專利名稱：調節(jié)肝細胞生長因子活化的方法和組合物的制作方法
技術領域：
一般說來，本發(fā)明涉及分子生物學和生長因子調節(jié)領域。更具體地說，本發(fā)明涉及HGF/c-met信號路徑的調節(jié)劑和所述調節(jié)劑的用途。
背景肝絲酶(hepsin)(也稱為TMRPRSS1)是細胞表面表達的凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，是II型跨膜絲氨酸蛋白酶(TTSP)家族的成員，其中II型跨膜絲氨酸蛋白酶也包括基質蛋白酶(也稱為MT-SP1)和腸肽酶(1)。位于19號染色體上的q11-13.2區(qū)的人肝絲酶基因(2)編碼包含短的N-末端胞質尾、跨膜區(qū)和胞外域(Arg45-Leu417)的417個氨基酸的多肽(3)，其中胞外域由清除受體半胱氨酸富集區(qū)(SRCR)和蛋白酶域組成。肝絲酶酶原通過Arg162-Ile163處的切割被自動催化活化(4)，形成具有二硫化物連接(Cys153-Cys277)到SRCR域的蛋白酶域的異二聚體酶。除共價的Cys-Cys鍵之外，最近確定的肝絲酶的晶體結構顯示SRCR和蛋白酶域共用廣泛的分界面區(qū)，每個域埋藏大約1200 2(5)。因為這一分界面區(qū)靠近SRCR域的近膜側的殘基，因此肝絲酶蛋白酶域和活性部位可能位于接近細胞表面的位置(5)。這基本上不同于其它細胞表面裝配的絲氨酸蛋白酶類，例如，活性部位位于膜表面上方更遠地方(60-80 )的凝血因子VIIa(FVIIa)1、IXa和Xa。
肝絲酶的生理機能仍然是難以捉摸的。除凝血因子VII外，沒有高分子底物是已知的，而且也沒有鑒定出生理學上相關的抑制劑。Kazama et al.(1995)(9)表明肝絲酶轉染細胞可以活化凝血因子VII，這暗示了肝絲酶在血液凝固中的作用。但是，缺乏肝絲酶的小鼠能存活，而且沒有顯示出血液凝固紊亂(10，11)，這令人懷疑肝絲酶在正常止血中的重要性。但是，肝絲酶在病理情況下，例如腎細胞癌(12)中有助于纖維蛋白形成是可能的，其中腎細胞癌中缺乏血液凝固的主要起始因子-組織因子(13，14)。而且，其它研究也暗示肝絲酶和細胞生長之間存在功能連接。已經(jīng)報告肝絲酶具有促進生長(15)或抑制生長的活性(16)，具體效果取決于使用的腫瘤細胞系和實驗條件。有關肝絲酶的其它信息也可參見如下文獻PCT申請WO2004/009803；美國專利No.6,482,630；美國專利No.6,423,543；美國專利No.5,981,830；美國專利申請2004/0009911 A1；美國專利申請20040001801 A1；美國專利申請2003/0223973 A1；美國專利申請2003/0175736 A1；美國專利申請2003/0013097 A1(也可以是WO02/059373)；美國專利申請2003/0049645 A1(也可以是WO02/064839)和美國專利申請2004/0132156。
最近的基因表達實驗鑒定出肝絲酶是前列腺癌中最高度上調基因中的一個(17-22)。原位染色顯示肝絲酶在前列腺分泌腺的上皮細胞上表達(19)。肝絲酶的表達與瘤性轉化相關(19)，即在患有重病的病人的腫瘤中表達最高，在良性增生中表達最低(18，22)。與此相反，一項研究發(fā)現(xiàn)肝絲酶蛋白質的低表達與高Gleason得分和大腫瘤相關(20)。這一明顯的矛盾是否與使用的方法，即免疫組織化學(20)對RNA定量(18，22)有關還不清楚。而且，在主要與上皮細胞類型(12)有關的卵巢癌(23)和腎細胞癌中，肝絲酶也明顯上調。
位于上皮細胞表面上的肝絲酶理論上會與細胞外基質成分及其它膜結合蛋白相互作用。已經(jīng)已知包括結構上與肝絲酶相關的TTSP基質蛋白酶(同義詞MT-SP1)(24，25)的凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶能活化纖維蛋白溶酶、基質金屬蛋白酶，以及生長因子的潛在形式(latent form)，例如肝細胞生長因子(HGF)。HGF通過活化受體酪氨酸激酶Met(在(26，27)中進行了綜述)促進細胞增殖、遷移、血管發(fā)生、存活和形態(tài)發(fā)生。除了在正常生理學中的重要性之外，HGF/Met路徑已經(jīng)牽涉侵入性腫瘤生長和腫瘤轉移(26)。HGF與絲氨酸蛋白酶纖溶酶原具有高度的相似性，由包含N域和四個Kringle域的α鏈，以及與凝乳蛋白酶樣蛋白酶具有同源性的β鏈組成。HGF是以非活性單鏈前體(前HGF)形式被分泌到細胞外基質中的，因此需要在Arg494-Val495進行切割活化以形成有生物活性的二硫化物連接的α/β異源二聚體(28-31)。這一步驟是由前HGF(pro-HGF)轉化絲氨酸蛋白酶，例如肝細胞生長因子活化劑(HGFA)(32)、基質蛋白酶(33，34)、尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(u-PA)(35)、因子XIIa(36)、因子XIa和血漿激肽釋放酶(34)介導的。HGFA和基質蛋白酶被細胞表面表達的庫尼茨(kunitz)型抑制劑，例如這兩個肝細胞生長因子活化劑抑制劑剪接變體HAI-1(37，38)和HAI-1B(34)，以及HAI-2(39)抑制。HAI-2(又稱為胎盤雙庫尼抑制劑)(40)也能有效地抑制因子XIa和血漿激肽釋放酶(41)，而HAI-1B幾乎沒有抑制活性(34)。因此，細胞外基質中的前HGF庫的生物可利用性受前HGF轉化酶和它們的抑制劑的活性調節(jié)。
肝絲酶在如上所述的癌組織中的表達譜，連同它在作為其它生長因子的調節(jié)劑中的潛在作用暗示調節(jié)肝絲酶與它的底物的相互作用可以被證明是有效的治療方法，其中所述其它生長因子的失調可能成為致癌作用的基礎。在這點上明確需要鑒定肝絲酶的生理學底物和/或它的生理學調節(jié)劑。本發(fā)明滿足了這一需要，而且提供了其它益處。
所有在這里引用的參考文獻，包括專利申請和出版物，都被全部引入作為參考。
發(fā)明公開的內(nèi)容如同這里描述的那樣，肝絲酶的生理學底物是本身在癌癥發(fā)展的許多方面起重要作用的肝細胞生長因子，肝絲酶是在多種癌癥中明顯過表達的細胞表面蛋白質。在這里顯示肝絲酶以可與有效的生理學前HGF轉化酶HGFA(肝細胞生長因子活化劑)相比較的活性切割前HGF。肝絲酶產(chǎn)生的雙鏈HGF(活化的)顯示出正常的生物學活性，包括誘導Met酪氨酸磷酸化、刺激細胞增殖和刺激細胞遷移。另外，在這里已經(jīng)鑒定，兩個庫尼茨域抑制劑HAI-1B和HAI-2可以作為肝絲酶酶活性的生理學調節(jié)劑。本發(fā)明提供了至少部分基于這些發(fā)現(xiàn)的方法和組合物，下文將對它們進行更詳細的描述。已經(jīng)表明肝絲酶和它與HGF和/或HGF的生理學抑制劑的相互作用可能是設計對抗與HGF/Met(也稱為″c-met″)路徑的信號發(fā)送異?；虿恍枰男盘柊l(fā)送有關的病理學條件的預防和/或治療方法時進行更精細調節(jié)的獨特有利的目標靶。因此，本發(fā)明提供鑒定和使用能夠通過調節(jié)與HGF活化調節(jié)有關的生理學相互作用分子來調節(jié)HGF/c-met路徑的物質的方法、組合物、試劑盒和制品。
因此，一方面，本發(fā)明提供了篩選(或鑒定)抑制HGF的肝絲酶活化的候選抑制劑(即拮抗劑)物質的方法，所述方法包括(a)讓候選物質接觸包含肝絲酶和前HGF底物的第一樣品，和(b)將樣品中前HGF底物活化的量與參考樣品中前HGF底物活化的量進行比較，參考樣品包含與第一樣品相似的肝絲酶和前HGF底物量，但它不與所述的候選物質接觸，與參考樣品相比第一樣品中前HGF底物活化的量下降表明候選物質能夠抑制肝絲酶活化單鏈HGF(前HGF)。在一個實施方案中，樣品中的肝絲酶是活化所述前HGF的有效量的肝絲酶。適合在這些方法中使用的前HGF底物可以以多種形式存在，只要它能模仿肝絲酶切割前HGF的位點特征就可以。前HGF底物的實例包括，但不局限于包含R494-V495肽鍵的野生型形式的全長單鏈HGF和包含該肽鍵的HGF任何片段。這種片段可以是任何長度，例如長度可以是至少(大約)5、7、10、15、20、25個氨基酸，或者長度可以在(大約)4和25、5和20、7和15個氨基酸者之間。通常優(yōu)選包含能夠被野生型肝絲酶切割的R494-V495肽鍵的前HGF底物。在一個實施方案中，前HGF底物包含與蛋白酶共有切割位點相適應的人HGF切割位點(即位置P1的堿性殘基，位置P1′，P2′-P1 R494，P1′V495、P2′V496上的兩個疏水氨基酸殘基)。
另一方面，本發(fā)明提供了篩選阻斷前HGF被肝絲酶活化的物質的方法，所述方法包括篩選結合(優(yōu)選，但不是必須，特異性地結合)肝絲酶或前HGF，并阻斷肝絲酶和前HGF之間特異性相互作用(例如結合)的物質。在一些實施方案中，該物質與肝絲酶競爭性地結合HGF。在一些實施方案中，該物質與前HGF競爭性地結合肝絲酶。在一個實施例中，所述物質包含與前HGF(例如人)具有至少約60％、70％、80％、90％、95％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列，或者由與前HGF(例如人)具有至少約60％、70％、80％、90％、95％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列組成，或者基本上由具有至少約60％、70％、80％、90％、95％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列組成，例如包含連接到495(Val)上的氨基酸殘基494(Arg)肽的人HGF片段。在一些實施例中，所述物質包含這樣的氨基酸序列、或由這樣的氨基酸序列組成，或者基本上由這樣的氨基酸序列組成，該片段被突變或者該片段缺乏HGFβ鏈的至少一部分，這樣就使所述片段與野生型HGF相比，具有降低的c-met活化活性。
與如上所述的那些篩選一致的篩選測定還可以包含篩選第一步驟以及隨后的篩選第二步驟，所述第一步驟基于對肝絲酶-HGF復合物形成的測定(readout)以獲得第一組候選調節(jié)物質，所述第二步驟基于第一組候選調節(jié)物質調節(jié)HGF活化和/或將HGF轉化為能活化HGF/c-met路徑的形式的能力，這對本領域熟練技術人員來說是很顯然的。合適的測定可以是本領域熟練技術人員顯而易見的，以對酶底物復合物形成和/或與HGF/c-met信號路徑有關的生物學活性的認識為基礎的任何測定方法?？梢岳?，例如常規(guī)生物化學測定(例如凝膠電泳、層析、NMR等等)測量酶底物復合物的形成。HGF/c-met生物學活性包括，但不局限于C-met磷酸化、作為C-met激酶底物的細胞分子的磷酸化、細胞生長(增殖、存活等等)、血管發(fā)生、細胞遷移、細胞形態(tài)發(fā)生等等。
一方面，本發(fā)明提供破壞HGF/c-met信號路徑的HGF/c-met拮抗劑。例如本發(fā)明提供抑制肝絲酶切割前HGF(例如，在R494-V495位置切割)的分子。該分子可以以許多途徑發(fā)揮抑制功能，包括但不限于結合肝絲酶或前HGF使肝絲酶切割前HGF被抑制、結合肝絲酶-前HGF復合物使前HGF的切割被抑制和/或結合前HGF或肝絲酶(單獨地或在復合物中)使肝絲酶切割HGF的效應被抑制(例如，抑制肝絲酶切割后HGF的釋放)。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑分子不抑制HGF結合c-met。例如，在一個實施例中，本發(fā)明的拮抗劑分子是與保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)、保藏號為ATCC HB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體具有類似的抑制和/或結合能力的抗體或其片段。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑分子抑制與HGF/c-met活化有關的生物學活性。
在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的拮抗劑分子源自這里描述的肝細胞生長因子活化抑制劑(HAI-1、HAI-1B、HAI-2)是肝絲酶活化前HGF的有效抑制劑的發(fā)現(xiàn)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了肝絲酶活化前HGF的拮抗劑，所述拮抗劑包含人HAI-1、HAI-1B或HAI-2的至少一部分(包括全部)。在一個實施例中，所述部分包含能夠抑制肝絲酶活化前HGF的庫尼茨域(Kunitz Domain，KD)序列。在一個實施方案中，所述庫尼茨域序列是HAI-1或HAI-1B的庫尼茨域1(KD1)。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑包含與人HAI-1的野生型KD1具有至少大約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％序列同一性的變體KD1序列，其中所述變體序列在抑制肝絲酶切割人前HGF方面具有至少可與野生型KD1相比的能力。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑包含與人HAI-1的野生型KD1具有大約70％和99％之間、大約75％和98％之間、大約80％和97％之間、85％和95％之間的序列同一性的變體KD1序列，其中所述變體序列在抑制肝絲酶切割人前HGF方面具有至少可與野生型KD1相比的能力。在一個實施方案中，所述庫尼茨域序列是HAI-2的一個或兩個庫尼茨域。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑包含與野生型人HAI-2的對應庫尼茨域具有至少大約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％的序列同一性的變體HAI-2庫尼茨域序列，其中所述變體序列在抑制肝絲酶切割人前HGF方面具有至少可與野生型HAI-2相比的能力。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑包含與野生型人HAI-2的對應的庫尼茨域具有大約70％和99％之間、大約75％和98％之間、大約80％和97％之間、85％和95％之間的序列同一性的變體HAI-2庫尼茨域序列，其中所述變體序列在抑制肝絲酶切割人前HGF方面具有可與野生型HAI-2相比的能力。
在一些實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑是或包含小分子、肽、抗體、抗體片段、適體(aptamer)或其組合。利用本領域已知的技術(包括那些在下文中更詳細描述的技術)，基于本文描述的肝絲酶、肝細胞生長因子活化抑制劑和前HGF之間相互作用的發(fā)現(xiàn)，可以常規(guī)獲得這里描述的拮抗劑。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑與肝絲酶競爭結合HGF，但它不具有在肝絲酶切割位點切割前HGF的能力。在一些實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑與前HGF競爭性結合肝絲酶。例如，在一個實施方案中，所述拮抗劑包含與前HGF(例如人的前HGF)具有至少約60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列，或者由與前HGF(例如人的前HGF)具有至少約60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列組成，或者基本上由具有至少約60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％序列相似性或同一性的氨基酸序列組成，而且它基本上能夠結合肝絲酶，但它缺乏肝絲酶切割位點(例如，包含野生型人HGF R494-V495肽連接的P1位點)和/或缺乏活化c-met的能力(例如，其中HGF β鏈發(fā)生了突變，缺乏HGF β鏈或其部分等等)。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑包含能夠結合肝絲酶的HGF片段、或由能夠結合肝絲酶的HGF片段組成，或者基本上由能夠結合肝絲酶的HGF片段組成，其中所述片段缺乏HGF β鏈的至少一部分，這樣使所述片段與野生型HGF相比，具有降低的c-met活化活性。
因此，本發(fā)明提供基本上能結合肝絲酶，但與野生型HGF相比具有降低的HGF/c-met調節(jié)活性的HGF突變體，例如HGF/c-met活性的拮抗劑，或者顯示出降低的HGF生物活性，但不是沒有HGF生物活性(例如，細胞生長刺活化性)的HGF變體。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑能夠抑制野生型HGF的生物活性(體內(nèi))(這種生物活性包括，但不局限于刺激細胞增殖、增強細胞存活、促進血管發(fā)生、誘導/促進細胞遷移)。在一個實施方案中，本發(fā)明的拮抗劑提供了降低的細胞生長促進活性(包括但不限于減低的細胞增殖促進活性、降低的細胞存活促進活性、降低的血管發(fā)生促進活性、降低的細胞遷移促進活性)。
在一些實施方案中，通過這里描述的本發(fā)明的篩選或鑒定方法來獲得本發(fā)明的拮抗劑。
一方面，本發(fā)明拮抗劑分子與毒素，例如細胞毒劑連接?？梢耘c添加劑/增強劑，例如放療劑和/或化療劑一起來配制或聯(lián)合施用這些分子/物質。
一方面，本發(fā)明提供了能夠增強肝絲酶切割前HGF的分子，其中所述分子能夠干擾HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2與肝絲酶的相互作用。在一些實施方案中，本發(fā)明的增強分子是或包含小分子、肽、抗體、抗體片段、適體或其組合。例如，本發(fā)明的增強分子可以包含HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2的片段或其變體，或由HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2的片段或其變體組成，或基本上由HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2的片段或其變體組成，其中所述片段能夠結合肝絲酶，但基本上不抑制肝絲酶切割前HGF。在一個實施方案中，所述分子能夠競爭性地抑制野生型HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2結合肝絲酶。在一個體實施方案中，本發(fā)明的增強分子是干擾包含肝絲酶和HAI-1、HAI-1B和/或HAI-2的復合物形成的抗體。在一個體實施方案中，本發(fā)明的增強分子是肝絲酶或其變體(包括下文限定的那些變體中的任何一種)，其中所述肝絲酶或其變體能夠影響前HGF在R494-V495位點的切割。
本發(fā)明也提供對調節(jié)與HGF/c-met信號軸失調有關的疾病狀態(tài)有用的方法和組合物。因此，一方面，本發(fā)明提供了在受試者中調節(jié)c-met活化的方法，所述方法包括給受試者施用本發(fā)明的HGF/c-met調節(jié)分子(例如，這里描述的抑制肝絲酶切割前HGF的拮抗劑分子)，借此調節(jié)c-met活化。在一個實施方案中，所述分子是抑制HGF/c-met活性的HGF/c-met拮抗劑。在一個實施方案中，所述分子是增加HGF/c-met活性的增強分子。一方面，本發(fā)明提供了治療受試者中與c-met活化有關的病理狀態(tài)的方法，所述方法包括給受試者施用本發(fā)明的c-met拮抗劑(例如，這里描述的肝絲酶切割前HGF的任何拮抗劑)，借此抑制c-met活化。
HGF/c-met信號路徑與多種生物學和生理功能有關，包括，例如刺激細胞生長(例如，細胞增殖、細胞存活、細胞遷移、細胞形態(tài)發(fā)生)和血管發(fā)生。因此，另一方面，本發(fā)明提供了抑制c-met活化的細胞生長(例如，增殖和/或存活)的方法，所述方法包括使細胞或組織接觸本發(fā)明的拮抗劑，借此抑制與c-met活化有關的細胞增殖。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制血管發(fā)生的方法，所述方法包括給具有與異常血管發(fā)生有關的狀態(tài)的細胞、組織和/或受試者施用本發(fā)明的拮抗劑，借此抑制血管發(fā)生。在另一方面，本發(fā)明提供了增強血管發(fā)生的方法，所述方法包括給具有將從增加的血管發(fā)生中受益的狀態(tài)和/或與最適量以下的血管發(fā)生有關的狀態(tài)的細胞、組織和/或受試者施用本發(fā)明的增強分子，借此增強血管發(fā)生。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的拮抗劑在制備治療和/或預防疾病，例如，癌癥、腫瘤、細胞增生性紊亂、免疫(例如，自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂的藥物中的用途。所述拮抗劑可以是這里描述的任何形式，包括抗體、抗體片段、小分子(例如，有機分子)、多肽(例如，寡肽)、核酸(例如，寡核苷酸，例如反義寡核苷酸或干擾RNA)、適體或其組合。
一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的增強分子在制備治療和/或預防疾病，例如，傷口愈合(例如，與糖尿病有關的創(chuàng)傷，外傷等等)的藥物中的用途。增強分子可以是這里描述的任何形式，包括抗體、抗體片段、小分子(例如，有機分子)、多肽(例如，寡肽)、核酸(例如，寡核苷酸，例如反義寡核苷酸或干擾RNA)、適體或其組合。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的核酸在制備治療和/或預防疾病，例如癌癥、腫瘤、細胞增生性紊亂、免疫(例如，自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂(例如，傷口愈合)的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的表達載體在制備治療和/或預防疾病，例如癌癥、腫瘤、細胞增生性紊亂、免疫(例如，自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂(例如傷口愈合)的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的宿主細胞在制備治療和/或預防疾病，例如癌癥、腫瘤、細胞增生性紊亂、免疫(例如，自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂(例如，傷口愈合)的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的制品在制備治療和/或預防疾病，例如癌癥、腫瘤、細胞增生性紊亂、免疫(例如，自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂(例如，傷口愈合)的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的試劑盒在制備治療和/或預防疾病，例如癌癥、腫瘤、細胞增生性紊亂、免疫(例如，自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂(例如，傷口愈合)的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明提供了抑制c-met活化的細胞增殖的方法，所述方法包括使細胞或組織接觸有效量的本發(fā)明的拮抗劑，借此抑制與c-met活化有關的細胞增殖。
一方面，本發(fā)明提供了治療與受試者c-met活化失調有關的病理狀態(tài)的方法，所述方法包括給受試者施用有效量的本發(fā)明的拮抗劑，借此治療所述狀態(tài)。
一方面，本發(fā)明提供了抑制表達c-met或肝細胞生長因子，或表達c-met和肝細胞生長因子兩者的細胞生長的方法，所述方法包括使所述細胞接觸本發(fā)明的拮抗劑，從而使所述細胞的生長被抑制。在一個實施方案中，使所述細胞接觸不同細胞表達的HGF(例如，通過旁泌性效應)。
一方面，本發(fā)明提供了治療患有癌性腫瘤的哺乳動物的治療方法，其中癌性腫瘤包含表達c-met或肝哺乳動物生長因子，或表達c-met和肝哺乳動物生長因子兩者的細胞，所述方法包括給所述哺乳動物施用有效量的本發(fā)明的拮抗劑，從而有效治療所述哺乳動物。在一個實施方案中，使所述細胞接觸不同細胞表達的HGF(例如，通過旁泌性效應)。
一方面，本發(fā)明提供了治療或防止與肝絲酶、c-met和/或肝細胞生長因子表達增加或活性增加有關的細胞增生性紊亂的方法，所述方法包括給需要這種治療的受試者施用有效量的本發(fā)明的拮抗劑，從而有效治療或防止所述的細胞增生性紊亂。在一個實施方案中，使所述細胞接觸不同細胞表達的HGF(例如，通過旁泌性效應)。在一個實施方案中，所述增生性紊亂是癌癥。
一方面，本發(fā)明提供了抑制細胞生長的方法，其中所述細胞的生長至少部分依賴于肝絲酶、c-met和/或肝細胞生長因子的生長加強效應，所述方法包括使所述細胞接觸有效量的本發(fā)明的拮抗劑從而抑制所述細胞的生長。在一個實施方案中，使所述細胞接觸不同細胞表達的HGF(例如，通過旁泌性效應)。
一方面，本發(fā)明提供了治療哺乳動物體內(nèi)腫瘤的方法，其中所述腫瘤的生長至少部分依賴于肝絲酶、c-met和/或肝細胞生長因子的生長加強效應，所述方法包括使所述細胞接觸有效量的本發(fā)明的拮抗劑從而有效治療所述腫瘤。在一個實施方案中，使所述細胞接觸不同細胞表達的HGF(例如，通過旁泌性效應)。
本發(fā)明的方法可用于影響任何合適的病理狀態(tài)，例如與肝絲酶和/或HGF/c-met信號路徑失調有關的細胞和/或組織。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法靶向的細胞是癌細胞。例如所述癌細胞可以選自乳腺癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭狀癌細胞(例如甲狀腺的)、結腸癌細胞、胰腺癌細胞、卵巢癌細胞、宮頸癌細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細胞、前列腺癌細胞、成骨肉瘤細胞(osteogenic sarcoma cell)、腎癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、頭和頸鱗狀細胞癌細胞、黑素瘤細胞和白血病細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法靶向的細胞是過度增生(hyperproliferative)和/或增生性(hyperplastic)細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法靶向的細胞是發(fā)育異常的細胞(dysplastic cell)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法靶向的細胞是轉移性細胞。
本發(fā)明的方法可以更進一步地包含附加的治療步驟。例如，在一個實施方案中，方法更進一步地包括其中靶細胞和/或組織(例如癌細胞)暴露于放療或化療劑的步驟。
c-met活化是一個重要的生物過程，其失調會導致許多病理狀態(tài)發(fā)生，這里已經(jīng)描述這一點。因此，在本發(fā)明方法的一個實例中，靶向的細胞(例如癌細胞)是與相同組織來源的正常細胞相比，c-met活化增強的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法導致靶細胞死亡。例如接觸本發(fā)明的拮抗劑可以導致細胞不能通過c-met路徑傳送信號，而這會導致細胞死亡。
c-met活化(和因此傳送信號)的失調可以由許多細胞變化引起，包括，例如，HGF(c-met的相關配體)和/或c-met自身的過表達。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括靶向與相同組織來源的正常細胞相比，其中c-met或肝細胞生長因子，或兩者的表達更豐富的細胞(例如，癌細胞)?？梢酝ㄟ^多種來源的HGF，即以自分泌或旁泌性方式調節(jié)表達c-met的細胞。例如在本發(fā)明的方法的一個實例中，用不同細胞表達的肝細胞生長因子(例如經(jīng)由旁泌性效應)來接觸/結合靶細胞。所述不同細胞可以具有相同或不同的組織起源。在一個實施方案中，用靶細胞自身表達的HGF(例如，經(jīng)由自分泌效應/環(huán))來接觸/結合該靶細胞。
一方面，本發(fā)明提供包括給受試者施用本發(fā)明的增強分子的方法。能用這種方法治療的合適的狀態(tài)包括與異常低/不期望低的血管發(fā)生生理水平有關的任何病理狀態(tài)，其中血管發(fā)生與受試者的HGF/c-met活性有關。這種狀態(tài)的實例包括，但不限于，傷口愈合、心臟肥大、心肌梗塞、肢體局部缺血、末梢動脈疾病(peripheral arterial disease)等等。
一方面，本發(fā)明提供包含一種或多種本發(fā)明的拮抗劑或增強劑和載體的組合物。在一個實施方案中，所述載體是藥學上可接受的載體。
一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的拮抗劑或增強劑分子的核酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸編碼拮抗劑或增強劑分子，該拮抗劑或增強劑分子是多肽(例如，寡肽)，或包含多肽(例如，寡肽)。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸編碼拮抗劑或增強劑分子，該拮抗劑或增強劑分子是抗體或其片段，或包含抗體或其片段。
一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的核酸的載體。
一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細胞。載體可以是任何類型，例如可以是重組載體，如表達載體?？梢允褂枚喾N宿主細胞中的任何宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是原核細胞，例如，大腸桿菌。在一個實施方案中，宿主細胞是真核細胞，例如哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
一方面，本發(fā)明提供制造本發(fā)明的拮抗劑或增強劑分子的方法。例如，本發(fā)明提供制造是抗體(或其片段)或包含抗體(或其片段)的拮抗劑的方法，所述方法包括在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_本發(fā)明的編碼所述抗體(或其片段)的重組載體和回收所述抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供制造是或包含多肽(例如寡肽)的拮抗劑或增強劑分子的方法，所述方法包括在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_本發(fā)明的編碼所述多肽(例如寡肽)的重組載體和回收所述多肽(例如寡肽)。
一方面，本發(fā)明提供了包含容器和裝在容器中的組合物的制品，其中所述組合物包含本發(fā)明的一種或多種拮抗劑或增強劑分子。在一個實施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的核酸。在一個實施方案中，包含拮抗劑或增強劑分子的組合物更進一步地包含載體，在一些實施方案中載體是藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，本發(fā)明制品更進一步地包含將組合物(例如，拮抗劑或增強劑分子)施用給受試者的說明。
一方面，本發(fā)明提供包括裝有組合物的第一容器和裝有緩沖液的第二容器的試劑盒，其中組合物包含本發(fā)明的一種或多種拮抗劑或增強劑分子。在一個實施方案中，緩沖液是藥學上可接受的緩沖液。在一個實施方案中，包含拮抗劑或增強劑分子的組合物更進一步地包含載體，在一些實施方案中載體是藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，試劑盒更進一步地包含將組合物(例如，拮抗劑或增強劑分子)施用給受試者的說明。
附圖簡述

圖1肝絲酶純度和對因子VII的活性。(A)CHO細胞表達的可溶性肝絲酶包含全部的細胞外域(Arg45-Leu417)和C末端His8標簽。純化的肝絲酶的染色凝膠(還原條件)顯示肝絲酶已經(jīng)通過在Arg163-Ile163的切割自然地變?yōu)殡p鏈形式(已經(jīng)通過N-末端測序證實)。(B)37℃在存在PCPS小囊和CaCl2的條件下，肝絲酶在2小時的時間里活化因子VII酶原。標明了FVII酶原、FVIIa的輕鏈(l.c)和蛋白酶域(h.c)的位置。分子量標記顯示為Mrx10-3。
圖2肝絲酶特異性活化前HGF。在20mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl(Hepes緩沖液)中，用濃度逐漸降低的肝絲酶和HGFA孵育125I標記的前HGF(0.05mg/ml)酶的3倍稀釋步驟，從第2道的40nM降至第7道的0.16nM。(A)肝絲酶和(B)HGFA。在37℃進行4小時之后，通過SDS-PAGE在還原條件下分析樣品，接下來將樣品曝光到X線膠片上。標明前HGF、HGF α-鏈和HGF β-鏈(雙聯(lián)體)的位置。第1道是剛好在反應開始時取的樣品等分。(C)t-PA和肝絲酶活化纖溶酶原。纖溶酶原(0.12mg/ml)在Hepes緩沖液中與t-PA(40 nM)、肝絲酶(40 nM)或緩沖液(對照)孵育。通過SDS-PAGE(還原條件)分析在不同時間點取的樣品等份，接下來用Simply Blue Safe染色劑染色。第1道，緩沖液0.5小時；第2道，t-PA 0.5小時；第3道，肝絲酶0.5小時；第4道，緩沖液5小時；第5道，t-PA 5小時；第6道，肝絲酶5小時。標明了纖溶酶原(Plg)和纖溶酶重鏈(h.c)的位置。
