專利名稱：對(duì)干擾素治療腎細(xì)胞癌反應(yīng)的鑒定標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用人基因多態(tài)性作為指示物(標(biāo)記)，評(píng)估使用干擾素對(duì)腎細(xì)胞癌的腫瘤抑制效果的方法，在這種方法中使用的寡核苷酸，以及這種基因多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
腎細(xì)胞癌是對(duì)目前實(shí)施的任何治療，例如，使用化學(xué)治療藥物、免疫治療藥物等的藥物治療、放射治療、外科手術(shù)和/或類似方法的反應(yīng)率都較低的難治性疾病。此外，據(jù)報(bào)道，到診斷出患有腎細(xì)胞癌時(shí)已經(jīng)發(fā)展為遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移的病例高達(dá)大約30％。除外科手術(shù)外，上述藥物治療中使用干擾素(IFNs)的免疫治療被認(rèn)為特別有效；但是，單獨(dú)施用IFN-α?xí)r，通過(guò)這種治療獲得的反應(yīng)率低到只有大約15％，單獨(dú)施用IFN-γ時(shí)，反應(yīng)率只達(dá)到10-15％。即使與抗癌劑組合使用，也沒(méi)有獲得產(chǎn)生的效果比IFN-α單一療法更高的其他治療方法。目前實(shí)施的使用IFN的免疫療法主要是單獨(dú)使用IFN-α或聯(lián)合使用IFN-γ的長(zhǎng)期維持治療。
與此同時(shí)，基因組科學(xué)的發(fā)展正在快速闡明與藥物反應(yīng)性有關(guān)的藥物動(dòng)力學(xué)、酶和蛋白質(zhì)的基因多態(tài)性等等。在人基因組分析中，因?yàn)樽罱?jīng)常發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性標(biāo)記，因此單核苷酸多態(tài)性(SNPs)已經(jīng)引起大家注意。已知這種SNPs可用于分析與常見疾病、藥物反應(yīng)等等相關(guān)的人基因組(參見非專利文件1、2和3)。也已經(jīng)已知利用多種SNPs的單倍體分析可用于分析對(duì)疾病的易感性(參見非專利文獻(xiàn)4)。
近來(lái)，為了建立所謂的個(gè)體病人定制醫(yī)學(xué)，已經(jīng)提議研究揭示給定的基因多態(tài)性和病人的藥物敏感性/藥物反應(yīng)性之間的關(guān)系。
預(yù)測(cè)IFN治療效果的已知方法是分析HCV(人丙型肝炎病毒(人HCV))感染病人的基因組上的MxA-8/MxA123 MBL-221/MBL-CLD密碼子54 SNPs與IFN-α應(yīng)答者(對(duì)該治療反應(yīng)性的病人)和非應(yīng)答者(對(duì)該治療沒(méi)反應(yīng)性的病人)之間的關(guān)系，從而預(yù)測(cè)和評(píng)估HCV感染的病人對(duì)IFN治療的反應(yīng)程度(專利文獻(xiàn)1)。另一個(gè)已知方法利用IFN-α受體2基因的啟動(dòng)子區(qū)域和位置134處的SNP作為基因多態(tài)性標(biāo)記來(lái)預(yù)測(cè)IFN治療反應(yīng)(專利文獻(xiàn)2)。該文件公開的靶疾病從由乙型肝炎、丙型肝炎、惡性膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、皮膚惡性黑色素瘤，類肝炎、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、毛細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞性性白血病、亞急性硬化性全腦炎、病毒性腦炎、免疫抑制病人的全身性帶狀皰疹和水痘、未分化鼻咽癌、伴隨聽力減退的內(nèi)耳病毒感染性疾病、皰疹性角膜炎、扁平濕疣、尖銳濕疣、由腺病毒和/或皰疹病毒感染引起的結(jié)膜炎、生殖器皰疹、感冒瘡、子宮頸癌、癌性胸膜積水、角化棘皮瘤、基底細(xì)胞癌和δ型慢性活動(dòng)型肝炎。
此外，評(píng)估IFN-α治療丙型肝炎的反應(yīng)的已知方法是測(cè)量IRF-1基因啟動(dòng)子區(qū)域位置196處的鳥嘌呤(G)被置換成腺嘌呤(A)(參見專利文獻(xiàn)3)。
但是迄今為止，還沒(méi)有文件具體報(bào)告IFN對(duì)腎細(xì)胞癌的治療反應(yīng)與給定SNPs之間的關(guān)系。
已經(jīng)報(bào)道IFN-α應(yīng)答者和非應(yīng)答者的幾百個(gè)基因表達(dá)圖譜(參見非專利文獻(xiàn)4和專利文獻(xiàn)4)。這些圖譜是利用如DNA芯片(高密度寡核苷酸或微陣列)、差異顯示、差異cDNA陣列、SAGE(基因表達(dá)系列分析)、表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)比較等技術(shù)產(chǎn)生的。這些方法可用來(lái)分析結(jié)腸癌、乳癌、卵巢癌、多發(fā)性硬化病變、白血病和腎細(xì)胞癌中的基因表達(dá)。此外非專利文獻(xiàn)4還包括了如IRF2、STAT1、STAT2、STAT4、STAT5、STAT6等的基因；但是，沒(méi)有公開用于本發(fā)明的具體基因的SNPs。
未審查的日本專利出版物No.2003-88382[專利文獻(xiàn)2]未審查的日本專利出版物No.2003-339380[專利文獻(xiàn)3]未審查的日本專利出版物No.2001-136973[專利文獻(xiàn)4]未審查的日本專利出版物No.2004-507253[非專利文獻(xiàn)1]Brookes，A.J.，″The essence of SNPs″，Gene，USA，(1999)，234，177-186[非專利文獻(xiàn)2]Cargill，M，等，″Characterization of single-nucleotidepolymorphisms in coding regions of human genes″，Nature Genet.，USA，(1999)，22，231-238[非專利文獻(xiàn)3]Evans，W.E.，&Relling，M.V.，″Pharmacogenomicstranslating functional genomics into rational therapeutics″，Science，USA，(1999)，286，487-491[非專利文獻(xiàn)4]Schlaak，J.F.，et.al.，″Cell-type and Donor-specificTranscriptional Responses to Interferon-α″，J.Biol.Chem.，(2002)277，51，49428-49437發(fā)明公開的內(nèi)容發(fā)明解決的問(wèn)題本發(fā)明的主要目標(biāo)是提供評(píng)估使用干擾素對(duì)腎細(xì)胞癌的治療反應(yīng)(腫瘤抑制效果)的方法。
解決問(wèn)題的方法為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人任意挑選了33個(gè)基因作為基因多態(tài)性分析的候選基因，這些基因包括IFN相關(guān)基因、據(jù)報(bào)道與IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因，以及據(jù)報(bào)道添加/施用IFN時(shí)其表達(dá)發(fā)生改變的基因。發(fā)明人利用公共的多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)搜索了這些候選基因上的SNPs，最終選擇出了463個(gè)候選SNPs。然后，利用來(lái)源于兩個(gè)病人組施用IFN-α在腎細(xì)胞癌誘導(dǎo)出腫瘤抑制效果的IFN應(yīng)答者組(對(duì)該治療起反應(yīng)的病人)和IFN非應(yīng)答者組(對(duì)該治療不起反應(yīng)的病人)的基因組DNA樣品，確定選擇的這些SNPs的頻率差異。結(jié)果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)下列8個(gè)基因上SNPs在上述兩個(gè)組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的差異。
(1)STAT3基因(轉(zhuǎn)錄的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和激活因子3STAT3(GenBank登記入冊(cè)號(hào)NT_010755))(以下簡(jiǎn)稱″STAT3基因″)、(2)SSI3基因(細(xì)胞因子信號(hào)抑制劑3SSI3(GenBank登記入冊(cè)號(hào)NT_010641))(以下簡(jiǎn)稱″SSI3基因″)、(3)IL-4R基因(白細(xì)胞介素4受體(GenBank登記入冊(cè)號(hào)NT_010393))(以下簡(jiǎn)稱″IL-4R″)、(4)IRF2基因(干擾素調(diào)節(jié)因子2IRF2(GenBank登記入冊(cè)號(hào)NT_022792))(以下簡(jiǎn)稱″IRF2基因″)、(5)ICSBP基因(干擾素共有序列結(jié)合蛋白ICSBP1(GenBank登記入冊(cè)號(hào)NT_019609)(以下簡(jiǎn)稱″ICSBP1基因″)、(6)PTGS1基因(前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶1PTGS1(GenBank登記入冊(cè)號(hào)NT_008470)(以下簡(jiǎn)稱″PTGS1基因″)、(7)PTGS2基因(前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2PTGS2(GenBank登記入冊(cè)號(hào)NT_004487)(以下簡(jiǎn)稱″PTGS2基因″)、(8)TAP2基因(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ATP結(jié)合盒，主要組織相容性復(fù)合物2TAP2(GenBank登記入冊(cè)號(hào)NT_007592)(以下簡(jiǎn)稱″TAP2基因″)本發(fā)明的發(fā)明人更進(jìn)一步地研究了上述基因上存在的SNPs與IFN治療腎細(xì)胞癌的反應(yīng)之間的關(guān)系。結(jié)果，發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)16個(gè)SNPs與施用IFN-α對(duì)腎細(xì)胞癌的腫瘤抑制效果密切相關(guān)，而且發(fā)明人也意識(shí)到這些SNPs可以作為評(píng)估IFN治療后的腫瘤抑制效果的標(biāo)記。更具體地說(shuō)，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)這些SNPs能夠預(yù)測(cè)施用的IFN對(duì)腎細(xì)胞癌的腫瘤抑制效果(治療反應(yīng))(預(yù)測(cè)性診斷)。發(fā)明人以這些發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，通過(guò)更進(jìn)一步的研究完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了如下文1-11條所描述的評(píng)估對(duì)腎細(xì)胞癌病人進(jìn)行IFN治療后的腫瘤抑制效果的方法。
條款1.一種評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制效果的方法，該方法包括下列步驟(i)到(iv)；(i)獲取來(lái)源于腎細(xì)胞癌病人的基因樣品(基因組DNA樣品)的步驟、(ii)利用在上述步驟(i)中獲得的基因樣品，制備選自STAT3基因、SSI3基因、IL-4R基因、IRF2基因、ICSBP基因、PTGS1基因、PTGS2基因和TAP2基因中的至少一個(gè)基因的基因組DNA或其互補(bǔ)鏈的步驟、(iii)分析基因組DNA或其互補(bǔ)鏈的DNA序列，并確定其基因多態(tài)性、和(iv)利用上述步驟(iii)中確定的至少一個(gè)基因多態(tài)性作為標(biāo)記，評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制效果。
條款2.一種依照條款1的評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制效果的方法，其中基因多態(tài)性是選自STAT3基因、IL-4R基因、IRF2基因和TAP2基因中的至少一個(gè)基因的多態(tài)性。
條款3.一種依照條款1的評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制效果的方法，其中基因多態(tài)性是選自下列(a)到(p)的至少一種多態(tài)性(a)在STAT3基因的位置4243095處具有基因型C/T或T/T的基因多態(tài)性(STAT3-2)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1905341表示、(b)在STAT3基因的位置4264926處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(STAT3-3)，用參考的SNP ID編號(hào)rs4796793表示、(c)在STAT3基因的位置4204027處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(STAT3-17)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2293152表示、
