專利名稱：一種引起呼吸道感染的新型人病毒及其用途的制作方法
本申請(qǐng)是2004年7月21日提交的美國專利申請(qǐng)序號(hào)10/895,064的部分繼續(xù)申請(qǐng)，美國專利申請(qǐng)序號(hào)10/895,064通過引用整體結(jié)合到本文中。
序列表本申請(qǐng)包含一份“超長”序列表，該序列表通過CD-R代替印刷的紙質(zhì)文本提交，其通過引用整體結(jié)合到本文中。所述CD-R于2005年3月21日刻錄，分別標(biāo)記為“CRF”、“Copy 1”和“Copy 2”，每個(gè)只含有一個(gè)相同的2.84MB文件(V0690044.APP)。
1.引言本發(fā)明涉及在人中引起呼吸道感染的新型病毒[“冠狀病毒-HKU1(CoV-HKU1)”]。種系發(fā)生分析已揭示，CoV-HKU1是一種新型的第2組冠狀病毒，其具有至少2個(gè)基因型A和B。本發(fā)明涉及含CoV-HKU1的完整基因組序列的核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含CoV-HKU1的部分基因組序列的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及CoV-HKU1完整基因組的推斷氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由這些序列編碼和/或來源于這些序列的核酸和肽，以及其在診斷方法和治療方法中的用途，例如用作免疫原。本發(fā)明進(jìn)一步包括由所述核苷酸序列編碼的嵌合或重組病毒以及針對(duì)由所述核苷酸序列編碼的多肽的抗體。此外，本發(fā)明涉及含CoV-HKU1重組和嵌合形式的所述病毒以及所述病毒的蛋白提取物和亞單位的疫苗制品。
2.發(fā)明背景因?yàn)樵谙喈?dāng)比例的呼吸道感染患者中還沒有鑒別出微生物學(xué)病因(Macfarlane，J.T.等，1993，Prospective study of aetiology and outcome ofadult lower-respiratory-tract infections in the community，Lancet 341511-514；Ruiz，M.，S.等，1990，Etiology of community-acquired pneumoniaimpact of age，comorbidity，and severity，Am.J.Respir.Crit.Care Med.160397-405)，所以仍在進(jìn)行鑒別可能的新病原體的研究。在近3年鑒別出的3種新病原體中有兩種是冠狀病毒，這3種新病原體包括人間質(zhì)肺病毒(Van den Hoogen等，2001，A newly discovered human pneumovirus isolatedfrom young children with respiratory tract disease，Nat.Med.7719-724)、嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)冠狀病毒(SARS-CoV)(Peiris，J.S.等，2003，Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome，Lancet3611319-1325)和人冠狀病毒NL63(HCoV-NL63)(Fouchier，R.A.等，2004，A previously undescribed coronavirus associated with respiratory disease inhumans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1016212-6216；van der Hoek等，2004，Identification of a new human coronavirus，Nat.Med.10368-373)，其中兩種是冠狀病毒。在所有的RNA病毒中，冠狀病毒具有約30kb的最大基因組。由于病毒復(fù)制的獨(dú)特機(jī)制，冠狀病毒具有高頻率的重組。
基于基因型和血清學(xué)特征，冠狀病毒被分為3個(gè)不同的組，人冠狀病毒229E(HCoV-229E)為第1組冠狀病毒，HCoV-OC43為第2組冠狀病毒(Lai，M.M.等，1997，The molecular biology of coronaviruses，Adv.ViirusRes.481-100)。它們占人呼吸道感染的5-30％。在2002年末和2003年，SARS-CoV引起的傳染病感染了超過8000人，750人死亡(例如Peiris，J.S.等，2003，Clinical progression and viral load in a community outbreak ofcoronavirus-associated SARS pneumoniaa prospective study，Lancet 3611767-1772)。我們還報(bào)告了得自喜馬拉雅果子貍(Himalayan palm civets)的SARS-CoV樣病毒分離株，這提示動(dòng)物可能是SARS-CoV祖先的儲(chǔ)存宿主(Guan，Y.等，2003，Isolation and characterization of viruses related to theSARS coronavirus from animals in southern China，Science 302276-278)。根據(jù)基因組分析，SARS-CoV屬于第4組冠狀病毒，或者屬于第2組冠狀病毒的遠(yuǎn)親(Eickmann，M.等，2003，Phylogeny of the SARS coronavirus，Science 3021504-1505；Marra，M.A.等，2003，The Genome sequence of theSARS-associated coronavirus，Science 3001399-1404；Rota，P.A.等，2003，Characterization of a novel coronavirus associated with severe acuterespiratory syndrome，Science 3001394-1399；Snijder，E.J.等，2003，Uniqueand conserved features of genome and proteome of SARS-coronavirus，anearly split-off from the coronavirus group 2 lineage，J.Mol.Biol.331991-1004；Yeh，S.H.等，2004，Characterization of severe acute respiratorysyndrome coronavirus genomes in Taiwanmolecular epidemiology andgenome evolution，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1012542-2547)。最近，已發(fā)現(xiàn)了一種與呼吸道感染相關(guān)的新型第1組人冠狀病毒HCoV-NL63，其基因組已測(cè)序(37)。
在2004年1月，一名71歲的中國男子由于發(fā)燒和寒戰(zhàn)達(dá)兩天并伴有咽喉痛、流涕、帶有膿性痰的痰咳、頭痛和惡心而入院。他在40多年前具有肺結(jié)核史，并發(fā)有右上葉結(jié)疤和支氣管擴(kuò)張以及慢性氣管銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)定殖。他是一名長期吸煙者，還具有慢性阻塞性氣管疾病、高脂血和無癥狀腹主動(dòng)脈瘤。他在入院前3天剛剛由中國深圳返回。在他的3天深圳之旅中，他沒有接觸或食用野生動(dòng)物史。在入院時(shí)，他的口腔溫度為37.6℃。身體檢查表明，氣管向右偏位，在前左下區(qū)有吸氣性爆裂音。他的血紅蛋白水平為14.7g/dL，總白細(xì)胞計(jì)數(shù)為12.1×109/L，嗜中性粒細(xì)胞為9.7×109/L，淋巴細(xì)胞為1.6×109/L，單核細(xì)胞為0.5×109/L，平板計(jì)數(shù)為303×109/L。他的肝功能和腎功能測(cè)試在正常限度內(nèi)。胸片顯示右上葉萎縮，在左下區(qū)有新斑狀浸潤。進(jìn)行血液培養(yǎng)。憑經(jīng)驗(yàn)開始口服羥氨芐青霉素/克拉維酸和阿奇霉素。鼻咽抽吸物的呼吸道病毒直接抗原檢測(cè)、A型流感病毒、人間質(zhì)肺病毒和SARS-CoV的RT-PCR以及病毒培養(yǎng)是陰性的。痰的細(xì)菌培養(yǎng)僅回收了銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)。痰的分枝桿菌培養(yǎng)為陰性。血液培養(yǎng)為陰性。成對(duì)血清的抗支原體(Mycoplasma)、衣原體(Chlamydia)、軍團(tuán)菌(Legionella)和SARS-CoV的抗體檢測(cè)未顯示任何抗體滴度增加。他在入院后2天發(fā)燒減退。他的咳嗽有好轉(zhuǎn)，在住院5天后他出院。羥氨芐青霉素/克拉維酸和阿奇霉素持續(xù)共7天。本發(fā)明的發(fā)明人為參與研究該患者的研究小組。用于鑒別一般公知的病毒和細(xì)菌的所有測(cè)試在這些患者中都是陰性的。直至本發(fā)明的發(fā)明人在本文公開了該患者的CoV-HKU1完整基因組，才知道引起該疾病的病原因子。本文公開的進(jìn)一步研究揭示，CoV-HKU1是人冠狀病毒，在CoV-HKU1中至少具有2種基因型A和B。本發(fā)明對(duì)臨床和科學(xué)研究這兩種用途均有用。
3.發(fā)明概述本發(fā)明基于本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)在人中引起肺炎的新型病毒(“CoV-HKU1”)的完整基因組測(cè)序。該病毒首先由在香港肺炎患者中發(fā)現(xiàn)。該病毒是正極性單鏈RNA病毒，屬于套式病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)。基于在12個(gè)月周期當(dāng)中對(duì)由社區(qū)獲得性肺炎患者前瞻性收集的鼻咽抽吸物(NPA)的進(jìn)一步研究揭示，CoV-HKU1具有至少2種基因型。因此，本發(fā)明涉及在種系發(fā)生上與冠狀病毒科已知成員相關(guān)并具體地說屬于第2組冠狀病毒的CoV-HKU1。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供2種基因型的CoV-HKU1的完整基因組序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒包括SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離自病毒的核酸。優(yōu)選病毒在其基因組中包含SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含或由SEQ ID NO1、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932或2934的核苷酸序列或其互補(bǔ)物或其部分組成，所述部分優(yōu)選為SEQ IDNO1、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932或2934的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,550、1,600、1,650、1,700、1,750、1,800、1,850、1,900、1,950、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含或由SEQ ID NO3或2919的核苷酸序列或其互補(bǔ)物或其部分組成，所述部分優(yōu)選為SEQ ID NO3或2919的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含或由SEQ ID NO2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948或2950的核苷酸序列或其互補(bǔ)物或其部分組成，所述部分優(yōu)選為SEQ ID NO2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948或2950的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,550、1,600、1,650、1,700、1,750、1,800、1,850、1,900、1,950、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含或由SEQ ID NO2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物或其部分組成，所述部分優(yōu)選為SEQ ID NO2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。此外，在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其在本文定義的嚴(yán)格雜交條件下與具有SEQID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的序列的核酸分子或其互補(bǔ)物雜交。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這種核酸分子編碼的氨基酸序列具有由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列編碼的多肽所表現(xiàn)出的生物活性。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，所述核酸分子包含或由SEQ ID NO1、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932或2934的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,550、1,600、1,650、1,700、1,750、1,800、1,850、1,900、1,950、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700或更多個(gè)連續(xù)核苷酸組成。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，所述核酸分子包含或由SEQ ID NO2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948或2950的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,550、1,600、1,650、1,700、1,750、1,800、1,850、1,900、1,950、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸組成。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，所述核酸分子包含或由SEQ ID NO2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300或更多個(gè)連續(xù)核苷酸組成。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，所述核酸分子包含或由SEQ ID NO3或2919的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸組成。多肽或蛋白包括具有圖2和3中所示SEQ ID NO2、34-2918以及圖9中所示SEQ ID NO2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和2970-4236的氨基酸序列的多肽或蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步提供分離自CoV-HKU1的蛋白或多肽，包括分離自用該病毒感染的細(xì)胞但在相應(yīng)的未感染細(xì)胞中不存在的病毒蛋白。本發(fā)明的多肽或蛋白優(yōu)選具有由以下核苷酸序列編碼的蛋白的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)SEQ ID NO1、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932或2934的核苷酸序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,550、1,600、1,650、1,700、1,750、1,800、1,850、1,900、1,950、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或蛋白具有由以下核苷酸序列編碼的蛋白的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)SEQ ID NO2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948或2950的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,550、1,600、1,650、1,700、1,750、1,800、1,850、1,900、1,950、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或蛋白具有由以下核苷酸序列編碼的蛋白的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)SEQ ID NO2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽或蛋白具有由以下核苷酸序列編碼的蛋白的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)SEQ ID NO3或2919的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及CoV-HKU1對(duì)于診斷方法用途。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在生物樣品中檢測(cè)免疫特異性結(jié)合CoV-HKU1或其任何蛋白或多肽的抗體的方法。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在生物樣品中檢測(cè)免疫特異性結(jié)合CoV-HKU1感染細(xì)胞的抗體的方法。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選免疫特異性結(jié)合并中和CoV-HKU1的抗體的方法。這種抗體可用于CoV-HKU1感染對(duì)象的被動(dòng)免疫或免疫治療。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及分離病毒的序列信息對(duì)于診斷方法的用途。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供適用作引物的核酸分子，其包含或由SEQID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物或其核苷酸序列的至少一部分組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供適于與CoV-HKU1核酸雜交的核酸分子，其包括但不限于作為PCR引物、逆轉(zhuǎn)錄酶引物、DNA或RNA分析或用于檢測(cè)CoV-HKU1核酸的其它核酸雜交分析的探針，其例如包含或由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966或其互補(bǔ)物或其部分組成。
本發(fā)明進(jìn)一步提供特異性結(jié)合本發(fā)明多肽和/或具有一種或多種本發(fā)明多肽生物活性的任何CoV-HKU1表位的抗體，本發(fā)明多肽由SEQ IDNO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其片段編碼，包括具有圖2和3中所示SEQ ID NO2或SEQ ID NO34-2918中任一個(gè)的氨基酸序列以及圖9中所示SEQ ID NO2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和2970-4236的氨基酸序列的多肽，或由包含以下核苷酸序列的核酸編碼該核苷酸序列在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列雜交。本發(fā)明進(jìn)一步提供特異性結(jié)合CoV-HKU1感染細(xì)胞或組織的抗體。這種抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫鍵連接的Fv、胞內(nèi)抗體以及含特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的VL或VH結(jié)構(gòu)域乃至互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在生物材料中檢測(cè)本發(fā)明的CoV-HKU1的存在情況、活性或表達(dá)的方法，所述生物材料例如為細(xì)胞、血液、唾液、尿等。樣品中CoV-HKU1的活性或表達(dá)相對(duì)對(duì)照樣品的升高或降低可通過使生物材料接觸可直接或間接檢測(cè)CoV-HKU1的存在情況、活性或表達(dá)的試劑而測(cè)定。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑是本發(fā)明的抗體或核酸。本發(fā)明的抗體還可用于檢測(cè)和/或治療其它冠狀病毒，例如嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(“SARS”)病毒。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供疫苗制品，其包含所述病毒的CoV-HKU1重組和嵌合形式，或該病毒的蛋白亞單位。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備重組和嵌合形式的CoV-HKU1的方法。在另一個(gè)具體的發(fā)明中，本發(fā)明的疫苗制品包含CoV-HKU1的核酸或片段，或具有SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的序列的核酸分子或其片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供疫苗制品，其包含由CoV-HKU1分離或由其核酸生產(chǎn)的一種或多種多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗制品包含由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其片段編碼的本發(fā)明多肽，其包括具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO34-2918、2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和2970-4236中任一個(gè)的氨基酸序列的多肽。此外，本發(fā)明通過單獨(dú)地或與各種抗病毒劑以及佐劑和/或其它藥物可接受的賦形劑組合，將本發(fā)明的抗病毒劑給予有需要的對(duì)象，提供治療、改善、管理或預(yù)防由CoV-HKU1引起的呼吸道感染的方法。
