專利名稱：經(jīng)修飾的hiv－1肽及其在檢測(cè)抗－h(huán)iv抗體中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可以在用于檢測(cè)由HIV-1病毒引起的感染的免疫測(cè)定法中使用的合成肽，其制備方法，包含這樣的肽的組合物和試劑盒，這樣的肽用于診斷目的的用途，以及使用它們來檢測(cè)抗HIV病毒抗體的免疫測(cè)定方法。
HIV-1型逆轉(zhuǎn)錄病毒(人免疫缺陷病毒1型或HIV-1)已知為歷史上第一種造成人AIDS的因子。如今，HIV-1型病毒被分為M群HIV-1病毒(主要群)和O群HIV-1病毒(次要群，最初被稱為O亞型)，兩者尤其在基因組和免疫學(xué)上不同。自1986年(Clavel等人，Science，第233卷，第343-346頁，18 July 1986)以來，已知了造成人AIDS的第二種病毒類型，稱為HIV-2。
為了表達(dá)方便，在下文中將用“HIV-1M”這種表述來表示M群的HIV-1病毒，用“HIV-1 O”這種表述來表示O群的HIV-1病毒。
最初發(fā)現(xiàn)了3種不同分離物形式的HIV-1型逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些分離物被稱為L(zhǎng)AV、HTLV-III和ARV分離物(有時(shí)也被稱為ARV-2)?？梢詤⒖糂arré-Sinoussi等人(Science 20 May 1983，220，第868-871頁)；Popovic等人(Science 4 May 1984，224，第497-500頁)；Gallo等人(Science 4 May 1984，224，第500-503頁)和Levy等人(Science 24 August 1984，225，第840-842頁)的文章，它們提及了這些分離物的發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在，所有這3種分離物均屬于HIV-1M病毒這一類別。HIV-1 O病毒要更晚(從1990年開始)才得到描述，并且它們的分離物有過不同的命名，例如HIV-3或ANT 70(歐洲專利申請(qǐng)EP 345 375和De Leys等人，Journal of Virology，March 1990，第64卷，No.3，第1207-1216頁)，或較晚時(shí)候的MVP5180/91(Gürtler等人，Journal of Virology，March 1994，第68卷，No.3，第1581-1585頁；專利申請(qǐng)EP 0 591 914)等。其他O群分離物，例如HIV-1VAU、HIV-1DUR、MVP2901/94等，從那以后也已得到描述。
1985年初，HIV-1M逆轉(zhuǎn)錄病毒的最初分離物的序列被闡明并公布可參考Wain-Hobson等人(Cell，January 1985，40，第9-17頁)；Ratner等人(Nature，24 January 1985，313，第277-284頁)和Sanchez-Pescador等人(Science 1 February 1985，227，第484-492頁)的文章。LAV、HTLV-III和ARV/ARV-2病毒從那以后一直被識(shí)別為是相同AIDS病毒的變體，現(xiàn)在已知被稱為HIV-1(對(duì)于人免疫缺陷病毒)(Ratner等人，Nature，第313卷，21 February 1985，第636-637頁)。
1984-1985年開始了由HIV-1 M引起的感染的最初體外診斷測(cè)定法，其通過免疫檢測(cè)法進(jìn)行，且旨在檢測(cè)人生物樣品例如血清或血漿中抗-HIV-1 M抗體的存在。用于檢測(cè)抗HIV-1 M抗體的那些最初免疫測(cè)定法利用病毒裂解產(chǎn)物作為靶抗原用于捕獲所研究的抗體(這即所謂的第一代免疫測(cè)定法)。由于它們所使用的抗原制劑純度不夠，有時(shí)給出假陰性結(jié)果和/或假陽性結(jié)果，因而隨后求助于基因工程以便生產(chǎn)出更好控制且更均質(zhì)的抗原，所述抗原被證明更靈敏且更特異。可以提及的是，例如，幾個(gè)團(tuán)隊(duì)關(guān)于各種不同形式的HIV-1 M包膜跨膜糖蛋白(gp41)抗原所進(jìn)行的工作以及使用它們的免疫測(cè)定法，他們的工作被記錄在Chang等人(Science，228，5 April 1985，第93-96頁)；Crowl等人(Cell，41，July 1985，第979-986頁)；Chang等人(BioTechnology，3，October 1985，第905-909頁)；Cabradilla等人(BioTechnology，4，F(xiàn)ebruary，1986，第128-133頁)等的文章中。從而，基于重組抗原的那些免疫測(cè)定法構(gòu)成了第二代免疫測(cè)定法。盡管它們帶來了巨大的進(jìn)步，但那些新的免疫測(cè)定法仍不能檢測(cè)所有感染了HIV-1 M的受試者的血清。
為尋求更大的靈敏性和特異性，一些團(tuán)隊(duì)轉(zhuǎn)向短的(通常少于50個(gè)氨基酸)合成肽，所述短的合成肽更易于制備和控制，并可用作用于檢測(cè)抗-HIV-1 M抗體的靶抗原。就是這樣，Wang等人(PNAS，第83卷，第6259-6163頁，August 1986)描述了利用序列為RILAVERYLKDQQLLGIWGC603S(SEQ ID NO.8)的HIV-1 M gp41的肽作為抗體的捕獲抗原。