(d)在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(STAT3-18)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2293153表示、(e)在SSI3基因的位置10246541處具有基因型A/C的基因多態(tài)性(SSI3-1)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2280148表示、(f)在IL-4R基因的位置18686025處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IL-4R-22)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1805011表示、(g)在IRF2基因的位置17736877處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IRF2-67)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2797507表示、(h)在IRF2基因的位置17744613處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IRF2-82)，用參考的SNP ID編號(hào)rs796988表示、(i)在ICSBP基因的位置390141處具有基因型A/A或A/C的基因多態(tài)性(ICSBP-38)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2292982表示、(j)在PTGS1基因的位置26793813處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-3)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1213264表示、(k)在PTGS1基因的位置26794182處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-4)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1213265表示、(l)在PTGS1基因的位置26794619處具有基因型A/G的基因多態(tài)性(PTGS1-5)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1213266表示、(m)在PTGS2基因的位置15697329處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(PTGS2-12)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2745557表示、(n)在TAP2基因的位置23602539處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(TAP2-5)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2071466表示、(o)在IL-4R基因的位置18686068處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IL-4R-14)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2234898表示、(p)在IL-4R基因的位置18686553處具有基因型T/T的基因多態(tài)性(IL-4R-29)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1801275表示。
條款4.一種依照條款3的評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制效果的方法，其中基因多態(tài)性是條款3的(a)、(f)、(h)、(n)、(o)和(p)中的任何一種。
條款5.一種依照條款1-4中任何一項(xiàng)的評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制效果的方法，其中IFN選自IFN-α、重組IFN-α和重組IFN-γ。
條款6.一種依照條款1-5中任何一項(xiàng)的方法，其中基因多態(tài)性是通過(guò)選自直接測(cè)序、等位基因特異的寡核苷酸(ASO)-斑點(diǎn)印跡分析、單核苷酸引物延伸法、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、PCR限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析、侵入方法、定量實(shí)時(shí)PCR和使用質(zhì)譜儀的質(zhì)譜陣列中的至少一種方法確定的。
條款7.依照條款6的方法，其中通過(guò)侵入方法或直接測(cè)序確定基因多態(tài)性。
條款8.依照條款6的方法，其中通過(guò)PCR-RFLP分析確定基因多態(tài)性。
條款9.依照條款8的方法，其中利用限制性內(nèi)切酶Mspl，用PCR-RFLP分析檢測(cè)人STAT3基因內(nèi)含子4204027處的G到C突變r(jià)s2293152。
條款10.依照條款6的方法，其中利用選自下列(a)到(p)中的至少一種寡核苷酸作為基因多態(tài)性檢測(cè)探針或引物確定基因多態(tài)性(a)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3基因的位置4243095具有基因型C/T或T/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1905341表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(b)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3基因的位置4264926具有基因型C/C的由參考SNP ID編號(hào)rs4796793表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(c)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3基因的位置4204027具有基因型G/G的由參考SNP ID編號(hào)rs2293152表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(d)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541具有基因型C/T的由參考SNP ID編號(hào)rs2293153表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(e)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在SSI3基因的位置10246541具有基因型A/C的由參考SNP ID編號(hào)rs2280148表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(f)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IL-4R基因的位置18686025具有基因型A/A的由參考SNP ID編號(hào)rs1805011表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(g)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IRF2基因的位置17736877具有基因型A/A的由參考SNP ID編號(hào)rs2797507表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(h)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IRF2基因的位置17744613具有基因型C/C的由參考SNP ID編號(hào)rs796988表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(i)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在ICSBP基因的位置390141具有基因型A/A或A/C的由參考SNP ID編號(hào)rs2292982表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，
(j)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS1基因的位置26793813具有基因型C/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1213264表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(k)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS1基因的位置26794182具有基因型C/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1213265表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(l)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS1基因的位置26794619具有基因型A/G的由參考SNP ID編號(hào)rs1213266表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(m)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS2基因的位置15697329具有基因型G/G的由參考SNP ID編號(hào)rs2745557表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(n)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在TAP2基因的位置23602539具有基因型G/G的由參考SNP ID編號(hào)rs2071466表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(o)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IL-4R基因的位置18686068具有基因型C/C的由參考SNP ID編號(hào)rs2234898表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，和(p)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IL-4R基因的位置18686553具有基因型T/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1801275表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)。
條款11.依照條款6的方法，其中基因多態(tài)性檢測(cè)引物對(duì)是下列(a)到(p)中的任何一個(gè)(a)由SEQ ID Nos.1和17代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(b)由SEQ ID Nos.2和18代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(c)由SEQ ID Nos.3和19代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(d)由SEQ ID Nos.4和20代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(e)由SEQ ID Nos.5和21代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(f)由SEQ ID Nos.6和22代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(g)由SEQ ID Nos.7和23代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(h)由SEQ ID Nos.8和24代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(i)由SEQ ID Nos.9和25代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(j)由SEQ ID Nos.10和26代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(k)由SEQ ID Nos.11和27代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(l)由SEQ ID Nos.12和28代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(m)由SEQ ID Nos.13和29代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(n)由SEQ ID Nos.14和30代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(o)由SEQ ID Nos.15和31代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，以及(p)由SEQ ID Nos.16和30代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)。