圖3肝絲酶和HGFA活化的前HGF的Met磷酸化。(A)用40nM肝絲酶或40nM HGFA切割未標記的前HGF(0.3mg/ml)產(chǎn)生＞95％的轉化。通過SDS-PAGE(還原狀態(tài))分析肝絲酶切割(HGF肝絲酶)和HGFA切割(HGFHGFA)產(chǎn)生的HGF，接下來用Simply Blue Safe Stain進行染色。(B)通過將A549細胞暴露給濃度逐漸增加的HGF肝絲酶(圓圈)、HGFHGFA(正方形)或scHGF(菱形)、未切割的單鏈形式的HGF，在KIRA測定中測量Met受體的磷酸化。用使用HGF對照制品獲得的最大信號的百分比來表示活性。得到的值是三個實驗的平均值±SD。
圖4用肝絲酶(HGF肝絲酶)和HGFA(HGFHGFA)活化的前HGF進行的細胞增殖和遷移。(A)在濃度逐漸增加的HGF肝絲酶(填充柱)和HGFHGFA(未填充柱)存在時BxPC3細胞的細胞增殖情況。數(shù)值是兩個實驗的平均值。(B)通過逐漸增加添加到孔間細胞遷移系統(tǒng)的下層腔中的HGF肝絲酶(填充柱)和HGFHGFA(未填充柱)的濃度刺激的細胞遷移的定量。數(shù)值是三個實驗的平均值±SD。在增殖和遷移測定中的活性用暴露于100ng/ml的對照HGF制品的對照細胞的百分比來表示，其中對照HGF制品包括在每個實驗中。
圖5在氨溶解(amidolytic)測定中的肝絲酶酶活性的抑制。在室溫讓肝絲酶(0.4nM)與抑制劑孵育30min，在動態(tài)微板讀數(shù)器(kinetic microplatereader)上確定對S2366(0.2mM～Km)的酶活性。(□)、sHAI-1B、()、sHAI-1B(R260A)、(l)、sHAI-1B(K401A)、(l)、sHAI-2。
圖6 sHAI-1B和sHAI-2的突變體形式對前HGF活化的抑制。125I標記的前HGF(0.05mg/ml)與肝絲酶(15nM)和抑制劑在37℃一起孵育4小時。按照圖1中的描述分析反應等分樣品。每個樣品中存在15nM的肝絲酶。抑制劑是1uM。第1道，t＝0時的等分；第2道，沒有抑制劑；第3道，sHAI-1B；第4道，sHAI-1B(R260A)；第5道sHAI-1B(K401A)；第6道，sHAI-2。標明前HGF、HGF α-鏈和HGF β-鏈(雙聯(lián)體)的位置。
圖7人天然肝絲酶的氨基酸序列的一個實例。
圖8人天然肝絲酶的氨基酸序列的另一個實例。
實施本發(fā)明的方式本發(fā)明提供包含HGF/c-met信號路徑調節(jié)劑的方法、組合物、試劑盒和制品，包括使用這種調節(jié)劑的方法。
在這里提供了這些方法、組合物、試劑盒和制品的細節(jié)。
一般技術除非另有陳述，否則本發(fā)明的實施將使用在本領域技術內(nèi)的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學傳統(tǒng)技術。文獻中對這些技術進行了充分解釋，例如，″Molecular CloningALaboratoryManual″，second edition(Sambrook et al.，1989)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait，ed.，1984)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1987)；″Methods in Enzymology″(Academic Press，Inc.)；″Current Protocols inMolecular Biology″(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，and periodic updates)；″PCRThe Polymerase Chain Reaction″，(Mullis et al.，ed.，1994)；″A PracticalGuide to Molecular Cloning″(Perbal Bemard V.，1988)；″Phage DisplayALaboratory Manual″(Barbas et al.，2001)。
定義這里使用的術語″肝絲酶(hepsin)″包括能夠以類似于野生型肝絲酶的方式切割前HGF的天然序列多肽、多肽變體，以及天然序列多肽和多肽變體(這里將對它們進行更進一步地限定)的片段。這里描述的肝絲酶多肽可以是分離自多種來源的多肽，例如來自人組織類型或另一個來源的多肽，或者是通過重組或合成方法制備的多肽。術語″肝絲酶″、″肝絲酶多肽″、″肝絲酶(hepsin enzyme)″和″肝絲酶蛋白質″的也包括這里公開的肝絲酶多肽的變體。
″天然序列肝絲酶多肽″包含與來源于自然界的對應肝絲酶多肽具有相同氨基酸序列的多肽。在一個實施方案中，天然序列肝絲酶多肽包含SEQ IDNO1的氨基酸序列(參見圖7)。在一個實施方案中，天然序列肝絲酶多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列(參見圖8)?？梢詮淖匀唤缰蟹蛛x這種天然序列肝絲酶多肽，或者可以通過重組或合成方法制備這種多肽。術語″天然序列肝絲酶多肽″特別包括具體肝絲酶多肽的天然發(fā)生的截短或分泌形式(例如，細胞外域序列)、天然發(fā)生的變體形式(例如，可替換的拼接形式)和多肽的天然發(fā)生的等位基因變體。
″肝絲酶多肽變體″或其變異形式指肝絲酶多肽，通常是與這里公開的任何天然序列的肝絲酶多肽序列具有至少大約80％的氨基酸序列同一性的活性肝絲酶多肽。這樣的肝絲酶多肽變體包括，例如，在天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或刪除一個或多個氨基酸殘基的多肽。通常，肝絲酶多肽變體與這里公開的天然序列的肝絲酶多肽序列具有至少大約80％的氨基酸序列同一性，或者至少大約81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。通常，肝絲酶變體多肽是長度為至少大約10個氨基酸、或者至少大約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600個氨基酸或更多個氨基酸的多肽。與天然肝絲酶多肽序列相比，肝絲酶變體多肽任選可以具有最多一個保守氨基酸替換，或者最多2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守氨基酸替換。
肽或多肽序列的″氨基酸序列同一性百分比(％)″定義為在對序列進行比對并在必要時引入缺口實現(xiàn)了最大的百分比序列同一性之后，候選序列中與具體肽或多肽序列的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，其中不認為任何保守取代是序列同一性的一部分。在本領域可以以多種方式實現(xiàn)確定氨基酸序列同一性百分比的比對，例如利用公眾可利用的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域熟練技術人員可以確定測量比對時的適當參數(shù)，包括需要對進行比較的全長序列進行最大比對的任何算法。但是，為了實現(xiàn)本文的目的，可以按照美國專利6,828,146中的描述利用序列比較計算機程序ALIGN-2來生成氨基酸序列同一性百分比數(shù)值。
這里使用的術語″載體″用來指能轉運另一個核酸到連接它的地方的核酸分子。一種載體是″質?！澹|粒是指可以將附加DNA片段連接到其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種載體是噬菌體載體。另一種載體是病毒載體，其中附加DNA片段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們插入其中的宿主細胞中自主復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和附加型(episomal)哺乳動物載體)。其它載體(例如，非附加型(non-episomal)哺乳動物載體)在引入宿主細胞時可以整合到宿主細胞基因組中，因此能夠與宿主基因組一起復制。而且，某些載體能夠指導與它們可操作性連接的基因的表達。這種載體在這里稱為″重組表達載體″(或簡稱為″重組載體″)。通常，在重組DNA技術中應用的表達載體經(jīng)常是質粒形式。在本發(fā)明的說明書中，″質?！搴汀遢d體″可以交換使用，因為質粒是最常用的載體形式。
″多核苷酸″或″核酸″在這里可交換使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基、和/或它們的類似物，或者是通過DNA或RNA聚合酶，或合成反應可以合并到聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和它們的類似物。如果存在修飾，可以在聚合物組裝之前或之后對核苷酸結構進行修飾?？梢酝ㄟ^非核苷酸成分中斷核苷酸序列?？梢栽诤铣芍蟾M一步地修飾多核苷酸，例如與標記物結合。其它修飾類型包括，例如″加帽″、用類似物替換一個或多個天然發(fā)生的核苷酸、核苷酸間修飾，例如具有不帶電荷的鍵(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等等)和帶電荷的鍵(例如硫代磷酸(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯等等.)的修飾、包含附加部分的那些修飾，所述附加部分例如，蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等等)、具有插入劑(例如，吖啶、補骨脂素等等)的那些修飾、包含螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、金屬氧化物等等)的那些修飾、包含烷化劑的那些修飾、具有修飾鍵的那些修飾(例如、α-異頭物核酸等等)，以及未修飾形式的多核苷酸的核苷酸間修飾。更進一步地，可以取代通常存在于糖中的任何羥基，例如可以用膦酸基團、磷酸基團替換，通過標準的保護基團也可以對其進行保護，可以對其進行活化以制備連接到附加核苷酸上的附加鍵，或者可以將其連接到固體或半固體支持物上。可以用胺或1-20個碳原子的有機封端基團部分磷酸化或替換5′和3′末端OH。其它的羥基也可以衍生成標準的保護基。多核苷酸還可以包含本領域通常已經(jīng)已知的核糖或脫氧核糖的相似形式，包括，例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-疊氮基核糖、碳環(huán)糖類似物、α-異頭物糖(anomeric sugar)、差向異構體糖，例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚糖、非環(huán)形類似物和非堿性(abasic)核苷類似物，例如甲基核糖核苷?？梢杂每蛇x擇的連接基團替代一個或多個磷酸二酯鍵。這些可選擇的連接基團包括，但不局限于其中磷酸鹽被P(O)S(″硫代酸(thioate)″)、P(S)S(″二硫代酸(dithioate)″)、″(O)NR.sub.2(″酰胺化″)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH.sub.2(″formacetal″)替代的實施方案，其中每個R或R’獨立地是H，或者任選地包含醚(-O-)鍵、芳烴基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或araldyl的替換或未替換的烷基(1-20C)。多核苷酸中的所有鍵并不需要是相同的。前面的描述適用于這里提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
這里使用的″寡核苷酸″通常指短的單鏈合成多核苷酸，其長度通常少于大約200個核苷酸，但不是必須少于大約200個核苷酸。術語″寡核苷酸″和″多核苷酸″不是互相排斥的。上述的有關多核苷酸的描述同樣完全地適用于寡核苷酸。
除非特別說明或上下文另外標明，否則這里使用的術語″肝細胞生長因子″或″HGF″指在允許活化HGF/c-met信號路徑的條件下，任何能夠活化HGF/c-met信號路徑的天然HGF多肽或HGF多肽變體(不論是天然發(fā)生的，還是合成的)。術語″野生型HGF″泛指包含天然發(fā)生的HGF蛋白質的氨基酸序列的多肽。術語″野生型HGF序列″泛指在天然發(fā)生的HGF中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。
術語″抗體″和″免疫球蛋白″在廣義上可交換使用，包括單克隆抗體(例如，全長或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如，只要顯示出想要的生物學活性的雙特異性抗體)，也可以包括某些抗體片段(這里將進行更詳細的描述)?？贵w可以是人的、人源化的和/或親合力成熟的抗體。
″抗體片段″僅僅包含完整抗體的一部分，其中這部分優(yōu)選保留通常與存在于完整抗體中的那部分相關的功能的至少一種，優(yōu)選大多數(shù)或全部。在一個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結合部位，因此保留了結合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段保留了通常與存在于完整抗體中的Fc區(qū)有關的生物功能的至少一種，例如結合FcRn、抗體半衰期調節(jié)、ADCC功能和結合補體。在一個實施方案中，抗體片段是具有基本上與完整抗體相似的體內(nèi)半衰期的單價抗體。例如，這樣的抗體片段可以包含連接到Fc序列上的抗原結合臂，其中Fc序列能夠使片段具有體內(nèi)穩(wěn)定性。
這里使用的術語″單克隆抗體″指從基本上均一的抗體群中獲得的抗體，即除可能少量存在的天然發(fā)生的可能突變之外，包含在該群體中的各抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異的靶向單個抗原的抗體。而且，與典型地包括靶向不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物相反，每個單克隆抗體只靶向抗原上的單個決定簇。
這里的單克隆抗體特別包括嵌合抗體，以及這種抗體的顯示出想要的生物活性的片段，其中嵌合抗體的重鏈和/或輕鏈的一部分等同于或同源于由特殊物種獲得的抗體或屬于特殊抗體類別或亞類的抗體的對應序列，這些鏈的剩余部分等同于或同源于由另一個物種獲得的抗體或屬于另一個抗體類別或亞類的抗體的對應序列(美國專利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))非人(例如，鼠的)抗體的″人源化″形式是包含由非人免疫球蛋白獲得的最小序列的嵌合抗體。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體抗體高變區(qū)的殘基被來自非人物種的抗體(供體抗體)，例如具有想要的特異性、親合力和能力(capacity)的小鼠、大鼠、兔子或非人類靈長目動物的抗體的高變區(qū)殘基替代。在有些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基被對應的非人殘基替代。而且，人源化抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。作這些修飾可以更進一步地改進抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包含至少一個，典型地兩個可變區(qū)的全部，其中全部或基本上全部的高變環(huán)相當于非人免疫球蛋白的那些高變環(huán)，全部或基本上全部的FRs是人免疫球蛋白序列的FRs。人源化抗體也可以任選包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，典型地包含人免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分?？梢詤⒁奐ones et al.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)以了解更多的細節(jié)。也可參見下列綜述文章和其中引用的參考文獻Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 231035-1038(1995)；Hurle andGross，Curr.Op.Biotech.5428-433(1994)。
″人抗體″是具有的氨基酸序列相當于人產(chǎn)生的抗體和/或利用這里公開的任何制造人抗體的技術已經(jīng)制備出來的抗體的氨基酸序列的抗體。人抗體的定義特別排除了包含非人的抗原結合殘基的人源化抗體。
″親合力成熟″抗體是在一個或多個CDRs中具有一個或多個改變的抗體，所述改變導致與不具有那些改變的親代抗體相比，抗體對抗原的親合力發(fā)生了改進。優(yōu)選對目標抗原的親合力是納摩爾，甚至是皮摩爾的親合力成熟抗體。通過本領域已知的方法可以生產(chǎn)親合力成熟抗體。Marks et al.Bio/Technology 10779-783(1992)描述了通過VH和VL區(qū)改組進行親合力成熟的技術。Barbas et al.Proc Nat.Acad.Sci，USA 913809-3813(1994)；Schier et al.Gene 169147-155(1995)；Yelton et al.J.Immunol.1551994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.1 54(7)3310-9(1995)和Hawkins et al，J.Mol.Biol.226889-896(1992)中描述了CDR和/或框架殘基的隨機誘變。
″阻斷抗體″或″拮抗劑″抗體是抑制或降低它結合的抗原的生物活性的抗體。優(yōu)選的阻斷抗體或拮抗劑抗體基本上抑制或完全抑制抗原的生物活性。
這里使用的″激動劑抗體″是模仿目的多肽的至少一種功能活性的抗體。
″紊亂(疾病)(disorder)″是將從用本發(fā)明的物質/分子或方法進行的治療中獲益的任何狀態(tài)。這包括慢性和急性紊亂，或包括使哺乳動物易患所討論的紊亂的那些病理學狀態(tài)的疾病。這里治療的紊亂的非限制實例包括惡性和良性腫瘤；非白血病和淋巴惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質、星形膠質細胞、下丘腦及其它腺體、巨噬細胞(macrophagal)、上皮細胞、間質和囊胚腔的紊亂(blastococlic disorder)；和炎性的、免疫學的及其它血管發(fā)生相關紊亂。
術語″細胞增生性紊亂(疾病)″和″增生性紊亂(疾病)″指與一定程度的異常細胞增殖有關的紊亂(疾病)。在一個實施方案中，細胞增生性紊亂(疾病)是癌癥。
這里使用的″腫瘤″指所有不論是惡性還是良性的贅生性細胞的生長和增殖，所有癌前和癌細胞和組織。這里提到的術語″癌癥″、″癌的″、″細胞增生性紊亂(疾病)″、″增生性紊亂(疾病)″和″腫瘤″不是互相排斥的。
術語″癌癥″和″癌″指或描述的是哺乳動物中典型地以無限制的細胞生長/增殖為特征的生理狀態(tài)。癌癥的實例包括，但不局限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤(blastoma)、肉瘤和白血病。這種癌癥更特殊的實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌(hepatocellular cancer)、胃腸癌、胰腺癌、惡性膠質瘤(glioblastoma)、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌(hepatoma)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(liver cancer)和各種類型的頭和頸癌。
這里使用的″治療″指嘗試改變被治療的個體或細胞的天然進程的臨床介入，可以以預防為目的而實施或在臨床病理學進程中實施。治療的合乎需要的效應包括防止疾病發(fā)生或復發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理后果、防止轉移、降低疾病進展的速度、改善或緩解疾病狀態(tài)，緩解或改進預后。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體被用來延緩疾病或紊亂的發(fā)展。
″有效量″指在必需的用藥時段實現(xiàn)想要的治療或預防結果的有效量。
本發(fā)明的物質/分子、激動劑或拮抗劑的″治療有效量″可以隨一些因素，例如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重、物質/分子、激動劑或拮抗劑在個體中引起想要的反應的能力而變化。治療有效量也是物質/分子、激動劑或拮抗劑的治療有益效果超過任何有毒或不利影響的劑量?！孱A防有效量″指在必需的用藥時段實現(xiàn)想要的預防結果的有效量。因為預防劑量是在疾病之前或疾病早期施用給受試者的，因此通常預防有效量小于治療有效量，但這并不是必須的。
這里使用的術語″細胞毒劑″指抑制或阻止細胞功能和/或導致細胞發(fā)生破壞的物質。該術語包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素)、化療劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、長春花生物堿(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它插入劑、酶和其片段，例如溶核酶、抗生素，毒素，例如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體、以及下文公開的各種抗腫瘤和抗癌劑。其它的細胞毒劑描述如下。破壞癌細胞的制劑會導致腫瘤細胞破壞。
″化療劑″是對癌癥治療有用的化合物?；焺┑膶嵗ㄍ榛瘎?，例如噻替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，例如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(特別是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素類(colchicines)；白樺脂酸(betulinicacid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成的類似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(依立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜樹堿(acetylcamptothecin)、東莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿(aminocamptothecin))；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括它的阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成的類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，例如烯二炔類(enediyne)抗生素(例如加利車霉素(calicheamicin)，特別是加利車霉素γII和加利車霉素ωI1(例如，參見Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33183-186(1994))；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)、包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(chromophore)和有關的色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L正亮氨酸、多柔比星(doxombicin)(包括ADRIAMYCIN、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、阿霉素HCl脂質體注射劑(DOXIL)和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zombicin)；抗代謝物，例如甲氨蝶呤、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegafur)(UFTORAL)、卡培他濱(capecitabine)(XELODA)、epothilone和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifiuridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺素，例如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如甲酰四氫葉酸(folinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋銨(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖復合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE，F(xiàn)ILDESIN)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇(taxoids)，例如，紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL)、清蛋白改造的納米顆粒劑型紫杉醇(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤；鉑類似物，例如順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春堿(vinblastine)(VELBAN)；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)(ONCOVIN)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；甲酰四氫葉酸(leucovorin)；長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE)；能滅瘤(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸(retinoids)，諸如維A酸(retinoic acid)；上述所有物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及上述的兩個或更多個組合，例如CHOP和FOLFOX，CHOP是環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍(prednisolone)的聯(lián)合治療的縮寫，F(xiàn)OLFOX是奧沙利鉑(oxaliplatin)(ELOXATINTM)聯(lián)合5-FU和甲酰四氫葉酸進行治療的縮寫。
調節(jié)、降低、阻斷或抑制激素作用的抗激素制劑也包括在該定義內(nèi)，其中所述的激素可以促進癌癥生長，所述的抗激素制劑經(jīng)常以系統(tǒng)或整體治療形式存在。所述抗激素制劑可以是激素本身。實例包括抗雌激素劑和選擇性的雌激素受體調節(jié)劑(SERMs)，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥泰米芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；抗孕酮類；雌激素受體下調劑(ERDs)；雌激素受體拮抗劑，例如氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX)；那些起抑制或阻斷卵巢功能的制劑，例如促黃體素釋放激素(LHRH)激動劑，例如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON和ELIGARD)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素劑，例如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；和抑制腎上腺中調節(jié)雌激素產(chǎn)生的芳香酶的芳香酶抑制劑，例如，4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、formestanie、法倔唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole)(RIVISOR)、來曲唑(letrozole)(FEMARA)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)。另外，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates)，例如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸鈉(etidronate)(DIDROCAL)、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate)(ZOMETA)、阿倫膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL)；以及曲沙他濱(troxacltabine)(1，3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制信號路徑中和異常細胞增殖有關聯(lián)的基因的表達的寡核苷酸，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，例如THERATOPE疫苗和基因治療疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；拓撲異構酶抑制劑(例如，LURTOTECAN)；rmRH(例如，ABARELIX)；lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR雙酪氨酸激酶小分子抑制劑，又名GW572016)；COX-2抑制劑，例如塞來考昔(celecoxib)(CELEBREX；4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；和上述所有物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物。
這里使用的″生長抑制劑″指抑制細胞生長的化合物或組合物，其中細胞的生長在依賴于體外或體內(nèi)的HGF/c-met活化。因此，生長抑制劑可以是能顯著降低S期HGF/c-met-依賴細胞百分比的制劑。生長抑制制劑的實例包括阻斷細胞周期進展(在除S期以外的其它時間點)的制劑，例如誘導G1期和M期停止的制劑。典型的M期阻斷劑包括長春藥屬(vinca)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、紫杉烷類(taxane)和拓撲異構酶II抑制劑，例如，多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻斷G1的制劑也可以延伸到S期阻斷，例如DNA烷化劑，如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil)和ara-C。在The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn and Israel，eds.，Chapter 1，entitled″Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplasticdrugs″by Murakami et al.(WB SaundersPhiladelphia，1995)中，特別是13頁可以發(fā)現(xiàn)更多信息。紫杉烷類(紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))都是由紫杉樹獲得的抗癌藥。由歐洲紫杉獲得的多西他賽(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb)的半合成類似物。紫杉醇和多西他賽促進微管蛋白二聚體組裝成微管，并通過防止解聚作用穩(wěn)定微管，這會導致細胞有絲分裂受到抑制。
“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽環(huán)類抗生素。多柔比星的完整化學名是(8S-順式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脫氧-α-L-來蘇-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-8-(羥基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-并四苯二酮((8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，10-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione)。
本發(fā)明的組合物和方法A.抗體在一個實施方案中，本發(fā)明提供了發(fā)現(xiàn)在這里可以用作治療和/或診斷制劑的抗體。示范的抗體包括多克隆的、單克隆的、人源化的、雙特異性的和異偶聯(lián)抗體。
1.多克隆抗體優(yōu)選通過多重皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關抗原和佐劑在動物中收集多克隆抗體。將相關抗原連接到在被免疫的物種中能產(chǎn)生免疫原性的蛋白質上可能是有用的(特別是當使用合成肽時)。例如利用雙功能制劑或衍生制劑，例如馬來酰亞胺苯酰硫代琥珀酰亞胺酯(maleimidobenzoylsulfo succinimide ester)(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基，可以將抗原連接到鑰孔血藍素(KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑上。