同樣地，以Genetic Systems Corporation的名義的專利申請(qǐng)WO86/06414描述了一系列短的肽，其中的一些來源于HIV-1 MBRU的gp41，例如肽(X)(39)，其相應(yīng)于非常類似的序列RILAVERYLKDQQLLGIWGC603SGKLIC609(SEQ ID NO.9)。
專利US 4,879,212(Wang等人)描述了稍微更長(zhǎng)(35個(gè)氨基酸)的HIV-1 M gp41的肽，其序列為RILAVERYLKDQQLLGIWGC603SGKLIC609TTAVPWNAS(SEQ ID NO.10)。
Wang等人的肽和專利申請(qǐng)WO86/06414的肽賦予新的基于肽的免疫測(cè)定法極大的靈敏性和極大的特異性，該基于肽的免疫測(cè)定法即所謂的第三代免疫測(cè)定法。許多作者沿著短肽這一途徑以開發(fā)出新的試劑，并由此開發(fā)出大量商業(yè)性的包含它們的抗-HIV抗體檢測(cè)試劑盒。
在位于La Jolla，California的Scripps診所中，John W.Gnann的團(tuán)隊(duì)甚至在上述肽(X)(39)中已鑒定出一種在診斷方面非常重要的表位，因?yàn)樵摫砦徊粌H具有非常高的免疫反應(yīng)性而且對(duì)HIV-1 M非常特異它是HIV-1 M gp41的優(yōu)勢(shì)免疫表位，其序列為WGC603SGKLIC609(Gnann等人，Journal of Virology，August 1987，第2639-2641頁；Gnann等人，Science，第237卷，11 September 1987，第1346-1349頁)。Gnann等人提出了這樣的觀點(diǎn)，即，在這個(gè)優(yōu)勢(shì)免疫表位中，兩個(gè)半胱氨酸C603和C609之間二硫橋的形成可能在該表位的抗原構(gòu)象中起關(guān)鍵作用，從而潛在地促進(jìn)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的生成。
之后不久，以Ferring AB的名義的專利申請(qǐng)WO89/03844和以IAFBiochem International的名義的EP 0 326 490 A2描述了以通過兩個(gè)半胱氨酸C603和C609之間的二硫橋而自動(dòng)環(huán)化的形式存在的、攜帶“Gnann等人的表位”的HIV-1 M gp41的肽，它可以一般的、簡(jiǎn)化的和象征化的方式由下列任意的式來表示
(R1-SEQ ID NO.11-R2)。他們證實(shí)了Gnann等人的具有首創(chuàng)性的直覺。
申請(qǐng)EP 0 326 490 A2尤其描述了專利US 4,879,212(Wang等人)的HIV-1 M gp41的35聚體肽，但其為環(huán)化形式并具有下列序列(I) (SEQ ID NO.7)然而，由此類如此環(huán)化的肽所提供的改進(jìn)仍受到爭(zhēng)議，因?yàn)檫@些后面的肽不允許足夠早期地檢測(cè)某些HIV-1 M血清轉(zhuǎn)變樣品。就是這樣，特別地，上述序列(I)的環(huán)狀肽在靈敏性方面的表現(xiàn)仍不令人滿意，因?yàn)檫@種肽不允許檢測(cè)所有在抗HIV-1 M抗體方面陽性的血清轉(zhuǎn)變樣品，并且此外它存在合成產(chǎn)率和溶解性方面的問題。
簡(jiǎn)言之，無論使用哪種gp41的肽作為用于檢測(cè)抗HIV-1 M血清轉(zhuǎn)變的靶抗原，仍有一些弱陽性樣品無法由第三代免疫測(cè)定法檢測(cè)。因此，在本研究領(lǐng)域中需要改進(jìn)的可溶性試劑，它可用于檢測(cè)在抗HIV-1M抗體方面陽性的樣品。尤其需要具有改進(jìn)的靈敏性的試劑，它允許更加早期地檢測(cè)出血清轉(zhuǎn)變。在輸血的情況下，事實(shí)上盡可能早地檢測(cè)出任何感染了HIV-1 M的樣品是至關(guān)緊要的。在檢測(cè)時(shí)間方面即使僅僅贏得一周的時(shí)間也是非常重要的，以便例如避免將病毒傳輸給接受輸血的受試者。
本發(fā)明的作者從尋求制造序列(I)的環(huán)狀肽的近似肽開始著手，但是為更容易地制造，也就是說具有更佳的產(chǎn)率。在各種可能的方法中，一種是簡(jiǎn)單地減少肽的大小，另一種是更換可能致使合成產(chǎn)率降低的氨基酸殘基(溶解性、偶聯(lián)、二次反應(yīng)等問題)。另一種可能的方法是用親水性氨基酸來延長(zhǎng)肽，以便嘗試使其溶解性更大，等等。
本發(fā)明人用不同的殘基替代第615位的色氨酸殘基，以獲得下列序列(II)的線性肽(沒有在兩個(gè)半胱氨酸殘基之間環(huán)化)
RILAVERYLKDQQLLGIWGC603SGKLIC609TTAVPX615Naa1aa2(II)(SEQ ID NO.6)其中X表示選自F和G的氨基酸，和兩個(gè)氨基酸aa1和aa2不存在或表示aa1丙氨酸aa2絲氨酸。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，字母F和G指氨基酸苯丙氨酸(F)和甘氨酸(G)。
通過直接氧化序列(II)的肽中的兩個(gè)半胱氨酸，本發(fā)明人隨后制備了相應(yīng)于下式(III)的環(huán)化肽 (SEQ ID NO.5)其中X表示選自F和G的氨基酸，和兩個(gè)氨基酸aa1和aa2不存在或表示aa1丙氨酸aa2絲氨酸。
特別地，他們已經(jīng)合成了下列環(huán)化肽，分別標(biāo)示為SEQ ID NO.1、NO.