發(fā)明的效果本發(fā)明提供了檢測(cè)對(duì)IFN治療腎細(xì)胞癌反應(yīng)的鑒定標(biāo)記的方法，特別是包括檢測(cè)來(lái)自腎細(xì)胞癌病人標(biāo)本的特定的人基因多態(tài)性或基因型和評(píng)估所述病人的IFN治療反應(yīng)(腫瘤抑制效果)的方法，用于該方法的試劑盒、基因多態(tài)性、基因型和用于該方法和試劑盒的基因型檢測(cè)探針和引物。他們?cè)趯?shí)施個(gè)體病人定制醫(yī)學(xué)中可用于確定藥物選擇優(yōu)先級(jí)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式在本說(shuō)明書中使用的氨基酸、肽、堿基序列、核酸等等的縮寫與IUPAC-IUB規(guī)則(IUPAC-IUB communication on BiologicalNomenclature，Eur.J.Biochem.，1389(1984))，(″Enki-hairetsu matahaaminosan-hairetsu wo fukumu meisaisho nado no sakusei no tamenogaidorain″(準(zhǔn)備含有堿基序列或氨基酸序列的說(shuō)明書的指南Guidelinesfor preparation of specifications containing base sequences or amino acidsequences″(由日本專利局匯編)和相關(guān)領(lǐng)域使用的標(biāo)準(zhǔn)符號(hào)一致。
本說(shuō)明書中使用的″基因多態(tài)性″和″多態(tài)性″指占據(jù)一個(gè)位點(diǎn)的多種等位基因群或這種群中的個(gè)體等位基因。在這些多態(tài)性中，只有一個(gè)核苷酸不同的那些多態(tài)性被定義為單核苷酸多態(tài)性或SNP。單核苷酸多態(tài)性在本說(shuō)明書中縮寫為″SNP″。
單倍體標(biāo)明了上述基因多態(tài)性(SNPs)的種類，以在連續(xù)的基因區(qū)域或基因群組中的多個(gè)SNP位點(diǎn)中的等位基因的種類和數(shù)量為基礎(chǔ)表示。
在本說(shuō)明書中，基因型指給定基因多態(tài)性位點(diǎn)中的基因位點(diǎn)的等位基因狀況。例如，在STAT3基因的位置4243095處的SNP基因型(STAT3-2)表示為C/T雜合型或T/T純合型。這也可以表示為″STAT3-2 C/T或T/T″。當(dāng)病人具有基因型STAT3-2 C/T或T/T時(shí)，預(yù)計(jì)病人可能對(duì)IFN治療腎細(xì)胞癌(腫瘤抑制效果)作出響應(yīng)(PR部分響應(yīng))或作出很好的響應(yīng)(CR完全響應(yīng))。因此，基因型STAT3-2C/T或T/T可用作鑒定對(duì)IFN治療腎細(xì)胞癌反應(yīng)的鑒定標(biāo)記。
本說(shuō)明書中標(biāo)明的人基因的基因組序列與在核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI(國(guó)家生物技術(shù)信息中心)(National Center for BiotechnologyInformation)登記的GenBank登錄號(hào)(e.g.NT_010641)下的核酸序列一致。同樣，在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考SNP ID編號(hào)(例如rs1213265)(參見參考SNP(refSNP)群報(bào)告，在<http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP>中可找到)下也可以發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中被稱為人基因多態(tài)性的SNPs的位點(diǎn)信息和核酸突變信息。也可以依照參考SNP ID編號(hào)標(biāo)明本說(shuō)明書中使用的SNP信息。
表1顯示從GenBank中獲得的關(guān)于基因序列、mRNA序列、SNP位點(diǎn)和核酸突變的基本信息。
表1
在表1中，基因下的那列顯示其中包含本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的SNPs的基因的名稱，后面是發(fā)明人任意分配的SNP編號(hào)。在該表中，″rs#_″表示參考SNPs的登錄號(hào)，″核酸″表示核酸突變(A/G指其中A轉(zhuǎn)變?yōu)镚的SNP)，″毗連群登記″表示基因組重疊群序列的登錄號(hào)，″毗連群位置″表示表明基因組序列中核酸突變的位置的位置編號(hào)，″mRNA″表示mRNA序列號(hào)的登錄號(hào)，″mRNA方向″表示包含基因多態(tài)性序列的mRNA的方向。更進(jìn)一步地，″蛋白質(zhì)″表示蛋白質(zhì)序列的登錄號(hào)，″位置″表示其上存在基因多態(tài)性的位點(diǎn)的信息，″dbSNP等位基因″表示互補(bǔ)雙鏈上的等位基因的核酸信息，″氨基酸殘基″表示那些被改變(被替換)的氨基酸殘基，″密碼子位點(diǎn)″表示核酸編碼的氨基酸的密碼子位點(diǎn)信息，“氨基酸序列信息”表示氨基酸序列的位點(diǎn)上的信息，以及″備注″表示基因的同義詞。
如表1所示，僅僅在與IL-4R有關(guān)的基因多態(tài)性中鑒定到用于本發(fā)明的方法的由特定的人基因多態(tài)性引起的氨基酸替換，其他基因的基因多態(tài)性沒(méi)有引起氨基酸替換。
用于本說(shuō)明書的術(shù)語(yǔ)″基因″不僅包括雙鏈DNAs，而且包括組成雙鏈DNAs的單鏈DNAs(有義鏈和反義鏈)。更具體地說(shuō)就是，除非另作說(shuō)明，否則依照本發(fā)明的基因(DNAs)包括包含人基因組DNAs的雙鏈DNAs、包含cDNAs的單鏈DNAs(有義鏈)、具有與所述有義鏈互補(bǔ)的序列的單鏈DNAs，以及其片段。更進(jìn)一步地，所述基因(DNAs)可以包含調(diào)節(jié)區(qū)域、編碼區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子。多核苷酸包括RNA和DNA。DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。多肽包括其片段、同源物、衍生物和變異體。更進(jìn)一步地，變異體指天然發(fā)生的等位基因變異體、非天然發(fā)生的那些等位基因變異體、被修飾(缺失、替換、添加和插入)的那些變異體，以及基本上不改變編碼多肽功能的多核苷酸序列。例如，氨基酸序列的修飾可以通過(guò)突變和翻譯后修飾天然地發(fā)生，或者可以利用天然發(fā)生的遺傳元件人工促成這種修飾。
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)是基于發(fā)現(xiàn)在人基因(IFN基因，據(jù)報(bào)道與IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)有關(guān)的基因，以及據(jù)報(bào)道添加/施用IFN時(shí)其表達(dá)發(fā)生改變的基因)的給定位點(diǎn)處包含基因型的基因多態(tài)性，特別是SNP或SNPs與IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制效果密切相關(guān)，以及檢測(cè)這種基因多態(tài)性(給定位點(diǎn)的基因型)能夠評(píng)價(jià)腎細(xì)胞癌病人對(duì)IFN治療的反應(yīng)。換句話說(shuō)，本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)某些人基因多態(tài)性，特別是特定的SNPs可用作評(píng)價(jià)對(duì)腎細(xì)胞癌的IFN治療的反應(yīng)的標(biāo)記而實(shí)現(xiàn)的。依照本發(fā)明，檢測(cè)來(lái)自腎細(xì)胞癌病人的標(biāo)本的特定SNPs能夠預(yù)測(cè)腎細(xì)胞癌病人對(duì)IFN治療的反應(yīng)。
本發(fā)明基本上需要檢測(cè)來(lái)自腎細(xì)胞癌病人標(biāo)本的特定的人基因多態(tài)性，即由STAT3-2、STAT3-3、STAT3-17、STAT3-18、SSI3-1、IL-4R-14、IL-4R-22、L-4R-29、IRF2-67、IRF2-82、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS1-4、PTGS1-5、PTGS2-12和TAP2-5組成的基因多態(tài)性(基因型)。
待通過(guò)本發(fā)明的方法檢測(cè)(分型)的SNPs，即與IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制效果有關(guān)的基因多態(tài)性(或基因型)更具體地顯示在下列的(a)到(p)中。
(a)在STAT3基因的位置4243095處具有基因型C/T或T/T的基因多態(tài)性(STAT3-2)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1905341表示、(b)在STAT3基因的位置4264926處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(STAT3-3)，用參考的SNP ID編號(hào)rs4796793表示、(c)在STAT3基因的位置4204027處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(STAT3-17)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2293152表示、(d)在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(STAT3-18)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2293153表示、(e)在SSI3基因的位置10246541處具有基因型A/C的基因多態(tài)性(SSI3-1)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2280148表示、(f)在IL-4R基因的位置18686025處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IL-4R-22)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1805011表示、(g)在IRF2基因的位置17736877處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IRF2-67)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2797507表示、(h)在IRF2基因的位置17744613處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IRF2-82)，用參考的SNP ID編號(hào)rs796988表示、(i)在ICSBP基因的位置390141處具有基因型A/A或A/C的基因多態(tài)性(ICSBP-38)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2292982表示、(j)在PTGS1基因的位置26793813處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-3)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1213264表示、(k)在PTGS1基因的位置26794182處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-4)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1213265表示、(l)在PTGS1基因的位置26794619處具有基因型A/G的基因多態(tài)性(PTGS1-5)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1213266表示、(m)在PTGS2基因的位置15697329處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(PTGS2-12)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2745557表示、(n)在TAP2基因的位置23602539處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(TAP2-5)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2071466表示、(o)在IL-4R基因的位置18686068處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IL-4R-14)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2234898表示、和(p)在IL-4R基因的位置1868553處具有基因型T/T的基因多態(tài)性(IL-4R-29)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1801275表示。