在另一方面，本發(fā)明通過將本發(fā)明的抗病毒劑單獨(dú)地或與其它抗病毒劑組合給予宿主細(xì)胞，提供在生理?xiàng)l件下預(yù)防或抑制CoV-HKU1或含核酸分子的病毒結(jié)合宿主細(xì)胞或感染宿主細(xì)胞或在宿主細(xì)胞中復(fù)制的方法，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗病毒劑包括本發(fā)明的免疫原性制品或免疫特異性結(jié)合CoV-HKU1或任何CoV-HKU1表位和/或中和CoV-HKU1的抗體。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗病毒劑是本發(fā)明的多肽或蛋白或本發(fā)明的核酸分子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人、靈長類動(dòng)物、牛、馬、綿羊、豬、禽(例如小雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、小鼠和大鼠細(xì)胞。優(yōu)選宿主細(xì)胞為靈長類動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選為人細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供含本發(fā)明的抗病毒劑和藥物可接受載體的藥物組合物。本發(fā)明還提供含本發(fā)明的藥物組合物的試劑盒。
3.1定義本文使用的術(shù)語“免疫特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體或抗體片段”指抗體或其片段免疫特異性結(jié)合SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其片段編碼的多肽，并且不非特異性結(jié)合其它多肽。免疫特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體或其片段可與其它抗原交叉反應(yīng)。優(yōu)選免疫特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體或其片段不與其它抗原交叉反應(yīng)。免疫特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體或其片段可通過例如免疫測(cè)定或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)鑒別。
“分離的”或“純化的”肽或蛋白基本不含來自所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞來源或組織來源的細(xì)胞材料或其它污染蛋白質(zhì)，或當(dāng)它們通過化學(xué)法合成時(shí)，基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。措詞“基本不含細(xì)胞材料”包括多肽/蛋白質(zhì)制品，其中多肽/蛋白質(zhì)與分離或重組生產(chǎn)其的細(xì)胞的細(xì)胞成分分離。因此，基本不含細(xì)胞材料的多肽/蛋白質(zhì)包括含少于約30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(干重)污染蛋白質(zhì)的多肽/蛋白質(zhì)制品。當(dāng)多肽/蛋白質(zhì)為重組生產(chǎn)時(shí)，還優(yōu)選基本不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基占蛋白質(zhì)制品的體積少于約20％、10％或5％。當(dāng)多肽/蛋白質(zhì)通過化學(xué)合成生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)選基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)，即與涉及蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)分離。因此，這種多肽/蛋白質(zhì)制品含少于約30％、20％、10％、5％(干重)的不屬于目標(biāo)多肽/蛋白質(zhì)片段的化學(xué)前體或化合物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽/蛋白質(zhì)是分離的或純化的。
“分離的”核酸分子是與其天然來源中存在的其它核酸分子分離的核酸分子。此外，“分離的”核酸分子，例如cDNA分子，當(dāng)通過重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí)可基本不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，當(dāng)通過化學(xué)法合成時(shí)可基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明多肽/蛋白質(zhì)的核酸分子是分離的或純化的。術(shù)語“分離的”核酸分子不包括為文庫成員、還未純化至與含有其它核酸分子的其它文庫克隆分離的核酸。
本文使用的術(shù)語“部分”或“片段”指含有相關(guān)核酸分子長度的至少約10、15、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多個(gè)連續(xù)核酸，且具有相關(guān)核酸分子的至少一種功能特征(或其編碼的蛋白質(zhì)具有相關(guān)核酸分子所編碼的蛋白質(zhì)的一種功能特征)的核酸分子片段；或指含有相關(guān)蛋白質(zhì)或多肽長度的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,100、4,200、4,300、4,350、4,360、4,370、4,380或更多個(gè)氨基酸殘基，且具有相關(guān)蛋白質(zhì)或多肽的至少一種功能特征的蛋白質(zhì)或多肽片段。
術(shù)語“具有蛋白的生物活性”或“具有本發(fā)明多肽的生物活性”指與以下多肽相比具有共同的生物活性、類似或相同的結(jié)構(gòu)域和/或具有足夠的氨基酸同一性的多肽或蛋白質(zhì)的特性SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列編碼的多肽；或具有SEQ ID NO2、34-2918、2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和2970-4236的任一個(gè)氨基酸序列的多肽或其互補(bǔ)物。本發(fā)明多肽的這種共同生物活性包括抗原性和免疫原性。
術(shù)語“在嚴(yán)格條件下”指相互之間具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列保持互相雜交的雜交和洗滌條件。這種雜交條件例如但不限于在Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.；BasicMethods in Molecular Biology，Elsevier Science Publishing Co.，Inc.，N.Y.(1986)，75-78頁和84-87頁；以及Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.(1982)，387-389頁中描述，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選非限制性實(shí)例是在約68℃下6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5％SDS中雜交，然后在室溫下2X SSC、0.5％SDS中洗滌一次或多次(例如每次約5-30分鐘)。嚴(yán)格雜交條件的另一個(gè)優(yōu)選非限制性實(shí)例是在約45℃下6X SSC中雜交，然后在約45-65℃下0.2XSSC、0.1％SDS中洗滌一次或多次(例如每次約5-30分鐘)。
本文使用的術(shù)語“變體”指CoV-HKU1的天然遺傳變體或重組制備的CoV-HKU1變體，和CoV-HKU1相比，它們各自在其基因組中含有一種或多種突變。術(shù)語“變體”還可指特定多肽的天然變體或重組制備的特定多肽或蛋白變體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基通過氨基酸置換、插入或缺失被修飾。
4.附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示由CoV-HKU1獲得的部分DNA序列(SEQ ID NO1)及其推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，所述CoV-HKU1與已知冠狀病毒(Coronavirus)的RNA依賴性RNA聚合酶蛋白具有91％的氨基酸同一性。
圖2顯示CoV-HKU1的完整基因組DNA序列(SEQ ID NO3)及以3種讀框由其獲得的推斷氨基酸序列。星號(hào)(*)表示標(biāo)記肽末端的終止密碼子。第一讀框翻譯和氨基酸序列SEQ ID NO34-456；第二讀框翻譯和氨基酸序列SEQ ID NO457-723；第三讀框翻譯和氨基酸序列SEQ IDNO724-1318。
圖3顯示3′→5′方向的CoV-HKU1完整基因組DNA序列(SEQ IDNO3)的互補(bǔ)物(SEQ ID NO1319)，及以3種讀框由其獲得的推斷氨基酸序列。星號(hào)(*)表示標(biāo)記肽末端的終止密碼子。第一讀框翻譯和氨基酸序列SEQ ID NO1319-1907；第二讀框翻譯和氨基酸序列SEQ ID NO1908-2453；第三讀框翻譯和氨基酸序列SEQ ID NO2454-2918。
圖4顯示CoV-HKU1的基因組結(jié)構(gòu)。29926個(gè)核苷酸的CoV-HKU1基因組RNA的整體結(jié)構(gòu)。標(biāo)出了編碼非結(jié)構(gòu)性多聚蛋白(p28、p65和nsp1-13)的預(yù)計(jì)ORF 1a和1b以及編碼血凝素酯酶、刺突、包膜、膜和核殼結(jié)構(gòu)蛋白的ORF。箭頭表示ORF 1a和ORF 1b編碼的復(fù)制酶多聚蛋白的推定切割位點(diǎn)(和對(duì)應(yīng)的核苷酸位置)。ATR、PL1pro和PL2pro分別代表nsp1中的酸性串聯(lián)重復(fù)序列和兩個(gè)木瓜蛋白酶樣蛋白酶。
圖5A顯示胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CLpro)、RNA依賴性RNA聚合酶(Pol)、解螺旋酶和血凝素酯酶(HE)的種系發(fā)生分析；圖5B顯示CoV-HKU1的刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核殼蛋白(N)的種系發(fā)生分析。通過使用Jukes-Cantor修正的相鄰相接法構(gòu)建種系發(fā)生樹，并由1000棵樹計(jì)算自展值。分析中分別包括3CLpro、Pol、解螺旋酶、HE、S、E、M和N中總共303、928、595、418、1356、75、225和406個(gè)氨基酸位置。標(biāo)注條表示每10個(gè)氨基酸的估計(jì)置換數(shù)。HCoV-229E人冠狀病毒229E；PEDV豬流行性腹瀉病毒；PTGV豬傳染性胃腸炎病毒；CCoV貓腸冠狀病毒；HCoV-NL63人冠狀病毒NL63；HCoV-OC43人冠狀病毒OC43；MHV鼠肝炎病毒；BCoV牛冠狀病毒；SDAV大鼠涎淚腺炎冠狀病毒；ECoV馬冠狀病毒NC99；PHEV豬凝血性腦脊髓炎病毒；IBV感染性支氣管炎病毒；SARS-CoVSARS冠狀病毒。
圖6顯示CoV-HKU1的刺突蛋白(SEQ ID NO420的殘基7-336)和其它第2組冠狀病毒的刺突蛋白(按照顯示順序分別為SEQ ID NO 21-26)。CoV-HKU1的刺突蛋白(1356個(gè)氨基酸)以水平欄表示[SS＝N末端信號(hào)序列(氨基酸殘基1-13)，HR1＝7氨基酸重復(fù)序列1(氨基酸殘基982-1083)，HR2＝7氨基酸重復(fù)序列2(氨基酸殘基1250-1297)，TM＝跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基1301-1323)]，(水平欄以下的7個(gè)序列按照顯示順序分別公開了SEQ ID NO420和SEQ ID NO 28-33的殘基752-766)。用ClustalX 1.83產(chǎn)生CoV-HKU1和其它第2組冠狀病毒的對(duì)受體結(jié)合重要的N-末端區(qū)(氨基酸殘基1-330)和S1與S2之間的切割位點(diǎn)上游區(qū)域的比對(duì)。與CoV-HKU1完全匹配的殘基加框。MHV中用于受體結(jié)合的3個(gè)保守區(qū)(位點(diǎn)I、II和III)加底紋。用箭頭表示MHV中對(duì)受體結(jié)合重要的4個(gè)保守氨基酸位置。(GenBank登錄號(hào)MHVP11224；BCoVNP 150077；HCoV-OC43NP 937950；SDAVAAF97738；PHEVAAL80031；ECoVAAQ67205)。
圖7顯示對(duì)鼻咽抽吸物中的CoV-HKU1的連續(xù)定量RT-PCR(實(shí)心方塊；拷貝/ml)；以及抗CoV-HKU1N蛋白的血清IgG抗體滴度(實(shí)心三角)。
圖8顯示純化的重組CoV-HKU1N蛋白抗原的蛋白質(zhì)印跡分析。使用在生病第2周和第4周當(dāng)中獲得的患者血清，通過蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)出約53kDa的主免疫反應(yīng)性蛋白條帶(即純化的重組CoV-HKU1N蛋白)(泳道2和3)。用分別由生病第1周的患者(泳道1)和兩個(gè)健康供血者(泳道4和5)獲得的血清樣品僅觀測(cè)到非常微弱的條帶。
圖9顯示CoV-HKU1的完整基因組DNA序列(SEQ ID NO2919)及以3種讀框由其獲得的其推斷氨基酸序列。星號(hào)(*)表示標(biāo)記肽末端的終止密碼子。第一讀框翻譯和氨基酸序列SEQ ID NO2970-3474；第二讀框翻譯和氨基酸序列SEQ ID NO3475-3721；第三讀框翻譯和氨基酸序列SEQ ID NO3722-4236。
圖10顯示CoV-HKU1中的復(fù)制酶多聚蛋白與HCoV-OC43、BcoV和MHV中復(fù)制酶多聚蛋白的比對(duì)。用ClustalX 1.83產(chǎn)生HCoV-OC43(SEQ ID NO4239)、BCoV(SEQ ID NO4238)和MHV(SEQ ID NO4237)的AC結(jié)構(gòu)域與兩名患者中的CoV-HKU1(SEQ ID NO 4240和4241)的AC結(jié)構(gòu)域和ATR(標(biāo)以下劃線)的比對(duì)。AC結(jié)構(gòu)域＝酸性結(jié)構(gòu)域，ATR＝酸性串聯(lián)重復(fù)序列。(GenBank登錄號(hào)MHVNC_001846；BcoVNC_003045；HCoV-OC43AY585229)。
圖11顯示患者1(SEQ ID NO2920，其編碼SEQ ID NO2921)、2(SEQ ID NO2922，其編碼SEQ ID NO2923)、4(SEQ ID NO2924，其編碼SEQ ID NO2925)、5(SEQ ID NO4242，其編碼SEQ ID NO4243)、6(SEQ ID NO2926，其編碼SEQ ID NO2927)、7(SEQ ID NO2928，其編碼SEQ ID NO2929)、8(SEQ ID NO2930，其編碼SEQ ID NO2931)、9(SEQ ID NO2932，其編碼SEQ ID NO2933)和10(SEQ ID NO2934，其編碼SEQ ID NO2935)的CoV-HKU1復(fù)制酶基因的多重比對(duì)。
圖12顯示死于和CoV-HKU1相關(guān)的社區(qū)獲得性肺炎的兩名患者的胸片。第一名患者的胸片(圖12A；表5中的第2號(hào)患者)在兩個(gè)肺中都顯示出斑片狀氣腔陰影，主要波及下區(qū)。具有原位Luque器械的第2名患者的胸片(圖12B；表5中的第10號(hào)患者)在兩個(gè)肺中都顯示出廣泛的氣腔陰影，中區(qū)波及更嚴(yán)重。
圖13顯示患者1(SEQ ID NO2936，其編碼SEQ ID NO2937)、2(SEQ ID NO2938，其編碼SEQ ID NO2939)、4(SEQ ID NO2940，其編碼SEQ ID NO2941)、5(SEQ ID NO4244，其編碼SEQ ID NO4245)、6(SEQ ID NO2942，其編碼SEQ ID NO2943)、7(SEQ ID NO2944，其編碼SEQ ID NO2945)、8(SEQ ID NO2946，其編碼SEQ ID NO2947)、9(SEQ ID NO2948，其編碼SEQ ID NO2949)和10(SEQ ID NO2950，其編碼SEQ ID NO2951)的CoV-HKU1刺突蛋白基因的多重比對(duì)。
圖14顯示患者1(SEQ ID NO2952，其編碼SEQ ID NO2953)、2(SEQ ID NO2954，其編碼SEQ ID NO2955)、4(SEQ ID NO2956，其編碼SEQ ID NO2957)、5(SEQ ID NO4246，其編碼SEQ ID NO4247)、6(SEQ ID NO2958，其編碼SEQ ID NO2959)、7(SEQ ID NO2960，其編碼SEQ ID NO2961)、8(SEQ ID NO2962，其編碼SEQ ID NO2963)、9(SEQ ID NO2964，其編碼SEQ ID NO2965)和10(SEQ ID NO2966，其編碼SEQ ID NO2967)的CoV-HKU1核殼蛋白基因的多重比對(duì)。
圖15顯示9名社區(qū)獲得性肺炎患者的HCoV-HKU1的完整pol、S和N基因序列的種系發(fā)生樹和非同義突變以及對(duì)應(yīng)的氨基酸變化。由通過相鄰相接法獲得的pol(圖15A)、S(圖15B)和N(圖15C)基因數(shù)據(jù)推斷樹，并由1000棵樹計(jì)算自展值。分別使用HCoV-OC43的pol、S和N基因序列作為樹根。分析中包括各個(gè)pol基因中的2784個(gè)核苷酸位置、各個(gè)S基因中的4071個(gè)核苷酸位置以及各個(gè)N基因中的1326個(gè)核苷酸位置。標(biāo)注條分別表示使用Jukes-Cantor修正估計(jì)的每100個(gè)堿基(圖15A)和50個(gè)堿基(圖15B和15C)的置換數(shù)。底紋核苷酸是在對(duì)應(yīng)位置與大多數(shù)不同的核苷酸。由于在S基因中有大量非同義突變，所以僅顯示了總共306個(gè)非同義突變中的NH2末端的45個(gè)。
圖16顯示9株HCoV-HKU1中pol基因的核苷酸1806-1835和2229-2258與HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63和SARS-CoV中這些核苷酸的多重比對(duì)。在RT-PCR的兩種引物(LPW1926；SEQ ID NO4248和LPW1927；SEQ ID NO4249)的3′末端與HCoV-OC43(SEQ ID NO4250和4251)、HCoV-229E(SEQ ID NO 4254和4255)、HCoV-NL63(SEQID NO 4256和4257)和SARS-CoV(SEQ ID NO 4252和4253)中的對(duì)應(yīng)堿基之間觀測(cè)到顯著差異，表明兩種引物對(duì)HCoV-HKU1是高度特異性的。LPW1926(SEQ ID NO4248)和LPW1927(SEQ ID NO4249)中的位置加框。在HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63和SARS-CoV中與引物序列中的堿基不同的堿基加底紋。
圖17顯示來自社區(qū)獲得性肺炎患者的10株HCoV-HKU1的pol基因序列的種系發(fā)生樹。由通過相鄰相接法獲得的pol基因數(shù)據(jù)推斷樹，并由1000棵樹計(jì)算自展值。使用HCoV-229E的pol基因序列作為樹根，分析中包括各個(gè)pol基因中的393個(gè)核苷酸位置(引物序列排除在外)。標(biāo)注條表示使用Jukes-Cantor修正估計(jì)的每50個(gè)堿基的置換數(shù)。HCoV-HKU1人冠狀病毒HKU1；HCoV-229E人冠狀病毒229E；HCoV-OC43人冠狀病毒OC43；MHV鼠肝炎病毒；BcoV牛冠狀病毒；PHEV豬凝血性腦脊髓炎病毒。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在種系發(fā)生上與已知冠狀病毒相關(guān)的CoV-HKU1。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，CoV-HKU1包含SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的CoV-HKU1核酸分子，其包含或由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物或其部分組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其在本文定義的嚴(yán)格雜交條件下與具有SEQID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的序列或冠狀病毒科(Coronaviridae)已知成員的特定基因或其互補(bǔ)物雜交。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，所述核酸分子包含為SEQID NO1、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932或2934的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,550、1,600、1,650、1,700、1,750、1,800、1,850、1,900、1,950、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，所述核酸分子包含或由為SEQ ID NO2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948或2950的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,550、1,600、1,650、1,700、1,750、1,800、1,850、1,900、1,950、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，所述核酸分子包含或由為SEQ ID NO2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成。在再另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由核酸分子編碼的分離的多肽或蛋白，所述核酸分子包含或由SEQ ID NO3或2919的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成。本發(fā)明的多肽或蛋白優(yōu)選具有以下蛋白的一種或多種生物活性由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的序列編碼的蛋白，或包含由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的序列或其部分編碼的氨基酸序列的天然病毒蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及分離病毒的序列信息對(duì)診斷和治療方法的用途。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供CoV-HKU1的完整核苷酸序列(SEQID NO3或2919)或其片段或互補(bǔ)物。此外，本發(fā)明涉及在嚴(yán)格條件下與CoV-HKU1(SEQ ID NO3或2919)基因組的任何部分雜交的核酸分子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供適用作引物的核酸分子，其包含或由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物或其部分組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供適用作檢測(cè)本發(fā)明多肽編碼核酸的雜交探針的核酸分子，其包含或由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物或其部分組成。本發(fā)明進(jìn)一步包括由所述核苷酸序列編碼的嵌合或重組病毒或病毒蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步提供抗體，其特異性結(jié)合由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其片段編碼的本發(fā)明多肽，或任何CoV-HKU1表位，以及具有圖2和3中所示SEQ ID NO2、SEQ ID NO34-2918、圖9中所示SEQ ID NO2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和2970-4236中任一個(gè)的氨基酸序列的多肽。這種抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫鍵連接的Fv、胞內(nèi)抗體以及含特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的VL或VH結(jié)構(gòu)域乃至互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在生物材料中檢測(cè)本發(fā)明的CoV-HKU1的存在情況、活性或表達(dá)的方法，所述生物材料例如為細(xì)胞、血液、唾液、尿、痰、鼻咽抽吸物等。樣品中CoV-HKU1的存在情況可通過使生物材料接觸可直接或間接檢測(cè)CoV-HKU1的存在情況、活性或表達(dá)的試劑而測(cè)定。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑是本發(fā)明的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑是本發(fā)明的核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供疫苗制品，其包含所述病毒的CoV-HKU1重組和嵌合形式，或該病毒的亞單位。