通過組合，例如100μg或5μg蛋白質或偶聯(lián)物(分別免疫兔子或小鼠)和3體積的福氏完全佐劑，并在多個位點將溶液注射到皮內(nèi)使動物免疫抗原、產(chǎn)生免疫原性的偶聯(lián)物、或衍生物。一個月以后，通過在多個位點皮下注射處于福氏完全佐劑中的是原有量1/5-1/10的肽或偶聯(lián)物加強免疫動物。7-14天后，采集動物血液，測定血清中的抗體滴度。加強免疫動物是直到滴度達到高水平穩(wěn)定狀態(tài)(plateaus)。也可以在重組細胞培養(yǎng)中以蛋白質融合物來制備偶聯(lián)物。聚集劑，例如明礬(alum)也可以適當?shù)赜糜谠鰪娒庖叻磻?br> 2.單克隆抗體可以利用Kohler et al.，Nature，256495(1975)最初描述的雜交瘤方法，或者通過重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)制備單克隆抗體。
在雜交瘤方法中，按照如上所述免疫的方法免疫小鼠或其它適當?shù)乃拗鲃游?，例如倉鼠以得到產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細胞，其中抗體特異性地結合用來進行免疫的蛋白質。或者，可以在體外免疫淋巴細胞。在免疫以后，分離淋巴細胞，然后利用適當?shù)闹趧?，例如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞系融合形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。
接種制備得到的雜交瘤細胞，讓其生長在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中，培養(yǎng)基優(yōu)選包含抑制未融合的親代骨髓瘤細胞(也稱為融合配偶體)生長或存活的一種或多種物質。例如如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，那么適合雜交瘤的選擇性培養(yǎng)基典型地包括阻止HGPRT缺乏細胞生長的次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT培養(yǎng)基)。
優(yōu)選的融合配偶體骨髓瘤細胞是那些能高效進行融合，支持選擇的抗體生產(chǎn)細胞高水平穩(wěn)定生產(chǎn)抗體，并對選擇淘汰未融合親代細胞的選擇性培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細胞。優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤細胞系，例如那些從獲自美國加利福尼亞圣地亞哥的Salk研究所細胞分布中心(SalkInstitute Cell Distribution Center)的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤獲得的骨髓瘤細胞系，SP-2及其衍生物，例如從美國弗吉尼亞州Manassas的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得的X63-Ag8-653細胞。也已經(jīng)描述生產(chǎn)人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；和Brodeur et al.，MonoclonalZchniques and Applications，pp.5 1-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
測定雜交瘤細胞生長其中的培養(yǎng)基中生產(chǎn)的針對抗原的單克隆抗體。優(yōu)選通過免疫沉淀反應或通過體外結合測定，例如放射免疫測定(RIA)或(酶聯(lián)免疫吸附測定)(ELISA)測定雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結合特異性。
例如，單克隆抗體的結合親合性可以通過Munson et al.Anal.Biochem.，107220(1980)中描述的Scatchard分析確定。
一旦鑒定出那些產(chǎn)生具有想要的特異性、親合性和/或活性的抗體的雜交瘤細胞，就可以通過有限稀釋方法亞克隆該克隆，并通過標準方法使它們生長(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。實現(xiàn)這一目的的適當培養(yǎng)基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，可以將雜交瘤細胞作為動物體內(nèi)的腹水腫瘤使其在體內(nèi)生長，例如通過腹膜內(nèi)注射細胞到小鼠體內(nèi)可以實現(xiàn)這一點。
利用常規(guī)的抗體純化方法，例如親和層析(例如利用蛋白質A或蛋白質G-Sepharose)或離子交換層析、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析等等，可以適當?shù)貜呐囵B(yǎng)基、腹水或血清中分離亞克隆分泌的單克隆抗體。
利用常規(guī)程序(例如，通過使用能特異結合到編碼鼠抗體重鏈和輕鏈基因上的寡核苷酸探針)很容易分離編碼單克隆抗體的DNA，并能對其進行測序。雜交瘤細胞可以作為這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離出這種DNA，就可以將DNA置入表達載體中，表達載體隨后被轉染到宿主細胞，例如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產(chǎn)生抗體蛋白質的骨髓瘤細胞里，以實現(xiàn)在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。關于在細菌中重組表達編碼抗體的DNA的綜述包括Skerra et al.，Curr.Opinion inImmunol.，5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130151-188(1992)。
在更進一步的實施方案中，單克隆抗體或抗體片段可以分離自使用McCafferty et al.，Nature，348552-554(1990)中描述的技術產(chǎn)生的抗體噬菌體庫。Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)描述了使用噬菌體庫分別分離鼠和人抗體的過程。后來的出版物描述了通過鏈改組(Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992))，以及作為構建非常大的噬菌體庫策略的組合感染和體內(nèi)重組(Waterhouse et al.，Nuc.Acids.Res.2l2265-2266(1993))生產(chǎn)高親合力(nM范圍)人抗體的情況。因此，這些技術是分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術的可行的替換方法。
可以修飾編碼抗體的DNA以產(chǎn)生嵌合的或融合白的抗體多肽，例如，通過用人重鏈和輕鏈恒定域(CH和CL)序列替換同源的鼠序列(美國專利No.4,816,567和Morrison，et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，816851(1984))，或者通過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列融合可以實現(xiàn)這一點。非免疫球蛋白多肽序列可以替代抗體恒定域，或者它們可以替換抗體的一個抗原結合部位的可變域以產(chǎn)生包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結合位點和對不同抗原具有特異性的另一個抗原結合位點的嵌合的二價抗體。
3.人和人源化抗體本發(fā)明的抗體可以更進一步地包含人源化抗體或人抗體。非人(例如，鼠的)抗體的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2或抗體的其它的抗原結合子序列)，所述免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段包含來源于非人免疫球蛋白的最少序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被來自非人物種的抗體(供體抗體)，例如具有期望特異性、親合性和能力(capacity)的小鼠、大鼠或兔子的抗體的CDR殘基替代。在有些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架殘基被對應的非人殘基替代。人源化抗體也可以包含既沒有在受體抗體中發(fā)現(xiàn)，也沒有在被引入的CDR或骨架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體基本上包含至少一種，典型地兩種可變域(variable domain)的全部，其中全部或基本上全部的CDR區(qū)相當于非人免疫球蛋白的那些CDR區(qū)，全部或基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白的共有序列。人源化抗體優(yōu)選也包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，典型地包含人免疫球蛋白的恒定區(qū)[Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)]。
人源化非人抗體的方法在本領域為大家所熟知。通常，人源化抗體具有來自非人來源的被引入的其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常被稱為″引入″殘基，″引入″殘基典型地取自″引入″可變域。遵循Winter和其同事的方法[Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann etal.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，2391534-1536(1988)]，通過用嚙齒類動物的CDRs或CDR序列替換人抗體的對應序列基本上可以完成人源化。因此，這種″人源化抗體″是嵌合抗體(美國專利No.4,816,567)，其中基本上小于完整人可變域的部分已經(jīng)被來自非人物種的對應序列替換。實際上，人源化抗體典型地是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基被嚙齒類動物抗體中來自相似位點的殘基替換的人抗體。
選擇制造人源化抗體時使用的人輕鏈和重鏈可變域對減少抗體治療人類時的抗原性和HAMA反應(人抗小鼠抗體)非常重要。根據(jù)所謂的″最佳擬合″方法，可以針對已知的人可變域序列的全體庫篩選嚙齒類動物抗體的可變域序列。鑒定最接近嚙齒類動物V域序列的人V域序列，它內(nèi)部的人框架區(qū)(FR)被接受用于人源化抗體(Sims et al.，J.Immunol.1512296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一個方法使用了由具體輕鏈或重鏈亞群的所有人抗體的共有序列獲得的具體框架區(qū)。相同的框架區(qū)可以用于幾種不同的人源化抗體(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.1512623(1993))。
更進一步地，人源化抗體保留對抗原的高結合親合力及其它有利的生物學特性是重要的。為了實現(xiàn)這一目標，依照優(yōu)選方法，可以通過使用親代和人源化序列的三維模型分析親代序列和各種理論上的人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可得到的，而且為本領域熟練技術人員所熟悉。說明和顯示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構象結構的計算機程序是可獲得的。這些研究可以對殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用進行分析，即對影響候選免疫球蛋白的抗原結合能力的殘基進行分析。這樣，可以從受體序列和引入序列中選擇和組合FR殘基，以實現(xiàn)想要的抗體特性，例如，增加的對目標抗原的親合力。通常，高變區(qū)殘基直接并且最大程度地影響抗原結合。
可以考慮各種形式的人源化抗體。例如人源化抗體可以是抗體片段，例如任選連接到一種或多種細胞毒劑上產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物的Fab?；蛘撸嗽椿贵w可以是完整的抗體，例如完整的IgG1抗體。
可以產(chǎn)生人抗體作為人源化抗體的替換物。例如現(xiàn)在產(chǎn)生免疫時能在缺少內(nèi)源免疫球蛋白生產(chǎn)的情況下生產(chǎn)人抗體所有成員的轉基因動物(例如，小鼠)是可能的。例如已經(jīng)描述在嵌合的種系突變小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因會導致內(nèi)源抗體生產(chǎn)完全被抑制。將人的種系免疫球蛋白基因排列轉移到這種種系突變小鼠中將導致抗原激發(fā)時產(chǎn)生人抗體。例如，參見Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year inImmuno.733(1993)；美國專利Nos.5,545,806、5,569,825、5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807和WO 97/17852。
或者，可以利用噬菌體展示技術(McCafferty et al.，Nature 348552-553 )在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)域基因庫制備人抗體和抗體片段。依據(jù)這種技術，抗體V域(domain)基因被克隆到絲狀噬菌體的主要或次要外殼蛋白(例如M13或fd)基因的閱讀框(in-frame)內(nèi)，并作為功能抗體片段展示在噬菌體顆粒表面。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，因此基于抗體功能特性的選擇也會導致對編碼呈現(xiàn)那些特性的抗體的基因的選擇。因此，噬菌體模仿B細胞的一些特性。可以以多種形式完成噬菌體展示，例如，Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3564-571(1993)進行了綜述。數(shù)種來源的V基因片段可用于噬菌體展示。Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)從來自免疫小鼠脾臟的V基因的小隨機組合庫分離了抗噁唑酮抗體的多種排列?？梢詷嫿▉碜晕疵庖呷斯w的全部V基因，并且基本上遵循Marks etal.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)，或Griffith et al.，EMBO J.12725-734(1993)中描述的技術可以分離到針對多種多樣的抗原排列(包括自身抗原)的抗體。也可以參見美國專利Nos.5,565,332和5,573,905。
正如以上所討論的，也可以通過體外活化的B細胞來產(chǎn)生人抗體(參見，美國專利5,567,610和5,229,275)。
4.抗體片段在某些環(huán)境中，使用抗體片段，而不是完整抗體具有優(yōu)勢。大小較小的片段允許快速清除，而且可以導致更容易進入實體瘤。
已開發(fā)了多種技術用于生產(chǎn)抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段通過對完整抗體進行蛋白水解消化來衍生(見例如，Morimoto等，J.Biochem.Biojphys.Methods 24107-117(1992)和Brennan等，Science 22981(1985))。然而，這些片段現(xiàn)在可通過重組宿主細胞直接生產(chǎn)。Fab，F(xiàn)v和ScFv抗體片段均可在大腸桿菌中表達并從中分泌，從而使這些片段的大量生產(chǎn)變得更容易。也可自上述的抗體噬菌體文庫分離抗體片段?？蛇x地，F(xiàn)ab’-SH片段可自大腸桿菌直接回收并利用化學方法偶聯(lián)形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10163-167(1992))。根據(jù)另一方法，F(xiàn)(ab’)2片段可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物中分離。包括補救受體結合表位殘基并具有延長的體內(nèi)半壽期的Fab和F(ab′)2片段在美國專利5,869,046中描述。熟練技術人員掌握其它產(chǎn)生抗體片段的技術。其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO 93/16185；美國專利5,571,894；和美國專利5,587,458。Fv和sFv是具有完整結合位點但缺乏恒定區(qū)的唯一種類；因此，其適于在體內(nèi)應用期間降低非特異結合?？梢詷嫿╯Fv融合蛋白，從而在sFv的氨基或羧基末端融合效應蛋白。見上文的Antibody Engineering，Borrebaeck編輯。抗體片段也可以是“線性抗體”，例如在美國專利5,641,870中描述。此種線型抗體片段可以是單特異或雙特異的。
5.雙特異性抗體雙特異抗體是對至少兩種不同表位具有結合特異性的抗體。典型的雙特異抗體可結合本文所述的肝絲酶、HGF和/或肝絲酶HGF復合物的兩種不同表位。其它此種抗體可將針對肝絲酶、HGF和/或肝絲酶HGF復合物的結合位點與針對另一多肽的結合位點組合?；蛘?，抗體臂可以與結合白細胞上觸發(fā)分子的臂組合，觸發(fā)分子例如T細胞受體分子(例如CD3)或IgG的Fc受體(FcγR)例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγR(CD16)，以將細胞防御機制集中和定位到表達和/或結合肝絲酶和/或HGF的細胞上。雙特異抗體也可用來將細胞毒劑定位到表達和/或結合肝絲酶、HGF和/或肝絲酶HGF復合物的細胞上。這些抗體具有多肽結合臂和結合細胞毒劑的臂(例如結合皂草素(saporin)，抗α-干擾素，長春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)?？梢詫㈦p特異抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab′)2雙特異抗體)。
WO96/16673描述了雙特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗體，美國專利5,837,234披露了雙特異性抗ErbB2/抗FcγRI抗體。在WO98/02463中顯示雙特異性抗ErbB2/Fcα抗體。美國專利5,821,337教導了雙特異性抗ErbB2/抗CD3抗體。
制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein et al，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機分配，這些雜交瘤(“四鏈瘤”(quadroma))產(chǎn)生10種不同抗體分子的可能混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法在WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)中披露。
依據(jù)另一不同方法，可將具有所需結合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結合位點)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含至少一部分鉸鏈區(qū)、CH2及CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉染至適當宿主細胞。在使用非等比的三種多肽鏈進行構建以獲得所需雙特異性抗體最佳產(chǎn)量的實施方案中，這提供了調整三種多肽片段的相互比例上的較大靈活性。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產(chǎn)時或所述比例對所需鏈組合的產(chǎn)量無明顯影響時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。
在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發(fā)現(xiàn)這種不對稱結構有利于從不想要的免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因為只有該雙特異性分子的一半存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于1994年3月3日公開的WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進一步細節(jié)可以參見，例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根據(jù)美國專利5,731,168所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養(yǎng)中獲得的異二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括CH3結構域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側鏈被較大側鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側鏈大小相同或相近的互補“溝”可通過將氨基酸大側鏈用小側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這提供了一種機制，其使異二聚體的產(chǎn)量比其它不想要的終產(chǎn)物如同型二聚體高。
雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點認為，這類抗體可用于將免疫系統(tǒng)細胞導向不想要的細胞(美國專利4，676，980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過任何適當?shù)慕宦?lián)方法制備。適當?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術為本領域已知，在美國專利4,676,980號中獲得。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術已有文獻。例如，雙特異性抗體可利用化學連接制備。Brennan等，科學22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解切割制備F(ab′)2片段的方法。這些片段在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉存在下被還原，使鄰近的二硫醇穩(wěn)定，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原再轉化成Fab′-硫醇，再與等摩爾量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
近期的進展促進了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經(jīng)化學偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，J.Exp.Med.，175217-225(1992)描述了完全人源化雙特異抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來，體外直接化學偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞結合，還能引發(fā)人類細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤靶向的裂解活性。直接從重組細胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同二聚體。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)所述的“雙抗體(diabody)”技術提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有VH，其通過接頭與VL相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個結構域之間無法配對。因此，同一片段上的VH和VL結構域被迫與另一片段上的互補VL和VH結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。此外還報道了另一種用單鏈FV(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，J.Immunol.，1525368(1994)。
本發(fā)明還涉及二價以上的抗體。例如可制備三特異抗體。Tutt等J.Immunol.14760(1991)。
6.異源偶聯(lián)抗體異源偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由兩個共價連接的抗體組成。例如，已經(jīng)計劃使這種抗體將免疫系統(tǒng)細胞靶向到不需要的細胞上[美國專利No.4,676,980]和將其用于治療HIV感染[WO 91/00360；WO92/200373；EP 03089]。打算利用合成蛋白化學作用，包括那些涉及交聯(lián)劑的合成蛋白化學作用中的已知方法在體外制備該抗體。例如，可以使用二硫化物交換反應或通過形成硫醚鍵構建免疫毒素。實現(xiàn)這一目的的適當?shù)脑噭嵗▉啺被虼见}(iminothiolate)和甲基-4-巰基丁酰亞氨酸酯(methyl-4-mercapto butyrimidate)，以及如美國專利No.4,676,980中公開的那些試劑。
7.多價抗體多價抗體比二價抗體更容易被表達與該抗體結合的抗原的細胞內(nèi)化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是具有三個或更多個抗原結合位點的多價抗體(例如四價抗體)(它們不是IgM類)，通過使編碼所述抗體多肽鏈的核酸重組表達可輕易制備該抗體。多價抗體可以包含二聚體化結構域和三個或更多個抗原結合位點。優(yōu)選的二聚體化結構域包括Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)，或由它們組成。在本文中，抗體包含F(xiàn)c區(qū)和三個或更多個位于Fc區(qū)氨基端的抗原結合位點。優(yōu)選的多價抗體在此包括三到約八個抗原結合位點，或由它們組成，但優(yōu)選四個抗原結合位點。多價抗體包括至少一條多肽鏈(并優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或多個可變區(qū)。例如，多肽鏈可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可變區(qū)，VD2是第二可變區(qū)，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽鏈可包括VH-CH1-柔韌接頭(flexible linker)-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或VH-CHl-VH-CHl-Fc區(qū)鏈。本文的多價抗體優(yōu)選進一步包含至少兩個(優(yōu)選四個)輕鏈可變區(qū)多肽。例如本文的多價抗體可包含從約兩個到約八個輕鏈可變區(qū)多肽。本文的輕鏈可變區(qū)多肽包含輕鏈可變區(qū)以及可選地進一步包含CL結構域。
8.效應器功能改造修飾本發(fā)明抗體的效應器功能可能是合乎需要的，例如，可以增強抗體的抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒性(CDC)。通過在抗體的Fc區(qū)插入一個或多個氨基酸替換可以實現(xiàn)這一點?；蛘呋蛄硗饪梢栽贔c區(qū)引入半胱氨酸殘基，從而允許在該區(qū)域內(nèi)形成鏈間二硫鍵。因此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可能具有改善的內(nèi)化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron et al.，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。也可以依照Wolff et al.，Cancer Research 532560-2565(1993)中的描述利用異雙功能交聯(lián)劑制備具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體?；蛘?，可以通過工程改造使抗體具有雙Fc區(qū)，從而使該抗體具有增強的補體溶解作用和ADCC能力。參見Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design3219-230(1989)。為了增加抗體的血清半衰期，可以依照，例如美國專利5,739,277中的描述將補救受體結合表位摻入抗體中(特別是抗體片段中)。這里使用的術語″補救受體結合表位″指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區(qū)負責增加IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。
9.免疫偶聯(lián)物本發(fā)明也涉及包含連接到細胞毒劑，例如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的具有酶活性的毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)上的抗體的免疫偶聯(lián)物或抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)。
抗體-藥物偶聯(lián)物在癌癥治療中用于局部投遞細胞毒劑或抑制細胞試劑(即用于殺死或抑制腫瘤細胞的藥物)的用途(Syrigos and Epenetos，Anticancer Research 19605-614(1999)；Niculescu-Duvaz and Springer，Adv.Drg.Del.Rev.26151-172(1997)；美國專利4,975,278)理論上能將藥物部分靶向投遞至腫瘤，并在那兒進行細胞內(nèi)積累，而系統(tǒng)施用這些未經(jīng)偶聯(lián)的藥物制劑可能對試圖消除的腫瘤細胞以及對正常細胞導致不可接受的毒性水平(Baldwin et al.，Lancet 603-05(1986年5月15日)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review”，在《MonoclonalAntibodies′84Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人編，第475-506頁，1985)。由此試圖獲得最大功效及最小毒性。多克隆抗體和單克隆抗體皆有報道可用于這些策略(Rowland et al.，Cancer Immunol.Immunother.211 83-87(1986))。這些方法中所使用的藥物包括道諾霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和長春地辛(vindesine)(Rowland et al.，1986，見上文)?？贵w-毒素偶聯(lián)物中所使用的毒素包括細菌毒素諸如白喉毒素、植物毒素諸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素諸如格爾德霉素(geldanamycin)(Mandler et al.，Jour.ofthe Nat.Cancer Inst.92(19)1573-1581(2000)；Mandler et al.，Bioorganic&Med.Chem.Letters 101025-1028(2000)；Mandler et al.，Bioconjugate Chem.13786-791(2002))、美登木素生物堿類(EP 1391213；Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938618-8623(1996))、和加利車霉素(calicheamicin)(Lode et al.，Cancer Res.582928(1998)；Hinman et al.，Cancer Res.533336-3342(1993))。所述毒素可通過包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制在內(nèi)的機制發(fā)揮其毒害細胞和抑制細胞的效果。有些細胞毒藥物在與大的抗體或蛋白質受體配體偶聯(lián)時趨于失活或活性降低。