依照本發(fā)明，檢測(cè)特定的人基因多態(tài)性(SNPs和單倍體)和/或基因型可以提供對(duì)理解和闡明腎細(xì)胞癌的腫瘤抑制效果和機(jī)制(IFN的腫瘤抑制效果)有用的的信息和方法，其可預(yù)測(cè)診斷腎細(xì)胞癌治療等等。更進(jìn)一步地，依照本發(fā)明的這種檢測(cè)可以提供確定腎細(xì)胞癌病人治療方案的有效信息，特別是確定在實(shí)施適合個(gè)體腎細(xì)胞癌病人的定制醫(yī)學(xué)的過(guò)程中是否應(yīng)當(dāng)施用IFN作為治療方案的重要信息。
在本發(fā)明中，用于腎細(xì)胞癌病人的IFN治療的IFN實(shí)例包含天然IFN-α、重組IFN-α和重組IFN-γ等等。這些IFNs可以包括在本發(fā)明的方法中，不僅可以單獨(dú)使用，而且可以與免疫治療藥物、化療藥物等等組合使用。
獲取包含基因多態(tài)性(SNPs)的人基因下文詳細(xì)描述了本發(fā)明。在本發(fā)明中，首先獲取來(lái)自腎細(xì)胞癌病人的基因樣品作為標(biāo)本(步驟i)。獲取的基因樣品包含特定的基因多態(tài)性(SNPs)，更具體地包含上述(a)到(p)的基因多態(tài)性中的任何一種。這種樣品的可用實(shí)例有通過(guò)常規(guī)方法從腎細(xì)胞癌病人中提取的cDNA和基因組DNA。樣品可以是包含上述基因多態(tài)性的DNA的互補(bǔ)鏈。
cDNA或基因組DNA樣品來(lái)源的實(shí)例包括各種細(xì)胞、組織、從其中衍生的培養(yǎng)細(xì)胞等等。更具體的實(shí)例包括體液，例如血液、唾液、淋巴、呼吸道粘液、尿、精液等等。來(lái)源于上述來(lái)源的作為標(biāo)本的樣品優(yōu)選來(lái)源于施用IFN(除已經(jīng)施用IFN以外的藥物的病例以外，還特別包括施用任何藥物的病例)之前的病人的DNA或基因組DNA?？梢砸勒諛?biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施從這些原始樣品中分離RNA、分離和純化mRNA、合成cDNA和克隆的過(guò)程。
在本發(fā)明的方法中，制備來(lái)自上述基因樣品的特定人基因的基因組序列或其互補(bǔ)鏈(例如包含上述(a)到(p)的基因多態(tài)性中的任何一種的基因或其互補(bǔ)鏈))(步驟ii)。
按照常規(guī)的基因工程技術(shù)，參考本說(shuō)明書中公開的包含上述SNPs(a)到(p)中任何一種的基因的具體序列信息可以很容易地實(shí)施這一制備過(guò)程[Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；Zoku Seikagaku Jikken KozaIdenshi Kenkyuho I，II，III(″Biochemistry Experiment Lecture Part IIGene Studies I，II，III″)，由日本生物化學(xué)協(xié)會(huì)1986年匯編等]。特別地，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如參見Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983)))))等)，利用針對(duì)(a)到(p)中任何具體基因型的適當(dāng)探針或限制性內(nèi)切酶可以實(shí)施從腎細(xì)胞癌病人提取包含如上所述(a)到(p)的任何基因多態(tài)性的cDNA或基因組DNA的制備過(guò)程。更具體地說(shuō)，通過(guò)制備包含基因型位點(diǎn)、能選擇性結(jié)合想要SNPs的DNA序列的探針，并使用這種探針實(shí)施單核苷酸引物延伸、侵入方法、實(shí)時(shí)定量PCR等等可以實(shí)現(xiàn)這一制備過(guò)程。
可用的篩選引物有基于目的基因的核酸序列信息設(shè)計(jì)的正向和反向引物?？梢宰裱瓨?biāo)準(zhǔn)方法，使用例如自動(dòng)合成器合成這些引物。典型地可以標(biāo)記這種篩選探針；但是，也可以使用非標(biāo)記探針，只要他們能直接或間接地特異結(jié)合標(biāo)記的配體就可以。探針和配體的標(biāo)記試劑和標(biāo)記技術(shù)在相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域是公知的。實(shí)例包括可以通過(guò)切口平移、隨機(jī)引物法、激酶處理等等轉(zhuǎn)移的放射性試劑、生物素、熒光染料、化學(xué)發(fā)光試劑、螢光素酶和類似的酶、抗體等等。
可以通過(guò)基因擴(kuò)增方法擴(kuò)增提取的DNA或mRNA。通過(guò)擴(kuò)增本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)更容易和更準(zhǔn)確的檢測(cè)?；驍U(kuò)增方法的實(shí)例包括PCR方法(Saiki，R.K.，Bugawan，T.L.等，Nature，324，163-166(1986))，NASBA方法(Comptom，J.，Nature，650，91-92(1991))，TMA方法(Kacian，D.L.，and Fultz，T.J.，美國(guó)專利No.5,399,491(1995))，SDA方法(Walker，G.T.，Little，M.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，89，392-396(1992))。
通過(guò)凝膠電泳或使用柱可以實(shí)現(xiàn)PCR方法擴(kuò)增的基因片段的分離和純化。通過(guò)，例如質(zhì)譜法或凝膠瓊脂糖電泳可以證實(shí)這些性能。依照擴(kuò)增基因的特性，可以對(duì)利用這些方法擴(kuò)增的基因檢測(cè)本發(fā)明的(a)到(p)的基因多態(tài)性(SNPs)(SNP分型)。
SNP分型依照本發(fā)明的方法，對(duì)上述標(biāo)本的給定基因區(qū)域中的DNA進(jìn)行測(cè)序和分析，并檢測(cè)其SNPs(SNP分型)(步驟iii)?？梢酝ㄟ^(guò)下列(1)到(8)的方法進(jìn)行分型。
(1)核苷酸直接測(cè)序采用用于確定這類基因的核酸序列通常使用的核苷酸直接測(cè)序法，例如雙脫氧法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，74，5463-5467(1977))、Maxim-Gilbert方法(Methods in Enzymology，65，499(1980))等，通過(guò)對(duì)給定基因進(jìn)行DNA測(cè)序可以檢測(cè)基因多態(tài)性。通過(guò)將核苷酸直接測(cè)序法與DNA擴(kuò)增法，例如PCR方法組合也可以有效檢測(cè)基因多態(tài)性。特別優(yōu)選實(shí)施PCR方法或與其等同的DNA擴(kuò)增方法與該直接測(cè)序法組合的方法，因?yàn)檫@種組合方法方便，而且容易操作，盡管只需要少量的DNA樣品，但仍然可以實(shí)現(xiàn)靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)。
例如，依照雙脫氧法、Maxum-Gilbert法等對(duì)PCR方法擴(kuò)增的基因片段或其純化產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，基本上可以實(shí)施這種優(yōu)選方法?；蛘?，可以通過(guò)使用商品化的序列分析試劑盒確定核苷酸序列很容易地實(shí)施這種方法。因此，可以檢測(cè)具體人基因的上述給定位置存在/缺少SNPs。
在上下文的方法中通過(guò)PCR擴(kuò)增的DNA片段是不受限制的，只要他們包含至少一個(gè)特殊位點(diǎn)就可以，其中推測(cè)會(huì)在該特殊位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)以前提到的變異。可使用的DNA片段典型地由大約50到大約數(shù)千個(gè)堿基組成，更優(yōu)選由大約50到大約幾百個(gè)堿基組成。
(2)等位基因特異的寡核苷酸(ASO)斑點(diǎn)印跡分析檢測(cè)特定基因上的多態(tài)性的另一個(gè)方法是進(jìn)行等位基因特異的寡核苷酸(ASO)斑點(diǎn)印跡分析(Conner，B.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，80，278-282(1983))。利用設(shè)計(jì)將靶SNP夾在中間的正向和反向引物，通過(guò)讓可與PCR擴(kuò)增基因片段的等位基因特異的寡核苷酸探針雜交的DNA片段進(jìn)行斑點(diǎn)印跡分析可以實(shí)施該方法。用這種方式可以檢測(cè)這種DNA片段上的SNP。
(3)單核苷酸引物延伸法通過(guò)單核苷酸引物延伸法，例如SNaPshot法、焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)和未審查的日本專利出版物No.2000-279197中公開的點(diǎn)突變檢測(cè)為基礎(chǔ)的方法也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的多態(tài)性檢測(cè)。在這些方法中，設(shè)計(jì)探針使其正好與緊接在靶SNP前的序列或靶SNP幾個(gè)堿基前的序列匹配，即設(shè)計(jì)探針使其3′末端位于檢測(cè)靶突變上游一個(gè)堿基或靠近檢測(cè)靶突變，該探針與DNA標(biāo)本進(jìn)行退火?？梢岳檬袌?chǎng)上的SNPs檢測(cè)試劑盒和其隨附的軟件實(shí)施這些方法。
例如利用ABI PRISM SnaPshot ddNTP引物延伸試劑盒(AppliedBiosystems制造)可以實(shí)施SnaPshot方法。在ABIPRISM310/377/3100/3700 DNA分析器(全部由Applied Biosystems制造)和GeneScan軟件上，通過(guò)利用反應(yīng)后產(chǎn)生的熒光片段可以對(duì)SNPs進(jìn)行分型。
可以按照如下描述進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。遵循標(biāo)準(zhǔn)方式從血液樣品等中分離基因組DNA，利用生物素標(biāo)記的引物PCR擴(kuò)增包含突變的幾十到數(shù)百個(gè)堿基，利用磁珠純化單鏈DNA并將純化的DNA用作標(biāo)本。將該標(biāo)本與設(shè)計(jì)用于從靶基因多態(tài)性上游的幾個(gè)堿基進(jìn)行測(cè)序的引物退火，然后依照靠近進(jìn)入軟件分析中的基因多態(tài)性的序列每次添加一種dNTP以引發(fā)反應(yīng)。因?yàn)镈NA聚合酶延伸核酸時(shí)會(huì)形成焦磷酸鹽(PPi)，PPi通過(guò)硫酸化酶會(huì)產(chǎn)生ATP。利用發(fā)光檢測(cè)器、CCD攝像機(jī)等可以確定螢光素酶與ATP底物反應(yīng)發(fā)射的光。因此，依照添加的dNTPs，通過(guò)發(fā)射光的峰值分析進(jìn)行靶基因分型是可能的。該方法在大約15分鐘可以對(duì)96個(gè)樣品進(jìn)行分型。
常見的試劑和設(shè)備都可用于上述方法。可使用的試劑實(shí)例包括由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、螢光素酶，腺苷三磷酸雙磷酸酶組成的酶混合物、由螢光素和APS(腺苷5′磷酸鹽硫酸鹽)組成的底物液體、市場(chǎng)上買到的包含dNTP作為成分的SNP試劑盒，其中dNTP由dATP(脫氧腺苷三磷酸)、dCTP、dGTP和dTTP組成(Pyrosequending AB制造)等等?？墒褂玫脑O(shè)備實(shí)例包括用于自動(dòng)DNA序列分析的PSQ96系統(tǒng)(Pyrosequending AB)和使用該系統(tǒng)的SNP軟件(PyrosequendingAB)。
可以依照美國(guó)專利No.6,159,693說(shuō)明書中的描述實(shí)施焦磷酸測(cè)序，即分離核酸并通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，利用READITTM系統(tǒng)(Promega Corporation)與焦磷酸鹽反應(yīng)，然后分析獲得的數(shù)據(jù)?？梢允褂美肦EADIT技術(shù)(Promega Corporation)的市場(chǎng)上可買到的Excel程序進(jìn)行這種數(shù)據(jù)分析。