本發(fā)明進(jìn)一步提供制備重組和嵌合形式的CoV-HKU1的方法。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗制品包含一種或多種核酸分子，其包含或由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的序列或其片段組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供疫苗制品，其包含由核苷酸序列編碼的一種或多種本發(fā)明多肽，所述核苷酸序列包含或由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其片段組成，所述本發(fā)明多肽包括具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO34-2918、2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和/或2970-4236的氨基酸序列的多肽。此外，本發(fā)明通過將本發(fā)明的抗病毒劑單獨(dú)或與其它抗病毒劑[例如金剛烷胺、金剛乙胺、更昔洛韋(gancyclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)、利巴韋林(ribavirin)、噴昔洛韋(penciclovir)、奧塞米韋(oseltamivir)、膦甲酸(foscarnet)、齊多夫定(zidovudine)(AZT)、去羥肌苷(didanosine)(ddI)、拉米夫定(lamivudine)(3TC)、扎西他濱(zalcitabine)(ddC)、司他夫定(stavudine)(d4T)、奈韋拉平(nevirapine)、地拉韋定(delavirdine)、茚地那韋(indinavir)、利托那韋(ritonavir)、阿糖腺苷(vidarabine)、奈非那韋(nelfinavir)、沙奎那韋(saquinavir)、樂瑞沙(relenza)、達(dá)菲(tamiflu)、普來可那立(pleconaril)、干擾素等]、類固醇和皮質(zhì)類固醇(如潑尼松、可的松、氟替卡松)和糖皮質(zhì)激素、抗生素、止痛劑、支氣管擴(kuò)張藥或其它用于呼吸道和/或病毒感染的治療藥物聯(lián)合給予有需要的對(duì)象，提供治療、改善、控制或預(yù)防呼吸道感染的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明的抗病毒劑預(yù)防或抑制病毒或病毒蛋白在生理?xiàng)l件下與宿主細(xì)胞的結(jié)合，由此預(yù)防或抑制病毒感染宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明的抗病毒劑通過與病毒核酸分子或其轉(zhuǎn)錄機(jī)制相互作用，預(yù)防或抑制病毒核酸分子在生理?xiàng)l件下于宿主細(xì)胞中復(fù)制。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗病毒劑包括本發(fā)明的疫苗或免疫原性制品，或免疫特異性結(jié)合CoV-HKU1或任何CoV-HKU1表位并可中和CoV-HKU1的抗體。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗病毒劑是本發(fā)明的多肽或蛋白或本發(fā)明的核酸分子。另外，本發(fā)明通過給予宿主細(xì)胞本發(fā)明的抗病毒劑，提供預(yù)防或抑制核酸分子在宿主細(xì)胞中復(fù)制或抑制多肽活性的方法，所述核酸分子具有SEQID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列，所述多肽由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其互補(bǔ)物或其部分編碼，包括具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO34-2918、2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和/或2970-4236的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人、靈長類動(dòng)物、馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、貓、禽類物種和嚙齒動(dòng)物的細(xì)胞。優(yōu)選細(xì)胞為靈長類動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選為人細(xì)胞。
此外，本發(fā)明提供含本發(fā)明的抗病毒劑和藥物可接受載體的藥物組合物。本發(fā)明還提供含本發(fā)明的藥物組合物的試劑盒。
5.1重組和嵌合CoV-HKU1本發(fā)明包括由來源于CoV-HKU1或其天然變體基因組的病毒載體編碼的重組或嵌合病毒。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，重組病毒是來源于CoV-HKU1的重組病毒。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，病毒具有SEQ ID NO3或2919的核苷酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，重組病毒是來源于CoV-HKU1天然變體的重組病毒。CoV-HKU1天然變體具有與CoV-HKU1基因組序列(SEQ ID NO3或2919)不同的序列，這是由于基因組序列的一個(gè)或多個(gè)自發(fā)突變，包括但不限于點(diǎn)突變、重排、插入、缺失等，所述突變會(huì)或不會(huì)導(dǎo)致表型改變。按照本發(fā)明，來源于CoV-HKU基因組的病毒載體含有編碼至少CoV-HKU1的一個(gè)ORF的一部分的核酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該ORF包含或由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其片段組成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在SEQID NO3或2919的核苷酸序列或其片段中有一個(gè)以上的ORF。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由該ORF編碼的多肽包含或由圖2和8中所示SEQ ID NO34-2918或SEQ ID NO2、SEQ ID NO34-2918、2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和/或2970-4236的氨基酸序列或其片段組成。按照本發(fā)明，這些病毒載體可包含或不包含對(duì)病毒基因組非天然的核酸。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合病毒是重組CoV-HKU1，其進(jìn)一步包含異源核苷酸序列。按照本發(fā)明，嵌合病毒可由核苷酸序列編碼，其中已向基因組添加了異源核苷酸序列，或者其中內(nèi)源或天然核苷酸序列已被異源核苷酸序列置換。
按照本發(fā)明，嵌合病毒由進(jìn)一步包含異源核苷酸序列的本發(fā)明病毒載體編碼。按照本發(fā)明，嵌合病毒由可包含或不包含對(duì)病毒基因組非天然的核酸的病毒載體編碼。按照本發(fā)明，嵌合病毒由病毒載體編碼，其中已添加、插入異源核苷酸序列或已置換天然或非天然序列。按照本發(fā)明，嵌合病毒可由來源于CoV-HKU1的不同毒株或變體的核苷酸序列編碼。具體地說，嵌合病毒由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列編碼來源于CoV-HKU1的不同毒株或變體的抗原性多肽。
嵌合病毒對(duì)于生產(chǎn)抗兩種或多種病毒的重組疫苗特別有用(Tao等，J.Virol.72，2955-2961；Durbin等，2000，J.Virol.74，6821-6831；Skiadopoulos等，1998，J.Virol.72，1762-1768(1998)；Teng等，2000，J.Virol.74，9317-9321)。例如，可以設(shè)想，來源于CoV-HKU1、表達(dá)CoV-HKU1變體的一種或多種蛋白質(zhì)(反之亦然)的病毒載體將保護(hù)接種了這種載體的對(duì)象免受天然CoV-HKU1及其變體的感染。減毒和復(fù)制缺陷型病毒可以象其它病毒的活疫苗一樣用于接種目的。
按照本發(fā)明，待摻入編碼本發(fā)明重組或嵌合病毒的病毒載體中的異源序列包括從CoV-HKU1的不同毒株或變體獲得或衍生的序列。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合或重組病毒由來源于病毒基因組的病毒載體編碼，其中一個(gè)或多個(gè)序列、基因間區(qū)、末端序列或ORF的部分或整體已被異源或非天然序列取代。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合病毒由來源于病毒基因組的病毒載體編碼，其中一種或多種異源序列已被插入或添加到載體中。
病毒載體的選擇可取決于有待治療或保護(hù)免受病毒感染的對(duì)象的種類。
按照本發(fā)明，可對(duì)病毒載體進(jìn)行工程改造，以提供對(duì)CoV-HKU1及其天然變體的感染帶來保護(hù)作用的抗原序列?？蓪?duì)病毒載體進(jìn)行工程改造，以提供一種、兩種、三種或更多種抗原序列。按照本發(fā)明，抗原序列可來源于同一病毒、同一種類病毒的不同毒株或變體、或不同病毒。
根據(jù)本發(fā)明獲得的表達(dá)產(chǎn)物和/或重組或嵌合病毒顆?？捎欣貞?yīng)用在疫苗制品中。可對(duì)本發(fā)明表達(dá)產(chǎn)物和嵌合病毒顆粒進(jìn)行工程改造，以產(chǎn)生抗多種病原體的疫苗，所述病原體包括病毒和細(xì)菌抗原、腫瘤抗原、變應(yīng)原抗原和與自身免疫病有關(guān)的自身抗原。具體地說，可對(duì)本發(fā)明嵌合病毒顆粒進(jìn)行工程改造，以產(chǎn)生能保護(hù)對(duì)象免受CoV-HKU1及其變體感染的疫苗。
在某些實(shí)施方案中，可對(duì)本發(fā)明表達(dá)產(chǎn)物和重組或嵌合病毒顆粒進(jìn)行工程改造，以產(chǎn)生抗多種病原體的疫苗，所述病原體包括病毒抗原、腫瘤抗原和與自身免疫病有關(guān)的自身抗原。實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)的一種方法包括對(duì)現(xiàn)有的CoV-HKU1基因進(jìn)行修飾，使得在其各自的外結(jié)構(gòu)域中包含外源序列。在異源序列為病原體的表位或抗原的情況下，這些嵌合病毒可用來誘導(dǎo)針對(duì)衍生這些決定簇的疾病因子的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明涉及使用病毒載體和重組或嵌合病毒來制備抗多種病毒和/或抗原的疫苗。本發(fā)明還包括包含病毒載體的重組病毒，所述病毒載體來源于CoV-HKU1或其變體，含有能使病毒具有更適合用于疫苗制品的表型的序列。突變和修飾可出現(xiàn)在病毒的編碼區(qū)、基因間區(qū)和前導(dǎo)序列和尾隨序列。
本發(fā)明提供包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。含有CoV-HKU1聚合酶成分的質(zhì)?；虿《据d體在原核細(xì)胞中產(chǎn)生，以在相關(guān)的細(xì)胞類型(細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、真核細(xì)胞)中表達(dá)所述成分。含有CoV-HKU1基因組全長拷貝或部分拷貝的質(zhì)?；虿《据d體在原核細(xì)胞中產(chǎn)生，以在體外或體內(nèi)表達(dá)病毒核酸。后者載體可含有其它病毒序列以產(chǎn)生嵌合病毒或嵌合病毒蛋白，可缺少病毒基因組的某些部分以產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒，并可含有突變、缺失或插入以產(chǎn)生減毒病毒。
此外，可使用短暫或穩(wěn)定表達(dá)一種或多種全長或部分CoV-HKU1蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞。這種細(xì)胞可通過轉(zhuǎn)染(蛋白質(zhì)載體或核酸載體)、感染(病毒載體)或轉(zhuǎn)導(dǎo)(病毒載體)來制成，可用于與所述野生型、減毒型、復(fù)制缺陷型或嵌合型病毒互補(bǔ)。
本發(fā)明病毒載體和嵌合病毒可通過刺激體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答或通過刺激對(duì)抗原的耐受性，用于調(diào)節(jié)對(duì)象的免疫系統(tǒng)。本文所用的對(duì)象指人、靈長目動(dòng)物、馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、貓、鳥類和嚙齒動(dòng)物。
5.2疫苗和抗病毒制劑在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由本發(fā)明核酸編碼的蛋白質(zhì)分子或CoV-HKU1特異性病毒蛋白或其功能片斷。有用的蛋白質(zhì)分子例如來源于可從本發(fā)明病毒衍生的任何基因或基因組片斷，包括包膜蛋白(E蛋白)、膜內(nèi)在蛋白質(zhì)(M蛋白)、刺突蛋白(S蛋白)、核殼蛋白(N蛋白)、血凝素酯酶(HE蛋白)和RNA依賴性RNA聚合酶。本文所提供的這種分子或其抗原片段例如可用于診斷方法或試劑盒中，以及用于藥物組合物如亞單位疫苗中。特別有用的是由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列編碼的多肽或其抗原片段，包括具有圖2和3中SEQ IDNO34-2918或圖9中SEQ ID NO2、2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和/或2970-4236的氨基酸序列的多肽，供混入作為抗原或亞單位免疫原，但也可使用滅活的全病毒。還尤其有用的是由CoV-HKU1基因組的重組核酸片段編碼的蛋白物質(zhì)；當(dāng)然，優(yōu)選的是在ORF的優(yōu)選界限內(nèi)、尤其是引發(fā)CoV-HKU1特異性抗體或T細(xì)胞應(yīng)答的蛋白物質(zhì)，無論是在體內(nèi)(例如出于保護(hù)目的或治療目的，或用于提供診斷性抗體)還是體外(例如通過噬菌體展示技術(shù)或其它用于產(chǎn)生合成抗體的技術(shù))。
本發(fā)明提供預(yù)防和治療CoV-HKU1感染的疫苗制劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗含重組和嵌合的CoV-HKU1病毒。
在另一方面，本發(fā)明還提供DNA疫苗制劑，其含CoV-HKU1的核酸或片段，或具有SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的序列或其片段的核酸分子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA疫苗制劑包含編碼免疫特異性結(jié)合CoV-HKU1的抗體的核酸或其片段。在DNA疫苗制劑中，疫苗DNA包含帶有插入片斷的病毒載體(例如來源于CoV-HKU1、細(xì)菌質(zhì)粒或其它表達(dá)載體)，所述插入片斷包含與一個(gè)或多個(gè)控制元件有效連接的本發(fā)明核酸分子，從而使得由所述核酸分子編碼的免疫蛋白質(zhì)可以在接種對(duì)象中表達(dá)。這種載體可用重組DNA技術(shù)制備成攜帶本發(fā)明核酸分子的重組或嵌合病毒載體。
已描述了各種供DNA接種以抗病毒感染的異源載體。例如，以下參考文獻(xiàn)描述的載體可用來表達(dá)CoV-HKU1序列而不是所描述的病毒或其它病原體的序列；尤其描述用于以下的載體乙型肝炎病毒(Michel，M.L.等，1995，DAN-mediated immunization to the hepatitis B surface antigen inmiceAspects of the humoral response mimic hepatitis B viral infection inhumans，Proc.Natl.Aca.Sci.USA 925307-5311；Davis，H.L.等，1993，DNA-based immunization induces continuous seretion of hepatitis B surfaceantigen and high levels of circulating antibody，Human Molec.Genetics21847-1851)、HIV病毒(Wang，B.等，1993，Gene inoculation generatesimmune responses against human imunodeficiency virus type 1，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 904156-4160；Lu，S.等，1996，Simian immunodeficiency virusDNA vaccine trial in macques，J.Virol.703978-3991；Letvin，N.L.等，1997，Potent，protective anti-HIV immune responses generated by bimodal HIVenvelope DNA plus protein vaccination，Proc Natl Acad Sci U SA.94(17)9378-83)和流感病毒(Robinson，HL等，1993，Protection against a lethalinfluenza virus challenge by immunizati on with a haemagglutinin-expressingplasmid DNA，Vaccine 11957-960；Ulmer，J.B.等，Heterologous protectionagainst influenza by injection of DNA encoding a viral protein，Science 2591745-1749)以及細(xì)菌感染如結(jié)核病(Tascon，R.E.等，1996，Vaccinationagainst tuberculosis by DNA injection，Nature Med.2888-892；Huygen，K.等，1996，Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNAvaccine，Nature Med.，2893-898)和寄生蟲感染如瘧疾(Sedegah，M.，1994，Protection against malaria by immunization with plasmid DNA encodingcircumsporozoite protein，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919866-9870；Doolan，D.L.等，1996，Circumventing genetic restriction of protection against malariawith multigene DNA immunizationCD8+T cell-interferonδ，and nitricoxide-dependent immunity，J.Exper.Med.，11831739-1746)。
可使用多種方法來輸入上述疫苗制品。這些方法包括但不限于口、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下和鼻內(nèi)途徑。或者，優(yōu)選通過疫苗針對(duì)其設(shè)計(jì)的病原體的自然感染途徑來輸入嵌合病毒疫苗制品。本發(fā)明的DNA疫苗可以鹽水溶液形式通過用注射器和針頭注射入肌肉或皮膚內(nèi)來給予(Wolff J.A.等，1990，Direct gene transfer into mouse muscle in vivo，Science 2471465-1468；Raz，E.，1994，Intradermal gene immunizationThepossible role of DNA uptake in the induction of cellular immunity to viruses，Proc.Natl.Acd.Sci.USA 919519-9523)。另一種給予DNA疫苗的方式稱為“基因槍”法，通過該法，涂有目標(biāo)DNA分子的微小金珠被射入細(xì)胞中(Tang，D.等，1992，Genetic immunization is a simple method for eliciting animmune response，Nature 356152-154)。有關(guān)DNA疫苗的方法的全面綜述參見Robinson，H.L.，1999，DNA vaccinesbasic mechanism and immuneresponses(綜述)，Int.J.Mol.Med.4(5)549-555；Barber，B.，1997，IntroductionEmerging vaccine strategies，Seminars in Immunology 9(5)269-270；和Robinson，H.L.等，1997，DNA vaccines，Seminars in Immunology9(5)271-283。
5.3佐劑和載體分子