ZEVALIN(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由針對在正常和惡性B淋巴細胞表面上發(fā)現(xiàn)的CD20抗原的鼠IgG1κ單克隆抗體與通過硫脲接頭-螯合劑所結合的111In或90Y放射性同位素構成的抗體-放射性同位素偶聯(lián)物(Wiseman et al.，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)766-77(2000)；Wiseman et al.，Blood 99(12)4336-42(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(10)2453-63(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(15)3262-69(2002))。盡管ZEVALIN具有針對B細胞非何杰金(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施藥在大多數(shù)患者中導致嚴重且長時間的血細胞減少。MYLOTARGTM(gemtuzumabozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，即由人CD33抗體與加利車霉素連接而構成的抗體-藥物偶聯(lián)物，在2000年批準用于經(jīng)注射治療急性骨髓性白血病(Drugs of the Future 25(7)686(2000)；美國專利4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumabmertansine(Immunogen Inc.)，即由huC242抗體經(jīng)二硫化物接頭SPP與美登木素生物堿藥物部分DM1連接而構成的抗體-藥物偶聯(lián)物，正在進行用于治療表達CanAg的癌癥諸如結腸癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期試驗。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特異膜抗原(PSMA)單克隆抗體與美登木素生物堿藥物部分DM1連接而構成的抗體-藥物偶聯(lián)物，正在進行用于前列腺腫瘤潛在治療的開發(fā)。將多拉司他汀(dolastatin)的合成類似物auristatin肽、auristatin E(AE)和單甲基auristatin(MMAE)與嵌合單克隆抗體cBR96(對癌上的Lewis Y特異)和cAC10(對惡性血液腫瘤上的CD30特異)偶聯(lián)(Doronina et al.，NatureBiotechnology 21(7)778-784(2003))，且正在進行治療性開發(fā)。
上文已經(jīng)描述了可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑?？墒褂玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria offcinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re?？贵w和細胞毒劑的偶聯(lián)物可使用多種雙功能蛋白質偶聯(lián)劑來制備，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲?；?己二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitettaet al.，Science 2381098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO 94/11026。
本文還設想了抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車霉素(calicheamicin)、美登木素生物堿類(maytansinoids)、單端孢霉素(trichothecene)和CC1065及這些毒素具有毒素活性的片段的偶聯(lián)物。
美登素和美登木素生物堿類在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體(全長或片段)與一個或多個美登木素生物堿分子偶聯(lián)。
美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白多聚化來發(fā)揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離得到(美國專利3,896,111)。隨后發(fā)現(xiàn)某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利4,151,042)。例如下列美國專利公開了合成美登醇及其衍生物和類似物4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。
美登未素生物堿-抗體偶聯(lián)物在改進其治療指數(shù)的嘗試中，已經(jīng)將美登素和美登木素生物堿類與特異結合腫瘤細胞抗原的抗體偶聯(lián)。例如下列專利公開了包含美登木素生物堿類的免疫偶聯(lián)物及其治療用途美國專利5,208,020；5,416,064；及歐洲專利EP 0 425 235 B1，明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938618-8623(1996)記載了包含與針對人結腸直腸癌的單克隆抗體C242連接的稱為DM1的美登木素生物堿的免疫偶聯(lián)物。發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物具有針對培養(yǎng)的結腸癌細胞的高度細胞毒性，而且在體內(nèi)腫瘤生長測定法中顯示抗腫瘤活性。Chari et al.，Cancer Research 52127-131(1992)記載了其中美登木素生物堿經(jīng)二硫化物接頭與結合人結腸癌細胞系上抗原的鼠抗體A7或結合HER-2/neu癌基因的另一種鼠單克隆抗體TA.1偶聯(lián)的免疫偶聯(lián)物。在體外在人乳癌細胞系SK-BR-3上測試了TA.1-美登木素生物堿偶聯(lián)物的細胞毒性，該細胞系每個細胞表達3x105個HER-2表面抗原。藥物偶聯(lián)物達到了與游離美登木素生物堿藥物相似的一定程度的細胞毒性，這可通過增加每個抗體分子偶聯(lián)的美登木素生物堿分子數(shù)目來提高。A7-美登木素生物堿偶聯(lián)物在小鼠中顯示低系統(tǒng)性細胞毒性。
抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物(免疫偶聯(lián)物)抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物可通過將抗體與美登木素生物堿分子化學連接且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿分子的生物學活性來制備。每個抗體分子偶聯(lián)平均3-4個美登木素生物堿分子在增強針對靶細胞的細胞毒性中顯示功效，且對抗體的功能或溶解度沒有負面影響，盡管預計甚至一個分子的毒素/抗體也將較之裸抗體的使用增強細胞毒性。美登木素生物堿類在本領域是眾所周知的，而且可通過已知技術合成或從天然來源分離。例如美國專利5,208,020和上文提及的其它專利及非專利發(fā)表物中公開了合適的美登木素生物堿類。優(yōu)選的美登木素生物堿類是美登醇和美登醇分子的芳香環(huán)或其它位置經(jīng)過修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。
本領域知道許多連接基團可用于制備抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物，包括例如美國專利5,208,020或歐洲專利0 425 235 B1及Chari et al.，CancerResearch 52127-131(1992)中所公開的。連接基團包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩(wěn)定基團、光不穩(wěn)定基團、肽酶不穩(wěn)定基團、或酯酶不穩(wěn)定基團，正如上文所述專利中所公開的，優(yōu)選二硫化物和硫醚基團。
可使用多種雙功能蛋白質偶聯(lián)劑來制備抗體和美登木素生物堿的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173723-737(1978))和N-琥珀酰亞氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫鍵連接。
根據(jù)連接的類型，可將接頭附著于美登木素生物堿分子的多個位置。例如，可使用常規(guī)偶聯(lián)技術通過與羥基的反應來形成酯鍵。反應可發(fā)生在具有羥基的C-3位置、經(jīng)羥甲基修飾的C-14位置、經(jīng)羥基修飾的C-15位置、和具有羥基的C-20位置。在一個優(yōu)選的實施方案中，在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成鍵連接。
加利車霉素另一種感興趣的免疫偶聯(lián)物包含與一個或多個加利車霉素分子偶聯(lián)的抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂。關于加利車霉素家族偶聯(lián)物的制備參見美國專利5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都授予美國Cyanamid公司)?？捎玫募永嚸顾亟Y構類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research 533336-3342(1993)；Lode et al.，Cancer Research 582925-2928(1998)；及上述授予美國Cyanamid公司的美國專利)。可與抗體綴合的另一種抗腫瘤藥物是QFA，它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和QFA都具有胞內(nèi)作用位點，且不易穿過質膜。因此，這些試劑經(jīng)由抗體介導的內(nèi)在化的細胞攝取大大增強了它們的細胞毒效果。
其它細胞毒劑可與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的其它抗腫瘤劑包括BCNU、鏈佐星(streptozoicin)、長春新堿(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美國專利5,053,394、5,770,710中記載的統(tǒng)稱為LL-E33288復合物的試劑家族、及埃斯波霉素類(esperamicins)(美國專利5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。參見例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本發(fā)明還設想了抗體和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯(lián)物。
為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。實例包括At211、II131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32、pb212和Lu的放射性同位素。在將偶聯(lián)物用于檢測時，可包含放射性原子用于閃爍照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋標記物用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以已知方式將放射性或其它標記物摻入偶聯(lián)物。例如，可生物合成肽，或是通過化學氨基酸合成法合成肽，其中使用牽涉例如氟-19代替氫的合適氨基酸前體?？山?jīng)肽中的半胱氨酸殘基來附著標記物，諸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111?？梢越?jīng)賴氨酸殘基來附著釔-90。IODOGEN法(Frakeret al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.8049-57(1978))可用于摻入碘-123?！禡onoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989)詳細記載了其它方法。
可使用多種雙功能蛋白質偶聯(lián)劑來制備抗體和細胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 2381098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO94/11026。接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari et al.，Cancer Research 52127-131(1992)；美國專利5,208,020)。
本發(fā)明的化合物明確涵蓋但不限于用下列交聯(lián)劑制備的ADC商品化(如購自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。見2003-2004年度應用手冊和產(chǎn)品目錄(ApplicationsHandbook and Catalog)第467-498頁。
抗體-藥物偶聯(lián)物的制備在本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)中，將抗體(Ab)經(jīng)接頭(L)與一個或多個藥物部分(D)綴合，例如每個抗體偶聯(lián)約1個至約20個藥物部分?？刹捎帽绢I域技術人員知道的有機化學反應、條件和試劑通過數(shù)種路徑來制備通式I的ADC，包括(1)抗體的親核基團經(jīng)共價鍵與二價接頭試劑反應，形成Ab-L，隨后與藥物部分D反應；和(2)藥物部分的親核基團經(jīng)共價鍵與二價接頭試劑反應，形成D-L，隨后與抗體的親核基團反應。
Ab-(L-D)pI抗體的親核基團包括但不限于(i)N末端氨基；(ii)側鏈氨基，如賴氨酸；(iii)側鏈巰基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗體中糖的羥基或氨基。氨基、巰基、和羥基是親核的，能夠與接頭部分上的親電子基團反應而形成共價鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、和酸性鹵化物；(ii)烷基和苯甲基鹵化物，諸如鹵代乙酰胺；(iii)醛類、酮類、羧基和馬來酰亞胺基團。某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵，即半胱氨酸橋?？赏ㄟ^還原劑諸如DTT(二硫蘇糖醇)處理使抗體具有與接頭試劑綴合的反應活性。每個半胱氨酸橋理論上將形成兩個反應性硫醇親核體?？山?jīng)由賴氨酸與2-亞氨基硫烷(Traut氏試劑)的反應，導致胺轉變?yōu)榱虼?，從而將額外親核基團引入抗體。
還可通過修飾抗體來生成本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物，即引入可與接頭試劑或藥物上的親核取代基反應的親電子部分。可用例如高碘酸鹽氧化劑氧化糖基化抗體的糖，從而形成可與接頭試劑或藥物部分的胺基團反應的醛或酮基團。所得亞胺Schiff堿基可形成穩(wěn)定的鍵，或者可用例如硼氫化物試劑還原而形成穩(wěn)定的胺連接。在一個實施方案中，糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應可在蛋白質中生成羰(醛和酮)基團，它可與藥物上的適宜基團反應(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一個實施方案中，包含N末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質可與偏高碘酸鈉反應，導致在第一個氨基酸處生成醛(Geoghegan&Stroh，Bioconjugate Chem.3138-146(1992)；US 5362852)。此類醛可與藥物部分或接頭親核體反應。
同樣，藥物部分上的親核基團包括但不限于胺、硫醇、羥基、酰肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基團，它們能夠與接頭部分上的親電子基團反應而形成共價鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯、和酸性鹵化物；(ii)烷基和苯甲基鹵化物，諸如鹵代乙酰胺；(iii)醛類、酮類、羧基、和馬來酰亞胺基團。
或者，可通過例如重組技術或肽合成來制備包含抗體和細胞毒劑的融合蛋白。DNA的長度可包含各自編碼偶聯(lián)物兩個部分的區(qū)域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭肽的區(qū)域分開，該接頭肽不破壞偶聯(lián)物的期望特性。
在又一個實施方案中，可將抗體與“受體”(諸如鏈霉親和素)偶聯(lián)從而用于腫瘤預先靶向，其中對患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結合的偶聯(lián)物，然后施用與細胞毒劑(如放射性核苷酸)偶聯(lián)的“配體”(如親合素)。
10.免疫脂質體這里公開的抗體也可以配制成免疫脂質體?！逯|體″是由各種脂質、磷脂和/或表面活性劑組成的對遞送藥物到哺乳動物有用的小囊泡。脂質體的成分通常以與生物膜的脂質排列相似的雙層形式排列。本領域的已知方法已經(jīng)制備出包含抗體的脂質體，例如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA823688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 774030(1980)；美國專利Nos.4,485,045和544,545；1997年19月23日公開的WO97/38731中描述的方法。美國專利No.5,013,556中公開了循環(huán)時間增強的脂質體。
特別有用的脂質體可以通過反相蒸發(fā)法，用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物來制備。通過擠壓脂質體通過具有限定孔徑大小的過濾器來產(chǎn)生具有想要直徑大小的脂質體?？梢砸勒誐artin et al.，J.Biol.Chem.257286-288(1982)中的描述通過二硫化物交換反應將本發(fā)明的抗體的Fab’片段結合到脂質體上?；焺┤芜x包含在脂質體內(nèi)部。參見Gabizon et al.，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
B.結合寡肽本發(fā)明的結合寡肽是結合，優(yōu)選特異性結合肝絲酶、HGF和/或這里描述的肝絲酶HGF復合物的寡肽。可以使用已知的寡肽合成方法化學合成結合寡肽，或者可以使用重組技術來制備和純化寡肽。結合寡肽長度通常是至少大約5個、或者至少大約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個氨基酸或更多氨基酸，其中這種寡肽能結合，優(yōu)選特異性結合這里描述的多肽。使用眾所周知的技術，不需要進行過度實驗就可以鑒定出結合寡肽。在這方面，已經(jīng)注意到篩選寡肽庫以選擇能特異性結合多肽靶的技術在本領域為大家所熟知(例如，參見美國專利Nos.5,556,762、5,750,373、4,708,871、4,833,092、5,223,409、5,403,484、5,571,689、5,663,143；PCT公開Nos.WO 84/03506和WO84/03564；Geysenet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，813998-4002(1984)；Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82178-182(1985)；Geysen et al.，in Synthetic Peptidesas Antigens，130-149(1986)；Geysen et al.，J.Immunol.Meth.，102259-274(1987)；Schoofs et al.，J.Immunol.，140611-616(1988)，Cwirla，S.E.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876378；Lowman，H.B.et al.(1991)Biochemistry，3010832；Clackson，T.et al.(1991)Nature，352624；Marks，J.D.et al.(1991)，J.Mol.Biol.，222581；Kang，A.S.et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888363和Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.，2668)。
在這方面，噬菌體(噬菌粒)展示是允許篩選大的寡肽庫以鑒定那些庫中能特異結合多肽靶的成員的一個眾所周知的技術。噬菌體展示是變體多肽作為外殼蛋白的融合蛋白質顯示在噬菌體顆粒表面上的技術(Scott，J.K.and Smith，G.P.(1990)Science，249386)。應用噬菌體展示在于從選擇性隨機化的蛋白質變體(或隨機克隆的cDNAs)的大容量庫中能夠快速和高效地選出以高親合性結合靶分子的那些序列的事實。噬菌體上的肽(Cwirla，S.E.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876378)或蛋白質(Lowman，H.B.et al.(1991)Biochemistry，3010832；Clackson，T.et al.(1991)Nature，352624；Marks，J.D.et al.(1991)，J.Mol.Biol.，222581；Kang，A.S.et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888363)展示庫已經(jīng)被用來從幾百萬的多肽或寡肽中篩選具有特異性結合特性的多肽或寡肽(Smith，G.P.(1991)CurrentOpin.Biotechnol.，2668)。分選隨機突變體的噬菌體庫需要構建和擴增許多變體的策略，使用靶受體進行親合純化的方法和評估結合富集結果的方式。美國專利Nos.5,223,409、5,403,484、5,571,689和5,663,143。
雖然大多數(shù)噬菌體展示方法已經(jīng)使用絲狀噬菌體，但是λ噬菌體展示系統(tǒng)(WO95/34683；美國5,627,024)、T4噬菌體展示系統(tǒng)(Ren et al.，Gene，215439(1998)；Zhu et al.，Cancer Research，58(15)3209-3214(1998)；Jiang etal.，Infection & Immunity，65(11)4770-4777(1997)；Ren et al.，Gene，195(2)303-311(1997)；Ren，Protein Sci.，51833(1996)；Efimov et al.，VirusGenes，10173(1995)和T7噬菌體展示系統(tǒng)(Smith and Scott，Methods inEnzymology，217228-257(1993)；U.S.5,766,905)也是已知的。
對基本噬菌體展示已經(jīng)有了許多其它的改進和變化。這些改進增強了展示系統(tǒng)從肽庫中篩選結合選定目標分子的能力，并且增強了展示功能蛋白的能力，所述功能蛋白具有篩選想要特性的那些蛋白質的潛能。已經(jīng)研發(fā)出進行噬菌體展示反應的組合反應裝置(WO98/14277)，也已經(jīng)使用噬菌體展示庫來分析和控制雙分子的相互作用(WO98/20169；98/20159)和受到限制的螺旋肽的特性(WO8/20036)。WO 97/35196描述了分離親合性配體的方法，其中噬菌體展示庫接觸第一溶液和第二溶液以選擇性地分離結合的配體，在所述第一溶液中，配體將結合靶分子；在所述第二溶液中，所述親合性配體。WO 97/46251描述了用親合純化的抗體生物淘洗(biopanning)隨機噬菌體展示庫，然后分離結合的噬菌體，接下來使用微量滴定板的各孔通過微淘洗過程分離高親合力結合的噬菌體的方法。也已經(jīng)報道使用金黃色葡萄球菌蛋白質A作為親合標記的方法(Liet al.(1998)MolBiotech.，9187)。WO97/47314描述了底物扣減庫(substrate substractionlibraries)使用可能是噬菌體展示庫的組合庫判別酶特異性的用途。WO97/09446中描述了利用噬菌體展示選擇適合在去污劑中使用的酶的方法。在美國專利5,498,538、5,432,018和WO 98/15833中描述了另外的選擇特異性結合蛋白的方法。
在美國專利5,723,286、5,432,018、5,580,717、5,427,908、5,498,530、5,770,434、5,734,018、5,698,426、5,763,192和5,723,323中也公開了產(chǎn)生肽庫和篩選這些庫的方法。
C.結合小分子結合性小分子優(yōu)選是除這里限定的結合，優(yōu)選特異性結合肝絲酶、HGF和/或這里限定的肝絲酶HGF復合物的寡肽或抗體以外的有機分子。利用已知方法可以鑒定和化學合成結合性有機小分子(參見，例如，PCT公開號WO00/00823和WO00/39585)。結合性有機小分子的大小通常小于大約2000道爾頓，或者小于大約1500、750、500、250或200道爾頓，其中利用眾所周知的技術不需要過度實驗就可以鑒定能結合，優(yōu)選特異性結合這里描述的多肽的這種有機小分子。在這方面，已經(jīng)注意到篩選有機小分子庫以選擇能結合多肽靶的技術在本領域為大家所熟知(參見，例如，PCT公開號WO00/00823和WO00/39585)。結合性有機小分子可以是，例如醛類、酮類、肟類、腙類、半卡巴腙類、卡巴肼類、伯胺類、仲胺類、叔胺類、N-取代的肼類、酰肼類、醇類、醚類、硫醇類、硫醚類、二硫化物、羧酸類、酯類、酰胺類、脲類、氨基甲酸酯類、碳酸酯類、酮縮醇類、硫代酮縮醇類、乙縮醛類、硫代乙縮醛類、芳基鹵、磺酸芳基酯類、烷基鹵、磺酸烷基酯類、芳族化合物、雜環(huán)化合物、苯胺類、烯烴類、炔烴類、二醇類、氨基醇類、噁唑烷類、噁唑啉類、噻唑烷類、噻唑啉類、烯胺類、磺酰胺類、環(huán)氧化物、氮丙啶類、異氰酸酯類、磺酰氯類、重氮化合物、?；阮惖鹊取?br> D.篩選具有想要特性的抗體、結合寡肽和結合小分子產(chǎn)生本發(fā)明的抗體、寡肽和小分子的技術已經(jīng)如上所述?？梢愿M一步地依照要求選擇具有某些生物學特性的抗體、寡肽或其它小分子。
可以通過本領域已知的方法，例如使用內(nèi)源性表達肝絲酶和/或前HGF的細胞，或用各自的基因轉染后表達肝絲酶和/或前HGF的細胞評價本發(fā)明的抗體、寡肽或其它小分子的生長抑制效果。例如，可以用各種不同濃度的本發(fā)明的單克隆抗體、寡肽或其它小分子處理適當?shù)哪[瘤細胞系和肝絲酶和/或HGF多肽轉染的細胞幾天(例如，2-7天)，用結晶紫或者MTT進行染色，或者通過其它的比色測定進行分析。另一個測量增殖的方法可以通過比較存在或不存在本發(fā)明的抗體、結合寡肽或結合小分子時處理的細胞對3H胸腺密啶核苷的吸收情況進行。處理后，收獲細胞，在閃爍計數(shù)器中測定摻入DNA中的放射性的量。適當?shù)年栃詫φ瞻ㄓ靡阎囊种萍毎瞪L的生長抑制性抗體處理選擇的那種細胞系。腫瘤細胞體內(nèi)的生長抑制可以通過本領域已知的多種方式確定。腫瘤細胞可以是過表達肝絲酶和/或前HGF多肽的腫瘤細胞。與未處理的腫瘤細胞相比，抗體、結合寡肽或結合性有機小分子在體內(nèi)或體外抑制表達肝絲酶和/或HGF的腫瘤細胞大約25-100％，更優(yōu)選大約30-100％，甚至更優(yōu)選大約50-100％或70-100％的細胞增殖，在一個實施方案中，抗體濃度是大約0.5-30μg/ml。在細胞培養(yǎng)中可以以大約0.5-30μg/ml或大約0.5 nM-200 nM的抗體濃度測量生長抑制，其中在讓腫瘤細胞接觸抗體后的1-10天確定生長抑制。如果施用大約1μ/kg至大約100mg/kg體重的抗體會導致從第一次施用抗體起的大約5天到3個月內(nèi)，優(yōu)選大約5天到30天內(nèi)腫瘤體積變小或腫瘤細胞增殖降低，那么抗體在體內(nèi)就是抑制生長的。
為了選擇導致細胞死亡的抗體、結合寡肽或結合性有機小分子，可以相對于對照評價，例如碘化丙錠(PI)、臺盼藍或7AAD吸收指示的膜完整性的喪失。在缺少補體和免疫效應細胞時可以實施PI吸收測定。表達肝絲酶和/或前HGF多肽的腫瘤細胞單獨與培養(yǎng)基或包含適當抗體、結合寡肽或結合性有機小分子(例如大約10μg/ml)的培養(yǎng)基一起孵育。孵育細胞3天時間。在處理每個細胞后，洗滌細胞并將細胞等分到35毫米濾網(wǎng)加帽的12×75的管中(每管1ml，每個處理組3管)以除去細胞團。然后讓管接受PI(10μg/毫升)?？梢岳肍ACSCAN流式細胞儀和FACSCONVERTCellQuest軟件(Becton Dickinson)分析樣品。選擇通過PI吸收確定的誘導統(tǒng)計學上顯著水平的細胞死亡的那些抗體、結合寡肽或結合性有機小分子作為誘導細胞死亡的抗體、結合寡肽或結合性有機小分子。
為了篩選與目的抗體結合的多肽上的表位的結合的抗體，寡肽或其它有機小分子，可以進行常規(guī)的交叉封閉測定，例如Antibodies，ALaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的測定。該測定可用于確定試驗抗體、寡肽或其它有機小分子是否與已知的抗體結合相同的位點或表位?；蛘呋蛄硗馔ㄟ^本領域已知的方法進行表位作圖。例如，可以通過丙氨酸掃描誘變處理抗體序列以鑒定接觸的殘基。最初測試突變抗體與多克隆抗體的結合以保證適當?shù)恼郫B。在不同的方法中，對應于多肽不同區(qū)域的肽可用于測試抗體或具有已表征表位或已知表位的測試抗體和抗體的競爭測定中。
E.抗體依賴的酶介導的前體藥物治療(ADEPT)本發(fā)明的抗體還可以用于ADEPT，通過使該抗體與將前體藥物(例如肽基化療劑，參見WO81/01145)轉化成活性抗癌藥的前體藥物活化酶偶聯(lián)來進行。例如，參見WO 88/07378和美國專利US4,975,278。
用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶成分包括能夠對前體藥物起作用的任意酶，按照這類方式以便將所述的前體藥物轉化成其更具活性的細胞毒性形式。
用于本發(fā)明方法的酶包括，但不限于用于將含有磷酸鹽的前體藥物轉化成游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含有硫酸鹽的前體藥物轉化成游離藥物的芳香基硫酸酯酶；用于將無毒性的5-氟胞嘧啶轉化成抗癌藥5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；用于將含肽的前體藥物轉化成游離藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌屬(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L)；用于轉化含有D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；用于將糖基化前體藥物轉化成游離藥物的碳水化合物裂解酶，諸如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；用于將用β-內(nèi)酰胺類衍生的藥物轉化成游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；和用于將用苯氧基乙?；虮交阴；诎返涎苌乃幬锓謩e轉化成游離藥物的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，具有酶活性的抗體，在本領域中也稱作″抗體酶″可以用于將本發(fā)明的前體藥物轉化成游離活性藥物(例如，參見Massey，Nature328457-458(1987))。可以如本文所述制備用于將抗體酶遞送至腫瘤細胞群的抗體-抗體酶偶聯(lián)物。
通過本領域眾所周知的技術，例如通過利用上述討論的異雙官能團交聯(lián)試劑，可以將本發(fā)明的酶共價結合到抗體上。或者，可以使用本領域眾所周知的重組DNA技術構建融合蛋白，它們包括本發(fā)明抗體的至少抗原結合區(qū)和與其連接的本發(fā)明酶的至少功能活性部分(參見，例如Neuberger etal.，Nature 312604-608(1984))。
F.抗體變體除這里描述的抗體之外，可以考慮制備抗體變體(變體)。通過導入適當?shù)暮塑账嶙兓骄幋aDNA中，和/或通過合成想要的抗體可以制備抗體變體。本領域熟練技術人員理解所述氨基酸變化可以改變抗體的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數(shù)目或位置，或者改變膜錨定特性。
例如，可以利用美國專利5,364,934中列出的保守和非保守突變的任何技術和準則在這里描述的抗體中產(chǎn)生變異。變異可以是編碼抗體的一個或多個密碼子的替換、缺失或插入，其中替換、缺失或插入導致氨基酸序列與天然序列的抗體或多肽相比發(fā)生了變化。變異任選可以是用抗體一個或多個域中的任何其它氨基酸替換至少一個氨基酸。通過將抗體序列與同源已知蛋白質分子比較，并使高度同源區(qū)域中發(fā)生的氨基酸序列變化的數(shù)目最小化可以得到確定哪個氨基酸殘基可以在對想要的活性沒有不利影響的情況下被插入、替換或刪除方面的啟示。氨基酸替換可以是另一個具有相似結構和/或化學性能的氨基酸替換一個氨基酸的結果，例如用絲氨酸替換蘇氨酸，即保守氨基酸替換。插入或缺失可以任選發(fā)生在約1-5個氨基酸的范圍內(nèi)。通過系統(tǒng)地在序列中制造氨基酸插入、缺失或替換并測試所產(chǎn)生的變體的由親代序列顯示的活性，可以確定允許的變異。
本文提供了抗體和多肽片段。例如，和全長天然抗體或蛋白質相比，這種片段可以在N末端或C末端被截短，或者可以缺少內(nèi)部的殘基。某些片段缺少維持抗體或多肽目的生物活性的非必需氨基酸殘基。