2、NO.3和NO.4SEQ ID NO.1RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NA617S618SEQ ID NO.2RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NSEQ ID NO.3RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NSEQ ID NO.4RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NA617S618。
以令人驚訝且完全出乎意料的方式，鑒于一方面對(duì)于某些肽縮短了具有35個(gè)氨基酸的最初的長(zhǎng)序列，存在因而丟失功能性表位的風(fēng)險(xiǎn)，并且另一方面生成了在天然病毒株中不存在的部分人造的序列，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過如此修飾現(xiàn)有技術(shù)的式(I)的環(huán)狀肽，所述式(I)的環(huán)狀肽不能檢測(cè)所有在抗HIV-1 M抗體方面陽性的血清轉(zhuǎn)變樣品，得到了新型肽——能夠檢測(cè)所有那些樣品的序列(III)的肽。
因此，本發(fā)明涉及序列(III)的HIV-1病毒gp41的環(huán)狀肽 (SEQ ID NO.5)其中X表示選自F和G的氨基酸，和兩個(gè)氨基酸aa1和aa2不存在或表示aa1丙氨酸aa2絲氨酸。
本發(fā)明還涉及組合物，特別是包含序列(III)的肽的抗原組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及選自下列肽的序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽SEQ ID NO.1RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NA617S618SEQ ID NO.2RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NSEQ ID NO.3RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NSEQ ID NO.4RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NA617S618。
本發(fā)明還涉及組合物，特別是包含序列(III)的肽的抗原組合物，所述序列(III)的肽選自上面顯示的SEQ ID NO.1-4這些肽。
本發(fā)明的范圍內(nèi)，“組合物”被理解為多個(gè)分子組分的任何液體或固體聯(lián)合體。某些組合物或混合物由包含一種或多種目的化學(xué)組分的水溶液、液體或固體構(gòu)成。這樣的水溶液可由pH一般接近中性(優(yōu)選pH 5-pH 9)的緩沖液構(gòu)成，所述緩沖液優(yōu)選與一種或多種用于所需目的的蛋白質(zhì)(protides)(即蛋白質(zhì)、多肽、寡肽和/或氨基酸)相聯(lián)合。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的緩沖液中，可以提及(但并不意味著任何限制)，磷酸鹽、碳酸鹽、Tris、硼酸鹽緩沖液等。在可用于緩沖液中的蛋白質(zhì)之中，可以特別提及，牛血清白蛋白(BSA)等。通常將防腐劑例如疊氮化鈉以及任選的去污劑加入這樣的組合物中。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，“抗原組合物”被理解為包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的(序列(III)的)肽的上文提及的任何組合物，所述肽為基本上保留其原始抗原反應(yīng)性(即，被抗HIV抗體識(shí)別的能力)的形式。此類抗原組合物還可整合入HIV-2的抗原和/或HIV-1 O的抗原，所述抗原保留了免疫反應(yīng)性。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的任何形式的免疫測(cè)定方案(參見，特別是，下文“發(fā)明詳述”部分的第4節(jié))，此類抗原組合物可以用于體外診斷人生物學(xué)流體樣品中的HIV感染，特別地但不是唯一地，用于檢測(cè)抗HIV抗體。
此類抗原組合物可以液體或干燥形式整合到用于體外診斷HIV感染的試劑盒中，特別是整合到用于檢測(cè)抗HIV抗體的試劑盒中。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的方法，此類抗原組合物可以固定在固相上，或整合到檢測(cè)抗原中，例如經(jīng)標(biāo)記的抗原，特別是用酶標(biāo)記的抗原，等等。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制備序列(III)的肽，特別是選自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4這些肽的肽的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制備組合物的方法，所述組合物包含序列(III)的肽，特別是選自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4這些肽的肽。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于檢測(cè)生物樣品中抗HIV抗體的方法，其包括a)使生物樣品與序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽，特別是選自肽SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4這些肽的肽，和/或包含這樣的肽的組合物接觸；或者與序列(III)的肽的組合接觸；b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下孵育所述混合物；和c)通過檢測(cè)手段揭示和檢測(cè)形成的抗原-抗體復(fù)合物，所述檢測(cè)手段任選由HIV-1抗原構(gòu)成，必要時(shí)它可以包含能夠結(jié)合被捕獲的抗HIV-1抗體的、經(jīng)標(biāo)記的、根據(jù)本發(fā)明的序列(III)的肽。