CoV-HKU1相關(guān)抗原與一種或多種佐劑一起給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，CoV-HKU1相關(guān)抗原與無機(jī)鹽佐劑或無機(jī)鹽凝膠佐劑一起給藥。這種無機(jī)鹽佐劑和無機(jī)鹽凝膠佐劑包括但不限于氫氧化鋁(ALHYDROGEL、REHYDRAGEL)、磷酸鋁凝膠、羥基磷酸鋁(ADJU-PHOS)和磷酸鈣。
在另一實(shí)施方案中，CoV-HKU1相關(guān)抗原與免疫刺激佐劑一起給藥。這類佐劑包括但不限于細(xì)胞因子(例如白介素-2、白介素-7、白介素-12、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ、白介素-1β(IL-1β)和IL-1β肽或Sclavo肽)、含細(xì)胞因子的脂質(zhì)體、三萜類糖苷或皂苷(例如QuilA和QS-21，亦在商標(biāo)STIMULON、ISCOPREP下出售)、胞壁酰二肽(MDP)衍生物如N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(蘇氨酰-MDP，在商標(biāo)TERMURTIDE下出售)、GMDP、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)、未甲基化的CpG二核苷酸和寡核苷酸如細(xì)菌DNA及其片段、LPS、單磷酰脂質(zhì)A(3D-MLA，在商標(biāo)MPL下出售)和聚磷腈。
在另一實(shí)施方案中，所用佐劑是特殊佐劑，包括但不限于乳液，例如弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、角鯊烯或角鯊?fù)樗妥魟┲苿?例如SAF和MF59，例如與嵌段共聚物如L-121(聚氧丙烯/聚氧乙烯，在商標(biāo)PLURONIC L-121下出售)一起制備)、脂質(zhì)體、病毒體、脂質(zhì)體卷(cochleates)和在商標(biāo)ISCOM下出售的免疫刺激復(fù)合物。
在另一實(shí)施方案中，使用微粒佐劑。微粒佐劑包括但不限于生物可降解和生物相容性聚酯、乳酸的均聚物(PLA)及乙醇酸的均聚物(PGA)和它們的共聚物、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)微粒、能自締合成微粒的聚合物(泊洛沙姆顆粒)、可溶性聚合物(聚磷腈)和病毒樣顆粒(VLP)如重組蛋白質(zhì)微粒，例如乙肝表面抗原(HbsAg)。
可以使用的又一類佐劑包括粘膜佐劑，包括但不限于來自大腸桿菌(Escherichia coli)的不耐熱腸毒素(LT)、來自霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的霍亂全毒素(CT)和霍亂毒素B亞單位(CTB)、突變株毒素(例如LTK63和LTR72)、微粒和聚合脂質(zhì)體。
在其它實(shí)施方案中，任何上述類型的佐劑都可相互組合或與其它佐劑組合使用。例如，可用來給予本發(fā)明CoV-HKU1相關(guān)抗原的組合佐劑制劑的非限制性實(shí)例包括包含免疫刺激蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子或T細(xì)胞和/或B細(xì)胞肽的脂質(zhì)體，或帶有或不帶包埋IL-2的微生物或含有腸毒素的微粒。本領(lǐng)域已知的其它佐劑也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)(參見VaccineDesignThe Subunit and Adjuvant Appoach，第7章，Michael F.Powell和Mark J.Newman(編輯)，Plenum Press，New York，1995，其通過引用整體結(jié)合到本文中)。
佐劑效力可通過測(cè)量誘導(dǎo)導(dǎo)向免疫原性多肽(含有CoV-HKU1多肽表位)的抗體來確定，所述抗體由在也包含各種佐劑的疫苗中給予這種多肽而產(chǎn)生。
所述多肽可配制成中性形式或鹽形式的疫苗。藥物可接受的鹽包括酸加成鹽(通過肽的游離氨基形成)和與無機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、馬來酸等)形成的鹽。通過游離羰基形成的鹽也可來源于無機(jī)堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，及有機(jī)堿，例如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
本發(fā)明的疫苗可為多價(jià)的或單價(jià)的。多價(jià)疫苗制備自表達(dá)超過一種抗原的重組病毒。
可使用多種方法來輸入本發(fā)明的疫苗制品。這些方法包括但不限于口、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下和鼻內(nèi)途徑，以及通過劃痕法(例如使用分叉針刮破皮膚的上層)。
給予疫苗的患者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選為人，但也可為非人動(dòng)物，包括但不限于牛、馬、綿羊、豬、禽(例如雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、小鼠和大鼠。
5.4抗體制備特異性識(shí)別本發(fā)明多肽(例如但不限于包含SEQ ID NO2或SEQ IDNO34-2918、2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和/或2970-4236中任一個(gè)的序列的多肽)或CoV-HKU1表位的抗體或其抗原結(jié)合片段可用來檢測(cè)、篩選和分離本發(fā)明多肽或其片段，或可能編碼其它生物類似酶的類似序列。例如，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合CoV-HKU1表位的抗體或其片段可用于各種體外檢測(cè)試驗(yàn)中，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡等，以在樣品例如生物材料中檢測(cè)本發(fā)明多肽或優(yōu)選CoV-HKU1，所述生物材料包括細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基(例如細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、酵母細(xì)胞培養(yǎng)基等)、血液、血漿、血清、組織、唾液、鼻咽抽吸物等。
對(duì)本發(fā)明多肽或CoV-HKU1的任何表位有特異性的抗體可通過本領(lǐng)域已知的任何適合方法產(chǎn)生。抗目標(biāo)抗原的多克隆抗體可通過本領(lǐng)域眾所周知的各種方法生產(chǎn)，所述目標(biāo)抗原例如為CoV-HKU1表位或由SEQID NO1或3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列編碼的多肽，包括圖2(SEQ ID NO34-1318)、圖3(SEQ ID NO1319-2918)以及SEQ IDNO2、2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和/或2970-4236中所示的多肽。例如，可將抗原給予各種宿主動(dòng)物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以誘導(dǎo)產(chǎn)生含有抗原特異性多克隆抗體的抗血清。可使用多種佐劑來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，取決于宿主物種，佐劑包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、無機(jī)凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚和對(duì)人類具有潛在用途的佐劑如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(corynebacterium parvum)。這種佐劑在本領(lǐng)域也是眾所周知的(參見5.4章，出處同上)。
單克隆抗體可使用多種本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備，包括使用雜交瘤技術(shù)、重組體技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)或它們的組合。例如單克隆抗體可使用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)，包括本領(lǐng)域已知的雜交瘤技術(shù)和例如在Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas，第563-681頁(Elsevier，N.Y.，1981)中教導(dǎo)的雜交瘤技術(shù)(兩者均通過引用整體結(jié)合到本文中)。本文所用術(shù)語“單克隆抗體”不限于通過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的抗體。術(shù)語“單克隆抗體”指來源于單個(gè)克隆的抗體，包括任何真核克隆、原核克隆和噬菌體克隆，而不是指抗體生產(chǎn)的方法。
使用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)和篩選特異性抗體的方法是常規(guī)的和本領(lǐng)域熟知的。在非限制性實(shí)例中，小鼠可用目標(biāo)抗原或表達(dá)這種抗原的細(xì)胞免疫。一旦檢測(cè)出免疫應(yīng)答，例如在小鼠血清中檢測(cè)出抗原特異性的抗體，則收獲小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞。然后通過熟知的技術(shù)將脾細(xì)胞與任何適合的骨髓瘤細(xì)胞融合。通過有限稀釋選擇和克隆雜交瘤。然后用本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)雜交瘤克隆中分泌能結(jié)合抗原的抗體的細(xì)胞。通常含有高水平抗體的腹水可通過用陽性雜交瘤克隆腹膜內(nèi)接種小鼠來產(chǎn)生。
識(shí)別特定表位的抗體片段可通過公知技術(shù)產(chǎn)生。例如，F(xiàn)ab和F(ab′)2片斷可通過使用酶例如木瓜蛋白酶(用于產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(用于產(chǎn)生F(ab′)2片段)對(duì)免疫球蛋白分子進(jìn)行蛋白酶水解來生產(chǎn)。F(ab′)2片段含有全部輕鏈以及重鏈的可變區(qū)、CH1區(qū)和鉸鏈區(qū)。
本發(fā)明的抗體或其片段也可通過本領(lǐng)域已知的任何抗體合成方法來生產(chǎn)，具體的說是通過化學(xué)合成法或優(yōu)選通過重組表達(dá)技術(shù)來生產(chǎn)。
編碼抗體的核苷酸序列可從本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲取的任何信息獲得(即從Genbank、文獻(xiàn)獲得或通過常規(guī)克隆和序列分析獲得)。如果含有編碼特定抗體或其表位結(jié)合片斷的核酸的克隆不可獲得，但抗體分子或其表位結(jié)合片段的序列是已知的，則編碼免疫球蛋白的核酸可通過化學(xué)法合成，或可得自合適的來源(例如抗體cDNA文庫，或從表達(dá)抗體的任何組織或細(xì)胞(如選擇用來表達(dá)抗體的雜交瘤)產(chǎn)生的cDNA文庫或從其中分離的核酸，優(yōu)選poly A+RNA)，通過使用可與序列的3′和5′末端雜交的合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增來獲得，或通過使用對(duì)特定基因序列具有特異性的寡核苷酸探針進(jìn)行克隆來獲得，以例如用于從編碼抗體的cDNA文庫中鑒別cDNA克隆。通過PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸隨后可使用本領(lǐng)域熟知的任何方法克隆至可復(fù)制克隆載體中。
一旦確定了抗體的核苷酸序列，抗體的核苷酸序列就可使用本領(lǐng)域熟知的操作核苷酸序列的方法，例如重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)誘變、PCR等(參見例如描述于Sambrook等，出處同上；和Ausubel等編輯，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY中的技術(shù)，這兩個(gè)文獻(xiàn)均通過引用整體結(jié)合到本文中)進(jìn)行操作，以通過例如在抗體的表位結(jié)合域區(qū)中或者在可增強(qiáng)或降低抗體生物活性的任何部分中引入氨基酸取代、缺失和/或插入，來產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體。
抗體的重組表達(dá)需要構(gòu)建含有編碼抗體的核苷酸序列的表達(dá)載體。一旦獲得編碼抗體分子或抗體重鏈或輕鏈或其部分的核苷酸序列，則用于生產(chǎn)抗體分子的載體可使用前面各節(jié)討論的本領(lǐng)域熟知的技術(shù)通過重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含有抗體編碼序列和合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組?？蓪⒕幋a重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、重鏈和輕鏈可變區(qū)、重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的表位結(jié)合片段、或抗體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的核苷酸序列克隆到這種載體中進(jìn)行表達(dá)。然后，如此制備的表達(dá)載體可被引入到合適的宿主細(xì)胞中以表達(dá)抗體。因此，本發(fā)明包括含有多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼對(duì)本發(fā)明多肽或其片段具有特異性的抗體。
宿主細(xì)胞可用本發(fā)明的兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，第一種載體編碼重鏈衍生的多肽，第二種載體編碼輕鏈衍生的多肽。所述兩種載體可含有相同的可選擇標(biāo)記，以使重鏈和輕鏈多肽的表達(dá)相等，或含有不同的可選擇標(biāo)記，以確保維持兩種質(zhì)粒。另外，也可使用編碼和能夠表達(dá)重鏈多肽和輕鏈多肽兩者的單一載體。在這種情況下，輕鏈應(yīng)位于重鏈的前面，以避免出現(xiàn)過量的有毒游離重鏈(Proudfoot，Nature，32252，1986；和Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，772197，1980)。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。
在另一實(shí)施方案中，抗體也可使用本領(lǐng)域熟知的各種噬菌體展示方法來產(chǎn)生。在噬菌體展示方法中，功能抗體結(jié)構(gòu)域展示在攜帶其編碼多核苷酸序列的噬菌體顆粒的表面上。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，這種噬菌體可用來展示從所有成分或組合抗體文庫(例如人的或鼠的)表達(dá)的抗原結(jié)合域，如Fab和Fv或二硫鍵穩(wěn)定的Fv。表達(dá)結(jié)合目標(biāo)抗原的抗原結(jié)合域的噬菌體可用抗原來選擇或鑒定，例如使用標(biāo)記抗原或結(jié)合或捕捉到固體表面或珠粒的抗原。在這些方法中使用的噬菌體通常是絲狀噬菌體，包括fd和M13?？乖Y(jié)合域被表達(dá)為與噬菌體基因III或基因VIII蛋白質(zhì)重組融合的蛋白質(zhì)?？捎脕碇苽浔景l(fā)明免疫球蛋白或其片段的噬菌體展示方法的實(shí)例包括在以下文獻(xiàn)中公開的方法Brinkman等，J.Immunol.Methods，18241-50，1995；Ames等，J.Immunol.Methods，184177-186，1995；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.，24952-958，1994；Persic等，Gene，1879-18，1997；Burton等，Advances in Immunology，57191-280，1994；PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB91/01134；PCT公開號(hào)WO 90/02809、WO 91/10737、WO92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401；和美國專利第5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108號(hào)；以上各文獻(xiàn)均通過引用整體結(jié)合到本文中。
如以上參考文獻(xiàn)所述，進(jìn)行噬菌體選擇后，可分離和使用來自噬菌體的抗體編碼區(qū)以產(chǎn)生所有的抗體，包括人抗體或任何其它需要的片段，并可表達(dá)于任何需要的宿主中，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌，例如以下所詳細(xì)描述的。例如，也可應(yīng)用重組生產(chǎn)Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技術(shù)，使用例如在以下文獻(xiàn)中公開的本領(lǐng)域已知方法PCT公開號(hào)WO 92/22324；Mullinax等，BioTechniques，12(6)864-869，1992；和Sawai等，AJRI，3426-34，1995；和Better等，Science，2401041-1043，1988(以上各文獻(xiàn)均通過引用整體結(jié)合到本文中)。可用來生產(chǎn)單鏈Fv和抗體的技術(shù)的實(shí)例包括在以下文獻(xiàn)中描述的技術(shù)美國專利第4,946,778和5,258,498號(hào)；Huston等，Methods in Enzymology，20346-88，1991；Shu等，PNAS，907995-7999，1993；和Skerra等，Science，2401038-1040，1988。
一旦本發(fā)明抗體分子已通過上述任何方法生產(chǎn)出來，其隨后可通過本領(lǐng)域已知的任何純化免疫球蛋白分子的方法進(jìn)行純化，所述方法例如色譜法(例如離子交換色譜、親合色譜，尤其是進(jìn)行A蛋白和G蛋白純化后對(duì)特定抗原的親合色譜，以及排阻柱色譜)、離心法、差示溶解度法、或任何其它蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。此外，本發(fā)明抗體或其片段可與本文所述的或本領(lǐng)域已知的異源多肽序列融合，以促進(jìn)純化。
對(duì)于某些應(yīng)用，包括在人體內(nèi)使用抗體和體外檢測(cè)試驗(yàn)，優(yōu)選使用嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。嵌合抗體是其中抗體的不同部分來源于不同動(dòng)物物種的抗體分子，例如具有來源于鼠單克隆抗體的可變區(qū)和來源于人免疫球蛋白的恒定區(qū)的抗體。生產(chǎn)嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如Morrison，Science，2291202，1985；Oi等，BioTechniques，4214 1986；Gillies等，J.Immunol.Methods，125191-202，1989；美國專利第5,807,715、4,816,567和4,816,397號(hào)，以上各文獻(xiàn)均通過引用整體結(jié)合到本文中。人源化抗體是來自非人類物種的能結(jié)合所需抗原的抗體分子，其具有一個(gè)或多個(gè)來自非人類物種的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)。通常，人構(gòu)架區(qū)中的構(gòu)架殘基會(huì)被來自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基置換，以改變、優(yōu)選改進(jìn)抗原結(jié)合。這些構(gòu)架置換可通過本領(lǐng)域熟知的方法來鑒定，例如通過對(duì)CDR和構(gòu)架殘基的相互作用進(jìn)行建模，以鑒定對(duì)抗原結(jié)合重要的構(gòu)架殘基，以及通過序列比較，以鑒定在特定位置的不尋常構(gòu)架殘基。參見例如Queen等，美國專利第5,585,089號(hào)；Riechmann等，Nature，332323，1988，以上文獻(xiàn)均通過引用整體結(jié)合到本文中?？贵w可使用多種本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)進(jìn)行人源化，包括例如CDR嫁接(EP 239,400；PCT公開號(hào)WO 91/09967；美國專利第5,225,539、5,530,101和5,585,089號(hào))、鑲飾(veneering)或重塑(resurfacing)(EP 592,106、EP 519,596、Padlan，Molecular Immunology，28(4/5)489-498，1991；Studnicka等，Protein Engineering，7(6)805-814，1994；Roguska等，Proc Natl.Acad.Sci.USA，91969-973，1994)和鏈改組(美國專利第5,565,332號(hào))，以上各文獻(xiàn)均通過引用整體結(jié)合到本文中。
全人抗體特別適合用于對(duì)人患者進(jìn)行治療處理。人抗體可通過多種本領(lǐng)域已知的各種方法來制備，包括使用來源于人免疫球蛋白序列的抗體文庫通過上述噬菌體展示技術(shù)來制備。參見美國專利第4,444,887和4,716,111號(hào)；和PCT公開號(hào)WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，以上各文獻(xiàn)均通過引用整體結(jié)合到本文中。
人抗體也可使用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫球蛋白、但能表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來生產(chǎn)。有關(guān)這種生產(chǎn)人抗體的技術(shù)的綜述，參見參見Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.，1365-93，1995。有關(guān)這種生產(chǎn)人抗體和人單克隆抗體的技術(shù)以及生產(chǎn)這種抗體的方案的詳細(xì)討論，參見例如PCT公開號(hào)WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735；歐洲專利第0598877號(hào)；美國專利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5,939,598號(hào)，以上各文獻(xiàn)均通過引用整體結(jié)合到本文中。另外，可與例如Abgenix，Inc.(Fremont，CA)、Medarex(NJ)和Genpharm(San Jose，CA)公司約定，以提供使用類似上述技術(shù)生產(chǎn)的導(dǎo)向選定抗原的人抗體。