可以通過許多傳統(tǒng)方法中的任何方法來制備抗體和多肽片段?？梢曰瘜W合成想要的肽片段。一個替換方法涉及通過酶消化，例如用已知的在特殊氨基酸殘基限定的位點切割蛋白質的酶處理蛋白質，或者通過用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化DNA和分離想要的片段來產(chǎn)生抗體或多肽片段。但另一個適用技術涉及分離和通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增編碼想要的抗體或多肽片段的DNA片段。PCR時，在5’和3’引物中使用限定出DNA片段想要的末端的寡核苷酸。抗體和多肽片段優(yōu)選與本文公開的天然抗體或多肽共用至少一種生物學和/或免疫活性。
在具體實施方案中，感興趣的保守替換顯示在下表中優(yōu)選替換這一標題下。如果這種替換導致生物活性發(fā)生變化，那么導入該表中替換舉例標題下的更實質性的變化，或者更進一步地導入在下文中描述的與氨基酸類別有關的變化，并篩選產(chǎn)物。

對抗體的生物學特性的實質性修改可通過選擇取代來完成，所述取代的效應在維持(a)取代區(qū)多肽框架的結構，例如片層結構或螺旋構象，(b)該分子靶位點的電荷或疏水性，(c)側鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據(jù)共有的側鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸，和
(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。這種替換的殘基也可以被引入保守替換位點中，或者更優(yōu)選地被引入剩余的(非保守)位點中。
利用本領域已知的方法，例如寡核苷酸介導(定點)的誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變可以產(chǎn)生變異。可以在克隆的DNA上實行定點誘變[Carteret al.，Nucl.Acids Res.，134331(1986)；Zoller et al.，Nucl.Acids Res.，106487(1987)]、盒式誘變[Wells et al.，Gene，34315(1985)]、限制選擇誘變[Wells etal.，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317415(1986)]或其它已知的技術，以產(chǎn)生抗體或多肽變體DNA。
還可以使用掃描氨基酸分析鑒定沿著連續(xù)序列的一個或多個氨基酸。在掃描氨基酸之中優(yōu)選的是相對小的中性氨基酸。這樣的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。典型地，丙氨酸是這些基團中優(yōu)選的掃描氨基酸，因為它消除了β碳以外的側鏈，而且很少會改變變體的主鏈構象[Cunningham and Wells，Science，2441081-1085(1989)]。典型地，丙氨酸也是優(yōu)選的，因為它是最常見的氨基酸。更進一步地，經(jīng)常會在埋藏的位點和暴露的位點發(fā)現(xiàn)它[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman&Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，1501(1976)]。
如果丙氨酸替換不產(chǎn)生足量的變體，可以使用等構氨基酸。
通常，也可以用絲氨酸替換不參與保持抗體或多肽合適構象的任何半胱氨酸殘基以改善分子的抗氧化性和防止發(fā)生異常交聯(lián)。相反，可以添加半胱氨酸鍵到抗體或多肽中以改善它的穩(wěn)定性(特別是，當抗體是抗體片段，例如Fv片段時)。
取代變體的特別優(yōu)選類型包括取代親本抗體(例如人源化抗體或人抗體高變區(qū)的一或多個殘基。通常，所選用于進一步開發(fā)的所得變體相對于其所來源的親本抗體應具有改進的生物學活性。產(chǎn)生這種取代變體的一個方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說，使高變區(qū)的幾個位點(如6-7個位點)突變以便在每一位點產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣產(chǎn)生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學活性(如結合親和力)。為了鑒定備選的高變區(qū)修飾位點，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結合作出主要貢獻的高變區(qū)殘基?；蛘呋虼送?，分析抗原-抗體復合物的晶體結構以確定抗原多肽與抗體之間的接觸點也較有利。這些接觸殘基及鄰近殘基是根據(jù)本文所述技術進行取代的候選位點。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對它們?nèi)窟M行篩選，選出在一或多個相關實驗中具有良好特性的抗體以便進一步開發(fā)。
利用本領域已知的多種方法可以制備編碼抗體的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括，但不局限于從天然來源分離(在存在天然發(fā)生的氨基酸序列變體的情況下)、或者通過寡核苷酸介導(或定位)誘變、PCR誘變和盒式誘變以前制備的抗體變體或抗體的非變體型式來制備。
G.抗體和多肽的修飾抗體和多肽的共價修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一種共價修飾包括使抗體或多肽的靶氨基酸殘基與有機衍生劑反應，其中有機衍生劑能與選擇的抗體或多肽的側鏈或N或C末端殘基反應。用雙功能試劑進行的衍生作用是有用的，例如，可以將抗體或多肽交聯(lián)到純化抗體方法中使用的不溶于水的支持基質或表面上，反之亦然。通常使用的交聯(lián)劑包括，例如，1，1-雙(重氮基乙?；?-2-苯乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀酰亞胺酯類，例如，與4-疊氮基水楊酸的酯類；同雙官能亞氨基酯類，包括二琥珀酰亞胺基酯類，諸如3，3′-二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)；雙官能馬來酰亞胺類，諸如雙-N-馬來酰亞氨基-1，8-辛烷；和諸如甲基-3-[(對-疊氮基苯基)二硫代]丙酰亞氨酸酯類。
其它修飾包括分別使谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰基脫酰胺成相應的谷氨?；吞於滨埢皇垢彼岷唾嚢彼崃u化；使絲氨?；蛱K氨?；鶜埢姿峄?；賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的α-氨基甲基化[T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983)]；N-末端胺的乙?；?；和任意C-末端羧基的酰胺化。
包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體或多肽的另一種共價修飾包括改變抗體或多肽的天然糖基化模式。為實現(xiàn)這里描述的目的設計″改變天然糖基化模式″指刪除在天然序列抗體或多肽中發(fā)現(xiàn)的一個或多個糖部分(通過化學和/或酶方法除去潛在的糖基化位點或刪除糖基化)和/或添加一個或多個在天然序列抗體或多肽中不存在的糖基化位點。另外，該短語包括涉及存在的不同糖部分的性質和比例變化的天然蛋白質糖基化中的質變。
抗體及其它多肽的糖基化典型地是N-連接或O-連接。N-連接指碳水化物部分附著到天冬酰胺殘基的側鏈上。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸是酶催化碳水化物部分附著到天冬酰胺側鏈上的識別順序，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中存在這些三肽序列中的任何一個就可以產(chǎn)生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一個附著到羥氨基酸上，雖然也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥基賴氨酸，但通常大多數(shù)附著到絲氨酸或蘇氨酸上。
通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述的三肽序列(適合于N-連接糖基化位點)可以方便地添加糖基化位點到抗體或多肽上。也可以通過添加或替換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基到原有抗體或多肽序列上來實施改變(適合于O-連接糖基化位點)。通過DNA水平的變化，特別是通過突變編碼抗體或多肽的DNA的預選堿基以產(chǎn)生翻譯成想要氨基酸的密碼子，可以任選改變抗體或多肽的氨基酸序列。
另一個增加抗體或多肽上糖部分數(shù)目的方式是通過化學偶聯(lián)或酶催化偶聯(lián)糖苷到多肽上。本領域已經(jīng)描述這種方法，例如在1987年9月月11日公開的WO 87/05330和Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中已經(jīng)描述該方法。
可以用化學方法或酶方法，或者通過突變替換編碼作為糖基化靶的氨基酸殘基的密碼子完成除去存在于抗體或多肽上的糖部分的過程。化學方法去糖基化技術本領域已經(jīng)已知，例如在Hakimuddin，et al.，Arch.Biochem.Biophys.，25952(1987)和Edge et al.，Anal.Biochem.，118131(1981)中已描述。通過利用Thotakura et al.，Meth.Enzymol.，138350(1987)描述的多種內(nèi)-和外糖苷酶可以實現(xiàn)用酶從多肽上切割糖部分。
抗體或多肽的另一種共價修飾包括以美國專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中列出的方式，連接抗體或多肽到多種非蛋白質聚合物中的一種上，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯上。例如，還可以在通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微囊(例如，分別為羥甲基纖維素或明膠-微囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微囊)中，在膠體遞藥系統(tǒng)(例如，脂質體、清蛋白微球、微乳、納米粒和納米囊)中或在粗乳狀液中俘獲抗體或多肽。Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thedition，Oslo，A.，Ed.，(1980)中公開了這種技術。
以形成包含融合到另一個異源多肽或氨基酸序列上的抗體或多肽的嵌合分子的方式也可以修飾本發(fā)明的抗體或多肽。
在一個實施方案中，這種嵌合分子包含抗體或多肽與標記多肽的融合物，其中標記多肽(tag polypeptide)提供了抗標記抗體可以選擇性結合的表位。表位標記通常位于抗體或多肽的氨基或羧基末端。利用針對標記多肽的抗體可以檢測抗體或多肽的這種表位標記形式的存在。提供表位標記也使抗體或多肽能通過使用抗標記抗體或另一種結合表位標記的親合基質很容易地純化出來。各種不同的標記多肽和它們各自的抗體在本領域為大家所熟知。實例包括聚組氨酸(poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標記；flu HA標記多肽和它的抗體12CA5[Field et al.，Mol.Cell.Biol.，82159-2165(1988)]；c-myc標記以及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體[Evan et al.，Molecular and Cellular Biology，53610-3616(1985)]；和單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標記和它的抗體[Paborsky et al.，Protein Engineering，3(6)547-553(1990)]。其它的標記多肽包括該Flag肽[Hopp et al.，BioTechnology，61204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin et al.，Science，255192-194(1992)]；α微管蛋白表位肽[Skinner et al.，J.Biol.Chem.，26615163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白質肽標記[Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876393-6397(1990)]。
在替換的實施方案中，嵌合分子可以包含抗體或多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白的特殊區(qū)域的融合物。為了得到二價形式的嵌合分子(也稱為″免疫粘附素″)，這種融合可以是與IgG分子的Fc區(qū)域的融合。Ig融合優(yōu)選包括抗體或多肽的可溶性形式(跨膜域被刪除或失活)代替Ig分子內(nèi)的至少一個可變區(qū)的替換。在特別優(yōu)選的實施方案中，免疫球蛋白融合包括IgG1分子的鉸鏈、CH2和CH3，或者鉸鏈、CH1、CH2和CH3區(qū)域。產(chǎn)生免疫球蛋白融合物的方法可以參見1995年6月27日授權的美國專利No.5,428,130。
H.抗體和多肽的制備下面的描述主要涉及通過培養(yǎng)用包含抗體和多肽的編碼核酸的載體轉化或轉染的細胞生產(chǎn)抗體和多肽的過程。當然，可以考慮用本領域為大家所熟知的替換方法來制備抗體和多肽。例如，可以通過使用固相技術的直接肽合成來產(chǎn)生適當?shù)陌被嵝蛄谢蚱洳糠諿參見，例如Stewart et al.，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)]。生物體外蛋白質合成可以采用人工技術或自動化方式實行。例如，利用制造商的說明，使用適用的生物系統(tǒng)肽合成器(Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(Foster City，CA)可以完成自動化合成。可以以化學方法分別合成抗體或多肽的各個部分，然后利用化學方法或酶法組合各個部分產(chǎn)生想要的抗體或多肽。
1.編碼抗體或多肽的DNA的分離可以從cDNA庫中獲得編碼抗體或多肽的DNA，其中cDNA庫是從認為具有抗體或多肽mRNA并以可檢測水平表達抗體或多肽的組織中制備的。因此，人抗體或多肽DNA可以方便地獲自從人組織制備的cDNA庫。也可以從基因組庫或通過已知的合成過程(例如自動化核酸合成)獲得抗體或多肽編碼基因。
可以用設計的鑒定目的基因或目的基因編碼的蛋白質的探針(例如，至少大約20-80個堿基)來篩選庫。可以利用標準程序，例如，Sambrook etal.，Molecular CloningA Laboratory Manual(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中的描述來實施用選擇的探針篩選cDNA或基因組庫的過程。分離編碼抗體或多肽基因的替換方式是使用PCR方法[上文Sambrook et al.，；Dieffenbach et al.，PCR PrimerA Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1995)]。
篩選cDNA庫的技術在本領域為大家所熟知。選擇作為探針的寡核苷酸序列應該具有足夠長度，而且應該足夠清楚以使假陽性降到最低。優(yōu)選對寡核苷酸進行標記，這樣當寡核苷酸與被篩選庫中的DNA雜交時就可以檢測到。標記方法在本領域為大家所熟知，包括使用放射性標記，像32P標記的ATP、生物素化或酶標記。在上文的Sambrook et al沖提供了雜交條件，包括中等嚴謹和高度嚴謹雜交條件。
在這種庫篩選法中鑒定的序列可以與儲存在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫，例如GenBank或其它私人序列數(shù)據(jù)庫中的其它已知序列進行比較和比對。利用本領域已知的方法，依照這里的描述可以確定所述分子限定區(qū)域內(nèi)或全長序列的序列同一性(在氨基酸或核苷酸水平)。
利用這里首次公開的推斷的氨基酸序列，通過篩選選擇的cDNA或基因組庫可以獲得具有蛋白質編碼序列的核酸，而且必要時，可以依照上文Sambrook et al.的描述利用常規(guī)的引物延伸方法檢測可能已經(jīng)逆轉錄成cDNA的mRNA的前體和加工中間體。
2.宿主細胞的選擇和轉化用這里描述的適合于生產(chǎn)抗體或多肽的表達或克隆載體轉染或轉化宿主細胞，并在修飾的適合誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼目的序列的基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。本領域熟練技術人員不需要過度實驗就能夠選擇確定培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)基、溫度、pH等等。通常，在MammalianCell Biotechnologya Practical Approach，M.Butler，ed.(IRL Press，1991)和上文的Sambrook et al中能發(fā)現(xiàn)最大化細胞培養(yǎng)生產(chǎn)率的原則、操作規(guī)程和實用技術。
真核細胞轉染和原核細胞轉化的方法為普通技術人員所知，例如可通過CaCl2、CaPO4、脂質體介導和電穿孔進行?？衫眠m合于這種細胞的標準技術實施轉化，而這取決于使用的宿主細胞。上文Sambrook et al中描述的使用氯化鈣的鈣處理或電穿孔通常被用于原核生物。依照Shaw et al.，Gene，23315(1983)和1989年6月9日公開的WO 89/05859中的描述可以用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感染轉化某些植物細胞。對于沒有這種細胞壁的哺乳動物細胞，可以使用Graham and van der Eb，Virology，52456-457(1978)的磷酸鈣沉淀法。美國專利No.4,399,216中已經(jīng)描述哺乳動物細胞宿主系統(tǒng)轉染的一般情況。典型地，可以依照Van Solingen et al.，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，763829(1979)的方法進行酵母轉化。但是，也可以使用其它插入DNA到細胞中的方法，例如核顯微注射、電穿孔、細菌原生質體與完整細胞的融合或多聚陽離子，例如聚凝胺(polybrene)、聚鳥氨酸。轉化哺乳動物細胞的各種技術參見Keown et al.，Methods in Enzymology，185527-537(1990)和Mansour etal.，Nature，336348-352(1988)。
克隆或表達載體中的DNA的適當?shù)乃拗骷毎ㄔ松?、酵母或更高級的真核生物細胞。適當?shù)脑松锇?，但不局限于真細菌類，革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如，腸桿菌科，例如大腸桿菌。各種大腸桿菌菌株是公眾可得到的，例如大腸桿菌K12菌株MM294(ATCC 31，446)；大腸桿菌X1776(ATCC31，537)；大腸桿菌菌株W3110(ATCC27，325)和K5 772(ATCC53，635)。其它適當?shù)脑松锼拗骷毎c桿菌科，例如埃希氏桿菌屬，例如，大腸桿菌、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏桿菌屬、變形桿菌屬、沙門氏菌屬，例如，鼠傷寒沙門氏菌、沙雷氏菌屬，例如，Serratia marcescans，志賀氏菌屬，以及芽胞桿菌屬，例如，枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌(1989年4月12日公開的DD 266,710中公開的地衣芽胞桿菌41P)、假單胞菌屬，例如，銅綠假單胞菌和鏈霉菌屬。這些實例是說明性的，而不是限制性的。菌株W3110是一個特別優(yōu)選的宿主或親代宿主，因為它是重組DNA產(chǎn)物發(fā)酵的常見宿主菌株。宿主細胞優(yōu)選分泌最小量的蛋白水解酶。例如可以修飾菌株W3110以在編碼宿主內(nèi)源蛋白質的基因中引起遺傳突變，這種宿主的實例包括具有完全的基因型tonA的大腸桿菌W3110菌株1A2；具有完全基因型tonA ptr3的大腸桿菌W3110菌株9E4；具有完全基因型tonAptr3 phoAE15(argF-lac)169 degP ompT kanr的大腸桿菌W3110菌株27C7(ATCC55，244)；具有完全基因型tonAptr3 phoAE15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr的大腸桿菌W3110菌株37D6；大腸桿菌W3110菌株40B4是具有非卡那霉素抗性degP缺失突變的菌株37D6和1990年8月7日授權的美國專利4,946,783中公開的、具有突變的周質蛋白酶的大腸桿菌菌株?；蛘撸w外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反應也是適合的。
可以在細菌中生產(chǎn)全長抗體、抗體片段和抗體融合蛋白質，特別是當不需要糖基化和Fc效應器功能時，例如當治療的抗體結合到細胞毒劑(例如毒素)上，免疫偶聯(lián)物本身顯示出破壞腫瘤細胞的功效時更是如此。全長抗體在循環(huán)中具有更長的半衰期。在大腸桿菌中進行生產(chǎn)更快，而且成本效率更高。在細菌中表達抗體片段和多肽可以參見，例如描述了適合于優(yōu)化表達和分泌的翻譯起始區(qū)(TIR)和信號序列的美國專利5,648,237(Carter et.al)、美國專利5,789,199(Joly et al)和美國專利5,840,523(Simmonset al)，這些專利在此合并作為參考。表達后，從可溶級分中的大腸桿菌細胞糊分離抗體，而且可以通過，例如依據(jù)同種型選擇的蛋白質A或G柱純化抗體。可以按照與純化，例如純化CHO細胞中表達的抗體的過程相似的方式進行最后純化。
除原核生物外，真核微生物，例如絲狀真菌或酵母是適合于抗體或多肽編碼載體的適當?shù)目寺』虮磉_宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是通常使用的低等真核宿主微生物。其它的包括稷酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse，Nature，290140 ；1985年5月2日公開的EP 139,383)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國專利4,943,529；Fleer et al.，Bio/Technology，9968-975(1991))，例如乳克克魯維酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt et al.，J.Bacteriol.，154(2)737-742 )、脆性克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12，424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16，045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24，178)、K.waltii(ATCC56，500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36，906；Van den Berg et al.，Bio/Technology，8135(1990))、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K.marxianus)；西洋蓍霉(yarrowia)(EP402，226)；巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)(EP183,070；Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol.，28265-278 )；念珠菌屬(Candida)；瑞氏木霉屬(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)(Case et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263 )；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)，例如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公開的EP394,538)；絲狀真菌，例如，鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、Tolypocladium(1991年1月10日公開的WO 91/00357)，曲霉屬宿主，例如，構巢曲霉(A.nidulans)(Ballance et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112284-289 ；Tilbum et al.，Gene，26205-221 ；Yelton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811470-1474 和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes，EMBO J.，4475-479 )。甲基營養(yǎng)(methylotropic)酵母在本文中是合適的，包括但不限于能夠在甲醇上生長的酵母，其選自漢遜氏酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、克勒克氏酵母屬(Kloeckera)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、球擬酵母屬(Torulopsis)和紅酵母屬(Rhodotorula)。屬于這類酵母中典型的具體種類的實例可以在C.Anthony，The Biochemistry of Methylotrophs，269(1982)中找到。
適合于表達糖基化抗體或多肽的適當?shù)乃拗骷毎醋远嗉毎麢C體。無脊椎動物細胞的實例包括昆蟲細胞，例如，果蠅S2和Spodoptera Sf9，以及植物細胞，例如棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽?；?petunia)、番茄(tomato)和煙草的細胞培養(yǎng)物。已經(jīng)鑒定許多桿狀病毒(baculoviral)菌株和變體，以及來自宿主，例如草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛蟲)、埃及伊蚊(Aedesaegypti，蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus，蚊子)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)的對應許可昆蟲宿主細胞。公眾可獲得適合于轉染的多種病毒株，例如，家蠶蛾NPV的加利福尼亞Y級夜蛾(Autographa california)NPV和Bm-5菌株的L-1變體，依照本發(fā)明，這種病毒可用作這里描述的病毒，特別適合于轉染草地夜蛾細胞。
但是在脊椎動物細胞中意義最大，而且在培養(yǎng)中繁殖脊椎動物細胞(組織培養(yǎng))已經(jīng)變成常規(guī)程序。有效哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40轉化的猴腎CVl細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(293細胞或經(jīng)過再克隆后能在懸浮培養(yǎng)物中生長的293細胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；倉鼠幼鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.774216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod 23243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL2)；犬腎細胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝細胞癌細胞系(Hep G2)。
用上述適合于生產(chǎn)抗體或多肽的表達或克隆載體轉染或轉化宿主細胞，并在修飾的適合誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼目的序列的基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
3.可復制載體的選擇和使用可以將編碼抗體或多肽的核酸(例如，cDNA或基因組DNA)插入可復制的載體用于克隆(擴增DNA)或表達。公眾可以獲得各種載體。載體可以是，例如，質粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w形式?？梢酝ㄟ^多種方法將適當?shù)暮怂嵝蛄胁迦胼d體中。通常利用本領域已知的技術將DNA插入適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點。載體組件通常包括，但不局限于一個或多個信號序列、復制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。可使用熟練技術人員已知的標準連接技術構建適當?shù)陌@些組件中的一個或多個的載體。
不僅可以直接重組生產(chǎn)多肽，而且可以以與異源多肽的融合多肽形式來重組生產(chǎn)多肽，其中異源多肽可以是信號序列或在成熟蛋白質或多肽的N末端具有特異切割位點的其它多肽。通常，信號序列可以是載體的一個組件，或者可以是插入載體中的抗體或多肽編碼DNA的一部分。信號序列可以是，例如，選自堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定腸毒素II引導部分的原核生物信號序列。適合于酵母分泌的信號序列可以是，例如，酵母轉化酶引導序列、α因子引導序列(包括酵母菌屬和克魯維酵母屬α因子引導序列，美國專利5,010,182對后者進行了描述)，或酸性磷酸酶引導序列、C.albicans葡糖淀粉酶引導序列(參見1990粘4月4日公開的EP 362,179)，或1990年11月15日公開的WO 90/13646中描述的信號序列。在哺乳動物細胞表達中，哺乳動物信號序列，例如來自相同或相關物種的分泌多肽的信號序列和病毒分泌引導序列可用來指導蛋白質分泌。
表達和克隆載體都包含使載體能夠在一種或多種選擇的宿主細胞中復制的核酸序列。適合于多種細菌、酵母和病毒的這種序列為大家所熟知。來自質粒pBR322的復制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌、2μ質粒起點適合于酵母，各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)對哺乳動物細胞中的克隆載體有用。
表達和克隆載體典型地包含選擇基因，也稱為可選擇標記。典型的選擇基因編碼那些(a)賦予抗生素或其它毒素，例如，氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素抗性(b)補充營養(yǎng)缺陷不足，或(c)提供不能從復合培養(yǎng)基中獲得的重要營養(yǎng)素的蛋白質，例如，編碼適合于芽胞桿菌屬的D-丙氨酸消旋酶的基因。
適合于哺乳動物細胞的適當?shù)目蛇x擇標記的實例是那些能夠鑒定有能力攝取抗體或編碼多肽的核酸的細胞的可選擇標記，例如DHFR或胸苷激酶。當使用野生型DHFR時，適當?shù)乃拗骷毎且勒誙rlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980)的描述制備和擴增缺乏DHFR活性的CHO細胞系。供酵母使用的適當?shù)倪x擇基因是存在于酵母質粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb et al.，Nature，28239(1979)；Kingsman et al.，Gene，7141(1979)；Tschemper et al.，Gene，10157(1980)]。trp1基因提供了選擇缺少在色氨酸中的生長能力的酵母突變株，例如ATCC No.44076或PEP4-1的選擇標記[Jones，Genetics，8512(1977)]。
表達和克隆載體通常包含可操作性地與抗體或編碼多肽的核酸序列相連的指導mRNA合成的啟動子。多種潛在的宿主細胞識別的啟動子為大家熟知。適合原核生物宿主使用的啟動子包括β內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)[Chang et al.，Nature，275615(1978)；Goeddel et al.，Nature，281544(1979)]、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)[Goeddel，Nucleic Acids Res.，84057(1980)；EP 36,776]和雜合啟動子，例如tac啟動子[deBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983)]。供細菌系統(tǒng)使用的啟動子也包含可操作性地與編碼抗體或多肽的DNA連接的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。