本發(fā)明還涉及前述抗HIV抗體的檢測(cè)方法，其中步驟a)包括使生物樣品與混合物接觸，所述混合物由至少一種根據(jù)本發(fā)明的序列(III)的gp41的肽和HIV-2的抗原和/或HIV-10的抗原構(gòu)成。
本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)生物樣品中抗HIV抗體的試劑盒，所述試劑盒包括序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽，特別是選自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4這些肽的肽，或者包含這樣的肽的組合物，任選與HIV-2的抗原和/或HIV-1 O的抗原相組合。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及至少一種序列(III)的HIV病毒gp41的肽，特別是選自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4這些肽的肽，任選與HIV-2的抗原和/或HIV-1 O的抗原相組合，用于檢測(cè)抗HIV病毒抗體的用途。
發(fā)明詳述1.生物樣品在本發(fā)明范圍內(nèi)，表述“生物樣品”被理解為人的任何體液的樣品，例如血液、血清、血漿、唾液、淚液、精液、腦脊液以及可能包含抗HIV抗體的任何其他體液。
2.根據(jù)本發(fā)明的肽的制備根據(jù)本發(fā)明的序列(III)的肽優(yōu)選通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)制備，因?yàn)檫@更實(shí)際，但不是唯一的。作為實(shí)例，可以提及Merrifield型合成(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，第2149-2154頁，1963)。還可以使用“Fmoc”(9-芴基甲氧基羰基)型合成，因?yàn)榧兌?、抗原特異性、沒有不希望的次生產(chǎn)物以及易于實(shí)施，所以它是有利的。
肽合成可通過合成儀而自動(dòng)進(jìn)行，例如Perspective的“Pioneer”合成儀、ABI(Applied Biosystems Inc.)的“433A”合成儀、或Rainin的“Symphony”合成儀那樣的類型。
依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的技術(shù)，肽同樣可通過均相合成而獲得。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的各種方法，特別是根據(jù)專利申請(qǐng)WO89/03844(使用碘的甲醇溶液的化學(xué)氧化步驟)和EP 0 326 490 A2(鐵氰化鉀法)所描述的方法之一，可以進(jìn)行線性肽的環(huán)化以獲得根據(jù)本發(fā)明的式(III)的環(huán)化肽。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知的方法，在蛋白質(zhì)、多肽、寡肽或氨基酸和用于構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的抗原組合物的其他化學(xué)化合物存在下，根據(jù)本發(fā)明的肽可以任選地整合到緩沖液中。
3.可以在根據(jù)本發(fā)明的用于檢測(cè)抗HIV抗體的方法以及抗HIV抗體的檢測(cè)試劑盒中使用的其他HIV抗原作為HIV-2的抗原，可以使用各種抗原，優(yōu)選HIV-2的gp140或跨膜糖蛋白gp36，更優(yōu)選至少包含Gnann等人的(gp36的)優(yōu)勢(shì)免疫表位，即至少包含WGCAFRQVC這些氨基酸的肽(例如，參見Gnann等人的文章，Science，第237卷，11 September 1987，第1346-1349頁；Guyader等人的文章，Nature 16 April 1987，326，第662-669頁，它描述了HIV-2ROD的完整序列，或?qū)＠鸈P 0 239 425中給出的env序列)，更加優(yōu)選至少包含WGCAFRQVC這些氨基酸的肽，其形式為通過這兩個(gè)半胱氨酸之間的二硫橋而環(huán)化。
作為HIV-1 O的抗原，可以使用各種抗原，優(yōu)選HIV-1 O的gp160或gp41。更優(yōu)選地，可以使用包含Gnann等人的(gp41)優(yōu)勢(shì)免疫表位的肽，其例如至少包含WGCKGKLIC這些氨基酸(這些氨基酸是MVP5180/91的氨基酸，描述于專利申請(qǐng)EP 0 591 914的env序列中，或以登錄號(hào)L20571可從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得的序列中，參見Gürtler等人，Journal of Virology，March 1994，第68卷，No.3，第1581-1585頁)。更加優(yōu)選地，可以使用至少包含WGCKGKLIC這些氨基酸的肽，其形式為通過這兩個(gè)半胱氨酸之間的二硫橋而環(huán)化。
可替代地，作為HIV-1 O的抗原，可以使用例如WGCKGKLVC這些氨基酸(這些氨基酸是以登錄號(hào)L20587可從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得的序列HIV-3/ANT70的氨基酸，參見Gürtler等人，Journal ofVirology，March 1994，第68卷，No.3，第1581-1585頁)。更加優(yōu)選地，可以利用至少包含WGCKGKLVC這些氨基酸的肽，其形式為通過這兩個(gè)半胱氨酸之間的二硫橋而環(huán)化。