識(shí)別選定表位的完全人抗體可使用稱為“導(dǎo)向選擇”的技術(shù)來產(chǎn)生。在此方法中，選定的非人單克隆抗體如小鼠抗體被用來指導(dǎo)選擇識(shí)別同一表位的全人抗體。(Jespers等，Bio/technology，12899-903，1988)。
與異源多肽融合或綴合的抗體可用于本領(lǐng)域熟知的體外免疫試驗(yàn)和純化方法(例如親合色譜)中。參見例如PCT公開號(hào)WO 93/21232；EP439,095；Naramura等，Immunol.Lett.，3991-99，1994；美國專利5,474,981；Gillies等，PNAS，891428-1432，1992；和Fell等，J.Immunol.，1462446-2452，1991，以上各文獻(xiàn)均通過引用整體結(jié)合到本文中。
抗體也可吸附到固體支持體上，這對(duì)免疫試驗(yàn)或純化本發(fā)明多肽或其片段、衍生物、類似物或變體或具有與本發(fā)明多肽類似的酶活性的類似分子來說是特別有用的。這種固體支持體包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
5.5藥物組合物和試劑盒本發(fā)明包括包含本發(fā)明抗病毒劑的藥物組合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗病毒劑是免疫特異性結(jié)合CoV-HKU1或其變體或其任何衍生蛋白質(zhì)的抗體。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗病毒劑為本發(fā)明多肽或核酸分子。藥物組合物具有預(yù)防性抗病毒劑的效用，可給予已暴露于或預(yù)期暴露于病毒的對(duì)象。
已知有各種傳遞系統(tǒng)可用來給予本發(fā)明的藥物組合物，所述傳遞系統(tǒng)例如為脂質(zhì)體包囊化、微粒、微膠囊、能表達(dá)突變病毒的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞作用(參見例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.26244294432)。引入的方法包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑。化合物可通過任何方便的途徑給藥，例如通過輸注或推注(bolus injection)、通過上皮或粘膜皮膚襯層(例如口腔粘膜、直腸粘膜和腸粘膜等)吸收，并可與其它生物活性劑一起給藥。給藥可以是全身給藥或局部給藥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，期望通過任何合適的途徑將本發(fā)明的藥物組合物引入肺部。也可例如通過使用吸入器或噴霧器，與氣霧化劑一起配制來實(shí)施肺部給藥。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，期望將本發(fā)明的藥物組合物局部給予需要治療的區(qū)域；這可例如(非限制性地)通過手術(shù)中的局部輸注、局部敷用(例如與手術(shù)后的傷口敷料一起)、通過注射、通過導(dǎo)管、通過栓劑、通過鼻噴霧或通過植入物來實(shí)現(xiàn)，所述植入物是多孔、無孔或凝膠狀材料，包括膜如硅橡膠(sialastic)膜或纖維。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過在受感染組織的部位(或從前部位)直接注射來給藥。
在另一實(shí)施方案中，藥物組合物可在小泡、尤其是脂質(zhì)體中進(jìn)行傳遞(參見Langer，1990，Science 2491527-1533；Treat等，載于Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez Berestein和Fidler(編輯)，Liss，New York，353-365頁(1989)；Lopez-Berestein，出處同上，317-327頁；通常參見出處同上)。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物可在控釋系統(tǒng)中傳遞。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用泵(參見Langer，出處同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald等，1980，Surgery 88507；和Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一實(shí)施方案中，可使用聚合物材料(參見Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(編輯)，CRCPres.，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，DrugProduct Design and Performance，Smolen和Ball(編輯)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；另參見Levy等，1985，Science 228190；During等，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71105)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，控釋系統(tǒng)可置于組合物靶標(biāo)即肺的附近，從而只需要全身劑量的一部分(參見例如Goodson，載于Medical Applications of Controlled Release，出處同上，第2卷，115-138頁(1984))。
其它控釋系統(tǒng)在Langer的綜述(Science 2491527-1533(1990))中有討論。
本發(fā)明的藥物組合物包含治療有效量的重組或嵌合CoV-HKU1以及藥物可接受的載體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，術(shù)語“藥物可接受的”指得到聯(lián)邦政府或州政府的管理機(jī)關(guān)批準(zhǔn)，或被列入美國藥典或其它通常公認(rèn)的藥典中，以供在動(dòng)物中、更具體在人類中使用。術(shù)語“載體”指與藥物組合物一起給予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或介質(zhì)。這種藥物載體可以是無菌液體如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的液體，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)靜脈內(nèi)給予藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選載體。鹽水溶液和葡萄糖及甘油水溶液也可用作液體載體，尤其是用于可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、石灰石、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如需要，組合物也可含有少量的濕潤劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可采用溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、緩釋劑等形式。組合物可與傳統(tǒng)的粘合劑和載體如甘油三酯一起配制成栓劑。口服劑型可包含標(biāo)準(zhǔn)載體，如藥物級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適藥物載體的實(shí)例在E.W.Martin著的“Remington′sPharmaceutical Sciences”中有描述。劑型應(yīng)與給藥方式相適應(yīng)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物按照常規(guī)程序配制成適合供靜脈內(nèi)給予人類的藥物組合物。典型地，供靜脈內(nèi)給藥的組合物是無菌等滲水緩沖液的溶液。必要時(shí)，組合物也可包括增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。通常，各成分以單位劑量形式單獨(dú)或混和供應(yīng)，例如作為在密封容器如安瓿或小袋(sachette)中的凍干粉或無水濃縮物，容器上標(biāo)明活性藥物的量。在組合物通過輸液給藥的情況下，其可用裝有無菌藥物級(jí)水或鹽水的輸液瓶來調(diào)劑。在組合物通過注射給藥的情況下，可提供一安瓿注射用無菌水或鹽水，以便在給藥前混合各成分。
本發(fā)明的藥物組合物可配制成中性形式或鹽形式。藥物可接受的鹽包括與游離氨基形成的鹽，如來源于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽，以及與游離羧基形成的鹽，如來源于氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽。
本發(fā)明的藥物組合物能有效治療具體病狀或病癥的量須取決于病狀或病癥的性質(zhì)，可通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來確定。另外，可任選采用體外試驗(yàn)來幫助確定最佳的劑量范圍。在制劑中待采用的精確劑量也須取決于給藥途徑和疾病或病狀的嚴(yán)重程度，且應(yīng)按照?qǐng)?zhí)業(yè)醫(yī)生的判斷和各個(gè)患者的情況來決定。但是，靜脈內(nèi)給藥的合適劑量范圍通常是每公斤體重約20-500微克活性化合物。鼻內(nèi)給藥的合適劑量范圍通常是約0.01pg/kg體重至1mg/kg體重。有效劑量可從得自體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的量效曲線推知。
栓劑通常含有0.5％-10％重量的活性成分；口服劑型優(yōu)選含有10％-95％的活性成分。
本發(fā)明還提供包含一個(gè)或多個(gè)容器的藥物包或藥盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物成分?？梢匀芜x伴隨這種容器的是管理藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)關(guān)的規(guī)定形式通知書，該通知書反映了政府機(jī)關(guān)對(duì)生產(chǎn)、使用或銷售人用藥品或生物制品的批準(zhǔn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑盒含本發(fā)明的抗病毒劑，例如對(duì)SEQ IDNO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列編碼的多肽或任何CoV-HKU1表位、或本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)(包括圖2(SEQ ID NO34-1318)、圖3(SEQ ID NO1319-2918)、圖9(SEQ ID NO2970-4236)和SEQID NO2中所示的多肽)、或本發(fā)明核酸分子具有特異性的抗體，其可單獨(dú)存在，或與佐劑、抗病毒藥物、抗生素、止痛劑、支氣管擴(kuò)張藥或其它藥物可接受賦形劑組合。
本發(fā)明進(jìn)一步包括藥盒，其包含含有本發(fā)明藥物組合物的容器和使用說明書。
5.6檢測(cè)實(shí)驗(yàn)本發(fā)明提供在生物樣品中檢測(cè)免疫特異性結(jié)合CoV-HKU1的抗體的方法，生物樣品例如來自呼吸道感染患者的血液、血清、血漿、唾液、尿等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法包括將樣品與直接固定在基質(zhì)上的由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列編碼的多肽或蛋白(包括具有圖2中所示SEQ ID NO34-1318、圖3中所示SEQ IDNO1319-2918或圖9中所示SEQ ID NO2、2921、2923、2925、2927、2929、2931、2933、2935、2937、2939、2941、2943、2945、2947、2949、2951、2953、2955、2957、2959、2961、2963、2965、2967和/或2970-4236的氨基酸序列的多肽)接觸，并通過標(biāo)記的異源抗同種型抗體直接或間接檢測(cè)與病毒結(jié)合的抗體。在另一具體實(shí)施方案中，樣品與含具有SEQ IDNO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列的核酸分子并表達(dá)由其編碼的多肽的宿主細(xì)胞接觸，然后可通過免疫熒光試驗(yàn)來檢測(cè)結(jié)合的抗體。
檢測(cè)生物樣品中是否存在本發(fā)明多肽或核酸的示例性方法包括從各種來源獲得生物樣品，將樣品與能夠檢測(cè)CoV-HKU1的表位或核酸(例如mRNA、基因組RNA)的化合物或試劑接觸，使得可檢測(cè)樣品中CoV-HKU1的存在情況。檢測(cè)本發(fā)明CoV-HKU1mRNA或基因組RNA的優(yōu)選試劑是能夠與編碼本發(fā)明多肽的mRNA或基因組RNA雜交的標(biāo)記核酸探針。該核酸探針可以是例如包含或由SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列或其部分或其互補(bǔ)物組成的核酸分子，如長度為至少15、20、25、30、50、100、250、500、750、1000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，其在嚴(yán)格條件下足以特異性地與CoV-HKU1mRNA或基因組RNA雜交。
在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，使用引物通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來檢測(cè)樣品中CoV-HKU1的存在情況，所述引物基于CoV-HKU1基因組的部分核苷酸序列或SEQ ID NO3或2919的基因組核酸序列構(gòu)建，或基于SEQ ID NO1、3、2919、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964和/或2966的核苷酸序列構(gòu)建。在一個(gè)非限制性具體實(shí)施方案中，用于RT-PCR方法的優(yōu)選引物是5’-GGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA-3’(SEQ ID NO4)和5’-CCATCATCAGATAGAATCATCATA-3’(SEQ ID NO5)，或5’-AAAGGATGTTGAC-AACCCTGTT-3’(LPW1926；SEQ ID NO2968)和5’-ATCATCATACTAAAATGCT-TACA-3’(LPW 1927；SEQ ID NO2969)，在3mM MgCl2存在下，熱循環(huán)例如但不限于94℃8分鐘，隨后94℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃1分鐘的循環(huán)40次。在更優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)以如下檢測(cè)生物樣品中CoV-HKU1的存在情況從樣品抽提總RNA，對(duì)抽提總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用特定引物如具有SEQ ID NO4、5、2968和2969的核苷酸序列的引物以及熒光染料如SYBRGreen I(其在非特異性結(jié)合雙鏈DNA時(shí)會(huì)發(fā)出熒光)，使cDNA經(jīng)歷PCR反應(yīng)。由于經(jīng)一系列熱循環(huán)后產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，在各延伸步驟結(jié)束時(shí)捕捉這些反應(yīng)的熒光信號(hào)，從而可以基于擴(kuò)增圖定量測(cè)定樣品中的病毒負(fù)載量。
檢測(cè)CoV-HKU1的優(yōu)選試劑是特異性結(jié)合本發(fā)明多肽或任何CoV-HKU1表位的抗體，優(yōu)選具有可檢測(cè)標(biāo)記的抗體。抗體可以是多克隆抗體，或更優(yōu)選為單克隆抗體。可使用完整的抗體或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。
涉及探針或抗體的術(shù)語“標(biāo)記”包括通過將可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)到探針或抗體以對(duì)探針或抗體進(jìn)行直接標(biāo)記，以及通過與被直接標(biāo)記的另一試劑反應(yīng)以對(duì)探針或抗體進(jìn)行間接標(biāo)記。間接標(biāo)記的實(shí)例包括用熒光標(biāo)記的第二抗體檢測(cè)第一抗體和用生物素對(duì)DNA探針進(jìn)行末端標(biāo)記，使得可用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白來檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法可用來體外以及體內(nèi)檢測(cè)樣品中的mRNA、蛋白質(zhì)(或任何表位)或基因組RNA。例如，體外檢測(cè)mRNA的技術(shù)包括RNA雜交、原位雜交、RT-PCR和RNA酶保護(hù)。體外檢測(cè)CoV-HKU1表位的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀法和免疫熒光法。體外檢測(cè)基因組RNA的技術(shù)包括DNA雜交、RT-PCR和RNA酶保護(hù)。此外，體內(nèi)檢測(cè)CoV-HKU1的技術(shù)包括向?qū)ο笊矬w中引入針對(duì)多肽的標(biāo)記抗體。例如，抗體可用放射性標(biāo)志標(biāo)記，所述放射性標(biāo)志在對(duì)象生物體中的存在和位置可通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)(包括放射自顯影術(shù))來檢測(cè)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明方法進(jìn)一步包括從對(duì)照對(duì)象獲得對(duì)照樣品，將對(duì)照樣品與能檢測(cè)CoV-HKU1(例如本發(fā)明多肽或編碼本發(fā)明多肽的mRNA或基因組RNA)的化合物或試劑接觸，從而檢測(cè)樣品中CoV-HKU1或多肽或編碼多肽的mRNA或基因組RNA的存在情況，并將對(duì)照樣品中CoV-HKU1或多肽或編碼多肽的mRNA或基因組RNA的不存在與測(cè)試樣品中CoV-HKU1或多肽或編碼多肽的mRNA或基因組RNA的存在情況相比較。
本發(fā)明還包括檢測(cè)待測(cè)樣品中CoV-HKU1或本發(fā)明多肽或核酸的存在情況的試劑盒。所述試劑盒例如可包含能檢測(cè)待測(cè)樣品中CoV-HKU1或多肽或編碼多肽的核酸分子的標(biāo)記化合物或試劑，在某些實(shí)施方案中，還包含確定樣品中多肽或mRNA的量的工具(例如結(jié)合多肽的抗體或與編碼多肽的DNA或mRNA結(jié)合的寡核苷酸探針)。試劑盒還可包含使用說明書。
對(duì)于基于抗體的試劑盒，其可包含例如(1)第一抗體(例如連接到固體支持體上)，其結(jié)合本發(fā)明多肽或CoV-HKU1表位；和任選的(2)不同的第二抗體，其結(jié)合多肽或第一抗體，且綴合到可檢測(cè)的試劑上。
對(duì)于基于寡核苷酸的試劑盒，其可包含例如(1)寡核苷酸，例如可檢測(cè)標(biāo)記的寡核苷酸，其與編碼本發(fā)明多肽的核酸序列或CoV-HKU1基因組內(nèi)的序列雜交，或(2)一對(duì)引物，其可用于擴(kuò)增含有CoV-HKU1序列的核酸分子。所述試劑盒還可包含例如緩沖劑、防腐劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。所述試劑盒也可包含用于檢測(cè)可檢測(cè)試劑所需的成分(例如酶或底物)。所述試劑盒還可含有對(duì)照樣品或一系列對(duì)照樣品，所述對(duì)照樣品可用來進(jìn)行試驗(yàn)并與待測(cè)樣品所含的相比較。試劑盒的各成分通常封閉在單獨(dú)的容器中，所有的各種容器與使用說明書一起裝在單一包裝物中。
6.實(shí)施例以下實(shí)施例說明了新型CoV-HKU1的鑒定。這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制性的。方法和結(jié)果使用Wiedbrauk DL和Johnston SLG(Manual of Clinical Vifology，Raven Press，New York，1993)作為一般參考文獻(xiàn)。
6.1實(shí)施例16.1.1臨床對(duì)象患者是香港聯(lián)合基督教醫(yī)院的住院病人。在患病的第1周至第5周每周收集患者的鼻咽抽吸物，在患病的第1周和第2周每周收集患者的糞和尿，在患病的第1、2和4周每周收集患者的血清。
6.1.2抗體檢測(cè)為生產(chǎn)用于蛋白純化的融合質(zhì)粒，使用引物5′-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTAAGCAACAGAGTCTTCTA-3′(SEQ IDNO6)和5′-CGGAATTCGATGTCTTATACTCCCGGT-3′(SEQ ID NO7)，通過RT-PCR擴(kuò)增編碼CoV-HKU1N蛋白的基因。擴(kuò)增編碼N蛋白的氨基酸殘基1-441的序列，并按讀框克隆入表達(dá)載體pET-28b(+)(Novagen，Madison，WI，USA)的EcoRI和NotI位點(diǎn)中，在6組氨酸殘基系列的下游。在大腸桿菌中表達(dá)(His)6-標(biāo)記(SEQ ID NO27)重組N蛋白，并使用Ni2+-裝載的HiTrap螯合系統(tǒng)(Amersham Pharmacia，USA)按照生產(chǎn)商的說明純化。
如下實(shí)施蛋白質(zhì)印跡分析將200ng純化的(His)6-標(biāo)記(SEQ IDNO27)重組CoV-HKU1N蛋白裝載入十二烷基硫酸鈉(SDS)-10％聚丙烯酰胺凝膠的各個(gè)孔中，隨后電印跡至硝酸纖維素(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上。將印跡切成條，將印跡條分別與在患者生病第1、2和4周中獲得的血清樣品的1∶2000稀釋液溫育。兩個(gè)健康供血者的血清樣品用作對(duì)照。用ECL熒光系統(tǒng)(Amersham Life Science，Buckinghamshire，UK)檢測(cè)抗原-抗體相互作用。
由在患者生病第2和4周中收集的血清樣品觀察到幾條主要免疫反應(yīng)條帶(圖8，泳道2和3)。最大條帶的大小約53kDa，與全長(His)6-標(biāo)記(SEQ ID NO27)N蛋白的預(yù)期大小52.8kDa一致，而其它條帶與(His)6-標(biāo)記(SEQ ID NO27)N蛋白的降解產(chǎn)物一致。由生病第1周的患者(圖8，泳道1)和兩個(gè)健康供血者(圖8，泳道4和5)獲得的血清樣品僅觀測(cè)到非常微弱的條帶。