供酵母宿主使用的適當?shù)拇龠M序列的實例包括適合于3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.，2552073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess etal.，J.Adv.Enzyme Reg.，7149(1968)；Holland，Biochemistry，174900(1978)]，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡糖異構酶和葡糖激酶的啟動子。其它的酵母啟動子是適合于乙醇脫氫酶2、異細胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶，以及負責麥芽糖和半乳糖應用的酶的啟動子區(qū)域，其中酵母啟動子是具有另外的生長條件控制的轉錄優(yōu)點的誘導啟動子。EP 73,657中更進一步地描述了供酵母表達使用的適當?shù)妮d體和啟動子。
在哺乳動物宿主細胞中從載體轉錄抗體或多肽可受到選自如下的啟動子的控制，所述啟動子例如，通過從病毒，例如多瘤病毒(polyoma virus)、雞痘病毒(fowlpox virus)(1989年7月5日公開的UK 2,211,504)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒(bovine papilloma virus)、鳥類肉瘤病毒(aviansarcoma virus)、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)的基因組中獲得的啟動子，來自異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子和來自熱休克蛋白啟動子，條件是這種啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容。
通過將增強子序列插入載體可以增加高等真核生物對編碼抗體或多肽的DNA的轉錄。增強子是作用于啟動子以增加轉錄的DNA順式作用元件，通常長大約10-300bp?，F(xiàn)在從哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α甲胎蛋白和胰島素)中已經(jīng)知道許多增強子序列。但是典型地可以使用來自真核細胞病毒的增強子。實例包括在復制起點近側的SV40增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、在復制起點近側的多瘤病毒增強子和腺病毒增強子。增強子可以在抗體或多肽編碼序列的5’或3’位置處剪接到載體中，但優(yōu)選位于啟動子5’位點。
在真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人，或來自其它多細胞機體的有核細胞)中使用的表達載體也包含終止轉錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。這種序列通?？梢詮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA的5′非翻譯區(qū)獲得，偶而可以從真核或病毒DNA或cDNA的3′非翻譯區(qū)獲得。這些區(qū)域包含編碼抗體或多肽的mRNA的非翻譯部分中作為多(聚)腺苷酸片段被轉錄的核苷酸片段。
Gething et al.，Nature，293620-625(1981)；Mantei et al.，Nature，28140-46(1979)；EP 117,060和EP 117,058中仍然描述了適合于改進重組脊椎動物細胞培養(yǎng)中合成抗體或多肽的其它方法、載體和宿主細胞。
4.培養(yǎng)宿主細胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體或多肽的宿主細胞。市場上可買到的培養(yǎng)基，例如，Ham’s F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigrna)，和達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)適合于培養(yǎng)宿主細胞。另外，Ham et al.，Meth.Enz.5844(1979)，Barnes et al.，Anal.Biochem.102255(1980)，美國專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195或美國專利Re.30,985中描述的任何培養(yǎng)基可用作宿主細胞培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基中的任何培養(yǎng)基都可以根據(jù)需要補充激素和/或其它生長因子(例如，胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如，氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺苷和胸腺密啶核苷)、抗菌素(例如，慶大霉素藥物)、微量元素(定義為存在的最終濃度通常在微摩爾范圍的無機化合物)，以及葡萄糖或能量能量源。也可以包括本領域熟練技術人員所知的任何適當濃度的其它必要補充物。培養(yǎng)條件，例如，溫度、pH等等是以前選擇的表達宿主細胞用到的條件，因此對本領域普通技術人員來說是顯而易見的。
5.檢測基因擴增/表達例如，以這里提供的序列為基礎，利用適當?shù)臉擞浱结?，通過常規(guī)的Southern印跡、測定mRNA轉錄的Northern印跡[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980)]、斑點印跡(DNA分析)或原位雜交可以在樣品中直接測定基因擴增和/或表達。或者，可以使用能識別特異雙鏈體，包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜種雙鏈體或DNA-蛋白質雙鏈體的抗體依次標記抗體，測定可以在雙鏈體結合到表面的條件下進行，這樣當表面上形成雙鏈體時，就可以檢測結合到雙鏈體上的抗體的存在。
或者，可以通過免疫方法，例如細胞或組織切片的免疫組織化學染色和測定細胞培養(yǎng)物或體液直接對基因產(chǎn)物的表達進行定量測定基因表達?？捎糜诿庖呓M織化學染色和/或液體樣品測定的抗體可以是單克隆或多克隆抗體，而且可以在任何哺乳動物中制備。以這里提供的DNA序列為基礎，針對天然序列多肽或合成肽，或者針對融合到多肽DNA上的編碼特異抗體表位的外源序列可以方便地制備抗體。
6.抗體和多肽的純化可以從培養(yǎng)基或宿主細胞溶解產(chǎn)物中回收抗體和多肽形式。如果抗體結合膜，那么利用適當?shù)南礈煲?例如，Triton-X 100)或通過酶催化裂解就能夠從膜上釋放抗體。通過各種物理或化學方法，例如凍融循環(huán)、超聲處理、機械破碎或細胞溶解劑可以破壞用于表達抗體和多肽的細胞。
從重組細胞蛋白質或多肽中純化抗體和多肽是符合要求的。下列過程是適當?shù)募兓^程的示范通過在離子交換柱上進行分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或陽離子交換樹脂，例如DEAE上進行層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；利用，例如Sephadex G-75進行的凝膠過濾；蛋白質A Sepharose柱除去污染物，例如IgG；和結合表位標記形式的抗體和多肽的金屬螯合柱?？梢允褂酶鞣N蛋白質純化方法，這些方法在本領域是已知的，例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中已經(jīng)描述這些方法。例如，選擇的純化步驟取決于使用的生產(chǎn)過程的性質和產(chǎn)生的特殊抗體或多肽。
當利用重組體技術時，抗體可以在細胞內(nèi)，周質空間中產(chǎn)生，或者可以直接分泌到培養(yǎng)基中。如果抗體是在細胞內(nèi)產(chǎn)生的，那么第一步就是通過，例如離心或超濾除去宿主細胞或溶解的片段的微粒碎片。Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992)描述了分離分泌到大腸桿菌周質空間的抗體的過程。簡而言之就是在存在醋酸鈉(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的情況下解凍細胞糊大約30分鐘。通過離心可以除去細胞碎片。當抗體被分泌到培養(yǎng)基中時，通常首先利用市場上可買到的蛋白質濃縮過濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元濃縮來自這種表達系統(tǒng)的上清液。蛋白酶抑制劑，例如PMSF可以包括在上述的任何步驟內(nèi)以抑制蛋白質水解，而且抗生素也可以包括在其中以阻止偶發(fā)污染物的生長。
利用，例如，羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析可以純化從細胞制備的抗體組合物，其中親和層析是優(yōu)選的純化技術。蛋白質A作為親合配體的適應性取決于存在于抗體中的任何免疫球蛋白Fc域的種類和同種型。蛋白質A可用于純化以人γ1、γ2或γ4重鏈為基礎的抗體(Lindmarket al.，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。推薦的蛋白質G可用于所有小鼠同種型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.515671575(1986))。大多數(shù)親合配體附著于其上的基質常常是瓊脂糖，但也可以使用其它基質。與瓊脂糖實現(xiàn)的流速和處理時間相比，機械穩(wěn)定基質，例如可控多孔玻璃或多聚(苯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)允許更快的流速和更短的處理時間。當抗體包含CH3域時，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)對純化是有用的。也可以依據(jù)待回收的抗體使用其它的蛋白質純化技術，例如在離子交換柱上分級分離、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上的層析、在肝素SEPHAROSETM上的層析、在陰離子或陽離子交換樹脂上(例如，聚天冬氨酸柱)的層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。
在任何初步純化步驟之后，可以利用pH在大約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，讓包含目的抗體和污染物的混合物經(jīng)受低pH疏水性相互作用層析，優(yōu)選在低鹽濃度(例如大約0-0.25M鹽)條件下進行。
I.藥物制劑通過將具有想要純度的抗體、多肽、寡肽或有機小分子/無機小分子與任選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備凍干劑型或水溶液形式的本發(fā)明使用的抗體、結合寡肽、結合性有機小分子或無機小分子和/或多肽的可貯藏的治療劑型(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980))?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑所使用的劑量和濃度對接受者沒有毒性，它包括緩沖液，例如醋酸鹽、Tris、磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；包括抗壞血酸和甲硫氨酸的抗氧化劑；防腐劑((諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯己雙銨；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚；丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間-甲酚)；低分子量(低于約10個殘基)多肽類；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖類、二糖類和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；張力劑(tonicifiers)，諸如海藻糖和氯化鈉；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；表面活性劑，諸如聚山梨醇酯；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬復合物(例如Zn-蛋白質復合物)；和/或非離子型表面活性劑，諸如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇(PEG)?？贵w優(yōu)選包括濃度為5-200mg/ml，優(yōu)選10-100mg/ml的抗體。
這里的制劑也可以包含待治療的特殊適應癥必需的一種以上活性化合物，優(yōu)選那些具有不會不利地影響彼此的補充活性的活性化合物。例如，除抗體、結合寡肽，或結合有機或無機小分子之外，在一個制劑中包含另外的抗體，例如結合相同多肽上的不同表位的第二抗體，或針對一些其它靶標，例如影響特殊癌生長的生長因子的抗體可能是合乎需要的。或者或另外地，組合物可以更進一步地包含化療劑、細胞毒劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素劑和/或心臟保護劑。這種分子可以以對預定目標有效的量適當?shù)亟M合存在。
還可以在通過例如凝聚技術或通過界面聚合制備的微囊(例如，分別為羥甲基纖維素或明膠-微囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微囊)中，在膠體遞藥系統(tǒng)(例如，脂質體、清蛋白微球、微乳、納米粒和納米囊)中或在粗乳狀液中俘獲活性組分。這類技術披露在Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thedition，Oslo，A.，Ed.，(1980)中。
可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適的實例包括含有抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質，所述的基質為成形制品形式，例如薄膜或微囊。緩釋基質的實例包括聚酯類；水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))；聚交酯類(美國專利US3,773,919)；L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物；不能降解的乙烯-乙酸乙烯酯；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)；和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。可以通過無菌濾膜過濾實現(xiàn)這一目的。
J.抗體、結合寡肽和結合有機/無機小分子的處理為了確定癌中多肽(肝絲酶和/或HGF)的表達，可利用各種檢測測定。在一個實施方案中，可以通過免疫組織化學(IHC)來分析多肽的過表達。來自腫瘤活檢的石蠟包埋組織切片可以經(jīng)IHC測定，判定多肽染色強度的標準如下得分0沒有觀察到染色或者在少于10％的腫瘤細胞中觀察到膜染色。
得分1+在超過10％的腫瘤細胞中檢測到模糊的/勉強可覺察的膜染色。所述細胞只有部分膜被染色。
得分2+在超過10％的腫瘤細胞中觀察到弱到中等的完全膜染色。
得分3+在超過10％的腫瘤細胞中觀察到中等到強的完全膜染色。
多肽表達得分記為0或1+的那些腫瘤可以稱為不過表達所述多肽，而那些得分為2+或3+的腫瘤可以稱為過表達所述多肽。
或者或另外地，可以在福爾馬林固定的石蠟包埋腫瘤組織上進行FISH測定，例如INFORM(Ventana，Arizona出售)或PATHVISION(Vysis，Illinois)以確定腫瘤中多肽過表達(如果有)的程度。
利用體內(nèi)檢測測定，例如通過施用結合待檢測的分子并被可檢測的標記(例如放射性同位素或熒光標記)標記的分子(例如抗體、寡肽或有機小分子)，以及從外部掃描病人以定位標記可以評估多肽過表達或擴增。
如上所述，本發(fā)明的抗體、寡肽和有機小分子具有各種非治療應用。本發(fā)明的抗體、寡肽和有機/無機小分子可用于對多肽表達癌進行分期(例如，用在放射成像中)。抗體、寡肽和有機小分子也可用于從細胞中純化多肽或免疫沉淀多肽，以體外檢測多肽和對多肽進行定量，例如用在ELISA或Western印跡中作為純化其它細胞的步驟，從混合細胞群體中殺死或除去表達多肽的細胞。
當前，癌癥治療取決于癌癥發(fā)展的階段，涉及下列治療方法中的一種或組合手術除去癌組織、放療和化療。抗體、寡肽或有機小分子治療在上了年紀的病人中可能是特別合乎需要的，因為它們不能很好地耐受化療的毒性和副作用，而且在轉移性疾病中放療只有有限的有效性。當初期診斷疾病時或疾病復發(fā)期間，本發(fā)明的腫瘤目標抗體、寡肽和有機/無機小分子對減輕表達多肽的癌癥是有用的。在治療上應用時，抗體、寡肽或有機/無機小分子可單獨使用，或與，例如激素、抗血管發(fā)生劑(antiangiogens)或放射標記化合物，或者與手術、冷凍療法和/或放療進行組合(聯(lián)合)治療。抗體、寡肽或者有機/無機小分子的治療可以與其它常規(guī)治療一起施用，可以連續(xù)地與常規(guī)治療同時、在常規(guī)治療前或常規(guī)治療后施用?；熕幬铮鏣AXOTERE(多西他賽(docetaxel))、TAXOL(紫杉醇(paclitaxel))、雌莫司汀(estramustine)和米托蒽醌(mitoxantrone)用于治療癌癥，特別是用于治療高風險病人。在本發(fā)明目前的治療或減輕癌癥的方法中，可以將抗體、寡肽或有機/無機小分子和一種或多種在前的化療劑進行的治療一起施用給癌癥病人。特別可以考慮與紫杉醇和其修飾的衍生物(參見，例如，EP0600517)的聯(lián)合治療?？贵w、寡肽或有機/無機小分子可以與治療有效量的化療劑一起施用。在另一個實施方案中，抗體、寡肽或有機/無機小分子與化療一起施用以增強化療劑，例如，紫杉醇的活性和功效。The Physicians′Desk Reference (PDR)已經(jīng)公開了這些試劑用于各種癌癥治療的劑量。治療有效的這些上述化療藥物的給藥方法和劑量取決于待治療的特定癌癥、疾病發(fā)展的程度，以及為本領域熟練內(nèi)科醫(yī)師熟知并能被內(nèi)科醫(yī)師確定的其它因素。
在一個特定的實施方案中，將包含與細胞毒劑偶聯(lián)的抗體、寡肽或有機/無機小分子的偶聯(lián)物施用給病人。結合到蛋白質上的免疫偶聯(lián)物優(yōu)選被細胞內(nèi)化，這導致免疫偶聯(lián)物殺死它結合的癌細胞的治療效能增加。在一個優(yōu)選實施方案中，細胞毒劑靶向或干擾癌細胞中的核酸。這種細胞毒劑的實例如上所述，包括美登木素生物堿類、加利車霉素、核糖核酸酶和DNA內(nèi)切核酸酶。
依照與已知方法，例如靜脈內(nèi)給藥(例如靜脈推注(bolus)或一段時間內(nèi)連續(xù)輸注方式進行的靜脈內(nèi)給藥)、通過肌內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、腦脊髓內(nèi)(intracerobrospinal)給藥、皮下給藥、關節(jié)內(nèi)給藥、滑膜內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、口服給藥、局部給藥或吸入途徑給藥可以將抗體、寡肽、有機/無機小分子或其毒素偶聯(lián)物施用給病人。優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下施用抗體、寡肽或有機小分子。
其它的治療方案可以與施用寡肽或有機/無機小分子聯(lián)合。聯(lián)合給藥包括使用分開的制劑(separate formulations)或單個藥物制劑(singlepharmaceutical formulation)的同時給藥(co-administration)，以及以任何次序連續(xù)給藥(consecutive administration)，其中優(yōu)選有一段時間兩個(或全部)活性劑同時發(fā)揮它們的生物學活性。優(yōu)選這樣的聯(lián)合治療產(chǎn)生協(xié)同治療效果。
所述抗體、寡肽或有機/無機小分子與針對與特定癌癥有關的另一腫瘤抗原的抗體聯(lián)合施用也可能是所期望的。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的治療方法涉及聯(lián)合施用抗體(或多種抗體)、寡肽或有機/無機小分子和一種或多種化療劑或生長抑制劑，包括同時給藥不同化療劑的雞尾酒樣混合物?；焺┌姿岽颇就?、潑尼莫司汀(prednimustine)、順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、美法侖(melphalan)、環(huán)磷酰胺、羥基脲(hydroxyurea)和羥基脲紫杉烷(hydroxyureataxanes)(例如，紫杉醇和多西他賽)和/或蒽環(huán)類抗生素?？梢砸勒罩圃焐痰恼f明或熟練技術人員憑經(jīng)驗確定的方法來使用這種化療劑制品和其給藥方案。在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中也描述了這種化療劑的制品和給藥方案。
抗體、寡肽或有機/無機小分子可以以這種分子已知的劑量與抗激素化合物，例如，抗雌激素化合物，例如它莫西芬(tamoxifen)；抗黃體酮，例如奧那司酮(onapristone)(參見EP 616 812)或抗雄激素，例如氟他米特(flutamide)聯(lián)合。當待治療的癌癥是依賴雄激素的癌癥時，病人可以預先經(jīng)受抗雄激素治療，在癌癥變成雄激素不依賴性的癌癥之后，可以給病人施用所述抗體、寡肽或有機/無機小分子(和這里描述的任意其它試劑)。
有時，也給病人同時施用心臟保護劑(防止或降低與治療有關的心肌功能障礙)或一種或多種細胞因子是有益的。除上述治療方式之外，病人還可以在抗體、寡肽或有機/無機小分子治療之前、同時或之后經(jīng)受手術除去癌細胞和/或放射療法。上述任何共同施用制劑的適當劑量是目前使用的劑量，也可以由于與抗體、寡肽或有機/無機小分子的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)，所述任何共同施用制劑的劑量可能會降低。
為了預防或治療疾病，將依照已知的標準由內(nèi)科醫(yī)師選擇給藥劑量和方式?？贵w、寡肽或有機/無機小分子的適當劑量取決于上文限定的待治療的疾病的種類、疾病的嚴重性和病程、施用抗體、寡肽或有機/無機小分子是為了預防目的還是治療目的、以前的治療、病人的臨床病史，病人對抗體、寡肽或有機/無機小分子的反應和主治醫(yī)師的判斷?？贵w、寡肽或有機/無機小分子可以適當?shù)匾淮问┯媒o病人或通過一系列的治療施用給病人。優(yōu)選通過靜脈內(nèi)輸注或皮下注射來施用抗體、寡肽或有機/無機小分子。依據(jù)疾病的類型和嚴重性，可以將大約lug/kg-大約50mg/kg體重(例如，大約0.1-15mg/kg/劑)的抗體作為初始候選劑量(initial candidate dosage)施用給病人，例如，可以通過一次或多次單獨的給藥(separate administrations)，或通過連續(xù)輸注來施用。給藥方案可以包括施用大約4mg/kg的初始負載劑量(initial loading dose)的抗體，接下來施用大約2mg/kg的每周維持量。但是，其它給藥方案也可能是有用的。典型的每日劑量可以隨上述因素在大約1μg/kg到大約100m/kg或更高劑量的范圍內(nèi)變化。隨情況不同，可以在幾天或更長時間里重復給藥，可以持續(xù)到疾病的癥狀得到期望的抑制。通過常規(guī)方法和測定，以內(nèi)科醫(yī)師或本領域其它熟練技術人員所知的標準為基礎，可以很容易地監(jiān)測這些治療的進展。
除了施用抗體蛋白質對給病人外，本申請的應用考慮通過基因治療施用抗體。這種施用編碼抗體的核酸包括在″施用治療有效量的抗體″這一表述方式中。參見，例如，1996年3月14日公開的涉及利用基因治療產(chǎn)生胞內(nèi)抗體的WO96/07321。
有兩個主要的使核酸(任選包含在載體中)進入病人細胞的方法—體內(nèi)(in vivo)和回體(ex vivo)方法。為了進行體內(nèi)遞送，可以將核酸直接注射到病人體內(nèi)，通常注射到需要抗體的位點。為了進行回體治療，可以取出病人的細胞，然后將核酸引入這些分離的細胞中，并直接將修飾的細胞施用給病人，或者通過，例如包封在被植入病人體內(nèi)的多孔膜內(nèi)將修飾的細胞施用給病人(參見，例如，美國專利Nos.4,892,538和5,283,187)?？色@得多種將核酸插入活細胞的技術。所述技術將隨核酸是被轉移到體外的培養(yǎng)細胞里，還是被轉移到體內(nèi)預定的宿主細胞里而變化。適合于體外轉移核酸到哺乳動物細胞里的技術包括利用脂質體、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀法等等?；伢w遞送基因通常使用的載體是逆轉錄病毒載體。
當前優(yōu)選的體內(nèi)(in vivo)核酸轉移技術包括使用病毒載體(例如，腺病毒、單純性皰疹病毒I型或腺病毒相關病毒)和基于脂質的系統(tǒng)(用于脂質介導的基因轉移有用的脂質是DOTMA、DOPE和DC-Chol)進行轉染。當前已知的基因標記和基因治療規(guī)程的綜述可以參見Anderson et al.，Science256808-813(1992)。也可以參見WO93/25673和其中引用的參考文獻。
本發(fā)明的抗體可以是包括在這里的″抗體″定義中的不同形式的抗體。因此，抗體包括全長或完整抗體、抗體片段、天然序列抗體或氨基酸變體、人源化、嵌合或融合抗體、免疫偶聯(lián)物和其功能片段。在融合抗體中，抗體序列與異源的多肽序列融合?？梢栽贔c區(qū)修飾抗體以提供想要的效應器功能。就像在本文比較詳細討論的那樣，結合在細胞表面的具有適當?shù)腇c區(qū)域的裸抗體可以誘導細胞毒性，例如，經(jīng)由抗體依賴的細胞毒性作用(ADCC)，通過在補體依賴的細胞毒性中補充補體或其它機制誘導細胞毒性?；蛘撸セ蚪档托鞴δ芤允垢弊饔没蛑委煵l(fā)癥降到最低程度，此時可以使用某些其它的Fc區(qū)域。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及與本發(fā)明的抗體競爭性結合或充分結合(substantially bind)相同的表位的抗體。也考慮具有本發(fā)明抗體的生物學特性的抗體，其中生物學特性特別包括體內(nèi)腫瘤靶向和任何細胞增殖抑制特性或細胞毒特性。
這里詳細描寫了產(chǎn)生上述抗體的方法。
本發(fā)明的抗體、寡肽和有機/無機小分子具有治療表達肝絲酶和/或HGF的癌癥，或減輕哺乳動物中該癌癥的一種或多種癥狀的用途。本發(fā)明的方法包括在治療和/或減輕與這些癌癥有關的轉移性腫瘤的癥狀時使用拮抗劑?？贵w、寡肽或有機/無機小分子拮抗劑能結合哺乳動物中表達多肽(肝絲酶和/或HGF)的癌細胞的至少一部分。在一個實施方案中，抗體、寡肽或有機/無機小分子在體外或體內(nèi)結合多肽時，在破壞或殺死表達多肽的腫瘤細胞和/或應答的腫瘤細胞，或抑制這樣的腫瘤細胞的生長方面是有效的。這樣的抗體包括裸抗體(不偶聯(lián)到任何制劑上)。具有細胞毒或細胞生長抑制特性的裸抗體可以更進一步地與細胞毒劑固定(hamess)在一起，使它們在腫瘤細胞破壞方面更加有效。例如，通過將抗體與細胞毒劑偶聯(lián)形成這里描述的免疫偶聯(lián)劑可以將細胞毒特性賦予給抗體。在一些實施方案中，細胞毒劑或生長抑制劑是小分子。在一些實施方案中，使用了毒素，例如加利車霉素或美登木素生物堿，及其類似物或衍生物。
本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的抗體、寡肽或有機/無機小分子和載體的組合物。為了實現(xiàn)治療癌癥的目的，可以將組合物施用給需要這種治療的病人，其中組合物可以包括以免疫偶聯(lián)物或裸抗體存在的一種或多種抗體。在更進一步的實施方案中，組合物可以包括與其它治療劑，例如細胞毒劑或生長抑制劑，包括化療劑組合的抗體、寡肽或有機/無機小分子。本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的抗體、寡肽或有機/無機小分子和載體的制劑。在一個實施方案中，該制劑是包含藥學上可接受載體的治療制劑。
本發(fā)明另一方面是分離的編碼抗體的核酸。包括編碼H和L鏈，特別是高變區(qū)殘基的核酸，編碼天然序列抗體，以及該抗體的變體、修飾形式和人源化形式的各鏈的核酸。
本發(fā)明也提供在哺乳動物中治療癌癥或減輕癌癥的一種或多種癥狀的有用方法，包括給哺乳動物施用治療有效量的抗體、寡肽或有機/無機小分子?？梢栽趦?nèi)科醫(yī)師的指導下，短期(急性(acute))，長期或間斷地施用抗體、寡肽或有機/無機小分子治療組合物。也提供了抑制表達多肽(肝絲酶和/或HGF)的細胞和/或應答細胞的生長和殺死表達多肽(肝絲酶和/或HGF)的細胞和/或應答細胞的方法。
本發(fā)明也提供包含至少一種抗體、寡肽或有機/無機小分子的試劑盒和制品。發(fā)現(xiàn)包含抗體、寡肽或有機/無機小分子的試劑盒可用于，例如細胞殺傷測定，從細胞中純化或免疫沉淀多肽。例如，為了分離和純化多肽，所述試劑盒可以包含與珠子(例如，瓊脂糖凝膠珠子)偶聯(lián)在一起的抗體、寡肽或有機/無機小分子。為了體外檢測和定量多肽，例如在ELISA或Western印跡中檢測和定量多肽，可以提供包含該抗體、寡肽或有機/無機小分子的試劑盒?？梢院蜆擞洠鐭晒饣蚍派錁擞浺黄鹛峁┻@種用于檢測的抗體、寡肽或有機/無機小分子。
K.制品和試劑盒本發(fā)明的另一個實施方案是包含用于治療表達多肽(肝絲酶和/或HGF)的癌癥，例如前列腺癌和卵巢癌的原料的制品。所述制品包含容器和標記或位于容器上的包裝說明書或與容器相連的包裝說明書。適當?shù)娜萜靼ǎ缙?、管形瓶、注射器等等。容器可以由多種原料，例如玻璃或塑料組成。容器裝有能有效治療癌癥狀態(tài)的組合物，而且可能有無菌存取孔(例如，容器可能是靜脈用溶液袋或具有可被皮下注射針穿過的塞子的管形瓶)。組合物中的至少一種活性劑是本發(fā)明的抗體、寡肽或有機/無機小分子。標記或包裝說明書表明組合物可用于治療癌癥。標記或包裝說明書更進一步地包括施用抗體、寡肽或有機/無機小分子組合物給癌癥病人的說明。另外，制品可以更進一步地包括含有藥學上可接受的緩沖液，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水Ringer氏溶液和葡萄糖溶液的第二容器。它可以更進一步地包括合乎市場和用戶需要的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、過濾器、針和注射器。
也可以提供可用于多種目的試劑盒，例如，用于殺死表達多肽的細胞的測定的試劑盒，用于從細胞中純化或免疫沉淀多肽的試劑盒。為了分離和純化多肽，所述試劑盒可以包含與珠子(例如，瓊脂糖凝膠珠子)偶聯(lián)在一起的抗體、寡肽或有機/無機小分子。為了體外檢測和定量多肽，例如在ELISA或Western印跡中檢測和定量多肽，可以提供包含該抗體、寡肽或有機/無機小分子的試劑盒。和制品一樣，所述試劑盒可以包含容器和標記或位于容器上的包裝說明書或與容器相連的包裝說明書。容器裝有包含本發(fā)明的至少一種抗體、寡肽或有機/無機小分子的組合物。還可以包括那些包含，例如稀釋劑、緩沖液和對照抗體的另外的容器。所述標記或包裝說明書可以提供對組合物的描述，以及計劃的體外使用或檢測使用的說明。
L.多肽和編碼多肽的核酸-它們的具體形式和應用編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列(或它們的互補序列)在分子生物學領域具有多種應用，而且可用于治療等等。編碼多肽的核酸對通過這里描述的重組技術制備多肽有用，其中發(fā)現(xiàn)那些多肽可用于，例如制備這里描述的抗體。
全長天然序列多肽基因或其部分可用作雜交探針從cDNA庫中分離與這里公開的天然多肽序列具有想要的序列同一性的其它cDNAs(例如，那些編碼天然發(fā)生的多肽變體或來自其它物種的多肽的cDNAs)。探針的長度任選可以是大約20-大約50個堿基。可以從全長天然核苷酸序列的至少部分新區(qū)域或包括天然序列多肽的啟動子、增強子元件和內(nèi)含子的基因組序列獲得雜交探針，其中不需要過度的實驗就可以確定那些新區(qū)域。舉例來說，篩選方法包括使用已知的DNA序列合成大約40個堿基的選擇探針來分離多肽基因的編碼區(qū)域?？梢允褂枚喾N標記物，包括放射性核素，例如32P或35S，或酶標記，例如，經(jīng)由親和素/生物素偶聯(lián)系統(tǒng)與所述探針連在一起的堿性磷酸酶來標記雜交探針。具有與本發(fā)明的多肽基因的探針互補的序列的標記探針可用于篩選人cDNA、基因組DNA或mRNA庫以確定探針與這些庫中的哪些成員雜交。在下面的實施方案中將更進一步地詳細描述雜交技術。類似地，在本申請公開的任何EST序列都可以使用這里公開的方法用作探針。
編碼多肽的核酸的其它有用片段包括包含能結合靶多肽mRNA(有義)或多肽DNA(反義)序列的單鏈核酸序列(RNA或DNA)的反義或有義寡核苷酸。依照本發(fā)明的反義或有義寡核苷酸包括編碼這里描述的肝絲酶、前HGF或結合片段的DNA的編碼區(qū)域的片段。這種片段通常包含至少大約14個核苷酸，優(yōu)選包含大約14-30個核苷酸。例如，Stein and Cohen(CancerRes.482659，1988)和van der Krol et al.(BioTechniques 6958，1988)中描述了基于編碼給定蛋白質的cDNA序列，衍生反義或有義寡核苷酸的能力。