(4)PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析更進(jìn)一步地，可以通過(guò)PCR-SSCP分析實(shí)現(xiàn)用本發(fā)明方法檢測(cè)基因多態(tài)性的過(guò)程(Orita，M.，Iwahara，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，86，2776-2770(1989))。在該方法中，讓PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(單鏈DNA)進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從而以每個(gè)PCR產(chǎn)物遷移的差異為基礎(chǔ)鑒定存在或缺少單核苷酸多態(tài)性。
(5)PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析為了檢測(cè)本發(fā)明的特異基因上的SNPs或單倍體，當(dāng)包含待檢測(cè)的靶多態(tài)性的核酸序列也包含限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位時(shí)，也可以通過(guò)限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析完成檢測(cè)(Botstein，D.R.等，Am.J.Hum.Gen.，32，314-331(1980))。
更具體地說(shuō)，可以按照如下描述對(duì)如上所述基因多態(tài)性(a)到(p)的給定位點(diǎn)上的基因型實(shí)施RFLP分析。取如上所述的基因(c)上的給定位點(diǎn)的基因型作為一個(gè)例子，為了檢測(cè)STAT3基因的基因組序列位置4204027具有基因型G/G的基因多態(tài)性[STAT3-17]，可以利用不僅識(shí)別靶基因型位點(diǎn)，而且也識(shí)別該位點(diǎn)上下游的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行RFLP分析。用于RFLP分析的酶可以是能識(shí)別靶基因型位點(diǎn)和該位點(diǎn)上下游序列的各種已知的限制性內(nèi)切酶。象這樣的具體實(shí)例有Mspl。
更優(yōu)選通過(guò)PCR-RFLP法實(shí)施RFLP分析，即預(yù)先通過(guò)PCR或其修飾的方法擴(kuò)增和制備DNA標(biāo)本，并對(duì)大量制備的濃縮DNA樣本進(jìn)行RFLP分析。因此，可以檢測(cè)其中位點(diǎn)被特異切割的靶基因多態(tài)性。
依據(jù)這種基因多態(tài)性檢測(cè)方法，首先從人標(biāo)本中提取基因組DNA，通過(guò)PCR等擴(kuò)增包含所述基因的基因多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段，從而獲得大量濃縮的基因樣品。然后利用特定的限制性內(nèi)切酶切割擴(kuò)增的DNA樣本，并遵循標(biāo)準(zhǔn)方法研究切割的DNA(存在或缺少切割，切割片段的堿基長(zhǎng)度)。
(6)侵入方法還可以通過(guò)侵入方法(invader method)實(shí)施對(duì)本發(fā)明特異基因的SNPs的檢測(cè)?？梢詤⒖枷铝形募?shí)施侵入方法；Lyamichev，V.等，Nat.Bioltechnol.，17(3)292-296(1999)和國(guó)際專利出版物No.WO9823774(未審查的專利出版物No.2001-526526)。
這些出版物中公開的方法分析基因組DNA上的SNPs時(shí)不需要預(yù)先擴(kuò)增靶DNA，它是按照如下描述實(shí)施的。
為了檢測(cè)具體靶基因，例如(a)、(b)，以及(d)到(p)中描述的基因中SNPs的存在，首先分離基因組DNA，然后利用，例如自動(dòng)化合成器合成探針。首先設(shè)計(jì)待合成的由30到幾百個(gè)堿基組成的靶寡核苷酸探針，使其具有15到50個(gè)堿基的5′翼，在所述5′翼的3′末端側(cè)面上具有待檢測(cè)的核酸(本發(fā)明中的SNP)，并與除靶基因型核酸外的靶基因組DNA互補(bǔ)。由15或更多堿基組成的侵入寡核苷酸探針被設(shè)計(jì)成與靶基因組DNA互補(bǔ)，而且在其3′末端具有與待檢測(cè)核酸的互補(bǔ)的核酸。分離的基因組DNA和切割第一個(gè)探針5′翼(翼核酸內(nèi)切酶)的酶同時(shí)添加到這些探針中，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)。
當(dāng)標(biāo)本中的基因組DNA包含想要的SNP時(shí)，完成其中3′末端具有基因型的核酸的5′翼被分離的第一反應(yīng)。當(dāng)標(biāo)本中的基因組DNA不包含該基因型核酸序列時(shí)，上述酶不發(fā)生切割。
通過(guò)酶切割從第一探針?lè)蛛x的5′翼互補(bǔ)結(jié)合作為靶的熒光共振能量傳遞(FRET)探針，5′翼的3′末端侵入到FRET探針當(dāng)中。同樣，上述酶可以引起反應(yīng)，從而分離已經(jīng)被淬滅的熒光染料。
盡管第二個(gè)反應(yīng)中使用的FRET探針是待檢測(cè)的靶，但它包含相同的序列，而且構(gòu)建的這種探針基本上包含下列兩個(gè)元件。
(1)與第一個(gè)反應(yīng)中的分離產(chǎn)物互補(bǔ)的3′區(qū)域，和(2)包含報(bào)告熒光染料和淬滅熒光染料的自身互補(bǔ)區(qū)域，其形成雙鏈體以模仿單鏈探針與靶雜交。
當(dāng)上述報(bào)告熒光染料附著于其上也附著有上述淬滅熒光染料的探針上時(shí)，由于熒光共振能量傳遞報(bào)告染料被淬滅。當(dāng)它不附著于具有上述淬滅熒光染料的探針上時(shí)，報(bào)告染料不被淬滅。因此，當(dāng)通過(guò)切割從第一探針?lè)蛛x的5′翼與FRET探針雜交時(shí)，所述翼在第二反應(yīng)中作為侵入寡核苷酸起作用，因此產(chǎn)生被酶特異識(shí)別的被入侵復(fù)合物。因此，上述特定酶切割FRET探針可以分離兩種熒光染料，并產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)熒光微量滴定板讀數(shù)器上讀出這種熒光信號(hào)可以檢測(cè)包含想要SNPs的基因多態(tài)性。通過(guò)組合第一和第二反應(yīng)可以將熒光信號(hào)放大1至106倍。更具體地說(shuō)，使用不同熒光染料的兩個(gè)FRET探針可以實(shí)施SNP分型。
(7)實(shí)時(shí)定量PCR本發(fā)明通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(TaqMan方法)可以很容易地對(duì)特定基因上的基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。
可以按照如下描述實(shí)施該方法。為了檢測(cè)包含靶SNP的基因多態(tài)性，制備用于檢測(cè)其上適當(dāng)區(qū)域包含多態(tài)性(核酸位點(diǎn))的DNA片段的正向和反向引物，每個(gè)引物由15到39個(gè)堿基組成。但是，設(shè)計(jì)的正向和反向引物不包含靶核酸位點(diǎn)(單核苷酸基因型)。然后制備探針，探針是具有由15到50個(gè)堿基組成的堿基序列的其上附著有報(bào)告熒光染料和淬滅熒光染料的寡核苷酸。必須挑選這種探針的堿基序列使正向引物的雜交區(qū)域不與探針的雜交區(qū)域重疊。設(shè)計(jì)探針使其具有與等位基因特異序列互補(bǔ)的序列，以檢測(cè)存在/缺少靶單核苷酸基因型。使用這種探針，通過(guò)PCR擴(kuò)增標(biāo)本中待測(cè)的給定基因，例如上述(a)到(p)描述的基因中的目的DNA片段，并實(shí)時(shí)測(cè)量反應(yīng)混合物產(chǎn)生的熒光量。這樣就能實(shí)現(xiàn)SNP分型了。更具體地說(shuō)，可以使用不同熒光染料的兩種探針實(shí)施SNP檢測(cè)(分型)。
在上述侵入分析和TaqMan方法中使用的報(bào)告熒光染料的優(yōu)選實(shí)例包括熒光素型熒光染料，例如FAM(6-羧基熒光素)，淬滅熒光染料的優(yōu)選實(shí)例包括若丹明型熒光染料，例如TAMRA(6-羧基-四甲基-若丹明)。這些熒光染料為大家所熟知，為方便使用可將他們包括在市場(chǎng)上可買到的實(shí)時(shí)PCR試劑盒中。報(bào)告熒光染料和淬滅熒光染料的結(jié)合部位不受限制，但是報(bào)告熒光染料典型地結(jié)合寡核苷酸探針的一端(優(yōu)選5′末端)，淬滅熒光染料結(jié)合另一端。將熒光染料結(jié)合到寡核苷酸上的方法是已知的，而且在出版物，例如Noble等，(1984)，Nuc.Acids Res.，123387-3403和lyer等，(1990)，J.Ame.Chem.Soc.，1121253-1254中已經(jīng)公開。
TaqMan方法本身是一種已知的方法，設(shè)計(jì)的用于該方法的裝置和試劑盒已經(jīng)上市銷售。在本發(fā)明中，也可以使用這些市場(chǎng)上買到的裝置和試劑盒。當(dāng)使用這些市場(chǎng)上買到的裝置和試劑盒時(shí)，可遵循專利No.2,825,976中公開的程序，或PE Biosystems制造的ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)用戶手冊(cè)實(shí)施本發(fā)明的方法。
(8)使用質(zhì)譜儀的質(zhì)譜陣列質(zhì)譜陣列法檢測(cè)由多態(tài)性引起的質(zhì)量差。更具體地說(shuō)，通過(guò)PCR擴(kuò)增包含待檢測(cè)的多態(tài)性的區(qū)域，延伸引物正好雜交在SNP位置前，利用包含ddNTP/dNTP混合物的反應(yīng)混合物，例如包含ddATP、dCTP、dGTP和dTTP的反應(yīng)混合物進(jìn)行延伸反應(yīng)，從而依照SNPs產(chǎn)生具有不同3′端的片段。純化這些產(chǎn)物，并用MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，從而確定分子量和基因型之間的相互關(guān)系(Pusch，W.，Wurmbach，JH.，Thiele，H.，Kostrzewa，M.，MALDI-TOF mass spectrometry-based SNPgenotyping，Pharmacogenomics，3(4)537-48(2002))。利用，例如Sequenom′s MassArray高通量SNP檢測(cè)系統(tǒng)可以很容易地實(shí)施該方法。
(9)其他分型方法也可以通過(guò)各種已知的方法，包括對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序的方法和檢測(cè)基因多態(tài)性和基因突變的方法對(duì)本發(fā)明的方法中使用的基因進(jìn)行SNPs分型。這些方法的實(shí)例如下。
(9-1)PCR-SSO(序列特異的寡核苷酸)分型載體上的對(duì)應(yīng)SNP的固相探針與標(biāo)本(基因擴(kuò)增產(chǎn)物)雜交，從而確定基于存在/缺少錯(cuò)配而產(chǎn)生的雜交效率差異。
(9-2)用于檢測(cè)點(diǎn)突變的PCR-SSP分型使用在3′末端設(shè)計(jì)有與點(diǎn)突變匹配的堿基、基因擴(kuò)增用序列特異的引物，這種分型利用由引物3′末端是否互補(bǔ)引起的PCR擴(kuò)增效率的顯著差異。
(9-3)PCR-DGGE(變性梯度凝膠電泳)分析混合包含基因多態(tài)性的DNA片段和野生型DNA片段進(jìn)行雜交，隨后在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，聚丙烯酰胺凝膠中變性劑，例如尿素、甲酰胺等等的濃度逐步增高。與沒(méi)有錯(cuò)配的同源雙鏈相比，產(chǎn)生的DNA片段會(huì)在變性劑濃度較低的位置離解成單鏈DNAs。因?yàn)閱捂淒NA比雙鏈DNA具有更快的電泳遷移率，基于DNA鏈之間的遷移率差異可以檢測(cè)單堿基多態(tài)性(差異)。
(9-4)PCR-DGGE/GC鉗(Shefield，V.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，86，232-236(1989))除上述PCR-DGGE分析之外，這種方法通過(guò)將GC含量高的區(qū)域偶聯(lián)到包含待檢測(cè)的基因多態(tài)性核酸的DNA片段上，彌補(bǔ)了發(fā)生多個(gè)堿基替換、缺失、添加或插入時(shí)檢測(cè)不完全的缺點(diǎn)。該方法需要添加GC鉗到包含待檢測(cè)基因多態(tài)性的DNA片段上的步驟。
(9-5)RNase保護(hù)分析(Finkelstein，J.等，Genomics，7，167-172(1990))(9-6)原位RT-PCR(Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993))(9-7)原位雜交(9-8)Southern印跡(Sambrook，J.等，Molecular Cloning aLaboratory Manual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(1989)(9-9)點(diǎn)雜交分析(Southern，E.M.，J.Mol.Biol.，98503-517(1975)，etc.)