使用如上所述制備的CoV-HKU1重組N蛋白進(jìn)行ELISA。用20ng的純化(His)6-標(biāo)記(SEQ ID NO27)重組N蛋白包被Nunc免疫平板(Roskilde，Denmark)的各個(gè)孔12小時(shí)，然后在含2％牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽水中封閉。將由生病第1、2和4周的患者獲得的血清樣品連續(xù)稀釋，并加入到(His)6-標(biāo)記(SEQ ID NO27)重組N蛋白包被的平板的孔中，每孔100μl總體積，并于37℃溫育2小時(shí)。在用洗滌緩沖液洗滌5次后，以100μl/孔將1∶4000稀釋度的辣根過氧化物酶綴合山羊抗人IgG抗體(Zymed Laboratories Inc.，South San Francisco，CA，USA)加入到各個(gè)孔中，并于37℃溫育1小時(shí)。在用洗滌緩沖液洗滌5次后，將100μl稀釋的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(Zymed Laboratories Inc.)加入到各個(gè)孔中，并于室溫溫育15分鐘。加入100μl 0.3M H2SO4，并檢測(cè)各個(gè)孔450nm的吸光度。各個(gè)樣品以雙份進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算各個(gè)血清的平均吸光度。
用不同稀釋度的(His)6-標(biāo)記(SEQ ID NO27)重組N蛋白包被抗原和由生病第4周的患者獲得的血清實(shí)施箱滴定法。分別鑒別出以下結(jié)果每個(gè)ELISA孔20ng和80ng純化的(His)6-標(biāo)記重組N蛋白為理想平板包被量，1∶1000和1∶20為用于IgG和IgM檢測(cè)的最優(yōu)血清稀釋度。
為建立測(cè)試基線，在CoV-HKU1抗體ELSIA中檢測(cè)100名健康供血者的血清樣品(對(duì)于IgG和IgM，分別以1∶1000和1∶20稀釋)。對(duì)于100份健康供血者血清，IgG和IgM檢測(cè)的平均ELISA OD450值為0.178和0.224，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.070和0.117。分別選擇0.387和0.576的吸光度為IgG和IgM的截?cái)嘀?等于健康對(duì)照平均值的和以及標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍)。使用這些截?cái)嘀?，在生病?、2和4周中獲得的患者血清樣品的IgG滴度分別為＜1∶1000、1∶2000和1∶8000(圖7)，IgM的滴度分別為1∶20、1∶40和1∶80(未列出數(shù)據(jù))。
6.1.3RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCRRT-PCR實(shí)驗(yàn)開發(fā)用于從NPA樣品檢測(cè)CoV-HKU1序列的RT-PCR。用隨機(jī)六聚體逆轉(zhuǎn)錄來自臨床樣品的總RNA，cDNA用引物5′-GGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA-3′(SEQIDNO4)和5′-CCATCATCAGATAGAATCATCATA-3′(SEQ ID NO5)在2.5mM MgCl2存在下擴(kuò)增(94℃8分鐘，然后94℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃1分鐘的循環(huán)40次)，所述兩種引物基于CoV-HKU1的RNA依賴性RNA聚合酶編碼序列(SEQ ID NO1)構(gòu)建。
典型的RT-PCR方案概述如下1.RNA提取通過QIAquick病毒RNA提取試劑盒從140μl NPA樣品中提取RNA，洗脫在50μl洗脫緩沖液中。
2.逆轉(zhuǎn)錄RNA11.5μl0.1M DTT 2μl5x緩沖液 4μl10mM dNTP 1μlSuperscript II，200U/μl(Invitro gen) 1μl隨機(jī)六聚體，0.3μg/μl 0.5μl
反應(yīng)條件42℃，50分鐘94℃，3分鐘4℃3.PCR如下在50μl反應(yīng)物中擴(kuò)增通過隨機(jī)引物產(chǎn)生的cDNAcDNA2μl10mM dNTP 0.5μl10x緩沖液 5μl25mM MgCl25μl25μM正向引物 0.5μl25μM反向引物 0.5μlAmpliTaq Gold聚合酶，5U/μl(Applied Biosystems) 0.25μl水 36.25μl熱循環(huán)條件95℃10分鐘，然后95℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃1分鐘的循環(huán)40次。
4.引物序列引物基于CoV-HKU1的RNA依賴性RNA聚合酶編碼序列(SEQ IDNO1)設(shè)計(jì)。
正向引物5′-GGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA-3′(SEQ ID NO4)反向引物5′-CCATCATCAGATAGAATCATCATA-3′(SEQ ID NO5)產(chǎn)物大小440bp實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)利用QIAamp病毒RNA微型試劑盒(Qiagen)按生產(chǎn)商的說明從140μl鼻咽抽吸物(NPA)提取總RNA。在含有0.15μg隨機(jī)六聚體、10mmol/LDTT和0.5mmol/L dNTP的20μl反應(yīng)混和物中，將10μl洗脫的RNA樣品用200U SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)按說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后在SYBRGreen I熒光反應(yīng)(Roche，IN)混合物中擴(kuò)增互補(bǔ)DNA。簡(jiǎn)單地說，用Light-Cycler(Roche)按PCR程序[95℃10分鐘，然后95℃10分鐘、57℃5秒、72℃9秒循環(huán)50次]，熱循環(huán)含有2μl cDNA、3.5mmol/LMgCl2、0.25μmol/L正向引物[5′-GGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA-3′(SEQ ID NO4)]和0.25μmol/L反向引物[5′-CCATCATCAGATAGAATCATCATA-3′(SEQ ID NO5)]的20μl反應(yīng)混合物。含有目標(biāo)序列的質(zhì)粒用作陽性對(duì)照。在每個(gè)循環(huán)的延伸步驟結(jié)束時(shí)捕捉這些反應(yīng)的熒光信號(hào)。為確定試驗(yàn)的特異性，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)PCR產(chǎn)物(440個(gè)堿基對(duì))進(jìn)行解鏈曲線分析(65℃至95℃，每秒0.1℃)(數(shù)據(jù)未列出)。
每周跟蹤鼻咽抽吸物中的CoV-HKU1RNA量。定量RT-PCR表明，在患病第1周收集的2份鼻咽抽吸物中CoV-HKU1RNA量為8.5×105和9.6×106拷貝/ml，在患病第2周的2個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分別收集的NPA中的CoV-HKU1RNA量為1.5×105拷貝/ml，但在患病第3、4和5周收集的NPA中未檢測(cè)到CoV-HKU1RNA(圖7)。在患病第1和2周收集的患者尿和糞中也未檢測(cè)到CoV-HKU1RNA。
討論CoV-HKU1基因組為29926個(gè)核苷酸長的多腺苷酸化RNA。G+C含量為32％，在可得到基因組序列的所有已知冠狀病毒中是最低的，GC偏斜0.19。表1顯示了CoV-HKU1和其它冠狀病毒的基因組特征對(duì)比，以及CoV-HKU1預(yù)測(cè)的胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CLpro)、RNA依賴性RNA聚合酶(Pol)、解螺旋酶(Hel)、血凝素-酯酶(HE)、刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核殼蛋白(N)與其它冠狀病毒的對(duì)應(yīng)蛋白之間的氨基酸同一性。
表1
aHCoV-229E，人冠狀病毒229E；PEDV豬流行性腹瀉病毒；PTGV豬傳染性胃腸炎病毒；CCoV貓腸冠狀病毒；HCoV-NL63人冠狀病毒NL63；HCoV-OC43人冠狀病毒OC43；MHV鼠肝炎病毒；BCoV牛冠狀病毒；SDAV大鼠涎淚腺炎冠狀病毒；ECoV馬冠狀病毒NC99；PHEV豬凝血性腦脊髓炎病毒；IBV感染性支氣管炎病毒；SARS-CoVSARS冠狀病毒。
基因組結(jié)構(gòu)與其它冠狀病毒相同，具有5′-復(fù)制酶、S、E、M、N-3′的特征基因次序。5′和3′末端均含有短的非翻譯區(qū)?；蚪M的5′末端由推定的5′前導(dǎo)序列組成。推定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(TRS)基序5′-CUAAAC-3′存在于前導(dǎo)序列的3′末端，在各個(gè)翻譯的ORF之前，編碼推定的E蛋白的ORF4和ORF6除外。表2顯示了在CoV-HKU1基因組中的推定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。
表2
如同在SDAV(涎淚腺炎病毒)和MHV(小鼠肝炎病毒)中一樣，ORF6可具有與ORF 5相同的TRS，提示E蛋白的翻譯是帽非依賴性的，可能借助其內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。3′非翻譯區(qū)含在N基因下游59-119bp的預(yù)測(cè)假結(jié)結(jié)構(gòu)。這種假結(jié)結(jié)構(gòu)在冠狀病毒中是高度保守的，在冠狀病毒RNA復(fù)制中起作用。
CoV-HKU1基因組的編碼可能性示于圖4和表3，胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CLpro)、復(fù)制酶、解螺旋酶、血凝素-酯酶(HE)、S、E、M和N的種系發(fā)生分析示于圖5A和5B。
表3
復(fù)制酶1a ORF(堿基206-13600)和復(fù)制酶1b ORF(堿基13600-21753)占CoV-HKU1基因組的21.5kb。和其它冠狀病毒類似，移碼中斷了蛋白編碼區(qū)，并分開了1a和1b ORF。該ORF編碼許多推定蛋白，包括具有兩個(gè)拷貝的PLP結(jié)構(gòu)域PLP1pro和PLP2pro的木瓜蛋白酶樣蛋白酶(PLP)、3CLpro、復(fù)制酶、解螺旋酶和其它未知功能的蛋白。這些蛋白通過蛋白酶剪切大多聚蛋白產(chǎn)生(圖4)。所獲推定蛋白的序列與MHV基因組中的序列相同。通過在ORF 1a和ORF 1b接合處假結(jié)結(jié)構(gòu)上游的保守位點(diǎn)(UUUAAAC)的a-1核糖體移碼合成此多聚蛋白。此核糖體移碼應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)7182個(gè)氨基酸的多聚蛋白，其與其它第2組冠狀病毒的多聚蛋白具有75-77％的氨基酸同一性，與其它非第2組冠狀病毒的多聚蛋白具有43-47％的氨基酸同一性。編碼928個(gè)氨基酸的CoV-HKU1復(fù)制酶基因與其它第2組冠狀病毒的復(fù)制酶具有87-89％的氨基酸同一性，與其它非第2組冠狀病毒的復(fù)制酶具有54-65％的氨基酸同一性(表4和圖5A)。表4顯示了CoV-HKU1的預(yù)測(cè)胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CLpro)、復(fù)制酶(Rep)、解螺旋酶(Hel)、血凝素-酯酶(HE)、刺突蛋白(S)、殼蛋白(E)、膜蛋白(M)和核殼蛋白(N)與其它冠狀病毒的對(duì)應(yīng)蛋白之間的氨基酸同一性。
表4
HCoV-229E＝人冠狀病毒229E；PEDV豬流行性腹瀉病毒；PTGV豬傳染性胃腸炎病毒；CCoV貓腸冠狀病毒；HCoV-NL63人冠狀病毒NL63；HCoV-OC43人冠狀病毒OC43；MHV鼠肝炎病毒；BCoV牛冠狀病毒；SDAV大鼠涎淚腺炎冠狀病毒；ECoV馬冠狀病毒NC99；PHEV豬凝血性腦脊髓炎病毒；IBV感染性支氣管炎病毒；SARS-CoVSARS冠狀病毒在所有冠狀病毒的3CLpro中都保守的催化性組氨酸和半胱氨酸氨基酸殘基存在于CoV-HKU1的預(yù)測(cè)3CLpro中(ORF 1a的氨基酸His3375和Cys3479)。在推定PLP(ORF 1a的氨基酸殘基945-1104)的N-末端有14個(gè)編碼NDDEDVVTGD(SEQ ID NO15)的30堿基重復(fù)序列的串聯(lián)拷貝，之后是編碼NNDEEIVTGD(SEQ ID NO16)和NDDQIVVTGD(SEQ IDNO17)的兩個(gè)30堿基區(qū)域，其位于PLP結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)拷貝PLP1pro的上游。此重復(fù)序列在其它冠狀病毒中未觀測(cè)到。
ORF 2(堿基21773-22933)編碼具有386個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)HE糖蛋白。CoV-HKU1的HE蛋白與其它第2組冠狀病毒的HE蛋白具有50-57％的氨基酸同一性(表4和圖5A)。ORF的PFAM和InterProScan分析表明，預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸殘基1-349為血凝素酯酶家族的一員(PFAM登錄號(hào)PF03996，INTERPRO登錄號(hào)IPR007142)。該家族包含存在于病毒表面上并與細(xì)胞感染過程相關(guān)的膜糖蛋白。其包含血凝素鏈1(HE1)和血凝素鏈2(HE2)，與通過二硫鍵連接兩條鏈形成的各個(gè)單體形成同三聚體。而且，該ORF的PFAM和InterProScan分析表明，預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸殘基122-236為HE-融合糖蛋白家族的血凝素結(jié)構(gòu)域(PFAM登錄號(hào)PF02710，INTERPRO登錄號(hào)IPR003860)。HE還存在于其它第2組冠狀病毒和C型流感病毒中。SignalP分析揭示，信號(hào)肽可能性為0.738，在殘基13和14之間具有切割位點(diǎn)。盡管該ORF的TMpred和TMHMM分析分別顯示出4和3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，但該ORF的PHDhtm分析僅顯示出一個(gè)在位置354-376的跨膜結(jié)構(gòu)域。這與在BCoV(牛冠狀病毒)和鳥嘴海雀病毒的HE的C末端中僅報(bào)告了一個(gè)跨膜區(qū)一致。CoV-HKU1的HE蛋白的PrositeScan分析揭示有8個(gè)潛在的N-連接糖基化(6個(gè)NXS和2個(gè)NXT)位點(diǎn)。這些位點(diǎn)位于位置83(NYT)、110(NGS)、145(NVS)、168(NYS)、193(NFS)、286(NSS)、314(NVS)和328(NFT)。神經(jīng)氨酸酯O-乙酰-酯酶活性的推定活性位點(diǎn)FGDS(SEQ ID NO18)位于31-34位。
ORF 3(堿基22942-27012)編碼具有1356個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)S糖蛋白(PFAM登錄號(hào)PF01601)。CoV-HKU1的S蛋白與其它第2組冠狀病毒的S蛋白具有58-61％的氨基酸同一性，但與第1組、第3組和SARS-CoV的S蛋白的氨基酸同一性低于35％(表4和圖5B)。InterProScan分析預(yù)測(cè)其為I型膜糖蛋白。CoV-HKU1的S蛋白的重要特征示于圖6。CoV-HKU1的S蛋白的PrositeScan揭示有28個(gè)潛在的N-連接糖基化(12個(gè)NXS和16個(gè)NXT)位點(diǎn)。SignalP分析揭示信號(hào)肽可能性為0.909，在殘基13和14之間具有切割位點(diǎn)。通過與其它第2組冠狀病毒S蛋白的多重比對(duì)，鑒別出潛在的切割位點(diǎn)，其位于RRKRR(SEQ ID NO19)之后，在殘基760和761之間，在此情況下S被切割為S1和S2。緊鄰RRKRR(SEQ ID NO19)上游有一列5絲氨酸殘基，其在任何其它已知冠狀病毒中都不存在(圖6)。S蛋白(殘基15-1300)的大部分暴露在病毒外表，在C末端具有跨膜結(jié)構(gòu)域(該ORF的TMHMM分析顯示在位置1301-1356有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域)，之后是富含半胱氨酸殘基的胞質(zhì)尾區(qū)。通過與其它冠狀病毒的多重比對(duì)鑒別出存在兩個(gè)七氨基酸重復(fù)序列(HR)，位于殘基982-1083(HR1)和1250-1297(HR2)。在MHV中，已經(jīng)證實(shí)其S蛋白結(jié)合的受體是CEACAM1，CEACAM1是免疫球蛋白超家族中的糖蛋白癌胚抗原(CEA)家族的一員。此外，通過定點(diǎn)誘變還已經(jīng)表明，在S蛋白N末端中的3個(gè)保守區(qū)(位點(diǎn)I、II和III)和某些氨基酸殘基(MHV中的Thr62、Thr212、Tyr214和Tyr216)對(duì)其受體結(jié)合活性特別重要。通過與MHV和其它第2組冠狀病毒的S蛋白的N末端330個(gè)氨基酸的多重比對(duì)，觀察到這些保守區(qū)和氨基酸存在于CoV-HKU1中(圖6)。這暗示，CoV-HKU1的受體可能是呼吸道中細(xì)胞表面上的CEA家族的一員。另一方面，對(duì)于HCoV-OC43而言，已體外表明S蛋白受體為唾液酸。但是，還沒有完全明確HCoV-OC43的S蛋白上對(duì)受體結(jié)合重要的氨基酸殘基。
ORF 4(堿基26960-27070)編碼具有36個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)蛋白。該ORF與編碼S蛋白的ORF重疊。此ORF不存在于其它冠狀病毒中，該ORF的BlastP分析未顯示任何命中結(jié)果。
ORF 5(堿基27051-27380)編碼具有109個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)蛋白。該ORF與編碼E蛋白的ORF重疊。該ORF的PFAM分析表明，預(yù)測(cè)蛋白為冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS2家族的一員(PFAM登錄號(hào)PF04753)。Tmpred和TMHMM分析未揭示任何跨膜螺旋。CoV-HKU1的該預(yù)測(cè)蛋白與其它第2組冠狀病毒的對(duì)應(yīng)蛋白具有44-51％的氨基酸同一性。
ORF 6(堿基27373-27621)編碼具有82個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)E蛋白。CoV-HKU1的E蛋白與其它第2組冠狀病毒的E蛋白具有54-60％的氨基酸同一性，但與第1組、第3組和SARS-CoV的E蛋白的氨基酸同一性低于35％(表4和圖5B)。該ORF的PFAM和InterProScan分析表明，預(yù)測(cè)E蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白NS3/Small包膜蛋白E(NS3_envE)家族的一員(PFAM登錄號(hào)PF02723)。SignalP分析預(yù)測(cè)存在跨膜錨定區(qū)(可能性0.995)。該ORF的TMpred分析表明在位置16-34和39-59有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，該ORF的TMHMM分析顯示在位置10-32和39-58有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，與預(yù)期的E蛋白和病毒包膜相關(guān)一致。兩個(gè)程序都預(yù)測(cè)N末端和C末端均位于病毒表面。
ORF 7(堿基27633-28304)編碼具有223個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)M蛋白。CoV-HKU1的M蛋白與其它第2組冠狀病毒的M蛋白具有76-78％的氨基酸同一性，但與第1組、第3組和SARS-CoV的M蛋白的氨基酸同一性低于40％(表4和圖5B)。該ORF的PFAM分析表明，預(yù)測(cè)的M蛋白是冠狀病毒基質(zhì)糖蛋白(Corona_M)家族的一員(PFAM登錄號(hào)PF01635)。SignalP分析預(yù)測(cè)存在跨膜錨定區(qū)(可能性0.926)。該ORF的TMpred分析顯示在位置21-42、53-74和77-98具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。該ORF的TMHMM分析顯示在位置20-39、46-68和78-100具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。N末端的19-20個(gè)氨基酸位于病毒外部，C末端123-125個(gè)氨基酸的親水結(jié)構(gòu)域位于病毒內(nèi)部。
ORF 8(堿基28320-29645)編碼具有441個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)N蛋白(PFAM登錄號(hào)PF00937)。CoV-HKU1的N蛋白與其它第2組冠狀病毒的N蛋白具有57-62％的氨基酸同一性，但與第1組、第3組和SARS-CoV的N蛋白的氨基酸同一性低于40％(表4和圖5B)。
ORF 9(堿基28342-28959)編碼205個(gè)氨基酸的假定蛋白(N2)，其在編碼預(yù)測(cè)N蛋白的ORF中。該ORF的PFAM分析表明預(yù)測(cè)蛋白是冠狀病毒核殼I蛋白(Corona_I)家族的一員(PFAM登錄號(hào)PF03187)。CoV-HKU1的該假定N2蛋白與其他第2組冠狀病毒N2蛋白具有32-39％的氨基酸同一性。
我們報(bào)告了在肺炎患者鼻咽抽吸物中檢測(cè)到的新冠狀病毒的特征和完整基因組序列。該病毒在第一名患者中的臨床表現(xiàn)以在其患病第1周當(dāng)中患者鼻咽抽吸物中的高病毒載量為證，這與患者出現(xiàn)的急性癥狀相符。病毒載量在患病第2周當(dāng)中降低，在患病第3周不可檢測(cè)。另外，病毒載量的下降伴隨著疾病的康復(fù)，并出現(xiàn)針對(duì)病毒的重組N蛋白的特異性抗體應(yīng)答。和其它最近發(fā)現(xiàn)的病毒如丙型肝炎病毒、GB病毒C、輸液傳染性病毒和SEN病毒類似，不能使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系由細(xì)胞培養(yǎng)物中回收本發(fā)明的病毒。這可能與冠狀病毒固有的低回收率有關(guān)。人冠狀病毒特別難以體外培養(yǎng)。在識(shí)別出HCoV-229E和HCoV-OC43之后幾十年，仍僅可獲得少量原代病毒分離株，HCoV-OC43的原代分離需要器官培養(yǎng)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，僅可由少于20％的血清學(xué)和RT-PCR證明的SARS-CoV肺炎患者中回收SARS-CoV。因此，新冠狀病毒CoV-HKU1迄今為止被證實(shí)難以體外培養(yǎng)并不令人驚奇。在發(fā)現(xiàn)第一名患者中的CoV-HKU1之后，我們對(duì)在SARS傳染期最后一年收集的400份鼻咽抽吸物進(jìn)行初步研究。在這400份鼻咽抽吸物中，在1個(gè)標(biāo)本中檢測(cè)到CoV-HKU1，病毒載量與第一名患者的病毒載量相當(dāng)。這些結(jié)果提示，CoV-HKU1不僅僅偶然存在于1名患者中，而是與肺炎相關(guān)的先前未認(rèn)識(shí)的冠狀病毒。