4.根據(jù)本發(fā)明的抗HIV抗體的檢測(cè)方法的實(shí)施方案關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的抗HIV抗體的檢測(cè)方法的可能實(shí)施方案，可以有利地參考，例如，James P.Gosling的綜述“A Decade of DevelopmentIn Immunoassay Methodology”，Clinical Chemistry，36/8，第1408-1427頁，(1990)，文中提到了免疫測(cè)定中可用且已知的大量技術(shù)和變化形式。
用于檢測(cè)生物樣品中的抗HIV抗體的方法可以通過任何免疫測(cè)定法來進(jìn)行，在廣義上，即牽涉至少一種根據(jù)本發(fā)明的肽和至少一種抗-HIV抗體之間形成免疫復(fù)合物的免疫測(cè)定法。免疫學(xué)測(cè)定的方法或免疫測(cè)定法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且根據(jù)所選的標(biāo)記物或經(jīng)標(biāo)記的試劑可以是EIA(酶免疫測(cè)定法)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)、RIA(放射免疫測(cè)定法)、FIA(熒光免疫測(cè)定法)類型，等等。
術(shù)語“經(jīng)標(biāo)記的”不僅指直接標(biāo)記(通過酶、放射性同位素、熒光染料、發(fā)光化合物等)，也指間接標(biāo)記(例如，通過自身經(jīng)直接標(biāo)記的抗體，或借助于經(jīng)標(biāo)記的“親和力對(duì)”的試劑，例如，但不是唯一的，經(jīng)標(biāo)記的抗生物素蛋白-生物素對(duì)，等等)。根據(jù)本發(fā)明的抗HIV抗體的檢測(cè)方法的檢測(cè)手段可以例如但不是唯一地由下列構(gòu)成經(jīng)標(biāo)記的HIV抗原，經(jīng)標(biāo)記的人抗免疫球蛋白抗體，或以經(jīng)標(biāo)記的形式的對(duì)于免疫球蛋白具有親和力的任何其他分子，如A蛋白或G蛋白，等等。作為標(biāo)記物，可以提及酶、放射性同位素、熒光染料、發(fā)光化合物等，它們通過本身已知的方法而與所述根據(jù)本發(fā)明的肽、或所述抗免疫球蛋白抗體、或被選作檢測(cè)手段的任何其他分子(如A蛋白或G蛋白)偶聯(lián)。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，根據(jù)本身已知的方案，例如Nakane和Kawaoki的技術(shù)(J.Histochem.Cytochem.22，第1984頁(1974))，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他偶聯(lián)技術(shù)，可借助于辣根過氧化物酶對(duì)肽進(jìn)行標(biāo)記。可以使用其他酶，例如堿性磷酸酶等。
根據(jù)本發(fā)明的抗HIV抗體的檢測(cè)方法可以以固相(非均相測(cè)定法)或以液相(均相測(cè)定法)進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的對(duì)于抗HIV抗體的檢測(cè)可涵蓋本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種不同的方案競(jìng)爭(zhēng)類型的方案，間接類型的方案，或者常規(guī)的抗原-抗體-抗原夾心類型的方案，也稱為“雙抗原夾心”法(Maiolini等人，Journal of Immunological Methods，20(1978)25-34)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的非均相實(shí)施方案，在間接類型的方案中或者在“雙抗原夾心”法中，相應(yīng)于gp160、gp41或本發(fā)明的肽的HIV-1M包膜抗原固定在固相上，其與HIV-2的抗原和/或HIV-1 O的抗原相組合或不相組合地用作抗體的捕獲抗原。作為固相的非限制性實(shí)例，可以使用微量培養(yǎng)板，特別是聚苯乙烯微量培養(yǎng)板，例如由Nunc公司(Denmark)銷售的那些。也可使用固體顆?；蛑?，順磁珠，例如由Dynal或Merck-Eurolab(France)(商標(biāo)為EstaporTM)供給的那些，或者聚苯乙烯或聚丙烯試管，硝化纖維素細(xì)帶。等等。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在“雙抗原夾心”法(Maiolini等人，1978)的范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的肽以經(jīng)標(biāo)記的形式用作檢測(cè)手段，即，用作用于揭示在固相上形成并固定的復(fù)合物的抗原。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，在間接類型的方案的范圍內(nèi)，人抗免疫球蛋白抗體，或所述抗體的免疫反應(yīng)性片段(Fab、Fab′等)可以以經(jīng)標(biāo)記的形式用作檢測(cè)手段，即，用作用于揭示在固相上形成并固定的復(fù)合物的抗原。
5.抗HIV抗體的檢測(cè)試劑盒可以提供可用于根據(jù)本發(fā)明的方法來檢測(cè)生物樣品中的抗HIV抗體的試劑盒和試劑，從而以簡(jiǎn)單的并適用于大量生物樣品的方式來實(shí)施本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)生物樣品中抗HIV抗體的試劑盒，其包含-至少一種捕獲和/或檢測(cè)抗原，所述抗原是可以由根據(jù)本發(fā)明的序列(III)的肽構(gòu)成的肽，或包含這樣的肽的抗原組合物；-至少一種用于檢測(cè)形成的抗原-抗體復(fù)合物的手段。