(9-10)熒光原位雜交(FISHTakahashi，E.等，Hum.Genet.，86，1416(1990))(9-11)比較基因組雜交(CGHKallioneimi，A.等，Science，258，818-821(1992))，和光譜核型分析(SKYRowley，J.D.等，Blood，93，2038-2042(1999))。
(9-12)使用酵母人工染色體載體克隆作為探針的方法(Lengauer，C.等，Cancer Res.，52，2590-2596(1992))。
因此通過(guò)本發(fā)明的方法可以檢測(cè)人基因SNPs和單倍體。
依照本發(fā)明的預(yù)測(cè)腎細(xì)胞癌病人對(duì)IFN治療反應(yīng)的方法，當(dāng)通過(guò)上述方法在標(biāo)本中檢測(cè)的人基因多態(tài)性-指示物(標(biāo)記)被鑒定出來(lái)時(shí)，預(yù)期標(biāo)本對(duì)IFN治療高度敏感(步驟iv)。
因?yàn)轭A(yù)計(jì)對(duì)IFN治療的反應(yīng)被確定為高的病人能產(chǎn)生優(yōu)良的治療效果，因此在藥物選擇階段優(yōu)先選擇IFN來(lái)治療腎細(xì)胞癌。這樣可以抑制給病人施用不必要的藥物，因此能減少藥物引起的副作用。
特別地，依照本發(fā)明的方法檢測(cè)的人基因的基因多態(tài)性或基因型與IFN對(duì)腎細(xì)胞癌的治療效果(腫瘤抑制效果)高度相關(guān)。因此，檢測(cè)結(jié)果可以實(shí)施腎細(xì)胞癌病人的個(gè)體定制醫(yī)學(xué)，即適當(dāng)選擇對(duì)個(gè)體病人最有效的藥物的醫(yī)學(xué)治療。
寡核苷酸本發(fā)明更進(jìn)一步地提供在本發(fā)明的評(píng)估(檢測(cè))方法中用作檢測(cè)基因多態(tài)性的探針或引物的寡核苷酸。這種核苷酸不受限制，只要他們能特異擴(kuò)增包含給定人基因多態(tài)性或基因型區(qū)域的序列就可以?？梢砸越o定基因多態(tài)性或基因型的序列信息為基礎(chǔ)，依照標(biāo)準(zhǔn)方式合成和構(gòu)建這種核苷酸。
更具體地說(shuō)，使用市場(chǎng)上買到的自動(dòng)寡核苷酸合成器，例如GeneAssembler PlusPharmacia LKB)等等，通過(guò)典型的化學(xué)合成，例如亞磷酰胺方法、磷酸鹽三酯方法等等可以進(jìn)行合成。通過(guò)合成化學(xué)合成的單鏈產(chǎn)物和其互補(bǔ)鏈，并讓它們?cè)谶m當(dāng)?shù)臈l件下退火，或者使用適當(dāng)?shù)囊镄蛄泻虳NA聚合成酶將互補(bǔ)鏈附著到所述單鏈產(chǎn)物上可以獲得雙鏈片段。
用作上述探針或引物的寡核苷酸的優(yōu)選實(shí)例包括與設(shè)計(jì)含有給定基因的基因多態(tài)性序列的DNA片段部分匹配，并由至少10個(gè)，典型地大約10到大約35個(gè)連續(xù)堿基組成的寡核苷酸。引物對(duì)的實(shí)例包括被設(shè)計(jì)和合成為將基因DNA序列中的SNP夾合的兩種寡核苷酸序列。包含基因多態(tài)性序列的DNA片段本身可以用作寡核苷酸探針。
用作上述探針的寡核苷酸的優(yōu)選實(shí)例包括下列(a)到(p)描述的那些寡核苷酸。在下列寡核苷酸中，優(yōu)選的探針是那些具有由至少15個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的包含給定基因的多態(tài)性區(qū)域的探針。
(a)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3基因的位置4243095具有基因型C/T或T/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1905341表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(b)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3基因的位置4264926具有基因型C/C的由參考SNP ID編號(hào)rs4796793表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(c)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3基因的位置4204027具有基因型G/G的由參考SNP ID編號(hào)rs2293152表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(d)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3基因的位置4050541具有基因型C/T的由參考SNP ID編號(hào)rs2293153表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(e)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在SSI3基因的位置10246541具有基因型A/G的由參考SNP ID編號(hào)rs2280148表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(f)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IL-4R基因的位置18686025具有基因型A/A的由參考SNP ID編號(hào)rs1805011表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(g)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IRF2基因的位置17736877具有基因型A/A的由參考SNP ID編號(hào)rs2797507表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(h)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IRF2基因的位置17744613具有基因型C/C的由參考SNP ID編號(hào)rs796988表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(i)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在ICSBP基因的位置390141具有基因型A/A或A/C的由參考SNP ID編號(hào)rs2292982表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(j)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS1基因的位置26793813具有基因型C/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1213264表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(k)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS1基因的位置26794182具有基因型C/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1213265表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(l)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS1基因的位置26794619具有基因型A/G的由參考SNP ID編號(hào)rs1213266表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(m)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS2基因的位置15697329具有基因型G/G的由參考SNP ID編號(hào)rs2745557表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(n)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在TAP2基因的位置23602539具有基因型G/G的由參考SNP ID編號(hào)rs2071466表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(o)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IL-4R基因的位置18686068具有基因型C/C的由參考SNP ID編號(hào)rs2234898表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，和(p)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IL-4R基因的位置1868553具有基因型T/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1801275表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)。
本發(fā)明的用作上述引物對(duì)的寡核苷酸的具體實(shí)例包括在下文實(shí)施例中描述的分別針對(duì)上述基因的作為正向引物的序列號(hào)為1到16的那些引物和作為反向引物的序列號(hào)為17到32的引物。
檢測(cè)試劑盒使用試劑盒檢測(cè)標(biāo)本中給定人基因的基因多態(tài)性或基因型的可以更容易地實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)(評(píng)估)方法。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了這種試劑盒。
依照本發(fā)明的試劑盒的實(shí)施例包括作為關(guān)鍵成分的至少一種DNA片段，該片段部分或完全與包含給定人基因的上述任何基因多態(tài)性或基因型的DNA片段的堿基序列或其互補(bǔ)堿基序列雜交、或者包括作為關(guān)鍵成分的至少一種DNA片段，該片段與包含上述特定基因多態(tài)性位點(diǎn)或基因型位點(diǎn)中任何一個(gè)的上游的一到幾個(gè)堿基的堿基序列雜交。依照本發(fā)明的試劑盒的另一個(gè)實(shí)施例包括識(shí)別包含作為關(guān)鍵成分的上述任何特定基因多態(tài)性位點(diǎn)或基因型位點(diǎn)的幾個(gè)核酸的序列的限制性內(nèi)切酶，例如Mspl。
包含在本發(fā)明的試劑盒中的其他成分包括標(biāo)記試劑，實(shí)施PCR需要的試劑(例如TaqDNA聚合成酶、脫氧核苷酸三磷酸、DNA擴(kuò)增引物等等)。標(biāo)記試劑的實(shí)例包括化學(xué)修飾物質(zhì)，例如放射性同位素、發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)等等，DNA片段本身可以預(yù)先與這種標(biāo)記試劑結(jié)合。為了方便測(cè)量，本發(fā)明的試劑盒可以更進(jìn)一步地包含適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)稀釋劑、標(biāo)準(zhǔn)抗體、緩沖液、沖洗液、反應(yīng)終止溶液等等。
因?yàn)楸景l(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)給定基因的基因多態(tài)性或基因型與IFN對(duì)腎細(xì)胞癌的治療效果(腫瘤抑制效果)高度相關(guān)，因此依照本發(fā)明，在實(shí)施定制醫(yī)學(xué)的過(guò)程中為個(gè)體腎細(xì)胞癌病人合適地選擇更有效的藥物成為可能。本發(fā)明提供了檢測(cè)作為與IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌的效果相關(guān)的標(biāo)記的給定人基因多態(tài)性或基因型的方法，即檢測(cè)腎細(xì)胞癌病人的標(biāo)本中的給定基因多態(tài)性或基因型作為對(duì)IFN治療腎細(xì)胞癌反應(yīng)的鑒定標(biāo)記的方法、用于這種方法的診斷試劑和診斷試劑盒。
實(shí)施例本發(fā)明更進(jìn)一步地詳細(xì)描述了下列實(shí)施例，但不局限于這些實(shí)施例。
(1)分析樣本用于該測(cè)試中分析的樣本是在參與機(jī)構(gòu)獲得受試者的知情同意后從非可追蹤的匿名血樣提取的基因組DNA樣品，以及來(lái)自已經(jīng)在參與機(jī)構(gòu)被提取的基因組DNAs的樣品。沒(méi)有經(jīng)過(guò)同意的樣品和非匿名樣品不用來(lái)進(jìn)行分析。更進(jìn)一步，受試者信息(病人背景等等)不傳輸給實(shí)驗(yàn)室工人或合作者Otsuka Pharmaceutical有限公司治療診斷學(xué)研究中心(以下簡(jiǎn)稱″TRC″)。
有86個(gè)注冊(cè)樣品用于這項(xiàng)測(cè)試，其中76個(gè)樣品源自于血樣，而且已經(jīng)制備10個(gè)樣品作為DNA。以O(shè)tsuka制藥有限公司倫理委員會(huì)(Ethical Committee of Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd)批準(zhǔn)的申請(qǐng)發(fā)展小組實(shí)施的研究項(xiàng)目″旨在研究IFN治療腎細(xì)胞癌效果的預(yù)測(cè)因子的干擾素相關(guān)基因中的SNPs分析(倫理委員會(huì)接收號(hào)010724-1)″為基礎(chǔ)收集這些樣品。
遵照教育、文化、運(yùn)動(dòng)、科技部；衛(wèi)生、勞動(dòng)和福利部；以及經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易和工業(yè)部在2001年3月宣布的″人基因組/基因分折研究道德準(zhǔn)則″(第一通告)來(lái)實(shí)施這一項(xiàng)目。
收集的血樣是在參與機(jī)構(gòu)制備為不可追蹤的匿名血樣，將血樣冷凍運(yùn)輸?shù)絋RC。在TRC從這些血樣中提取基因組DNAs用作分析樣品。
已經(jīng)從中提取基因組DNAs的樣品也是在參與機(jī)構(gòu)制備的不可追蹤的匿名樣品，將樣品冷凍運(yùn)輸?shù)絋RC備用。
在研究期間，嚴(yán)格處理用于這項(xiàng)研究的所有基因組DNA樣品，并將其保存在TRC實(shí)驗(yàn)室的指定存儲(chǔ)器中(冷凍在4℃)。
(2)基因分析用于在這項(xiàng)測(cè)試中進(jìn)行分析的基因有下列基因簇。