基因組分析已揭示，CoV-HKU1是第2組冠狀病毒。CoV-HKU1的基因組結(jié)構(gòu)與其它冠狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)一致，具有特征基因次序，即5′-復(fù)制酶、S、E、M、N-3′、在5′和3′兩個(gè)末端的短非翻譯區(qū)、5′保守冠狀病毒核心前導(dǎo)序列、多個(gè)ORF上游的推定TRS和3′非翻譯區(qū)中的保守假結(jié)。和其它組的冠狀病毒相反，CoV-HKU1含為第2組冠狀病毒的特征的某些特性，包括存在HE、ORF 5和N2。3CLpro、復(fù)制酶、解螺旋酶、S、E、M和N蛋白的種系發(fā)生分析表明，CoV-HKU1的這些基因與其它第2組冠狀病毒的對(duì)應(yīng)基因成簇。但是，CoV-HKU1的蛋白在種系發(fā)生樹中形成不同的分支，表明CoV-HKU1是該組的獨(dú)特成員，與第2組冠狀病毒的任何其它已知成員不是非常緊密地相關(guān)(圖4A和4B)。
除了推定蛋白的種系發(fā)生分析以外，CoV-HKU1還具有不同于其它第2組冠狀病毒的某些特征。和其它第2組冠狀病毒相比，在CoV-HKU1的復(fù)制酶ORF 1b和HE ORF 2之間有約800bp的缺失。在包括MHV、SDAV、HCoV-OC43和BcoV在內(nèi)的其它第2組冠狀病毒中，在復(fù)制酶ORF 1b和HE ORF 2之間存在798-837bp(273-278氨基酸)的ORF。該ORF編碼冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS2a家族的蛋白(PFAM登錄號(hào)PF05213)。該ORF在CoV-HKU1a中不存在表明這有可能是冠狀病毒的非必需基因。除了缺失以外，ORF 1a中推定PLP的N末端含編碼高度酸性結(jié)構(gòu)域的30bp重復(fù)序列的14個(gè)串聯(lián)拷貝。已在人、大鼠和寄生物的基因組中發(fā)現(xiàn)具有不同氨基酸組成的相似重復(fù)序列，但還沒有在其它冠狀病毒中發(fā)現(xiàn)。還未充分了解這些重復(fù)序列的功能，盡管某些錨定區(qū)域提示該重復(fù)序列可能是重要的抗原，其生物學(xué)作用可能涉及其特有的三維結(jié)構(gòu)。中華枝睪吸蟲(Clonorchis sinensis)的卵黃腺抗原性蛋白含編碼DGGAQPPKSG(SEQ ID NO20)的30bp重復(fù)序列的23個(gè)串聯(lián)拷貝。對(duì)惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)而言，已經(jīng)表明，環(huán)子孢子蛋白的抗原性源于其重復(fù)的表位結(jié)構(gòu)。還已經(jīng)提示，串聯(lián)重復(fù)的肽可在感染宿主中誘導(dǎo)強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，因此還可用于血清學(xué)診斷。應(yīng)進(jìn)行其它的實(shí)驗(yàn)，以描繪CoV-HKU1的PLP中重復(fù)序列的抗原特性、生物學(xué)作用和可能的臨床有效性。
香港的地理、政治和經(jīng)濟(jì)位置使其處于研究新興傳染病的獨(dú)特位置。香港作為中國南方的門戶，成千上萬的人每天經(jīng)陸地和航空過境，具有由中國、南亞國家和世界其它地方輸入和輸出傳染病的高可能性。在1997年，香港報(bào)道了首個(gè)A型禽流感H5N1病毒感染的18人病例。在2003年早期，在香港診斷出兩例由在福建獲得的A型禽流感(H5N1)引起的人感染病例，這對(duì)隨后在2004年于東南亞即將發(fā)生威脅人和家禽的疾病提出了早期警告。對(duì)于SARS流行，盡管流行病學(xué)和基因組學(xué)證據(jù)都揭示該病于2002年11月首先發(fā)生在中國南方，但沒有得到更多的國際關(guān)注，直至該病擴(kuò)展至香港，并通過香港傳播至新加坡、多倫多、越南和美國。就新出現(xiàn)的細(xì)菌感染來說，50％與香港海鷗型菌(Laribacter hongkongensis)的回收相關(guān)的胃腸炎患者具有到中國南方旅行的近期史。在本報(bào)告中，其中1名患者在出現(xiàn)呼吸道疾病之前也有到中國深圳旅行的近期史。我們推測(cè)，他可能在深圳接觸了病毒。對(duì)在該地新出現(xiàn)的傳染性病原體的更深入監(jiān)測(cè)已得到授權(quán)。
6.2實(shí)施例2我們?cè)?2月的周期當(dāng)中由社區(qū)獲得性肺炎患者前瞻性收集了鼻咽抽吸物(NPA)。使用CoV-HKU1特異性引物通過RT-PCR由提取的RNA擴(kuò)增453-bp的CoV-HKU1pol基因片段。分析CoV-HKU1相關(guān)性肺炎患者的流行病學(xué)、臨床、實(shí)驗(yàn)室和放射學(xué)特征。使用基于重組CoV-HKU1N蛋白的ELISA檢測(cè)特異性抗體。擴(kuò)增并測(cè)序CoV-HKU1的完整pol、S和N基因。由香港和中國南方的56只野生和馴養(yǎng)動(dòng)物的208份鼻咽拭子和糞便樣品提取RNA，使用CoV-HKU1特異性引物對(duì)該RNA進(jìn)行CoV-HKU1pol基因的RT-PCR。
6.2.1患者和微生物學(xué)方法將在12個(gè)月周期內(nèi)[2003年3月22日(SARS在香港開始流行)-2004年3月21日]由社區(qū)獲得性肺炎患者前瞻性收集的所有NPA納入本研究中，這些NPA送至香港4家地區(qū)醫(yī)院的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)SARS-CoV但RT-PCR的SARS-CoV RNA為陰性。社區(qū)獲得性肺炎被定義為在入院前或入院后48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)與急性下呼吸道感染一致的癥狀和病征，伴有無法有其它解釋的新胸片陰影。一旦由NPA檢測(cè)出CoV-HKU1，就由兩名傳染病醫(yī)師取回并檢查對(duì)應(yīng)患者的醫(yī)院記錄、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果和胸片。對(duì)由NPA提取的RNA進(jìn)行用于A型流感病毒和人間質(zhì)肺炎病毒的RT-PCR(Peiris JSM等，Lancet 2003；3611319-25)。分別通過SERODIA-MYCO II(Fujirebio Inc.，Tokyo，Japan)、肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)MIF IgG(Focus technologies，Cypress，CA，USA)、間接免疫熒光(MRL，San Diego，CA，USA)和我們最近開發(fā)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)(Woo PCY等，Lancet 2004；363841-5)，對(duì)可獲得的儲(chǔ)存血清樣品進(jìn)行血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，用于檢測(cè)抗支原體(Mycoplasma)、衣原體(Chlamydia)、軍團(tuán)菌(Legionella)和SARS-CoV的抗體。
為測(cè)定與CoV-HKU1肺炎相關(guān)的可能風(fēng)險(xiǎn)因子，由患有社區(qū)獲得性肺炎但其NPA為CoV-HKU1陰性的患者對(duì)每名CoV-HKU1肺炎患者隨機(jī)選擇2名年齡和性別匹配的對(duì)照。對(duì)照比對(duì)應(yīng)的CoV-HKU1肺炎患者年長或年少5歲以內(nèi)，在對(duì)應(yīng)的CoV-HKU1肺炎患者入院前或后15天內(nèi)入院。由兩名傳染病醫(yī)師取回并檢查對(duì)照的醫(yī)院記錄、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果和胸片。
6.2.2RNA提取在收到標(biāo)本的10小時(shí)內(nèi)，使用QIAamp病毒RNA微型試劑盒(QIAgen，Hilden，Germany)按照生產(chǎn)商的說明由NPA中提取病毒RNA。洗脫的RNA用作RT-PCR模板。所有提取的RNA都立即儲(chǔ)存于-70℃，直至使用。6.2.3使用冠狀病毒-HKU1特異性引物進(jìn)行的冠狀病毒-HKU1的RNA依賴性RNA聚合酶基因的RT-PCR和DNA測(cè)序通過多重比對(duì)兩株CoV-HKU1的pol基因的核苷酸序列(Woo，PC等，J.of Virol.，2005，884-895頁)和其它可獲得的已知人冠狀病毒pol基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)CoV-HKU1特異性引物5′-AAAGGATGT-TGACAACCCTGTT-3′(LPW1926；SEQ ID NO2968)和5′-ATCATCATACTAAAATGC-TTACA-3′(LPW1927；SEQ ID NO2969)，使用以上引物通過RT-PCR擴(kuò)增CoV-HKU1的RNA依賴性RNA聚合酶(pol)基因的453-bp片段。使用SuperScript II試劑盒(Invitrogen，San Diego，CA，USA)按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行RT。PCR混合物(50μl)含cDNA、PCR緩沖液(10mM Tris-HCl pH 8.3、50mM KCl、3mM MgCl2和0.01％明膠)、200μM的各種dNTP和1.0U Taq聚合酶(Boehringer Mannheim，Germany)。在自動(dòng)化熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer Cetus，Gouda，The Netherlands)中以94℃1分鐘、48℃1分鐘和72℃1分鐘循環(huán)40次和72℃10分鐘的最終延伸擴(kuò)增混合物。蒸餾水用作陰性對(duì)照。為確保CoV-HKU1特異性引物的高特異性，還使用兩個(gè)CoV-HKU1特異性引物對(duì)由200份A和B型流感病毒、副流感病毒1-3、呼吸道合胞體病毒(RSV)或腺病毒抗原陽性的NPA提取的RNA以及HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和SARS-CoV的RNA進(jìn)行RT-PCR。
將10μl的各種擴(kuò)增的產(chǎn)物與分子量標(biāo)記(ΦX-174DNA HaeIII消化，Boehringer Mannheim，Germany)在1.5％(w/v)瓊脂糖凝膠中平行電泳。以100V在Tris-硼酸鹽-EDTA緩沖液中電泳1.5小時(shí)。用溴化乙錠(0.5μg/ml)染色凝膠15分鐘，淋洗，并在紫外燈照射下照相。
使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAgen，Hilden，Germany)凝膠純化PCR產(chǎn)物。使用兩個(gè)PCR引物，用ABI Prism 3700DNA分析儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)按照生產(chǎn)商的說明對(duì)PCR產(chǎn)物的兩條鏈測(cè)序兩次。將PCR產(chǎn)物序列與兩株CoV-HKU1的pol基因(Woo，PC等，J.of Virol.，2005，884-895頁)序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中冠狀病毒pol基因序列對(duì)比。
6.2.4使用CoV-HKU1的重組核殼蛋白的ELISA按照我們公開的方案(Woo，PC等，J.of Virol.，2005，884-895頁)實(shí)施基于ELISA的IgG和IgM抗體測(cè)試。簡(jiǎn)單地講，用純化的(His)6-標(biāo)記重組N蛋白(對(duì)于IgG為20ng，對(duì)于IgM為80ng)包被Nunc免疫平板(Roskilde，Denmark)的各個(gè)孔1小時(shí)，然后在含5％脫脂奶的磷酸緩沖鹽水中封閉。將在患病的急性期和康復(fù)期當(dāng)中由患者獲得的血清樣品連續(xù)稀釋，并加入到(His)6-標(biāo)記(SEQ ID NO27)重組N蛋白包被的平板的各個(gè)孔中，總體積100μl，并于37℃溫育2小時(shí)。在用清洗緩沖液清洗5次后，將100μl稀釋的辣根過氧化物酶綴合山羊抗人IgG(1∶4000)和小鼠抗人IgM(1∶1000)抗體(Zymed Laboratories Inc.，South San Francisco，CA，USA)加入到各個(gè)孔中，并于37℃溫育1小時(shí)。在用洗滌緩沖液洗滌5次后，將100μl稀釋的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(Zymed Laboratories Inc.)加入到各個(gè)孔中，并于室溫溫育15分鐘。加入100μl 0.3M H2SO4，并檢測(cè)各個(gè)孔450nm的吸光度。各個(gè)樣品以雙份進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算各個(gè)血清的平均吸光度。
6.2.5冠狀病毒-HKU1的完整RNA依賴性RNA聚合酶、刺突蛋白和核殼蛋白基因的RT-PCR和測(cè)序以及種系發(fā)生分析使用由NPA提取的RNA作為模板，對(duì)由10名患者中9名的具有足量可用RNA的NPA獲得的CoV-HKU1的完整pol、刺突蛋白(S)和N基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。通過組合的隨機(jī)引發(fā)和寡聚脫氧胸苷(Oligo(dT))引發(fā)策略將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。通過多重比對(duì)編碼兩個(gè)CoV-HKU1基因組(Woo，PC等，J.of Virol.，2005，884-895頁)中編碼pol、S和N基因的區(qū)域和其它第2組冠狀病毒的這些區(qū)域，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，并由第一輪和隨后輪次的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)另外的引物，利用此簡(jiǎn)并引物和另外的引物擴(kuò)增cDNA。組裝序列，并人工編輯，以產(chǎn)生不同患者的CoV-HKU1的pol、S和N基因的完整序列。將pol、S和N基因的核苷酸和推斷氨基酸序列與兩株CoV-HKU1(Woo，PC等，J.of Virol.，2005，884-895頁)和其它第2組冠狀病毒的這些序列對(duì)比。使用采用GrowTree(Genetics ComputerGroup，Inc.)的PileUp方法進(jìn)行種系發(fā)生樹構(gòu)建。
6.2.6動(dòng)物監(jiān)測(cè)對(duì)香港和中國南方的56只野生和馴養(yǎng)動(dòng)物[包括鼬獾(Melogalemoschata)、家貓(Felis catus)、豬獾(Arctonyx collaris)、果子貍(Pagumalarvata)、貉(Nyctereutes procyonoides)、帚尾鼠(Typhlomys cinereus)、鯪鯉(Manis pentadactyla)、海貍鼠(Myocastor coypus)、狗(Canis familiaris)、兔(Leporidae科)、蛇(Serpentes亞目)和蝙蝠(Microchiroptera亞目)]的208份鼻咽拭子和糞便樣品(Guan Y等，Science 2003；302276-8)進(jìn)行RNA提取，使用CoV-HKU1特異性引物(LPW1926；SEQ ID NO2968和LPW1927；SEQ ID NO2969)和上述方案進(jìn)行CoV-HKU1pol基因的RT-PCR。
6.2.7結(jié)果臨床和實(shí)驗(yàn)室特征12個(gè)月周期當(dāng)中由418名社區(qū)獲得性肺炎患者[男性∶女性＝198∶220，年齡(平均值±SD)＝49±26]獲得NPA，在4所醫(yī)院鑒別其中檢測(cè)SARS-CoV但經(jīng)RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV RNA為陰性。在10名(2.5％)患者中擴(kuò)增和測(cè)序了CoV-HKU1的pol基因的453-bp片段。序列分析揭示，該片段的序列與在上述實(shí)施例1中所述的報(bào)告索引患者(第5號(hào)患者)的CoV-HKU1 pol基因序列(圖11)(Woo，PC等，J.of Virol.，2005，884-895頁)之間有0-2％核苷酸差異。相反，使用我們的CoV-HKU1特異性引物，在A和B型流感病毒、副流感病毒1-3、RSV或腺病毒抗原陽性的200份NPA以及HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和SARS-CoV的RNA中沒有一個(gè)是RT-PCR陽性。
表5概述了包括第5號(hào)患者的10名CoV-HKU1相關(guān)性社區(qū)獲得性肺炎患者(Woo，PC等，J.of Virol.，2005，884-895)的流行病學(xué)、臨床和放射學(xué)特征。在10個(gè)病例中未鑒別出流行病學(xué)相關(guān)性。所有病例都發(fā)生在冬季或春季(1-3月)。平均年齡是71.5歲(范圍13-96歲)。7人是男性，3人為女性。9人是中國人，1人是阿拉伯人。8人患有基礎(chǔ)疾病，4人患有呼吸道基礎(chǔ)疾病。4人具有去中國南方的近期旅行史。5人吸煙。在臨床上，該病與其它社區(qū)獲得性肺炎無法區(qū)分。發(fā)燒、痰咳和呼吸困難是共同的發(fā)作癥狀。僅在兩名患者(第1和5號(hào)患者)中出現(xiàn)上呼吸道癥狀。1名患者(第7號(hào)患者)有稀便腹瀉。兩名患者在入院時(shí)于室內(nèi)空氣下的氧飽和度＜95％。在6名患者的右肺和6名患者的左肺觀察到氣腔陰影。分別在2、4和9名患者中有上、中和下區(qū)感染。除了第10號(hào)患者以外，所有患者都具有正常血小板計(jì)數(shù)和正常的肝和腎功能測(cè)試結(jié)果。在患者的任何痰樣品中都未檢測(cè)到細(xì)菌或分支桿菌病原體。所有NPA中A和B型流感病毒、副流感病毒1-3、RSV、腺病毒(Woo PCY等，J Clin Microbiol1997；351579-81)的直接抗原檢測(cè)以及A型流感病毒和間質(zhì)肺病毒的RT-PCR均為陰性。在可獲得其血清樣品的所有6名患者(第1、4、5、6、8和9號(hào)患者)中，抗肺炎支原體(M pneumoniae)、肺炎衣原體(C.pneumoniae)、鸚鵡熱披衣菌(C.psittaci)、嗜肺軍團(tuán)菌(L.pneumophila)的抗體均為陰性。所有這6名患者都顯示出4倍的IgG滴度變化(第4、5和6號(hào)患者)和/或存在抗CoV-HKU1的IgM(第1、5、8和9號(hào)患者)。
表5
+＝有；-＝無；RUZ＝右上區(qū)；LUZ＝左上區(qū)；RMZ＝右中區(qū)；LMZ＝左中區(qū)；RLZ＝右下區(qū)；LLZ＝左下區(qū)。
和非CoV-HKU1肺炎的年齡和性別匹配對(duì)照相比，在CoV-HKU1肺炎患者中未鑒別出流行病學(xué)、臨床、血液學(xué)、血清生物化學(xué)和放射學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因子(表6)。
表6
*連續(xù)變量表示為中值，分類變量表示為出現(xiàn)特征的患者數(shù)量。
10名患者中有2名死于CoV-HKU1肺炎。第一名患者(第2號(hào)患者)為一名出現(xiàn)一天呼吸困難的66歲老年男性。他患有2型糖尿病、陳舊性心肌梗塞和胃淋巴瘤，在2002年進(jìn)行了胃全切除，并施加化療。他患有嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞減少(0.2×109/L)，入院時(shí)氧飽和度僅有83％。胸片揭示在兩個(gè)肺中有主要波及下區(qū)的斑片狀氣腔陰影(圖12A)。他在入院后11天死亡。另一名患者(第10號(hào)患者)是一名出現(xiàn)一周發(fā)燒和痰咳的72歲老年男性。他患有2型糖尿病、腦血管意外和骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌，并發(fā)有脊髓壓迫，實(shí)施了椎板切除術(shù)和Luque器械術(shù)。他患有淋巴細(xì)胞減少(0.9×109/L)、血小板減少癥(33×109/L)、肝和腎功能測(cè)試紊亂，入院時(shí)的氧飽和度僅為88％。胸片揭示兩個(gè)肺都有廣泛的氣腔陰影，中區(qū)波及更嚴(yán)重(圖12B)。他在入院后5天死亡。
對(duì)比存活患者和死于CoV-HKU1相關(guān)性社區(qū)獲得性肺炎患者的臨床、實(shí)驗(yàn)室和放射學(xué)特征(圖7)。死亡患者具有較低的血紅蛋白濃度(P＝0.04)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(P＝0.04)、血清白蛋白(P＝0.04)和入院時(shí)的氧飽和度(P＝0.03)，以及在胸片上波及肺雙側(cè)(P＝0.003)和更多區(qū)域(P＝0.01)。
表7
*連續(xù)變量表示為中值，分類變量表示為出現(xiàn)特征的患者數(shù)量。
冠狀病毒-HKU1的完整RNA依賴性RNA聚合酶、刺突蛋白和核殼蛋白基因的RT-PCR和測(cè)序以及種系發(fā)生分析對(duì)由10名患者中9名的具有足量可用RNA的NPA獲得的CoV-HKU1的完整pol(圖11)、S(圖13)和N(圖14)基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。種系發(fā)生樹和非同義突變以及對(duì)應(yīng)的氨基酸變化示于圖15。在全部3種基因中，使用核苷酸或氨基酸構(gòu)建的的種系發(fā)生樹顯示相同的拓?fù)鋵W(xué)。對(duì)于S基因，分別有317和306個(gè)位置具有同義和非同義突變(圖15B)。對(duì)于N基因，分別有42和53個(gè)位置具有同義和非同義突變(圖15C)。9個(gè)S或N基因中有7個(gè)的核苷酸序列顯示出相似序列(基因型A，圖16B和16C)，另兩個(gè)的核苷酸序列也顯示出相似序列(基因型B，圖16B和16C)。對(duì)于患者1的CoV-HKU1，在N基因的核苷酸位置1300一致觀察到兩個(gè)峰(T和C)，提示存在準(zhǔn)種(圖15C)。對(duì)于pol基因，分別有95和13個(gè)核苷酸位置具有同義和非同義突變(圖15A)。在基因型A的7株CoV-HKU1中pol基因的核苷酸序列也簇集在一起(圖15A)。令人感興趣的是，7株基因型A的CoV-HKU1來自7名具有基礎(chǔ)疾病的患者，2株基因型B來自兩名沒有基礎(chǔ)疾病的患者(表5)。此外，9株CoV-HKU1的pol基因的核苷酸序列與HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63和SARS-CoV的多重比對(duì)揭示，我們?cè)诒狙芯恐惺褂玫囊飸?yīng)當(dāng)是CoV-HKU1特異性的(圖16)。
動(dòng)物監(jiān)測(cè)來自香港和中國南方的56只野生和馴養(yǎng)動(dòng)物的208份鼻咽拭子和糞便樣品沒有是CoV-HKU1RNA陽性的。
6.2.8討論CoV-HKU1是一種與社區(qū)獲得性肺炎相關(guān)的新型第2組冠狀病毒。因?yàn)?003年的SARS大流行，所以我們開始由社區(qū)獲得性肺炎患者前瞻性收集NPA并儲(chǔ)存提取的RNA，以便在發(fā)現(xiàn)新病毒時(shí)可及時(shí)研究疾病的流行病學(xué)，并由此研究疾病的臨床、實(shí)驗(yàn)室和放射學(xué)特征。在2004年1月，我們由社區(qū)獲得性肺炎患者中發(fā)現(xiàn)了一種新型冠狀病毒CoV-HKU1(Woo，PC等，J.of Virol.，2005，884-895頁)。立即取回由前瞻性收集的NPA提取的RNA，并尋找CoV-HKU1RNA的存在。418份NPA中有10份對(duì)CoV-HKU1RNA陽性，獲得2.5％的發(fā)生率。在這些標(biāo)本中存在CoV-HKU1 RNA是真實(shí)的，而不是由于污染，因?yàn)镃oV-HKU1的多個(gè)基因(pol，S和N)的擴(kuò)增和測(cè)序表明在不同患者的NPA中存在具有不同核苷酸序列的CoV-HKU1。而且，在全部6個(gè)可獲得其血清樣品的患者中出現(xiàn)特異性抗體反應(yīng)進(jìn)一步證實(shí)了CoV-HKU1的臨床表現(xiàn)。