有利地，該試劑盒可以包含多種捕獲和/或檢測(cè)抗原。
如上所述，捕獲抗原可以有利地以固定在固相例如微量培養(yǎng)板上的形式存在。
優(yōu)選的用于檢測(cè)生物樣品中抗HIV抗體的試劑盒包含a)捕獲抗原，其是根據(jù)本發(fā)明的序列(III)的肽，或包含這樣的肽的抗原組合物，所述捕獲抗原固定在微量培養(yǎng)板上；b)用酶標(biāo)記的檢測(cè)抗原。
另一種優(yōu)選的用于檢測(cè)生物樣品中抗HIV抗體的試劑盒包含a)捕獲抗原，所述捕獲抗原固定在微量培養(yǎng)板上；b)用酶標(biāo)記的檢測(cè)抗原，其是根據(jù)本發(fā)明的序列(III)的肽，或包含這樣的肽的組合物。
另一種優(yōu)選的用于檢測(cè)生物樣品中抗HIV抗體的試劑盒包含a)捕獲抗原，其是根據(jù)本發(fā)明的序列(III)的肽，所述捕獲抗原固定在微量培養(yǎng)板上；b)經(jīng)標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體，特別是用酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體。
下列實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明，而并不限制其范圍。
實(shí)施例1肽的合成下列合成通過采用“Fmoc”(9-芴基甲氧基羰基)化學(xué)在Pioneer合成儀上進(jìn)行在每個(gè)步驟中，加入過量的(“試劑的摩爾數(shù)/樹脂上的可替代基團(tuán)的摩爾數(shù)”比＝5)試劑(即被保護(hù)的氨基酸和偶聯(lián)活化劑(TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽)/HOBt(N-羥基苯并三唑))。在合成結(jié)束時(shí)，通過基于三氟乙酸的溶液(試劑K)從樹脂上分離出肽。然后，肽在冷的醚溶液中沉淀，隨后通過HPLC純化。
在每個(gè)合成的線性肽上進(jìn)行化學(xué)氧化步驟，其允許肽在兩個(gè)半胱氨酸的區(qū)域內(nèi)被環(huán)化。
如此，本發(fā)明人已實(shí)現(xiàn)了下列環(huán)化肽的合成RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPW615NA617S618(SEQ ID NO.10)。
合成了序列SEQ ID NO.10的肽并用于下文所述實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)椋罁?jù)本發(fā)明人，該肽表示最接近的現(xiàn)有技術(shù)的肽。因此，它被用于下文所舉例說明的比較中。
SEQ ID NO.1RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NA617S618SEQ ID NO.2RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NSEQ ID NO.3RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615N
SEQ ID NO.4RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NA617S618。
根據(jù)眾所周知的Nakane和Kawaoi(J.Histochem.Cytochem.22，第1984頁(1974))的方法，這些肽中的每一個(gè)都綴合了辣根過氧化物酶(經(jīng)標(biāo)記的綴合物)。
實(shí)施例2所用的血清樣品用于檢測(cè)抗-HIV抗體的血清為-由Boston Biomedica Inc.(7組；17份樣品)、Nabi(5組；14份樣品)和Impath Bioclinical Partners(4組BCP；10份樣品)提供的血清轉(zhuǎn)變組的樣品；-來自Bio-Rad，Marnes la Coquette，92430，F(xiàn)rance的內(nèi)部組的在抗HIV-1抗體方面陽性的4份血清樣品(C4、C5、C9和C10)；-另外測(cè)試了來自正常供體和來自陰性受試者的13份血清以確定測(cè)定法的閾值。
實(shí)施例3使用過氧化物酶-HIV 1肽這種綴合物的免疫酶測(cè)定法在下文的實(shí)施例中，針對(duì)HIV病毒的抗體的檢測(cè)基于“雙抗原夾心”類型的免疫酶技術(shù)的原則。該測(cè)試依靠，一方面使用用純化的抗原(其中包括HIV-1 M病毒的包膜糖蛋白(gp160))敏化的微量培養(yǎng)板(固相)，另一方面使用由用過氧化物酶標(biāo)記的本發(fā)明肽構(gòu)成的綴合物，所述綴合物將待檢測(cè)的抗HIV抗體捕捉入夾心中。
所采用的測(cè)定方案如下將100μl的稀釋至3/4的每份測(cè)試血清樣品分配于敏化的微量培養(yǎng)板的孔中，并使混合物均勻化?；旌衔镌谡承阅は掠?7℃孵育60分鐘后，隨后用Tris NaCl緩沖液洗滌微量培養(yǎng)板，向每個(gè)孔中添加100μl經(jīng)標(biāo)記的綴合物(用過氧化物酶標(biāo)記的根據(jù)本發(fā)明的HIV-1肽)。混合物在粘性膜下于18-30℃孵育30分鐘。
用上述Tris NaCl緩沖液洗去仍然游離的綴合物級(jí)分后，揭示出固定在復(fù)合物上的酶的存在。為此，向每個(gè)孔中加入80μl揭示液(包含在檸檬酸和乙酸鈉的溶液中的底物H2O2，以及生色化合物四甲基聯(lián)苯胺或TMB)。將該新混合物在黑暗中于18-30℃孵育30分鐘后，通過加入100μl 1N硫酸來終止顯色。在分光光度計(jì)上于450/620nm處讀取光密度。
通過比較所記錄的每個(gè)測(cè)試樣品的光密度(“OD”)與計(jì)算出的閾值的光密度(閾值＝陰性樣品的OD的平均值+0.100OD單位)來確定抗-HIV抗體存在與否。