反義或有義寡核苷酸結合靶核酸序列會導致形成通過幾種方式中的一種阻斷目標序列轉錄或翻譯的雙鏈體，其中幾種方式包括增強雙鏈體的降解、轉錄或翻譯過早終止或其它方式。這種方法也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此該反義寡核苷酸可用來阻斷蛋白質表達，其中蛋白質在誘導哺乳動物癌癥中起作用。反義或有義寡核苷酸更進一步地包括具有修飾的糖-磷酸二酯骨架(或其它的糖鍵，例如WO 91/06629中描述的那些)和其中糖鍵能抵抗內(nèi)源核酸酶的寡核苷酸。具有抵抗性糖鍵的這種寡核苷酸在體內(nèi)是穩(wěn)定的(即，能抵抗酶降解)，但是它保留了能結合靶核苷酸序列的序列特異性。
優(yōu)選的用于反義結合的基因內(nèi)位點包括導入基因開放閱讀框(ORF)的起始/起動密碼子(5′-AUG/5′-ATG)或終止/中止密碼子(5′-UAA、5′-UAG和5-UGA/5′-TAA、5′-TAG和5′-TGA)的區(qū)域。這些區(qū)域指mRNA或基因的一部分，包括從翻譯起始或終止密碼子起的任意方向(即5’或3’)的約25-約50個連續(xù)核苷酸。供反義結合的其它優(yōu)選區(qū)域包括內(nèi)含子；外顯子；內(nèi)含子-外顯子接合處；是翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間區(qū)域的開放閱讀框(ORF)或″編碼區(qū)域″；包含經(jīng)由5′-5′三磷酸酯鍵連接到mRNA的最5′端殘基上的N7-甲基化鳥嘌呤核苷殘基的mRNA5′帽，它包括5′帽結構本身和靠近帽的開始的50個核苷酸；5′未翻譯區(qū)域(5′UTR)，是在翻譯起始密碼子5′方向的mRNA部分，因此包括5′帽位點和mRNA的翻譯起始密碼子或基因上的對應核苷酸之間的核苷酸；和3′未翻譯區(qū)域(3′UTR)，是在翻譯終止密碼子3′方向的mRNA部分，因此包括mRNA的翻譯終止密碼子和mRNA的3′末端或基因上的對應核苷酸之間的核苷酸。
可用于抑制多肽表達的優(yōu)選的反義化合物的具體實例包括含有修飾的骨架或非天然的核苷間鍵的寡核苷酸。具有修飾骨架的寡核苷酸包括那些在骨架中保留了磷原子和那些在骨架中不含有磷原子的寡核苷酸。對本申請說明書和本領域有時引用的文獻來說，那些在它們的核苷間骨架中沒有磷原子的修飾寡核苷酸還可以被認為是寡核苷。優(yōu)選的修飾的寡核苷酸骨架包括，例如硫代磷酸(phosphorothioates)、手性硫代磷酸(chiralphosphorothioates)、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基及其它烷基膦酸鹽，包括3′-烯基膦酸酯、5′-烯基膦酸酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯(phosphinate)、磷酰胺(phosphoramidate)，包括3′-氨基磷酰胺(3’-aminophosphoramidate)和氨烷基磷酰胺(aminoalkylphosphoramidates)、硫羰磷酰胺(thionophosphoramidates)、硫羰烷基膦酸酯(thionoalkyphosphonates)、硫羰烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)、具有正常3′-5′鍵的硒基磷酸酯(selenophosphates)和硼基磷酸酯(borano-phosphates)，它們的2′-5′連接的類似物，以及具有相反極性(inverted polarity)的寡核苷酸，在具有相反極性的寡核苷酸中，一個或多個核苷酸間鍵是3′-3’、5′-5′或2′-2′鍵。優(yōu)選的具有相反極性的寡核苷酸在最3′端的核苷酸間鍵處包括單個3′-3′鍵，即可能是脫堿基的單個反轉的核苷(single inverted nucleoside)殘基(失去核堿基或者在其位置上具有羥基)。也包括上述物質的各種鹽，混合鹽和游離酸形式。典型的教導制備包含磷的鍵的美國專利包括，但不局限于美國專利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，在這里將每一篇文獻都引入作為參考。
優(yōu)選的其中不包含磷原子的修飾的寡核苷酸骨架具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵，混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵，或者一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成的骨架。這些包含那些具有嗎啉代(morpholino)的連接(部分在核苷的糖部分中形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；亞甲基formacetyl和thioformacetyl骨架；核糖乙?；?riboacetyl)架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸基酯(sulfamate)骨架；methyleneimino和methylenehydrazino骨架；磺酸酯和氨磺酰骨架；酰胺骨架；以及其它具有混合的N，O，S和CH2組成部分的骨架。典型的教導制備這種寡核苷的美國專利包括，但不局限于美國專利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,61 8,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，在此將每一篇文獻都引入作為參考。
在其它優(yōu)選的反義寡核苷酸中，用新的基團替換了糖和核苷間鍵，即核苷酸單元的骨架。保持了與適當?shù)暮怂岚谢衔镫s交的堿基單元。這樣的寡聚化合物被稱為肽核酸(PNA)，已經(jīng)顯示這種寡核苷酸模擬物具有優(yōu)良的雜交特性。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被包含酰胺的骨架替換，特別是被氨乙基甘氨酸骨架替換。所述核堿基(nucleobases)被保留，并被直接地或間接地與骨架酰胺部分的氮雜原子結合。典型的教導制備PNA化合物的美國專利包括，但不局限于美國專利5,539,082；5,714,331和5,719,262，在這里將每一篇文獻引入作為參考。在Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500中可以發(fā)現(xiàn)對PNA化合物更進一步的教導。
優(yōu)選的反義寡核苷酸整合了硫代磷酸骨架和/或雜原子骨架，特別是在上述參考的美國專利5,489,677中描述的-CH2-NH-O-CH2-，-CH2-N(CH3)-O-CH2-(稱為亞甲基(甲基亞胺)或MMI骨架)，-CH2-O-N(CH3)-CH2-，-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯骨架以-O-P-O-CH2-表示]和上述參考的美國專利5,602,240中的酰胺骨架。具有上述參考的美國專利5,034,506的嗎啉代骨架結構的反義寡核苷酸也是優(yōu)選的。
修飾的寡核苷酸也可以包含一個或多個取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2′位置包括下列中的一個OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未被取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。特別優(yōu)選的是O[(CH2)nO]mCH3，O(CH2)nOCH3，O(CH2)nNH2，O(CH2)nCH3，O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m來自于1至大約10。其它優(yōu)選的反義寡核苷酸在2′位置包括下列中的一個C1-C10低級烷基、取代的低級烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或氧-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基團、報告基團、嵌入劑或改善寡核苷酸藥效學特性的基團，及其它具有相似特性的取代基。優(yōu)選的修飾包括2′-甲氧乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，又名′-O-(2-甲氧乙基)或2′-MOE)(Martin et al.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)，即烷氧烷氧基團。更進一步的優(yōu)選修飾包括在下文實施方案中描述的2′-二甲氨氧乙氧基(2′-dimethylaminooxyethoxy)，即O(CH2)2ON(CH3)2基，又名2′-DMAOE，這在下面的實例中描述，以及2’-二甲氨乙氧乙氧基(2’-dimethylaminoethoxyethoxy)(本領域也已經(jīng)作為2′-O-二甲基氨乙氧乙基(dimethylaminoethoxyethyl)或2′-DMAEOE已知)，即2′-O-CH2-O-CH2-N(CH2)。
更進一步優(yōu)選的修飾包括其中2′-羥基連接到糖環(huán)的3’或4’碳原子上而形成二環(huán)糖部分的鎖核酸(locked Nucleic Acid)(LNA)。連接優(yōu)選是橋接2’氧原子和4’碳原子的亞甲基(-CH2)n基團，其中n是1或2。WO 98/39352和WO 99/14226中描述了LNA和其制備方法。
其它優(yōu)選的修飾包括2’-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-氨丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)、2′-烯丙基(2′-CH2-CH＝CH2)、2′-O-烯丙基(2′-O-CH2-CH＝CH2)和2’-氟代(2’-F)。2’修飾可以在arabino(向上)位置或ribo(向下)位置。優(yōu)選的2′arabino修飾是2′-F。也可以在寡核苷酸的其它位置進行類似的修飾，特別是3′末端核苷酸的糖的3′位置，2′-5′連接的寡核苷酸內(nèi)，以及5′末端核苷酸的5′位置。寡核苷酸也可以具有糖模擬物，例如用環(huán)丁基部分代替五呋喃(pentofuranosyl)糖。教導制備這種修飾的糖結構的代表性的美國專利包括，但不局限于美國專利4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747和5,700,920，在此將每一篇文獻的內(nèi)容都全部引入作為參考。
寡核苷酸也可以包括核堿基(在本領域常常簡稱為″堿基″)修飾或取代。在這里使用的″未修飾的″或″天然的″堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的堿基包括其它合成和天然的堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物、2-硫代嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(propynyl)(-C≡C-CH3或-CH2-C＝CH)尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶堿基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基及其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代，特別是5-溴代、5-三氟甲基及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤，以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。更進一步地修飾的堿基包括三環(huán)嘧啶，例如吩噁嗪胞啶(phenoxazine cytidine)(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)(1H-pyrimido[5，4-b][1，4]benzoxazine-2(3H)-one)、吩噻嗪胞啶(phenothiazinecytidine)(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)(1H-pyrimido[5，4-b][1，4]benzothiazine-2(3H)-one)、G夾(G-clamps)，例如取代的吩噁嗪胞啶(phenoxazine cytidine)(例如9-(2-氨乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)- 酮)(9-(2-aminoethoxy)-H-pyrimido[5，4-b][1，4]benzoxazine-2(3H)-one)、咔唑胞啶(carbazole cytidine)(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)(2H-pyrimido[4，5-b]indol-2-one)、吡啶吲哚胞啶(pyridoindole cytidine)(氫-吡啶并 [3’，2’4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-one)(H-pyrido[3’，2’4，5]pyrrolo[2，3-d]pyrimidine-2-one)。修飾的堿基也可以包括其中嘌呤或嘧啶堿基被其它雜環(huán)，例如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮取代的那些堿基。更進一步的堿基包括那些在美國專利3,687,808，The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pages 858-859，Kroschwitz，J.I.，ed.John Wiley & Sons，1990和Englisch et al.，AngewandteChemie，International Edition，1991，30，613中公開的堿基。這些堿基中的某些對增加本發(fā)明的寡聚化合物的結合親合力特別有用。這些包括5-取代的嘧啶，6-氮雜嘧啶，N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤(aminopropyladenine)，5-丙炔尿嘧啶(5-propynyluracil)和5-丙炔胞嘧啶(5-propynylcytosine)。已經(jīng)顯示5-甲基胞嘧啶取代可以使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加0.6-1.2.degree.C.(Sanghvi et al，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，pp.276-278)，因此是優(yōu)選的堿基取代，與2’-O-甲氧乙基糖修飾聯(lián)合時更是特別優(yōu)選的。典型的教導制備修飾的堿基的美國專利包括，但不局限于美國專利3,687,808，以及美國專利4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,681,941和5,750,692，在此將每一篇文獻都引入作為參考。
反義寡核苷酸的另外的修飾涉及用化學方法將增強寡核苷酸的活性，細胞分布或細胞攝取量的一個或多個部分或偶聯(lián)物連接到寡核苷酸上。本發(fā)明的化合物可以包括共價結合到功能基團，伯羥基或仲羥基(primary orsecondary hydroxyl groups)上的偶聯(lián)基團。本發(fā)明的偶聯(lián)基團包括嵌入劑、報告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強寡聚物藥效特性的基團和增強寡聚物藥物代謝動力學特性的基團。典型的偶聯(lián)基團包括膽固醇、脂質、陽離子脂質、磷脂、陽離子磷脂、生物素、吩嗪(phenazine)、葉酸鹽(folate)、菲啶(phenanthridine)、蒽醌(anthraquinone)、吖啶(acridine)、熒光素、若丹明(rhodamine)、香豆素(coumarin)和染料。在本發(fā)明的上下文中增強藥效特性的基團包括改善寡聚物攝取、增強寡聚物對降解的抗性和/或加強與RNA的序列特異性雜交的基團。在本發(fā)明的上下文中增強藥物代謝動力學特性的基團包括改善寡聚物攝取、分布、代謝或排泄的基團。偶聯(lián)物部分(conjugate moieties)包括但不局限于脂質部分，例如，膽固醇部分(Letsingeret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)、膽酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(tritylthiol)(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)、硫代膽固醇(thiocholesterol)(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)、脂肪族鏈，例如十二烷基二醇(dodecandiol)或十一烷基殘基(Saison-Behmoaraset al.，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov et al.，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75，49-54)、磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油(di-hexadecyl-rac-glycerol)或三乙基銨-1，2-二-O-十六烷基-rac-甘油基-3-H-膦酸鹽(酯)(triethyl-ammonium1，2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate)(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)，多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.，Nucleosides & Nucleotides，1995，14969-973，)，或金剛烷胺乙酸(adamantane acetic acid)(Manoharan etal.，Tetrahedron Lett.，1995，36，365 1-3654)，棕櫚酰部分(palmityl moiety)(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237，1995)，或十八胺或己胺-羰基-氧膽固醇部分。本發(fā)明的寡核苷酸也可以結合到活性藥物物質，例如阿司匹靈(aspirin)、華法令(warfarin)、保泰松(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、聯(lián)苯丁酮酸(fenbufen)、優(yōu)洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)吡喃洛芬((S)-(+)-pranoprofen)、卡布洛芬(carprofen)、丹酰肌氨酸(dansylsarcosine)、2，3，5-三碘苯甲酸、氟滅酸(flufenamic acid)、甲酰四氫葉酸(folinic acid)、苯(并)噻二嗪(benzothiadiazide)、氯噻嗪、二氮雜環(huán)丁烯(diazetine)、indomethicin、巴比妥酸鹽(barbiturate)、頭孢菌素(cephalosporin)、磺胺藥(sulfa drug)、抗糖尿病藥、抗菌素或抗生素上。在美國專利申請334,130(1999年6月5日申請)和美國專利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941中描述了寡核苷酸藥物偶聯(lián)物和它們的制備方法，在此將每一篇文獻引入作為參考。
不必將給定化合物中的所有位置都均勻地修飾，實際上超過一個的上述修飾可以納入到單個化合物中，甚至可以納入到寡核苷酸內(nèi)的單個核苷處。本發(fā)明也包括是嵌合化合物的反義化合物。在本發(fā)明的上下文中的″嵌合的″反義化合物或″嵌合體″是包含兩個或更多個化學獨特區(qū)域的反義化合物，特別是寡核苷酸，其中每個化學獨特區(qū)域(chemically distinct regions)由至少一個單體單元(monomer unit)組成，在寡核苷酸化合物情況下所述單體單元即為核苷酸。這些寡核苷酸典型地包含至少一個寡核苷酸被修飾的區(qū)域，該修飾賦予寡核苷酸增加的核酸酶降解抗性，增強的細胞攝取，和/或增加的對靶核酸的結合親合力。寡核苷酸的另外區(qū)域可以作為能切割RNA:DNA或RNA:RNA雜合體(hybrid)的酶的底物。舉例來說，RNase H是能切割RNA:DNA雙鏈體中的RNA鏈的細胞核酸內(nèi)切酶。因此，活化RNaseH可導致RNA靶標被切割，從而能大大增強寡核苷酸抑制基因表達的效率。因此，當使用嵌合的寡核苷酸時，用較短的寡核苷酸經(jīng)?？梢垣@得與和相同的目標區(qū)雜交的硫代磷酸脫氧寡核苷酸類似的結果。可以以如上所述的兩個或更多個寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的復合結構(composite structure)形式形成本發(fā)明的嵌合的反義化合物。優(yōu)選的嵌合的反義寡核苷酸在3’末端納入了至少一個賦予核酸酶抗性的2’修飾的糖(優(yōu)選2’-O-(CH2)2-O-CH3)和賦予RNase H活性的具有至少4個連續(xù)的2’-H糖的區(qū)域。這種化合物在本領域也被稱為雜合體(hybrid)或gapmers。優(yōu)選的gapmers在3’末端和5’末端具有2’修飾的糖(優(yōu)選2’-O-(CH2)2-O-CH5)，被具有至少4個連續(xù)2’-H糖的至少一個區(qū)域分隔，并且該gapmers優(yōu)選納入硫代磷酸酯骨架連接。典型的教導制備這種雜合體結構的美國專利包括，但不局限于美國專利5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356和5,700,922，在這里將每篇文獻引入作為參考。
可以利用公知的固相合成方法，常規(guī)方便地制備本發(fā)明中使用的反義化合物。幾家供應商，包括，例如Applied Biosystems(Foster City，CA加利福尼亞)在出售適合于這種合成的設備。可以另外使用或替換使用其它的任何適合這種合成的材料和方式。已經(jīng)公知可利用類似的方法制備寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基衍生物。也可以將本發(fā)明的堿基寡聚物摻合，包封，偶聯(lián)結合或其它方式連接到其它分子，分子結構或化合物的混合物中，例如連接到有助于攝取，分布和/或吸收的脂質體，受體靶分子，口服制劑，直腸給藥制劑，局部給藥制劑或其它制劑。典型的教導制備這種攝取、分布和/或吸收促進制劑的美國專利包括，但不局限于美國專利5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575和5,595,756，在這里將每篇文獻引入作為參考。
有義或反義寡核苷酸的其它實例包括那些共價連接到有機部分上的寡核苷酸，例如WO 90/10048中描述的那些部分(moieties)，及共價連接到增加寡核苷酸對靶核酸序列的親合力的其它部分，例如聚-(L-賴氨酸)。還有嵌入劑，例如玫瑰樹堿(ellipticine)，烷化劑或金屬復合物可以更進一步地附著于有義或反義寡核苷酸上以修飾有義或反義寡核苷酸對靶核苷酸序列的結合特異性。
通過任何基因轉移方法，包括，例如CaPO4介導的DNA轉染、電穿孔或使用基因轉移載體，例如，EB病毒可以將反義或有義寡核苷酸引入包含靶核酸序列的細胞。在優(yōu)選方法中，反義或有義寡核苷酸被插入適當?shù)哪孓D錄病毒載體中。包含靶核酸序列的細胞可以在體內(nèi)或回體(ex vivo)接觸重組逆轉錄病毒載體。適當?shù)哪孓D錄病毒載體包括，但不局限于那些由鼠逆轉錄病毒M-MuLV、N2(由M-MuLV獲得的逆轉錄病毒)，或被命名為DCT5A、DCT5B和DCT5C的雙拷貝載體(參見WO 90/13641)獲得的載體。
依照WO 91/04753的描述，也可以通過與配體結合分子形成偶聯(lián)物將有義或反義寡核苷酸引入包含靶核苷酸序列的細胞。適當?shù)呐潴w結合分子包括，但不局限于，細胞表面受體、生長因子、其它細胞因子或結合細胞表面受體的其它配體。配體結合分子的偶聯(lián)優(yōu)選基本上不干擾配體結合分子結合對應分子或受體的能力，或不阻斷有義或反義寡核苷酸或其偶聯(lián)物形式進入細胞。
或者，可以依照WO 90/10448的描述，通過形成寡核苷酸脂質-復合物偶聯(lián)物將有義或反義寡核苷酸引入包含靶核苷酸序列的細胞。有義或反義寡核苷酸-脂質復合物優(yōu)選在細胞內(nèi)通過內(nèi)源脂肪酶發(fā)生離解。
反義或有義RNA或DNA分子的長度通常是至少大約5個核苷酸，或者至少大約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000個核苷酸，其中術語″大約″在上下文中指參考的核苷酸序列長度加上或減去參考長度的10％。
在PCR技術中也可以使用探針以產(chǎn)生鑒定密切相關的多肽編碼序列的序列庫。
編碼多肽的核苷酸序列還可以用于構建對編碼多肽的基因進行作圖和對患有遺傳病的個體進行遺傳分析的雜交探針。利用已知的技術，例如原位雜交、針對已知染色體標記的連鎖分析和庫的雜交篩選，可以用這里提供的核苷酸序列對染色體和染色體的特定區(qū)域進行作圖。
多肽可用于鑒定涉及多肽的結合相互作用的其它蛋白質或分子的測定中。通過這種方法，可以鑒定受體/配體結合相互作用的抑制劑。涉及這種結合相互作用的蛋白質還可以用于篩選結合相互作用的肽或小分子抑制劑。篩選測定可以設計成發(fā)現(xiàn)模擬天然多肽或多肽受體的生物活性的先導化合物的形式。這種篩選測定包括適合高通量篩選化學制劑庫的測定，這使它們特別適合于鑒定小分子藥物候選物?？紤]的小分子包括合成的有機或無機化合物。測定可以以多種形式進行，包括在本領域已經(jīng)被清楚表征的蛋白質-蛋白質結合測定、生物化學篩選測定、免疫測定和基于細胞的測定。
編碼多肽或其修飾形式的核酸還可以用于產(chǎn)生之后用于開發(fā)和篩選治療有用試劑中有用的轉基因動物或″敲除″動物。轉基因動物(例如，小鼠或大鼠)是具有包含轉基因的細胞的動物，其中轉基因是在出生以前，例如胚胎期被引入動物或動物祖先中的。轉基因是被整合到細胞基因組中的DNA，從該細胞將發(fā)育成轉基因動物。在一個實施方案中，依照已確定的技術，可用編碼多肽的cDNA克隆編碼多肽的基因組DNA和用于產(chǎn)生轉基因動物的基因組序列，其中轉基因動物包含表達編碼多肽的DNA的細胞。產(chǎn)生轉基因動物，特別是如小鼠或大鼠的動物的方法在本領域已經(jīng)變成常規(guī)方法，例如已經(jīng)描述在美國專利4,736,866和4,870,009中。通常使多肽轉基因與組織特異性增強子整合實現(xiàn)特殊細胞的靶向。包含一個拷貝的在胚胎期被引入動物種系的編碼多肽的轉基因的轉基因動物可用于研究編碼多肽的DNA的表達增加產(chǎn)生的效果。這種動物能可用作試劑的試驗動物，其中的試劑被認為能提供保護，例如對與多肽過表達有關的病理學狀態(tài)的保護。依據(jù)本發(fā)明的這一方面可知，與負載轉基因的未處理動物相比，用所述試劑處理的動物病理狀態(tài)的發(fā)病率降低表明對病理狀態(tài)產(chǎn)生了潛在的治療干預。
或者，多肽的非人同系物可用于構建基因″敲除″動物，其中由于編碼多肽的內(nèi)源基因和被引入該動物的胚胎干細胞的編碼所述多肽的改變的基因組DNA之間的同源重組，基因″敲除″動物的編碼所述多肽的基因有缺陷或被改變。例如編碼所述多肽的cDNA可依照確定的技術用于克隆編碼所述多肽的基因組DNA。編碼所述多肽的基因組DNA的一部分可以刪除或可以用另一個基因，例如用于監(jiān)測整合作用的編碼可選擇標記的基因取代編碼所述多肽的基因組DNA的一部分。載體中典型地包括幾千堿基的未改變的側接DNA(在5’和3’末端)[參見，例如，描述同源重組載體的Thomasand Capecchi，Cell，51503(1987)]。將該載體引入胚胎干細胞系(例如，通過電穿孔)，并選擇其中插入的DNA已經(jīng)與內(nèi)源DNA發(fā)生同源重組的細胞[參見，例如Li et al.，Cell，69915(1992)]。然后把選擇的細胞注入動物(例如，小鼠或大鼠)胚泡以形成聚集嵌合體[參見，例如，Bradley，inTeratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson，ed.(IRL，Oxford，1987)，pp.113-152]。然后將嵌合的胚胎植入適當?shù)募僭写菩责B(yǎng)育動物中，讓胚胎發(fā)育至足月產(chǎn)生″敲除″動物。通過標準技術可以鑒定其生殖細胞中包含同源重組DNA的子代，而且可利用該子代來繁殖所有細胞都包含同源重組DNA的動物。敲除動物可以表現(xiàn)下列特性，例如，具有抵御某些病理學狀態(tài)的能力和由于缺少多肽而發(fā)展成病理學狀態(tài)的特性。
編碼多肽的核酸也可以用于基因治療。在基因治療應用中，基因被引入細胞以實現(xiàn)體內(nèi)合成治療有效的基因產(chǎn)物，例如，替換有缺陷的基因?！寤蛑委煛灏Ｒ?guī)基因治療和施用基因治療制劑，前者通過單次治療可以實現(xiàn)持久的效果，后者涉及一次或重復施用治療有效的DNA或mRNA。反義RNA和DNA可用作阻斷體內(nèi)某些基因表達的治療劑。已經(jīng)顯示短的反義寡核苷酸可以被引入細胞，盡管因為細胞膜的限制性吸收它們的胞內(nèi)濃度低，但它們可以起抑制劑的作用。例如，通過用不帶電的基團取代它們的帶負電的磷酸二酯基團可以修飾寡核苷酸，以增強它們的攝取。
可獲得多種將核酸導入活細胞的技術。所述技術將隨核酸是被轉移到體外的培養(yǎng)細胞里，還是被轉移到體內(nèi)預定宿主的細胞里而變化。適合于在體外將核酸轉移到哺乳動物細胞里的技術包含使用脂質體、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀法等等。當前優(yōu)選的體內(nèi)基因轉移技術包括用病毒(典型地是逆轉錄病毒)載體進行的轉染和病毒外殼蛋白脂質體介導的轉染(Dzau et al.，Trends in Biotechnology 11，205-210 )。在有些情況下，用靶向靶細胞的試劑，例如特異性針對細胞表面膜蛋白或靶細胞的抗體、針對靶細胞上受體的配體等等來提供核酸來源是合乎需要的。使用脂質體時，結合與胞吞作用有關的細胞表面膜蛋白的蛋白質，例如特殊細胞類型向性的衣殼蛋白質或其片段、針對在循環(huán)中經(jīng)歷內(nèi)化的蛋白質的抗體、靶向胞內(nèi)定位和增強胞內(nèi)半衰期的蛋白質，可用來起靶向作用和/或促進攝取。例如，Wu et al.，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987)和Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)描述了受體介導內(nèi)吞作用的技術。當前已知的基因標記和基因治療規(guī)程的綜述可以參見Anderson et al.，Science 256，808-813(1992)。
這里描述的編碼多肽的核酸分子或其片段對染色體鑒定有用。在這方面正存在鑒定新的染色體標記的需要，因為基于實際的序列資料，目前只能得到的相對少的染色體標記試劑。本發(fā)明的每個核酸分子都可以被用作染色體標記。
本發(fā)明的多肽和核酸分子在診斷上可用于組織分型，其中一個組織中多肽的表達與另一個組織相比存在差別，優(yōu)選有病組織中多肽的表達與相同組織類型的正常組織相比存在差別。發(fā)現(xiàn)核酸分子有產(chǎn)生供PCR、Northern分析、Southern分析和Western分析用的探針的用途。
本發(fā)明包括篩選化合物以鑒定那些阻止多肽作用的化合物(拮抗劑)的方法。設計拮抗劑藥物候選物的篩選測定方法以鑒定結合這里確定的基因編碼的多肽或與該多肽形成復合物的化合物、或干擾編碼的多肽與其它細胞蛋白質的相互作用的化合物，包括，例如抑制細胞表達多肽的化合物。這種篩選測定方法包括適合高通量篩選化學制劑庫的測定，這使它們特別適合鑒定小分子藥物候選物。
測定可以以多種形式進行，包括在本領域已經(jīng)被清楚表征的蛋白質-蛋白結合測定、生物化學篩選測定、免疫測定和基于細胞的測定。
對拮抗劑的所有測定都有共同之處，在于它們都要求藥物候選物接觸這里確定的核酸編碼的多肽，接觸的條件和時間足以允許這兩個成分發(fā)生相互作用。
在結合測定中，相互作用是結合，而且可以在反應混合物中分離或檢測形成的復合物。在特定的實施方案中，多肽或藥物候選物被共價或非共價的附著固定在固相上，例如固定在微量滴定板上。非共價附著通常伴有用多肽溶液包被固體表面并進行干燥?；蛘撸捎锰禺愋葬槍Υ潭ǘ嚯牡墓潭ǖ目贵w，例如單克隆抗體，將多肽錨定在固體表面上。通過添加被可檢測的標記物標記的非固定成分到固定成分，例如包含錨定的成分的包被表面，可以實施測定。當反應完成時，通過，例如洗滌除去未反應成分，并檢測錨定在固體表面上的復合物。當最初的非固定成分攜帶可檢測標記物時，固定在表面上的標記物的檢測表明發(fā)生了復合(complexing)。當最初的非固定成分不攜帶可檢測標記物時，可以通過，例如利用特異性結合固定的復合物的標記抗體檢測復合。
