％的帶有X染色體的精細胞。
38.權利要求4、5、6或7的方法，其中未接受能量劑量的精細胞包含至少97％的帶有Y染色體的精細胞。
39.權利要求4或權利要求31-38中任一項的方法，其中將被施用的分散體在冷凍之前置于吸管中。
40.權利要求1-14和權利要求39中任一項的方法，所述方法還包括使用另外的標記物標記被施用的分散體，其中與精細胞結合的所述另外的標記物的存在、缺少或數(shù)量表明被施用的分散體中精細胞亞群的遺傳、蛋白質組、結構或功能特征；光學檢測被施用的分散體以鑒定個體精細胞為亞群成員；確定被施用的分散體中亞群成員的位置；和遞送能量劑量至分散體中不同的位置以選擇性降低亞群成員使卵受精的能力，而不類似地影響分散體中其它位置的精細胞。
41.權利要求1-14中任一項的方法，其中經標記的精細胞的溫度是約0℃到約15℃。
42.權利要求1-14中任一項的方法，其中經標記的精細胞的溫度是約1℃到約10℃。
43.權利要求1-14中任一項的方法，其中經標記的精細胞的溫度是約2℃到約8℃。
44.權利要求1-14中任一項的方法，其中經標記的精細胞的溫度是約3℃到約6℃。
45.權利要求1-14中任一項的方法，其中經標記的精細胞的溫度是約4℃到約5℃。
46.權利要求1-14中任一項的方法，其中經標記的精細胞的溫度是約5℃。
47.權利要求1-14中任一項的方法，其中經標記的精細胞的溫度是約4℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了不使用物理分選細胞對一種特征選擇性富集活精細胞群的方法。在這樣富集的群體中含有的細胞得益于未經歷分選方法的優(yōu)勢。還公開了利用選擇性富集活精細胞群的方法授精雌性哺乳動物的方法以及形成精子分散體的方法。
文檔編號G01N1/30GK101048496SQ200580030309
公開日2007年10月3日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權日2004年7月22日
發(fā)明者J·A·格雷厄姆 申請人:孟山都技術公司