如果得到的OD大于閾值的OD，樣品就被認(rèn)為是陽性的(抗-HIV抗體的攜帶者)，如果OD小于閾值的OD，則被認(rèn)為是陰性的。
表I顯示了借助于在相同條件下制備的5種綴合物(上文合成的每種肽與過氧化物酶偶聯(lián))而獲得的比較結(jié)果。所制得的各種不同的綴合物描述如下-綴合物A與過氧化物酶偶聯(lián)的序列SEQ ID NO.10的肽-綴合物B與過氧化物酶偶聯(lián)的SEQ ID NO.1的肽-綴合物C與過氧化物酶偶聯(lián)的SEQ ID NO.2的肽-綴合物D與過氧化物酶偶聯(lián)的SEQ ID NO.3的肽-綴合物E與過氧化物酶偶聯(lián)的SEQ ID NO.4的肽。
在下表I中，給出的結(jié)果是在根據(jù)上述方案并使用所描述的綴合物A、B、C、D和E進(jìn)行免疫酶測(cè)定法后而讀取的OD值。
表I-以光密度單位表示的結(jié)果
表I-續(xù)及結(jié)束
對(duì)于受測(cè)試的陽性樣品，并以幾乎相同的閾值，用根據(jù)本發(fā)明的肽獲得的綴合物B、C、D和E所給出的OD值明顯高于用現(xiàn)有技術(shù)的35聚體肽(序列SEQ ID NO.10的肽)的綴合物A獲得的OD值。
在下表II中，同樣的結(jié)果以樣品OD/閾值(OD/CO)的比表示。
表II-以光密度/閾值的比表示的結(jié)果
表II-續(xù)
表II-續(xù)及結(jié)束
以幾乎相同的閾值，對(duì)于受測(cè)試的樣品，用根據(jù)本發(fā)明的肽獲得的綴合物B、C、D和E所給出的OD/CO比明顯高于用現(xiàn)有技術(shù)的35聚體肽(序列SEQ ID NO.10的肽)的綴合物A所得的OD/CO比。同樣地，某些在用現(xiàn)有技術(shù)的肽的綴合物A時(shí)為陰性的樣品，在使用根據(jù)本發(fā)明的肽時(shí)被發(fā)現(xiàn)呈陽性。
以O(shè)D/CO比表示的結(jié)果的表(表III)顯示了作為所得到的OD/CO比的函數(shù)的樣品分布
表III
表III清楚地顯示，使用根據(jù)本發(fā)明的肽比使用現(xiàn)有技術(shù)的序列SEQ ID NO.10的肽(綴合物A)能更好地檢測(cè)出受測(cè)試的陽性血清，因?yàn)榻o出的OD/CO比大于1的樣品數(shù)目明顯更多。
如表I、II和III所總體顯示的，根據(jù)本發(fā)明的肽(序列(III)的綴合物B、C、D和E)使得能夠比現(xiàn)有技術(shù)的序列SEQ ID NO.10的肽(綴合物A)明顯更早地檢測(cè)出血清轉(zhuǎn)變。
在下表IV中，綴合物B、C、D和E的免疫反應(yīng)性以作為參考的綴合物A的免疫反應(yīng)性的百分比給出。
表IV-以相對(duì)于綴合物A的免疫反應(yīng)性的百分比表示的結(jié)果
表IV-續(xù)
表IV-續(xù)
表IV-續(xù)及結(jié)束
表IV清楚地顯示了，根據(jù)發(fā)明的肽(序列(III)的綴合物B、C、D和E)所呈現(xiàn)的免疫反應(yīng)性通常明顯大于現(xiàn)有技術(shù)的序列SEQ ID NO.10的肽的免疫反應(yīng)性，并因此通常具有更高的檢測(cè)靈敏性。
總之，上述所有結(jié)果顯示，以明顯優(yōu)于通過現(xiàn)有技術(shù)的肽(序列SEQ ID NO.10的綴合物A)這種最接近的肽而獲得的檢測(cè)結(jié)果的方式，通過根據(jù)本發(fā)明的肽(序列(III)的綴合物B、C、D和E)檢測(cè)出受測(cè)試的抗HIV-1抗體陽性的血清。此外，根據(jù)本發(fā)明的肽(序列(III)的綴合物B、C、D和E)允許更加早地檢測(cè)出血清轉(zhuǎn)變。
因此，本發(fā)明通過根據(jù)本發(fā)明的肽很好地解答了所提出的問題。
序列表<110>Bio-Rad Pasteur<120>經(jīng)修飾的HIV-1肽及其在檢測(cè)抗-HIV抗體中的用途<130>BET 05P0796<150>FR 0408733<151>2004-08-06<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<400>1Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Phe20 25 30Asn Ala Ser35<210>2<211>33<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<400>2Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Phe20 25 30
Asn<210>3<211>33<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<400>3Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Gly20 25 30Asn<210>4<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<400>4Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Gly20 25 30Asn Ala Ser35<210>5<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa＝Phe或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(35)<223>Xaa Xaa＝不存在或Ala Ser<400>5Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Xaa20 25 30Asn Xaa Xaa35<210>6<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>Xaa＝Phe或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(35)<223>Xaa Xaa＝不存在或Ala Ser<400>6Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Xaa20 25 30Asn Xaa Xaa35