如果候選化合物干擾多肽，但不結合多肽，那么通過眾所周知的檢測蛋白質-蛋白質相互作用的方法可以測定候選化合物與多肽的相互作用。這種測定包括傳統(tǒng)方法，例如，交聯(lián)、共免疫沉淀和通過梯度或層析柱進行的共純化。另外，通過利用如Chevray and Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895789-5793(1991)公開的Fields和同事(Fields and Song，Nature(London)，340245-246(1989)；Chien et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578-9582(1991))描述的基于酵母的遺傳系統(tǒng)，可以監(jiān)測蛋白質-蛋白質相互作用。許多轉錄活化劑，例如酵母GAL4，由兩個物理上分離的模塊域(modulardomain)組成，一個起DNA結合域的作用，另一個起轉錄活化域的作用。在上述出版物中描述的酵母表達系統(tǒng)(泛指″雙雜交系統(tǒng)″)利用了這一特性，并使用了兩個雜合體蛋白，一個是其中靶蛋白質被融合到GAL4的DNA結合域的蛋白，另一個其中是候選活化蛋白質被融合到活化域的蛋白。GALl-lacZ報告基因在GAL4活化啟動子控制下的表達取決于經(jīng)由蛋白質-蛋白質相互作用實現(xiàn)的GAL4活性的重建(reconstitution)。用β半乳糖苷酶的產(chǎn)色底物檢測包含相互作用多肽的集落。利用雙雜交技術確定兩個具體蛋白質之間的蛋白質-蛋白質相互作用的完整試劑盒(MATCHMAKERTM)在市場上可從Clontech買到。該系統(tǒng)還可以延伸到對涉及具體蛋白質相互作用的蛋白質域作圖和精確地找到對這些相互作用重要的氨基酸殘基。
可以如下測試干擾編碼這里鑒定的多肽的基因與其它胞內(nèi)或胞外成分相互作用的化合物通常在條件和時間足以允許所述基因產(chǎn)物和所述胞內(nèi)或胞外成分發(fā)生相互作用和結合的情形下制備包含所述基因產(chǎn)物和所述胞內(nèi)或胞外成分的反應混合物。為了測試候選化合物抑制結合的能力，可以在缺少和存在所述測試化合物的情況下進行反應。另外，可添加空白對照劑(placebo)到第三反應混合物中作為陽性對照。依照上文的描述，監(jiān)測測試化合物和存在于混合物中的胞內(nèi)或胞外成分的結合(復合物形成)。在對照反應中形成復合物，但在包含測試化合物的反應混合物中不形成復合物表明測試化合物干擾了測試化合物和它的反應配偶體的相互作用。
為了測定拮抗劑，所述多肽可以和待篩選特殊活性的化合物一起添加到細胞中，存在多肽時化合物具有抑制目的活性的能力表明化合物是多肽拮抗劑?；蛘撸梢酝ㄟ^將多肽和潛在拮抗劑在用于競爭性抑制測定的適當條件下與膜結合多肽受體或編碼的受體聯(lián)合(combine)來檢測拮抗劑。可以標記多肽，例如通過放射活性標記多肽，這樣結合到受體上的多肽分子的數(shù)目就可用于確定潛在拮抗劑的效應。通過本領域熟練技術人員已知的許多方法，例如，配體淘洗和FACS揀選可以鑒定編碼受體的基因。Coliganet al.，Current Protocols in Immun.，1(2)Chapter 5(1991)。優(yōu)選使用其中多(聚)腺苷酸化的RNA是從對多肽應答的(responsive)細胞中制備的表達克隆，由此RNA產(chǎn)生的cDNA庫被分成群(pool)，而且可用來轉染COS細胞或對多肽不應答的其它細胞。將生長在載玻片上的已轉染細胞暴露于標記的多肽。可以通過多種方式，包括碘化作用或納入位點專一的蛋白質激酶的識別位點來標記多肽。在固定和孵育后，對載玻片進行放射自顯影分析。鑒定陽性群，并利用相互作用的亞群和再篩選過程制備和再轉染亞群，最后產(chǎn)生編碼推定受體的單個克隆。
作為受體鑒定的替換方法，可以將標記的多肽通過光親和性連接到細胞膜或表達受體分子的提取制備物上。通過PAGE分辨交聯(lián)材料，并將交聯(lián)材料暴露于X線膠片?？梢郧谐荏w的標記復合物，將標記復合物分解成肽片段，并對標記復合物進行蛋白質微測序。從微測序中獲得的氨基酸序列可用來設計一組簡并的寡核苷酸探針篩選cDNA庫以鑒定編碼推定受體的基因。
在拮抗劑另一種測定中，可以在存在候選化合物的情況下，讓表達受體的哺乳動物細胞或膜制備物與標記的多肽一起孵育。然后可以測定化合物增強或阻斷這一相互作用的能力。
潛在拮抗劑的更具體的實例包括結合免疫球蛋白與多肽融合物的寡核苷酸，特別是抗體，包括，但不限于多克隆抗體和單克隆抗體、抗體片段、單鏈抗體、抗獨特型抗體、這種抗體或片段的嵌合或人源化型式、以及人抗體和抗體片段?；蛘?，潛在拮抗劑可以是密切相關的蛋白質，例如，識別受體但不產(chǎn)生效應的多肽的突變形式，因此可以競爭性地抑制所述多肽的作用。
另一個潛在的拮抗劑是利用反義技術制備的反義RNA或DNA構建物，例如反義RNA或DNA分子通過與靶mRNA雜交和阻止蛋白質翻譯起作用，直接阻斷mRNA的翻譯。可以通過三股螺旋形成或反義DNA或RNA將反義技術用于控制基因表達，兩種方法都基于多核苷酸與DNA或RNA的結合。例如，編碼這里的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分可用于設計長度為大約10-40個堿基對的反義RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被設計成與涉及轉錄的基因區(qū)域互補(三股螺旋(triple helix)，參見Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al.，Science，241456(1988)；Dervan et al.，Science，2511360(1991)，因此能阻止多肽的轉錄和生產(chǎn)。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)與mRNA雜交，從而阻斷mRNA分子翻譯成多肽(antisense-Okano，Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression(CRC PressBoca Raton，F(xiàn)L，1988))；還可以將如上所述的寡核苷酸遞送給細胞，這樣反義RNA或DNA可以在體內(nèi)表達以抑制多肽生產(chǎn)。當使用反義DNA時，由翻譯起始位點，例如靶基因核苷酸序列的大約-10和+10位置之間獲得寡脫氧核糖核苷酸是優(yōu)選的。
潛在的拮抗劑包括結合活性部位、受體結合部位、生長因子或多肽的其它相關結合部位從而阻斷多肽正常生物活性的小分子。小分子的實例包括，但不局限于小肽或肽樣分子，優(yōu)選可溶性肽，和合成的非肽基有機或無機化合物。
核酶是能夠催化RNA的特異性切割的酶催化RNA分子。核酶通過與互補的靶RNA進行序列特異性雜交，然后進行內(nèi)切核酸酶(endonucleolytic)切割起作用。通過已知技術可以鑒別潛在RNA靶內(nèi)的特異核酶切割位點。為了解詳情，可參見，例如Rossi，Current Biology，4469-471(1994)和PCT公開No.WO 97/33551(1997年9月18日公開)。
在三螺旋結構中用于抑制轉錄的核酸分子應該是單鏈的由脫氧核苷酸組成的分子。設計這些寡核苷酸的堿基組成，使它能通過Hoogsteen堿基配對規(guī)則促進三螺旋形成，而這通常需要雙鏈體的一條鏈上有相當大的嘌呤或嘧啶延伸范圍。更多細節(jié)參見，例如上文的PCT申請WO 97/33551。
通過上文討論篩選測定中的任何一種或多種測定和/或本領域熟練技術人員眾所周知的任何其它篩選技術可以鑒定這些小分子。
利用本領域眾所周知的技術和參照這里的描述，可以將分離的編碼多肽的核酸用于重組生產(chǎn)多肽。然后使用本領域眾所周知的技術和參照這里的描述，可以將生產(chǎn)的多肽用于產(chǎn)生抗體。
可以以藥物組合物形式施用特異地結合這里鑒定的多肽的抗體，以及通過以上公開的篩選測定方法鑒定的其它分子來治療各種紊亂，包括癌癥。
如果多肽是胞內(nèi)的，而且使用完整的抗體作為抑制劑，那么優(yōu)選內(nèi)化抗體(intemalizing antibody)。但是，脂轉染(lipofections)或脂質體還可以用于遞送抗體或抗體片段到細胞里。使用抗體片段時，優(yōu)選特異地結合靶蛋白質結合域的最小抑制片段。例如以抗體可變區(qū)序列為基礎，可以將肽分子設計成保留了結合靶蛋白質序列能力的肽分子?？梢砸曰瘜W方法合成和/或通過DNA重組技術生產(chǎn)這種肽。參見，例如Marasco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-7893(1993)。
這里的制劑也可以包含待治療的特定適應癥必需的一種以上的活性化合物，優(yōu)選那些不會不利地彼此影響的、具有補充活性的活性化合物?；蛘呋蛄硗獾兀鼋M合物可以更進一步地包含增強它功能的試劑，例如，細胞毒劑、細胞因子、化療劑或生長抑制劑。這樣的分子可以以對預定目標有效的量適當?shù)亟M合存在。
提供下面的實施列只是用作解釋說明目的，無論如何，無意用它們限制本發(fā)明的范圍。
實施方案試劑產(chǎn)色底物S2366是從DiaPharma Group，Inc.(West Chester，OH)獲得的、Lys-纖溶酶原是從Haematologic Technologies Inc.(Essex Junction，VT)獲得的、組織型纖維蛋白溶酶原活化因子(t-PA)是從Genentech，Inc.(South SanFrancisco，CA)獲得的。在缺少血清的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達并利用HiTrap Sepharose SP層析純化的前HGF是由David Kahn(Genentech)提供的。在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達包含殘基Val373-Arg407的HGFA并依照(34)的描述進行純化。在人293細胞中表達的純化人重組FVII是MarkO，Connell(Genentech)的贈品，而且最近已經(jīng)被描述(42)。基本上依照(43)的描述，利用二油酰1，2-二?；?sn-甘油基-3-(磷酸-L-絲氨酸)(PS)(Dioleoyl 1，2-diacyl-sn-glycero-3-(phospho-L-serine))和油酰1，2-二酰基-sn-甘油基-3-膽堿磷酸(oleoyl 1，2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(PC)(Avanti Polar Lipids Inc.，Alabaster，AL)來產(chǎn)生PCPS小囊泡(vesicle)(73摩爾比)。分子量標記是SeeBlue Plus2和MultiMark標準(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
肝絲酶的表達和純化用限制內(nèi)切核酸酶EcoRI和Not I(New England Biolabs Inc.Beverly，MA)消化從I.M.A.G.E.協(xié)會(consortium)(ATCC，Manassas，VA)獲得的肝絲酶全長cDNA，并將其插入真核表達載體pRK5E。通過將編碼人HGF信號序列(氨基酸Metl-Gly31)的cDNA與編碼人肝絲酶細胞外域(Arg45-Leu417，依照Somoza et al.，2003(5)的編號系統(tǒng))的cDNA融合構建分泌的His標記的肝絲酶cDNA。另外，將His8標記添加到C末端Leu417之后，最后的cDNA構建物被插入真核表達載體pCMV.PD5。在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞短暫表達系統(tǒng)中表達肝絲酶，并基本上利用生產(chǎn)野生型sHAI-1B(34)時描述的鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)親和層析進行純化。
sHAI-1B、sHAI-1B突變體和sHAI-2的表達和純化在CHO細胞短暫表達系統(tǒng)中生產(chǎn)包含全部細胞外域的HAI-1B的可溶形式(sHAI-1B)，并依照先前(34)的描述進行純化。利用定位誘變分別將KDl(Arg260)和KD2(Lys401)的P1殘基轉變?yōu)锳la，表達產(chǎn)生的蛋白質sHAI-1B(R260A)和sHAI-1B(K401A)，依照(34)的描述進行純化。
利用寡dT/Not I位點作為引物和具有Sal I位點的第二鏈銜接頭，從來源于人胎兒肺RNA的cDNA庫(BD Biosciences Clontech，Palto Alto，CA)中獲得全長HAI-2。用Sal I和Not I消化cDNA；大于2.8kb的cDNA連接到pRK5D上。利用標準分子生物學方法產(chǎn)生人肺cDNA/pRK5D庫的單鏈DNA。反向引物(5′-tttcttgaggcactcctccttg-3′)復性連接到單鏈cDNA群(pool)上，利用T7或T4 DNA聚合酶進行延伸。用合成的雙鏈DNA轉化大腸桿菌，并利用標準濾膜雜交方法篩選集落。通過PCR和限制性內(nèi)切酶XbaI消化分析插入物大小。通過DNA測序鑒定和確認HAI-2全長克隆。通過構建編碼HAI-2細胞外域(Ala28-Lys197，依照Kawaguchi et al.，1997(39)的編號系統(tǒng))的cDNA和添加有Gly間隔物的C末端His8標記生產(chǎn)HAI-2的可溶形式(sHAI-2)。然后將獲得的互補DNA插入來源于pVL1393的桿狀病毒表達載體(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)。在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達sHAI-2，并基本上利用生產(chǎn)HGF β-鏈(44)時描述的Ni-NTA親和層析進行純化。通過定量氨基酸分析確定蛋白質濃度。
FVII和纖溶酶原活化測定37℃在存在0.5mM PCPS小囊泡和5mM CaCl2的情況下，通過存在于30mM Tris-HCl，pH 8.4，30mM咪唑，200mM NaCl(Tris緩沖液)中的230nM的肝絲酶活化濃度為0.11mg/ml的FVII。利用4-20％的梯度凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)，通過SDS-PAGE(還原條件)分析在不同時間點取的反應等份。用Simply Blue Safe染色劑對凝膠進行染色(invitrogen)。
0.12mg/ml的纖溶酶原在37℃與存在于20mM Hepes，pH 7.5，150mMNaCl(Hepes緩沖液)中的40nM肝絲酶或40nM t-PA(陽性對照)一起孵育。依照FVII活化測定中的描述，通過SDS-PAGE分析在不同時間點取的反應等份。
肝絲酶和HGFA活化前HGF37℃時，前HGF(pro-HGF)(0.3mg/ml)與40nM肝絲酶或40nM HGFA在Hepes緩沖液中一起孵育4h，然后儲存在-20℃直到再使用。通過SDS-PAGE對消化的材料、HGF肝絲酶和HGFHGFA的分析表明＞95％的前HGF被轉變?yōu)殡p鏈HGF。
依照描述(34，45)進行前HGF活化測定和前HGF125I標記。簡而言之就是Hepes緩沖液中的0.05mg/ml的125I標記的前HGF在37℃與濃度逐漸增加的肝絲酶或HGFA(0.16-40nM)一起孵育。4h之后，除去等份樣品，并通過SDS-PAGE(4-20％的梯度凝膠)(Invitrogen，Carlsbad，CA)進行分析。為了進行抑制研究，肝絲酶(15nM)37℃在Hepes緩沖液中與1μMsHAI-1B、sHAI-1B(K401A)、sHAI-1B(R260A)或sHAI-2孵育。4h后，通過SDS-PAGE分析樣品，并利用Simply Blue Safe染色劑(invitrogen)進行染色。
酶抑制測定測定條件與Somoza et al.2003(5)描述的利用產(chǎn)色底物S2366(L-焦磷酸谷氨酰(pyroglutamyl)-L-脯氨酰-L-精氨酸-p-硝基苯胺鹽酸化物(L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-arginine-p-nitroaniline hydrochloride))的條件相似。在室溫，肝絲酶(最終濃度為0.4 nM)在Tris緩沖液中與濃度逐漸增加的抑制劑一起孵育30分鐘。添加底物S2366，并在動態(tài)微板讀數(shù)器(Molecular Devices，Sunnyvale CA)上測量405nm處的吸光度變化。在最后的反應混合物中肝絲酶和S2366的濃度分別是0.4nM和0.2mM(確定的Km＝0.2mM)。抑制活性用不受抑制的酶活性的分數(shù)活性(vi/v0)來表示。通過將數(shù)據(jù)擬合到四參數(shù)回歸曲線擬合程序(Kaleidagraph，SynergySoftware，Reading，PA)來計算產(chǎn)生50％抑制的抑制劑濃度(IC50)。對每個抑制劑實施至少三個獨立實驗。
細胞增殖和遷移測定用從歐洲細胞培養(yǎng)中心(European Collection of Cell Cultures)(CAMR，Centre for Applied Microbiology and Research，Salisbury，Wiltshire，UK)獲得的人胰腺腺癌細胞系BxPC3進行增殖測定。細胞生長在包含10％FCS(Sigma，St.Louis，MO)、10mM hepes、2mM谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)和250μg/ml G418(Invitrogen)的RPMI培養(yǎng)基中。用PBS洗滌匯合的細胞層后用10mM EDTA/PBS進行洗滌，在用胰蛋白酶孵育之后解吸附細胞層。將細胞再懸浮到生長培養(yǎng)基中，并接種(10,000-15,000細胞/孔)到96孔白底MT板中(Cultur PlateTM，Packard/PerkinElmer，Boston，MA)。在24小時以后，用RPMI-0.1％BSA替換生長培養(yǎng)基。再過另外的24小時之后，除去培養(yǎng)基，添加存在于RPMI-0.1％BSA中的各種濃度的HGF肝絲酶和HGFHGFA，并讓細胞生長72小時。然后依照制造商的說明，通過利用CellTiter-Glo Luminescent試劑盒(Promega，Madison，WI)對細胞增殖進行定量。在Tropix TR717微板光度計(Berthold 75323，Bad Wildbad，Germany)上測量發(fā)光。在減去背景值(缺少HGF時的增殖)后，HGF肝絲酶和HGFHGFA的活性表示為100ng/ml HGF對照制品(從Dr.Ralph Schwall，Genentech獲得)的BxPC3增殖的百分比。
依照(44)的描述，用乳腺癌細胞系MDA-MB435(HTB-129，ATCC，Manassas VA)進行細胞遷移測定。簡而言之，將存在于沒有血清的培養(yǎng)基中的0.2ml細胞懸液(0.6-0.8 x 106個細胞/ml)添加到用10μg/ml的大鼠尾I型膠原(Upstate，Lake Placid，NY)預包被的24孔跨孔板(transwell plates)(孔徑大小8μm)(HTS MultiwellTMInsert System，F(xiàn)alcon，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)的上層室中，無血清培養(yǎng)基中的HGF制劑被添加到下層室中。在孵育13-14小時以后，除去膜頂面(apical side)上的細胞，并用4％的多聚甲醛固定遷移到基面(basal side)的細胞，然后用0.5％的龍膽紫溶液對這些細胞進行染色。將細胞溶解在10％的乙酸中，并在分子裝置微板讀數(shù)器(MolecularDevices microplate reader)上測量A560。減去缺少HGF時的基礎(basal)遷移后，HGF突變體的促遷移(Pro-migratory)活性表示為HGF對照制劑的百分比。
Met受體磷酸化測定依照(44)的描述進行激酶受體活化測定(KIRA)。簡而言之就是將肺癌A549細胞(CCL-185，ATCC，Manassas，VA)以每孔50,000細胞的密度接種到96孔板中。37℃孵育過夜后，除去生長培養(yǎng)基，使細胞在包含0.1％FBS的培養(yǎng)基中經(jīng)受血清饑餓30-60分鐘。在包含0.1％FBS的培養(yǎng)基中添加濃度逐漸增加的HGF肝絲酶和HGFHGFA。我們使用了其中切割位點發(fā)生突變(Arg494Glu)的不能被切割的單鏈形式的HGF(scHGF)作為對照(44)。37℃孵育10分鐘之后，除去培養(yǎng)基并用補充有蛋白酶抑制劑雞尾酒樣混合物的溶解緩沖液(Cell Signaling Technologies，Beverly，MA)溶解細胞。將BV-TAG標記的4G10抗體和生物素化的抗Met抗體添加到細胞溶解物中。在孵育1.5-2小時以后，添加鏈親和素磁珠(Dynabeads，Bio Veris)并孵育45分鐘。用外部施加的磁體俘獲具有結合材料(抗Met抗體/Met/抗磷酸酪氨酸抗體)的珠子。洗滌步驟后，在Bio Veris儀器上測量光源產(chǎn)生的化學發(fā)光信號的相對發(fā)光單位。每個實驗的HGF肝絲酶、HGFHGFA或scHGF引起的Met磷酸化表示為用HGF對照制劑獲得的最大信號的百分比。
結果肝絲酶蛋白水解處理前HGF在CHO細胞中表達包含全部細胞外域(Arg45-Leu417；依照Somoza etal.，2003(5)的編號系統(tǒng))和C末端His8標記的可溶形式的肝絲酶。在純化處理期間，肝絲酶酶原很可能由于自身活化(4)而自然地變?yōu)殡p鏈形式(圖1A)?！?0kda蛋白酶域的N-末端測序(163IVGGRDTSLGR173)證實裂解發(fā)生在產(chǎn)生活性酶的預期的Arg162-Ile163肽鍵位置。肝絲酶積極地將FVII酶原轉換成雙鏈FVIIa(圖1B)，這與Kazama et al.，1995(9)報道的利用細胞表面表達的肝絲酶確定FVII活化的實驗一致。通過測量125I標記的前HGF轉化成雙鏈HGF來研究肝絲酶對前HGF的活性。結果顯示前HGF以濃度依賴方式被肝絲酶切割(圖2A)。肝絲酶的活性與HGFA的活性相當(comparable)(圖2B)，在4-13nM的濃度時兩個酶都實現(xiàn)了完全轉化前HGF。在相同的測定系統(tǒng)中，前HGF活化物因子XIa、因子XIIa和血漿激肽釋放酶(kallikrein)要實現(xiàn)完全轉化前HGF需要高大約5-6倍的濃度(45)?！?6kDa和～39kDa HGFβ鏈的 N-末端測序得到相同的序列(495VVNGIPTRTNIG506)，顯示肝絲酶在預期的Arg494-Val495肽鍵處加工前HGF。即使在延長的反應周期之后，肝絲酶仍不象因子XIa和血漿激肽釋放酶，它不產(chǎn)生HGFα2鏈片段(通過Arg424-His425之間的切割產(chǎn)生)(45)。而且肝絲酶(40nM)在5小時的反應期間完全缺少活化纖溶酶原的能力(圖2C)。與此相比，t-PA能高效加工纖溶酶原，在0.5小時后已經(jīng)切割大約50％的酶原(圖2C)。
肝絲酶消化產(chǎn)生的HGF的生物活性用40nM肝絲酶或40nM HGFA可以將未標記的前HGF(0.3mg/ml)完全地轉換(＞95％)成HGF，分別產(chǎn)生HGF肝絲酶和HGFHGFA。在用A549肺癌細胞進行的激酶受體測定(KIRA)中，兩個HGF制劑在Met磷酸化中都誘導了類似的濃度依賴性增加，在250ng/ml時達到了最大活性(圖3B)。如以前所示(44)，具有改變的切割位點(R494E)的不可切割的單鏈形式的HGF(scHGF)沒有活性(圖3B)。對照實驗顯示單獨的肝絲酶或HGFA不產(chǎn)生效應(數(shù)據(jù)沒有顯示)。而且，HGF肝絲酶高效地促進了BxPC3胰癌細胞的增殖。該活性與研究范圍為5-100ng/ml(圖4A)的HGFHGFA的活性相當(comparable)。在利用膠原包被的跨孔(transwell)遷移系統(tǒng)中，用MDA-MB435細胞進行的細胞遷移測定可獲得類似的結果。就象在細胞增殖測定中發(fā)現(xiàn)的那樣，HGF肝絲酶的促遷移效應是濃度依賴性的，與HGFHGFA的活性是不可區(qū)別的(圖4B)。
sHAI-1B和sHAI-2抑制肝絲酶酶活性26個市場上可買到的產(chǎn)色底物的初期篩選顯示Somoza et al.，2003(5)報道的底物S2366可以被肝絲酶高速水解(數(shù)據(jù)未顯示)。利用S2366作為底物，測量高度純化的可溶形式的野生型HAI-1B(sHAI-1B)和HAI-2(sHAI-2)的抑制活性。另外，我們制備了通過替換P1殘基(KD1中的Arg260和KD2中的lys401)使各個庫尼茨域失活的兩個sHAI-1B突變體sHAI-1B(R260A)和sHAI-1B(K401A)。結果顯示sHAI-1B和sHAI-2都能有力地抑制肝絲酶的酶活性，IC50值分別是21.1±2.7nM和1.3±0.3nM(圖5)。而且，包含無功能KD2的突變體sHAI-1B(K401A)與野生型sHAI-1B同樣有效，而sHAI-1B(R260A)具有＞47倍的降低的活性(圖5)。獲得的IC50值概括在表1中。
表1.庫尼茨域抑制劑抑制肝絲酶

肝絲酶介導的前HGF活化的抑制在125I-前-HGF活化測定中測量sHAI-1B和sHAI-2干擾大分子底物加工的能力。獲得的結果與酰胺分解測定(amidolytic assay)測定中確定的抑制活性完全一致(圖6)。在1μm濃度的sHAI-2、野生型sHAI-1B和sHAI-1B(K401A)中出現(xiàn)了對前HGF切割的完全抑制(圖6)。與此相反，1μmsHAI-1B(R260A)沒有顯示抑制，前HGF活化進展到完全轉化(圖6)。
討論HGF/Met信號路徑在人生理學和病理學，包括腫瘤侵襲和轉移中起重要作用?；钚訦GF的局部可利用性受細胞外環(huán)境中調節(jié)非活性前HGF加工的凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶和它們的相關抑制劑的控制。因此，癌癥中′上游′前HGF轉化酶路徑的混亂可以通過加快前HGF加工促進腫瘤生長。這里，我們證明在前列腺癌和卵巢癌中高度上調的絲氨酸蛋白酶-肝絲酶是前HGF的有效活化劑。因此，肝絲酶可能在HGF/Met信號路徑活化引起的腫瘤生長中起重要作用(49，50)，所述HGF/Met信號路徑與前列腺癌(46-48)和卵巢癌(49，50)有關。
肝絲酶在Arg494-Val495肽鍵處蛋白水解切割前HGF，在因子XIa和血漿激肽釋放酶辨別的位置--Kringle域4的Arg424-His425處不產(chǎn)生任何另外的切割(45)。肝絲酶產(chǎn)生的雙鏈HGF完全是有功能的，具有可與HGFA產(chǎn)生的HGF相比較的誘導Met受體磷酸化，促進細胞增殖和遷移的活性。肝絲酶介導非活性的前HGF轉化成活性生長因子的潛在分子機制與凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶蛋白水解酶原成酶的轉化具有相似性。最近對前HGF活化的結構結果的研究支持這一點，結果表明Arg494-Val495處的切割導致蛋白酶樣HGFβ鏈的構象變化和Met受體結合部位的完全成熟(44，51)。集中在HGF′活性部位區(qū)′和′活化域′上的Met結合部位與絲氨酸蛋白酶的底物加工區(qū)具有顯著的相似性(44，51)。因此，肝絲酶對前HGF的切割引起HGFβ的結構重排，該結構重排允許形成許多的(productive)HGF/Met信號復合物。肝絲酶對前HGF的蛋白水解活性顯示出高度特異性，因為它不切割前HGF結構上最接近的同系物纖溶酶原。肝絲酶對其它的絲氨酸蛋白酶底物，例如凝血酶原、蛋白質C、因子X和因子IX(9)卻沒有蛋白水解活性。
對HGF無效小鼠(HGF null mice)的研究顯示HGF Met路徑對正常胚胎發(fā)育和存活是必不可少的(52，53)。與此相反，缺乏肝絲酶基因的小鼠能正常地發(fā)育，這表明肝絲酶不太可能是胚胎發(fā)生期間重要的HGF活化劑。與肝絲酶類似，其它已知的前HGF轉化酶基質蛋白酶(54)、因子XI(55)、前激肽釋放酶(56)和u-PA(57)的缺乏不是胚胎致死性的。因為HGF活性在胚胎發(fā)生中和出生后的生理學中的重要性，因此可以通過多重前HGF轉化酶系統(tǒng)以協(xié)調的方式調節(jié)HGF的活性。如果是這樣的話，聯(lián)合的前HGF轉化酶基因缺陷應該導致與HGF無效小鼠類似的生長發(fā)育缺陷?；蛘?，還沒有鑒定出前HGF轉化酶在胚胎發(fā)生期間調節(jié)HGF加工。
HAI-1B、HAI-1和HAI-2是上皮細胞表面抑制劑，在許多正常組織和腫瘤內(nèi)表達(34，58-63)。這樣理論上它們就能調節(jié)上皮細胞表達的TTSPs和可能的其它細胞表面相關絲氨酸蛋白酶的酶活性。實際上，HAI-1剪接變體HAI-1和HAI-1B有效地抑制TTSP基質蛋白酶(MT-SP1)，而且在人母乳中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HAI-1與基質蛋白酶的復合物(38)。我們在這里證明sHAI-1B和sHAI-2也是肝絲酶酶活性的有力抑制劑。而且，指向P1殘基的誘變實驗也證明肝絲酶的抑制完全是由sHAI-B的KD1介導的，因為突變體sHAI-1B(R260A)在前HGF測定中是非活性的，而且在酰胺分解測定中具有＜1％的野生型和KD2突變體活性。因此，肝絲酶、基質蛋白酶和HGFA不僅具有類似的前HGF轉換活性(34)，而且也被sHAI-1B以相等效能(16-30 nM)KD1特異方式抑制(34，64)。剪接變體HAI-1和HAI-1B的差別僅在于缺乏或存在位于KD1 C末端的16個氨基酸。它們在組織中的表達模式，包括在前列腺腫瘤和卵巢腫瘤中的表達模式是相同的，而且到目前為止沒有發(fā)現(xiàn)它們的效能和靶蛋白酶模式方面存在明顯差別。因此，我們認為這兩個剪接變體是體內(nèi)功能同等物。在我們的研究中沒有特別論述HAI-2庫尼茨域的作用。HAI-2對大部分目標酶都使用N-和C末端庫尼茨域(41，65)。
肝絲酶與HAI-1B和HAI-2在體外的功能聯(lián)系與它們在體內(nèi)的上皮細胞表面的定位一起暗示它們可以構成生理學上相關的酶抑制劑系統(tǒng)。例如正常前列腺和前列腺癌細胞系中表達兩種HAI-1剪接變體和HAI-2(34，59，61)，而且HAI-1抗原位于前列腺腺上皮的分泌細胞層(59)。讓人感興趣的是前列腺腫瘤中的肝絲酶表達位于相同的上皮細胞區(qū)室(comparment)中(19，20)，這支持HAI-1和可能的HAI-2在體內(nèi)與肝絲酶相關的觀點。當肝絲酶表達在前列腺癌中強烈上調時(17-22)，依照Welsh etal.，2001(17)報道的基因表達結果HAI-1和HAI-2(17)僅輕微增加(大約1.5倍)。因此，腫瘤內(nèi)的肝絲酶酶活性可能沒有被適當?shù)乜刂?，從而導致前HGF加工和腫瘤進展增強。已經(jīng)描述了與卵巢癌中的基質蛋白酶/HAI-1(68)、結腸直腸癌中的HGFA/HAI-1(66，67)和腎細胞癌中的HGFA/HAI-1(68)類似的不平衡的前HGF轉化酶/抑制劑系統(tǒng)。在這些癌的一些癌中的上調表達暗示某些轉化酶/抑制劑系統(tǒng)包括多重酶，因此增加的酶/抑制劑比例可以放大惡性后果。
總之，上述結果顯示肝絲酶高效地活化前HGF，因此揭示了腫瘤上皮細胞表面上的肝絲酶和包含非活性生長因子前體的細胞外基質之間的功能連接。HAI-1B和HAI-2是在前列腺癌和卵巢癌中上調的肝絲酶的有效抑制劑的這一發(fā)現(xiàn)提供了癌癥治療的新方法。例如HAI-1B或HAI-2的功能庫尼茨域可以作為使用噬菌體展示技術產(chǎn)生更特異的和/或更有效力的酶抑制劑的支架(scaffold)，其中噬菌體展示技術已經(jīng)成功地應用于其它的庫尼茨域支架(69，70)。
腳注/縮寫1因子VIIa，F(xiàn)VIIa；Hepes緩沖液，20mM Hepes，pH 7.5，150mMNaCl；Tris緩沖液，30mM Tris-HCl，pH 8.4，30mM咪唑，200mM NaCl；前HGF，單鏈肝細胞生長因子；HGF，雙鏈肝細胞生長因子；HGFA肝細胞生長因子活化劑；HAI-1，肝細胞生長因子活化物抑制劑-1；HAI-1B，肝細胞生長因子活化物抑制劑-1的剪接變體；HAI-2，肝細胞生長因子活化物抑制劑-2；KD1和KD2，HAI-1B的N-和C末端庫尼茨域；sHAI-1B，包含細胞外域的HAI-1B的可溶性形式；sHAI-2，包含細胞外域的HAI-2的可溶性形式；HGF肝絲酶，用肝絲酶活化前HGF產(chǎn)生的HGF；HGFHGFA，用HGFA活化前HGF產(chǎn)生的HGF；scHGF，具有突變切割位點(Arg494Glu)的不可切割的單鏈HGF；u-PA，尿激酶型血纖維蛋白溶解酶原活化劑；t-PA，組織型血纖維蛋白溶解酶原活化劑。Ni-NTA，鎳次氮基三乙酸。
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1.鑒定抑制HGF的肝絲酶活化的候選抑制劑物質的方法，所述方法包括(a)讓候選物質接觸包含肝絲酶和前HGF底物的第一樣品，和(b)將樣品中前HGF底物活化的量與參考樣品中前HGF底物活化的量進行比較，所述參考樣品包含與第一樣品相似量的肝絲酶和前HGF底物，但它不與所述的候選物質接觸，與參考樣品相比第一樣品中前HGF底物活化的量下降表明候選物質能夠抑制肝絲酶活化單鏈HGF(前HGF)。
2.權利要求1的方法，其中樣品中的肝絲酶是有效量的活化所述前HGF的肝絲酶。
3.權利要求1的方法，其中前HGF底物是包含HGF或其含有R494-V495肽鍵的野生型形式的片段的多肽。
4.權利要求1的方法，其中前HGF底物包含與蛋白酶共有切割位點相適合的人HGF切割位點，其中所述切割位點包含位置P1的堿性殘基和位置P1′和P2′上的兩個疏水性氨基酸殘基。
5.抑制肝絲酶和肝細胞生長因子相互作用的拮抗劑分子。
6.權利要求5的拮抗劑分子，其中該分子包含抗體或其片段。
7.權利要求5的拮抗劑分子，其中該分子包含含有庫尼茨域1序列的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供調節(jié)肝絲酶活性和HGF/c－met信號路徑的方法和組合物，特別是通過調節(jié)肝絲酶活化前HGF進行調節(jié)的方法和組合物。
文檔編號G01N33/74GK101023182SQ200580031687
公開日2007年8月22日 申請日期2005年7月25日 優(yōu)先權日2004年7月26日
發(fā)明者丹尼爾·K·柯克霍弗, 保羅·M·莫蘭, 馬克·D·皮克 申請人:健泰科生物技術公司