(2a)IFN-α受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)IFNAR1(α鏈)(干擾素α受體1)、IFNAR2(β鏈)(干擾素β受體2)、JAK1(Janus激酶1、一種酪氨酸激酶蛋白質(zhì))、Tyk2、STAT1(轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和活化因子1，91kda)、STAT2(轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和活化因子2，113kda)、STAT3(轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和活化因子3、急性期反應(yīng)因子)、p48(ISGF3γ，干擾素刺激轉(zhuǎn)錄因子3、γ、48kda)、SOCS-1(細(xì)胞因子信號(hào)抑制劑1/SSI-1)(別名JAB，CIS-1，SSI-1、)、SOCS-2(細(xì)胞因子信號(hào)抑制劑2/STATI2)(別名CIS-2，SSI-2、STATI2)、SOCS-3(細(xì)胞因子信號(hào)抑制劑3/SSI-3)(別名CIS-3，SSI-3)、Shp-2(別名PTPN11蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，非受體型11(Noonan綜合征1))。
(2b)Th1/Th2系統(tǒng)STAT4(轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和活化因子4)、IL-2(白細(xì)胞介素2)、IFN-γ(干擾素γ)、TNF-α(腫瘤壞死因子α)、TNF-β(腫瘤壞死因子β)(LTA淋巴細(xì)胞毒素α，TNF超家族，成員1)、IL-4(白細(xì)胞介素4)、IL-4受體-α、IL-4受體-β、IL-5(白細(xì)胞介素5、集落刺激因子、嗜酸性粒細(xì)胞)、IL-6(白細(xì)胞介素6、干擾素β2)、IL-10(白細(xì)胞介素10)、IL-13(白細(xì)胞介素13)。
(2c)據(jù)報(bào)道其表達(dá)被IFN-α改變的基因PKR(PRKR、蛋白激酶、干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA依賴的)、IRF1(IFN-調(diào)節(jié)因子1)、IRF2(IFN-調(diào)節(jié)因子2)、ICSBP(IFN共有序列結(jié)合蛋白)、Cox-1(PTGS1；前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶1、前列腺素G/H合酶和環(huán)加氧酶)、Cox-2(PTGS2；前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2、前列腺素G/H合酶和環(huán)加氧酶)、MxA(Mx-1；肌尾病毒(流感病毒)抗性1、干擾素誘導(dǎo)蛋白p78(小白鼠))(2d)其他基因TAP1(運(yùn)載體1、ATP結(jié)合盒、B亞家族(MDR/TAP))、TAP-2(運(yùn)載體2、ATP結(jié)合盒、B亞家族(MDR/TAP))、LMP7(PSMβ8；蛋白酶體(prosome、macropain)亞單位、β型、8(大的多功能蛋白酶7)、CTLA-4(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞聯(lián)合蛋白質(zhì)4)、GSTT1(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶θ1)、VHL、HIF-1α、HLF、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)。
(3)分析SNPs在上述基因簇之中，在測(cè)試開始時(shí)在NCBI dbSNPs中注冊(cè)的SNPs與注冊(cè)的基因序列在Otsuka制藥有限公司的生物信息室(以下簡(jiǎn)稱″BI室″)進(jìn)行比較分析。進(jìn)行比較的結(jié)果就是選擇作圖靠近注冊(cè)序列的那些SNPs用于本次測(cè)試分析，那些作圖不靠近注冊(cè)序列的SNPs在分析時(shí)被排除。最終分析的SNPs的數(shù)目是1167。
(4)檢測(cè)過(guò)程(4a)基因組DNA提取利用基因組提取試劑盒(PUREGENETM，Gentra Systems，Inc.)實(shí)施從全血中提取基因組DNA。遵照PUREGENETM附帶的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程實(shí)施提取過(guò)程。提取的基因組DNA在試劑盒包含的裂解溶液中裂解，測(cè)定吸光度以計(jì)算提取的總量。
(4b)PCR(用于侵入分析)通過(guò)PCR擴(kuò)增用于分析的包含SNPs的基因組區(qū)域。用ExTaqTM(TaKaRa)作為DNA聚合酶，附送的10×Ex Taq緩沖液用作反應(yīng)緩沖液。
在下列條件下進(jìn)行反應(yīng)。
模板量(基因組DNA)1-10ng引物濃度0.1-0.2uM總反應(yīng)混合物體積15ulPCR循環(huán)(1)95℃2min.、(2)95℃30sec.、(3)50-64℃30sec.、(4)72℃1.5min.、(5)(2)到(4)×50個(gè)循環(huán)，和(6)維持在15℃PCR產(chǎn)物用作下列侵入分析的反應(yīng)模板。
用于上述反應(yīng)的正向引物的核酸序列由序列號(hào)1-16代表的序列顯示，反向引物的核酸序列由序列號(hào)17-32代表的序列顯示。表2顯示了引物、給定的人基因基因組和其中包含的SNPs之間的關(guān)系。
表2
(5)侵入分析在蒸餾水中稀釋包含擴(kuò)增的SNP區(qū)域的PCR產(chǎn)物10-1000倍，通過(guò)95℃加熱5分鐘使稀釋的PCR產(chǎn)物變性以獲得單鏈DNAs，然后立即在冰上冷卻。將得到的用作反應(yīng)模板的DNAs與試劑混合制備侵入分析的反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物的組成與384孔反應(yīng)板形式的附加規(guī)程一致。
在63℃孵育反應(yīng)混合物30-60分鐘，并與酶發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)之后，利用熒光微板讀數(shù)器Safire(TECAN)，通過(guò)兩個(gè)波長(zhǎng)(紅色和綠色)的光，485±6nm的激發(fā)光，530±6nm的發(fā)射光(FAM染料)，以及560±6nm的激發(fā)光，620±6nm的發(fā)射光測(cè)量熒光強(qiáng)度。
利用基于Biomek FX/SAMI(Beckman Coulter)的SNPs自動(dòng)化分型系統(tǒng)實(shí)施除稀釋之外的全部分型過(guò)程。
熒光強(qiáng)度的測(cè)量結(jié)果輸入配備了自動(dòng)分型校正1.0版的BARCODE實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)(BLABSTM，Mitsui Knowledge Industry Co.，Ltd.)，通過(guò)自動(dòng)分型確定SNP基因型。研究員可以利用散點(diǎn)圖再一次確定分型結(jié)果。
(6)PCR-RFLP可以通過(guò)PCR-RFLP對(duì)不能通過(guò)侵入分析進(jìn)行分型的SNPs進(jìn)行分型。在這種方法中，通過(guò)限制性內(nèi)切酶切割包含SNP的區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)對(duì)SNPs進(jìn)行分型。當(dāng)SNP區(qū)域不包含限制性內(nèi)切酶識(shí)別的適當(dāng)位點(diǎn)時(shí)，通過(guò)設(shè)計(jì)靠近SNP的擴(kuò)增引物并有意改變引物的序列可以形成限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。
在該方法中，可以用限制性內(nèi)切酶Nspl檢測(cè)STAT3-17上的SNPs。
實(shí)施PCR可以使用Vogelstein緩沖液，其他條件如下。
模板量(基因組DNA)5ng引物濃度0.1-0.2uM總反應(yīng)混合物體積15uLPCR循環(huán)(i)95℃2min.、(ii)95℃30sec.、(iii)50-60℃30sec.、(iv)72℃1min.、(v)(ii)到(iv)的步驟進(jìn)行35-45個(gè)循環(huán)，和(vi)維持在15℃用限制性內(nèi)切酶處理PCR產(chǎn)物，并利用4％瓊脂糖凝膠電泳分析切割后的產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度以進(jìn)行分型。
(7)基因分型基于對(duì)上文(5)中描述的侵入分析反應(yīng)產(chǎn)生的兩種顏色的螢光強(qiáng)度的檢測(cè)可以確定基因型。因此，通過(guò)侵入分析可以對(duì)病人33個(gè)基因上的463個(gè)SNPs進(jìn)行基因型分型。更進(jìn)一步地，通過(guò)上文(6)中描述的PCR-RFLP同樣也可以對(duì)13個(gè)基因上的26個(gè)SNPs進(jìn)行基因型分型。
(8)結(jié)果1(對(duì)鑒定CR+PR組和PD組有用的SNPs調(diào)查研究)在累積的86個(gè)病例中，3例被評(píng)估為無(wú)反應(yīng)型，8例沒(méi)有轉(zhuǎn)移灶，24例具有恒定反應(yīng)評(píng)價(jià)(NC組＝無(wú)變化組))(包括沒(méi)有轉(zhuǎn)移灶的一個(gè)病例)。除這34個(gè)病例外，剩余的52個(gè)病例用于分析。他們是CR組(完全反應(yīng)組)、PR組(部分反應(yīng)組)，以及PD組(進(jìn)行性疾病組)。這些處理反應(yīng)的評(píng)價(jià)與1999年四月第三版的腎癌的一般規(guī)則一致。在下文中更進(jìn)一步地提到了這些規(guī)則″Guidelines to Evaluate theresponse to Chemotherapy in Solid Tumors″(J.Jpn.Soc.Cancer Ther.，21(5)929-924，June，1986)，由日本臨床腫瘤學(xué)協(xié)會(huì)出版通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)判別分析研究了每個(gè)SNP的鑒定能力，以判斷待分析的463個(gè)SNPs是否都是這些病例的鑒定因子。通過(guò)皮爾森卡方檢驗(yàn)確定的顯著性p＞0.1的SNPs推測(cè)具有低的鑒定能力，因此被排除在分析外。
這樣就從463個(gè)SNPs中排除了445個(gè)SNPs，只留下18個(gè)SNPs作為候選SNPs。此外，當(dāng)存在彼此間有密切相互關(guān)系的多個(gè)變量時(shí)，由于多變量分析的特性，需要調(diào)查多變量之中僅僅一個(gè)單變量的鑒定能力。因此，在實(shí)施邏輯回歸分析之前，利用Cramer′s V統(tǒng)計(jì)(L.D.Fisher and G.V.Belle，Biostatistics，A Methodology for the HealthSciences，278，1993，John Wiley&Sons，Inc.，New York)調(diào)查了彼此有密切相互關(guān)系的SNPs，這樣就將待分析的SNPs的數(shù)目由18減少到了16。
在利用逐步的邏輯回歸模型(L.D.Fisher and G.V.Belle，Biostatistics，A Methodology for the Health Sciences，638-647，1993，JohnWiley&Sons，Inc.，New York)調(diào)整與腫瘤抑制有關(guān)的背景因素的影響之后，假定通過(guò)上述分析最后剩下的SNPs具有鑒定能力。
調(diào)整的背景因素有性別、年齡、組織發(fā)現(xiàn)(細(xì)胞類型、等級(jí)、pT、pM、發(fā)作和復(fù)發(fā)、肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、大腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)。使用的顯著性水平是0.05。
結(jié)果顯示在表3和表4中。
因?yàn)橥ㄟ^(guò)邏輯回歸分析被確定為能進(jìn)行有效評(píng)估的唯一背景因素是存在/缺少肺轉(zhuǎn)移，因此該因素被強(qiáng)制合并到模型中，借此采用逐步邏輯回歸分析分析13種SNPs。結(jié)果顯示在表5中。
表5步驟0.肺轉(zhuǎn)移進(jìn)入 步驟1.肺轉(zhuǎn)移&IL4R-29組合
在表5中，″效果″下的項(xiàng)目是測(cè)試的SNPs。″DF″指自由度。
Wald卡方指Wald′s卡方統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，Score卡方指Score′s卡方(χ2)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，Pr＞ChiSq是Wald′s卡方檢驗(yàn)或Score′s卡方檢驗(yàn)的P值。
如表5所示，步驟0顯示調(diào)整存在肺轉(zhuǎn)移的影響之后的SNPs鑒定能力。SNPs的P值小于0.05表示即使在調(diào)整存在肺轉(zhuǎn)移的影響后對(duì)鑒定仍然有用。
結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)對(duì)鑒定有用的SNPs有STAT3-2、IL-4R-29、IL-4r-22、IRF2-82和TAP2-5。在這六個(gè)SNPs之中顯示出具有最高鑒定能力的IL-4R-29被合并到邏輯回歸分析模型(肺轉(zhuǎn)移調(diào)整)中。
表5的步驟1中的P值顯示剩余SNPs在存在/缺乏肺轉(zhuǎn)移和組合了IL-4R-29時(shí)的鑒定能力。SNPs的P值小于0.05表明其具有獨(dú)立于IL-4R-29的鑒定信息。
這種SNPs有STAT3-2、IRF2-82和TAP2-5。在調(diào)整存在/缺少肺轉(zhuǎn)移的影響之后，結(jié)果表明IL-4R-29和TAP2-5組合具有最高的鑒定能力。當(dāng)在這一步驟中與IL-4R-29組合時(shí)，沒(méi)有SNPs新變成顯著性。
總之表5中顯示的結(jié)果表明除最好的候選SNPs IL-4R-29之外，顯示作為腎細(xì)胞癌病人的原發(fā)病灶和遷徙性病灶的預(yù)期腫瘤抑制的鑒定標(biāo)記的SNPs是STAT3-2、IRF2-82、IL-4R-22和TAP2-5，其在步驟0中變得顯著。
將這階段的分類整合到模型中可以防止由病人的不均勻背景因素引起的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)傾斜，調(diào)整兩個(gè)組之間的病人的這種不均勻背景因素，以及證實(shí)兩個(gè)組之間的顯著性差異值。
對(duì)確定CR+PR組和NC+PD組有用的SNPs調(diào)查研究利用來(lái)自實(shí)施例1中描述的受試者的樣品，分析其中NC組被添加到PD組的病例的與IFN對(duì)治療腎細(xì)胞癌的效果有關(guān)的給定的基因多態(tài)性。