<210>7<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220>
<221>DISULFID<222>(20)..(26)<223>
<400>7Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp20 25 30Asn Ala Ser35<210>8<211>21<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>8Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser20<210>9<211>26<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>9Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys20 25<210>10<211>35<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型
<400>10Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 5 10 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp20 25 30Asn Ala Ser35<210>11<211>7<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>11Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys1 權(quán)利要求
1.序列(III)的HIV-1病毒gp41的環(huán)狀肽 其中X表示選自F和G的氨基酸，和兩個(gè)氨基酸aa1和aa2不存在或表示aa1丙氨酸aa2絲氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其選自下列肽SEQ ID NO.1RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NA617S618SEQ ID NO.2RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPF615NSEQ ID NO.3RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NSEQ ID NO.4RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPG615NA617S618。
3.抗原組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的肽。
4.用于制備權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所限定的序列(III)的肽的方法，所述方法包括所述肽的化學(xué)合成。
5.用于體外檢測(cè)生物樣品中的抗-HIV-1抗體的方法，其包括下列步驟a)使生物樣品與至少一種權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所限定的序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽，和/或根據(jù)權(quán)利要求3的組合物接觸；b)在允許序列(III)的肽和生物樣品中存在的抗-HIV-1抗體之間形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下孵育所述混合物；和c)揭示和檢測(cè)形成的抗原-抗體復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的檢測(cè)方法，其中，步驟a)包括使生物樣品與抗原組合物接觸，所述抗原組合物由至少一種序列(III)的gp41的肽和HIV-2的抗原和/或HIV-1 O的抗原構(gòu)成。
7.用于檢測(cè)生物樣品中的抗-HIV抗體的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所限定的序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽，或根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，任選與HIV-2的抗原和/或HIV-1 O抗原相組合。
8.用于檢測(cè)生物樣品中的抗-HIV抗體的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所限定的序列(III)的HIV-1病毒gp41的肽，或根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其任選與HIV-2的抗原和/或HIV-1 O抗原相組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及序列(III)的合成肽，其來源于HIV－1病毒的gp41，并可以在用于檢測(cè)由HIV－1病毒引起的感染的免疫測(cè)定法中使用。本發(fā)明還涉及所述肽的制備方法，包含所述肽的組合物和試劑盒，所述肽用于診斷目的的用途，以及使用所述肽來檢測(cè)抗－HIV病毒抗體的免疫測(cè)定法。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101035804SQ200580034237
公開日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月6日
發(fā)明者S·加代勒, F·里厄尼耶 申請(qǐng)人:比奧-拉德巴斯德公司