和HCoV-229E、HCoV-OC43和HCoV-NL63類似，CoV-HKU1可能是在人中特有的人冠狀病毒。和其它人冠狀病毒感染類似，CoV-HKU1肺炎病例也發(fā)生在冬季和春季。大部分CoV-HKU1肺炎患者是具有主要基礎(chǔ)疾病(尤其是呼吸道和心血管系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病)的老年人(80％超過65歲)。為了研究10株CoV-HKU1的種系發(fā)生和關(guān)聯(lián)，我們測(cè)序了提供足量RNA的9個(gè)CoV-HKU1病例的pol、S和N基因。與10株CoV-HKU1的pol基因的部分測(cè)序數(shù)據(jù)(圖17)組合，結(jié)果表明，與SARS-CoV的流行病學(xué)不同，10株CoV-HKU1不是純系的，種系發(fā)生樹的拓?fù)鋵W(xué)不符合純系突發(fā)(clonal outbreak)圖譜(圖15)。令人感興趣的是，使用S和N基因二者的序列構(gòu)建的種系發(fā)生樹顯示，基因型B的CoV-HKU1與沒有基礎(chǔ)疾病的兩名患者相關(guān)，但基因型A的CoV-HKU1與有基礎(chǔ)疾病的患者相關(guān)(表5；以及圖16B和16C)。多株CoV-HKU1的測(cè)序可能揭示，存在具有不同毒力的CoV-HKU1的基因型或進(jìn)化枝。為研究動(dòng)物儲(chǔ)存CoV-HKU1的可能性，我們嘗試通過RT-PCR由香港和中國南方的野生和馴養(yǎng)動(dòng)物尋找CoV-HKU1 RNA的存在。我們的結(jié)果揭示，沒有一個(gè)標(biāo)本顯示存在CoV-HKU1 RNA。由這些臨床流行病學(xué)、分子流行病學(xué)和生態(tài)流行病學(xué)研究的結(jié)果，我們推斷，CoV-HKU1可能是人冠狀病毒，提議將CoV-HKU1重新命名為人冠狀病毒HKU1(HCoV-HKU1)。
與SARS-CoV肺炎相比，HCoV-HKU1肺炎是一種單相疾病，大部分患者具有位于呼吸道的相對(duì)溫和的癥狀，僅簡(jiǎn)短入院處理即可。SARS-CoV肺炎經(jīng)常被描述為雙相疾病，第一相起因于活性病毒復(fù)制導(dǎo)致的細(xì)胞裂解，第二相可能起因于免疫病理學(xué)損傷(PeirisJSM等，Lancet 2003；3611319-25；Peiris JSM等，Lancet 2003；3611767-72)。另一方面，全部10名HCoV-HKU1肺炎患者均表現(xiàn)出單相疾病模式。盡管在半數(shù)HCoV-HKU1肺炎患者中于首發(fā)時(shí)出現(xiàn)呼吸困難，相比之下僅約20％的SARS-CoV肺炎患者于首發(fā)時(shí)出現(xiàn)呼吸困難(Peiris JSM等，Lancet 2003；3611319-25)，但HCoV-HKU1肺炎患者通?？焖倏祻?fù)，而SARS-CoV肺炎患者在7-10天后惡化(Peiris JSM等，Lancet 2003；3611319-25；Peiris JSM等，Lancet 2003；3611767-72)。對(duì)于康復(fù)的8名患者，平均住院持續(xù)時(shí)間僅為5.5天。HCoV-HKU1肺炎患者的這種快速康復(fù)可能與免疫系統(tǒng)快速控制病毒有關(guān)。這符合我們先前的研究，我們先前的研究表明，HCoV-HKU1肺炎索引患者(患者5)在發(fā)病后3天左右具有其峰值病毒載量(Woo，PC等，J.of Virol.，2005，884-895頁)。而且，僅有其中一名患者具有肺外癥狀，而所有可獲得的肺外標(biāo)本(糞、尿和血清)對(duì)CoV-HKU1都是RT-PCR陰性的(數(shù)據(jù)未公開)。另一方面，對(duì)SARS-CoV肺炎來說，患者通常在發(fā)病后7-10天具有其峰值病毒載量(Peiris JSM等，Lancet 2003；3611767-72)。而且，可在肺外標(biāo)本中容易地檢測(cè)到病毒，其中病毒載量與對(duì)應(yīng)癥狀的表現(xiàn)相關(guān)聯(lián)(Hung，IFN等，EmergInfect Dis 2004；101550-1557)。這些暗示，SARS-CoV病毒在疾病的初始階段不能被免疫系統(tǒng)良好控制。
盡管HCoV-HKU1肺炎在大部分患者中是相對(duì)溫和的疾病，但HCoV-HKU1肺炎與少數(shù)具有較低的血紅細(xì)胞濃度、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清白蛋白、入院氧飽和度和胸片上更廣泛波及的患者的死亡率相關(guān)。如同大部分肺炎病例一樣，肺中的更廣泛波及導(dǎo)致氣體交換不足，并因此導(dǎo)致缺氧和最終死亡。較低的血紅細(xì)胞濃度、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)和血清白蛋白可能代表較差的發(fā)病前狀態(tài)和對(duì)抗感染的能力有限。2名死亡患者具有基礎(chǔ)性糖尿病、惡性腫瘤(在一名患者中是胃淋巴瘤，在另一名患者中是前列腺癌)和心血管疾病(在一名患者中是陳舊性心肌梗塞，在另一名患者中是腦血管意外)。
7.市場(chǎng)潛力已完全測(cè)序兩個(gè)基因組型的CoV-HKU1。這些序列使得可以開發(fā)如上所述的各種診斷試驗(yàn)和治療方法。另外，CoV-HKU1的遺傳信息對(duì)臨床和科研應(yīng)用極其重要和有價(jià)值。
8.等價(jià)方案本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅僅采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，就將認(rèn)識(shí)到或能夠確定本文所述具體實(shí)施方案的許多等價(jià)方案。這種等價(jià)方案被以下權(quán)利要求書所包涵。
在本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)都通過引用結(jié)合到本說明書中。
本文對(duì)參考文獻(xiàn)的引用或討論不應(yīng)被解釋為承認(rèn)這就是本發(fā)明的先有技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或其互補(bǔ)物。
2.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含具有SEQ ID NO1的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300或350個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
3.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的核苷酸序列或所述核苷酸序列的互補(bǔ)物。
4.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO3的核苷酸序列或其互補(bǔ)物。
5.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含具有SEQ ID NO3的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000或29,000個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
6.一種分離的核酸分子，所述核酸分子在嚴(yán)格條件下與具有SEQID NO1、3的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的核酸分子雜交，其中所述核酸分子編碼的氨基酸序列具有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列編碼的多肽所具有的生物活性。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述分子為RNA。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述分子為DNA。
9.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求8的核酸分子。
10.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求9的載體。
11.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含有效連接至異源啟動(dòng)子的權(quán)利要求8的核酸分子。
12.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。
13.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
15.一種生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括由權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞表達(dá)DNA編碼的多肽，并回收多肽。
16.一種生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括由權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞表達(dá)DNA編碼的多肽，并回收多肽。
17.一種制備能夠表達(dá)多肽的細(xì)胞或其子代的方法，所述方法包括用權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
18.一種分離的多肽，所述多肽由權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的核酸分子編碼。
19.一種分離的多肽，所述多肽包含具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110和120個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列。
20.一種分離的多肽，所述多肽包含具有SEQ ID NO34-2918的氨基酸序列中任一個(gè)的氨基酸序列。
21.一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性結(jié)合權(quán)利要求18的多肽。
22.一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段免疫特異性結(jié)合權(quán)利要求19或20的多肽。
23.一種檢測(cè)生物樣品中權(quán)利要求18的多肽的存在情況的方法，所述方法包括(a)使生物樣品與選擇性結(jié)合所述多肽的化合物接觸；和(b)檢測(cè)化合物是否結(jié)合樣品中的所述多肽。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述生物樣品選自細(xì)胞、血液、血清、血漿、唾液、尿、糞、痰和鼻咽抽吸物。
25.權(quán)利要求23的方法，其中結(jié)合所述多肽的所述化合物為抗體或其抗原結(jié)合片段。
26.一種檢測(cè)生物樣品中權(quán)利要求19或20的多肽的存在情況的方法，所述方法包括(a)使生物樣品與選擇性結(jié)合所述多肽的化合物接觸；和(b)檢測(cè)化合物是否結(jié)合樣品中的所述多肽。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述生物樣品選自細(xì)胞、血液、血清、血漿、唾液、尿、糞、痰和鼻咽抽吸物。
28.權(quán)利要求26的方法，其中結(jié)合所述多肽的所述化合物為抗體或其抗原結(jié)合片段。
29.一種檢測(cè)生物樣品中第一種核酸分子的存在情況的方法，所述第一種核酸分子含權(quán)利要求1的核苷酸序列或其片段或其互補(bǔ)物，所述方法包括(a)使生物樣品與選擇性結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物接觸；和(b)檢測(cè)化合物是否結(jié)合樣品中的所述核酸分子。
30.權(quán)利要求29的方法，其中結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物是含SEQ ID NO1的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的第二種核酸分子。
31.權(quán)利要求29的方法，其中結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物是含SEQ ID NO1的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300或350個(gè)連續(xù)核苷酸的第二種核酸分子。
32.一種檢測(cè)生物樣品中第一種核酸分子的存在情況的方法，所述第一種核酸分子含權(quán)利要求3的核苷酸序列或其片段或其互補(bǔ)物，所述方法包括(a)使生物樣品與選擇性結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物接觸；和(b)檢測(cè)化合物是否結(jié)合樣品中的所述核酸分子。
33.權(quán)利要求32的方法，其中結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物是含SEQ ID NO1或3的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的第二種核酸分子。
34.權(quán)利要求32的方法，其中結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物是含SEQ ID NO1的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300或350個(gè)連續(xù)核苷酸的第二種核酸分子。
35.權(quán)利要求32的方法，其中結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物是含SEQ ID NO3的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000或29,000個(gè)連續(xù)核苷酸的第二種核酸分子。
36.一種預(yù)防或抑制含SEQ ID NO1和/或3的核苷酸序列或其部分或其互補(bǔ)物的核酸分子在宿主細(xì)胞中復(fù)制的方法，所述方法包括給予宿主細(xì)胞有效量的在生理?xiàng)l件下選擇性結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物。
37.權(quán)利要求36的方法，其中結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物是含SEQ ID NO1或3的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的第二種核酸分子。
38.權(quán)利要求36的方法，其中結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物是含SEQ ID NO1的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300或350個(gè)連續(xù)核苷酸的第二種核酸分子。
39.權(quán)利要求36的方法，其中結(jié)合所述第一種核酸分子的化合物是含SEQ ID NO3的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000或29,000個(gè)連續(xù)核苷酸的第二種核酸分子。
40.一種預(yù)防或抑制由SEQ ID NO1和/或3的核苷酸序列或其片段或其互補(bǔ)物編碼的多肽結(jié)合宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括給予宿主細(xì)胞有效量的在生理?xiàng)l件下特異性結(jié)合所述多肽的化合物。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述特異性結(jié)合所述多肽的化合物是免疫特異性結(jié)合所述多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段。
42.一種檢測(cè)生物樣品中抗體的存在情況的方法，所述抗體免疫特異性結(jié)合權(quán)利要求18的多肽，所述方法包括(a)使生物樣品與權(quán)利要求18的多肽接觸；和(b)檢測(cè)結(jié)合至多肽的抗體。
43.一種檢測(cè)生物樣品中抗體的存在情況的方法，所述抗體免疫特異性結(jié)合權(quán)利要求19或20的多肽，所述方法包括(a)使生物樣品與權(quán)利要求19的多肽接觸；和(b)檢測(cè)結(jié)合至多肽的抗體。
44.一種鑒別CoV-HKU1感染對(duì)象的方法，所述方法包括(a)由得自所述對(duì)象的生物樣品獲得總RNA；(b)逆轉(zhuǎn)錄總RNA，以獲得cDNA；和(c)使用一組來源于SEQ ID NO1或3的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的引物擴(kuò)增cDNA。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述引物組分別具有SEQ ID NO4和5的核苷酸序列。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述引物組分別具有SEQ ID NO6和7的核苷酸序列。
47.一種免疫原性制劑，所述免疫原性制劑包含免疫有效量的權(quán)利要求18的多肽和藥物可接受的載體。
48.一種免疫原性制劑，所述免疫原性制劑包含免疫有效量的權(quán)利要求19或20的多肽和藥物可接受的載體。
49.一種免疫原性制劑，所述免疫原性制劑包含免疫有效量的核酸分子和藥物可接受的載體，所述核酸分子包含SEQ ID NO1的核苷酸序列、其互補(bǔ)物或其片段。
50.一種免疫原性制劑，所述免疫原性制劑包含免疫有效量的核酸分子和藥物可接受的載體，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO3的核苷酸序列、其互補(bǔ)物或其片段。
51.一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子包含SEQ ID NO2919的核苷酸序列、其互補(bǔ)物或其片段。
52.一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子包含編碼CoV-HKU1的復(fù)制酶基因的核苷酸序列。
53.權(quán)利要求2的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932或2934的核苷酸序列。
54.一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子包含編碼CoV-HKU1的刺突蛋白基因的核苷酸序列。
55.權(quán)利要求4的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948或2950的核苷酸序列。
56.一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子包含編碼CoV-HKU1的核殼蛋白基因的核苷酸序列。
57.權(quán)利要求6的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964或2966的核苷酸序列。
58.一種分離的核酸分子，所述核酸分子在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求1的核酸分子雜交，其中所述核酸分子編碼的氨基酸序列具有權(quán)利要求51的核酸分子編碼的多肽所具有的生物活性。
59.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求51的核酸分子。
60.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求52的核酸分子。
61.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求54的核酸分子。
62.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求56的核酸分子。
63.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求59的載體。
64.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求60的載體。
65.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求61的載體。
66.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求62的載體。
67.一種分離的多肽，所述多肽由權(quán)利要求51的核酸分子編碼。
68.一種分離的多肽，所述多肽由權(quán)利要求52的核酸分子編碼。
69.一種分離的多肽，所述多肽由權(quán)利要求54的核酸分子編碼。
70.一種分離的多肽，所述多肽由權(quán)利要求56的核酸分子編碼。
71.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求67的多肽。
72.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求68的多肽。
73.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求69的多肽。
74.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求70的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供在香港分離的新型人冠狀病毒的完整基因組序列，將該新型人冠狀病毒造詞命名為人冠狀病毒－HKU1(“HCoV－HKU1”)。該病毒屬于套式病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)，是正極性單鏈RNA病毒。對(duì)社區(qū)獲得性肺炎患者的鼻咽抽吸物的進(jìn)一步研究已揭示，該病毒有2個(gè)基因型基因型A和基因型B。除了這兩個(gè)基因型的基因組序列以外，本發(fā)明還提供CoV－HKU1完整基因組的推斷氨基酸序列。HCoV－HKU1的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列用于預(yù)防、診斷和/或治療HCoV－HKU1感染。此外，基于HCoV－HKU1的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列，本發(fā)明提供使用重組和嵌合形式的HCoV－HKU1以及HCoV－HKU1亞單位的免疫原性和疫苗制品。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101076591SQ200580031315
公開日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2005年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月21日
發(fā)明者袁國勇, 胡釗逸, 劉嘉珮, 陳國雄, 潘烈文, 裴偉士, 管軼 申請(qǐng)人:香港大學(xué)