推測(cè)NC組中腫瘤大小不變的原因是腫瘤對(duì)IFN治療不起反應(yīng)，或者雖然腫瘤對(duì)IFN起反應(yīng)，但因?yàn)槟[瘤大小太大，因此他們的外觀沒(méi)有變化。IFN反應(yīng)評(píng)價(jià)依賴于考慮的原因，但在實(shí)施例中，NC組因?yàn)槠浜愣ǖ哪[瘤大小被認(rèn)為是無(wú)反應(yīng)組?；谶@一考慮，按照如上所述將NC組添加到PD組中以進(jìn)行基因多態(tài)性分型。
在收集的86個(gè)病例中，3例被評(píng)價(jià)為無(wú)反應(yīng)，8例沒(méi)有轉(zhuǎn)移灶。將除去這11例后剩余的75例用于分析。
采用和實(shí)施例1相同的方式，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)判別分析分析463個(gè)SNPs的個(gè)體鑒定能力，將推測(cè)具有低鑒定能力的SNPs從分析候選SNPs中除去。作為這種篩選的結(jié)果，從463個(gè)SNPs中排除了441個(gè)SNPs，只留下23個(gè)SNPs作為候選SNPs。
此外，在實(shí)施邏輯回歸分析之前，利用Cramer′s V調(diào)查了彼此有密切相互關(guān)系的SNPs的組合，這樣就將待分析的SNPs的數(shù)目由23減少到了17。
在調(diào)整與腫瘤抑制有關(guān)的背景因素的影響之后，利用逐步的邏輯回歸模型評(píng)估最后17個(gè)SNPs的鑒定能力。
只調(diào)整在上文的實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)的可能與腫瘤抑制相關(guān)的背景因素--肺轉(zhuǎn)移。顯著性水平是0.05。表6和7顯示了顯著性水平p≤0.1的23個(gè)SNPs作為個(gè)體SNP鑒定能力的的分析結(jié)果。
表6
表7
獲得表示這23個(gè)SNPs之間的相關(guān)度的Cramer′s V值，結(jié)果顯示STAT3-2、STAT3-21、STAT3-25和STAT3-52的鑒定能力被認(rèn)為大致相同。同樣，STAT3-18和STAT3-31鑒定能力相等，而且IL-4R-14、IL-4R-18和IL-4R-26的鑒定能力也相等。因此，STATA3-2、STAT3-18和IL-4R-14被作為來(lái)自每個(gè)組的代表用于多變量分析。結(jié)果，只剩下17個(gè)SNPs用于分析。
在75例已經(jīng)證實(shí)存在或缺少肺轉(zhuǎn)移的病例中，2例部分缺失SNP分析數(shù)據(jù)的病例被排除，剩下73例作為最后的候選者用于分析。
存在或缺少肺轉(zhuǎn)移被強(qiáng)制進(jìn)入模型，并對(duì)17個(gè)SNPs進(jìn)行逐步邏輯回歸分析。以與上文表5相同的方式將結(jié)果顯示在表8中。
表8步驟0.肺轉(zhuǎn)移合并 步驟1. 肺轉(zhuǎn)移肺轉(zhuǎn)移與STAT3-2組合 步驟2與STAT-3-2和PTGS1-4組合
表8中的步驟0顯示調(diào)整存在或缺少肺轉(zhuǎn)移影響之后的SNPs鑒定能力。SNPs的P值小于0.05表示即使在調(diào)整存在/缺少肺轉(zhuǎn)移影響后對(duì)鑒定仍然有效。發(fā)現(xiàn)能進(jìn)行有效鑒定的SNPs有STAT3-2、STAT3-17、SSI3-1、IL-4R-22、PTGS1-4和PTGS1-5。在這六個(gè)SNPs之中顯示出最高鑒定能力的STAT3-2被合并到模型中。
步驟1的P值表示存在或缺少肺轉(zhuǎn)移與STAT3-2組合時(shí)，剩余的每個(gè)SNPs的鑒定能力。SNPs的P值小于0.05表明其具有獨(dú)立于STAT3-2的鑒定信息。這種SNPs有SSI3-1、IL-4R-22、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS1-4、PTGS1-5、PTGS2-12和TAP2-5。在調(diào)整存在或缺少肺轉(zhuǎn)移的影響之后，結(jié)果表明在這些SNP之中STAT3-2和PTGS1-4組合具有最高的鑒定能力。與STAT3-2組合時(shí)，第一次顯示出對(duì)鑒定有用的SNPs有ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS2-12和TAP2-5。
步驟2表示存在/缺少肺轉(zhuǎn)移與STAT3-2和PTGS1-4組合時(shí)，剩余的每個(gè)SNPs的鑒定能力。當(dāng)與STAT3-2和PTGS1-4組合時(shí)，顯示具有獨(dú)立于STAT3-2和PTGS1-4的信息的有用變量有IL-4R-22、IRF2-67和ICSBP-38。結(jié)果顯示在這一階段IRF2-67是首次鑒定有用的SNP。
總之表8中顯示的結(jié)果表明除最好的候選SNPs STAT3-2之外，在腎細(xì)胞癌病人的原發(fā)病灶和遷徙性病灶的預(yù)期腫瘤抑制的鑒定標(biāo)記的SNPs有STAT3-17、SSI3-1、IL-4R-22、PTGS1-4和PTGS1-5，其在步驟0中變得重要；在步驟1中變成新的重要SNPs的ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS2-12和TAP2-5；在步驟2中變成新的重要SNPs的IRF2-67。
實(shí)施例1和2進(jìn)行的在CR+PR組和PD組之間的比較分析顯示STAT3-2、IL-4R-29、IL-4R-14、IL-4R-22、IRF2-82和TAP2-5是與IFN對(duì)腎細(xì)胞癌的治療效果(腫瘤抑制效果)相關(guān)的基因多態(tài)性，而且TAP2-5、STAT3-17、SSI3-1、IL-4R-22、PTGS1-4、PTGS1-5、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS2-12、TAP2-5和IRF2-67在CR+PR組和NC+PD組之間的比較中也被認(rèn)為是這種基因多態(tài)性。
在CR+PR組和PD組之間的比較中，結(jié)果顯示STAT3-2具有最高的鑒定能力，在CR+PR組和NC+PD組之間的比較中，結(jié)果顯示IL-4R-29具有最高的鑒定能力。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)STAT3-3一樣與STAT3-18有關(guān)。
依照上文獲得的結(jié)果，本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)腎細(xì)胞癌病人對(duì)干擾素治療反應(yīng)的方法，通過(guò)從腎細(xì)胞癌病人標(biāo)本制備基因組序列或其互補(bǔ)鏈，作為與IFN對(duì)腎細(xì)胞癌的治療效果(腫瘤抑制效果)有關(guān)的基因多態(tài)性、、確定基因組DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列，利用至少一種選自STAT3-2、STAT3-3、STAT3-17、STAT3-18、SSI3-1、IL-4R-22、IRF2-67、IRF2-82、ICSBP-38、PTGS1-3、PTGS1-4、PTGS1-5、PTGS2-12、TAP2-5、IL-4R-14、IL-4R-29和IRF2-67的基因的基因多態(tài)性或基因型的存在作為鑒定標(biāo)記。
工業(yè)實(shí)用性依照本發(fā)明，檢測(cè)是否存在與IFN對(duì)治療腎細(xì)胞癌的效果(腫瘤抑制效果)有關(guān)的基因多態(tài)性，檢測(cè)的多態(tài)性作為指示物可以方便地用作對(duì)IFN治療腎細(xì)胞癌反應(yīng)的鑒定標(biāo)記。
序列表自由文本序列號(hào)1-32顯示引物序列。
序列表序列表<110>大塚制藥株式會(huì)社(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)<120>對(duì)干擾素治療腎細(xì)胞癌反應(yīng)的鑒定標(biāo)記(Identification marker responsive to interferontherapy for renal cell cancer)<130>SCT071777-47<150>JP 2004-314160<151>2004-10-28<160>32<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for STAT3-2<400>1gagagtggga ggagggagag 20<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for STAT3-3<400>2gcagccagtg gaagaatagg 20<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for STAT3-17<400>3ggcctgaagt gactttttgg 20<210>4<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for STAT3-18<400>4gttacaaggc tgaaggctgc 20<210>5<211>20<212>DNA<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(forward)for SSI3-1<400>5tccacttgtg gttgctatcg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for IL-4R-22<400>6tgcaagtcag gttgtctgga 20<210>7<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for IRF2-67<400>7actgatgaac cggtttgctt 20<210>8<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for IRF2-82<400>8tgaagaaaag gggtgtggag 20<210>9<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for ICSBP-38<400>9ggtttgtgat tacggetggt 20<210>10<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for PTGS1-3<400>10tccaggactg agcgtgacta 20<210>11
<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for PTGS1-4<400>11atcccatgaa gggggtttag 20<210>12<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for PTGS1-5<400>12gaagggatgg aaagggagag 20<210>13<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for PTGS2-12<400>13tcagacagca aagcctaccc 20<210>14<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for TAP2-5<400>14gggtaggagg taggaggcag 20<210>15<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for IL-4R-14<400>15ctctctggga cacggtgact 20<210>16<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(forward)for IL-4R-29<400>16tgtcctctac cttttccccc 20
<210>17<211>21<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for STAT3-2<400>17tcccaaagtg acaggttttt g21<210>18<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for STAT3-3<400>18cacatggttc cccagatacc 20<210>19<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for STAT3-17<400>19aggcttcctt ttgttccgtt 20<210>20<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for STAT3-18<400>20accgtcccct acaatgtctg 20<210>21<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for SSI3-1<400>21attacatcta ctccgggggc 20<210>22<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for IL-4R-22
<400>22tgcgatgtgt ggagttgttt 20<210>23<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for IRF2-67<400>23gtagcctcca tctgtgccat 20<210>24<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for IRF2-82<400>24gtcaatgttt ggcggagttc 20<210>25<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for ICSBP-38<400>25ttgggaaagg cacagaattt 20<210>26<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for PTGS1-3<400>26ggacttgact cagtgcccat 20<210>27<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for PTGS1-4<400>27aatcttgcag cctgacacct 20<210>28<211>20<212>DNA<213>Artificial
<220>
<223>Primer sequence(reverse)for PTGS1-5<400>28ggagggactc acccaagaat 20<210>29<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for PTGS2-12<400>29tgggagcagg aaagaactga 20<210>30<211>21<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for TAP2-5<400>30ttttcatgcc tctttcaggt g21<210>31<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for IL-4R-14<400>31gtggagtgtg aggaggagga 20<210>32<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer sequence(reverse)for IL-4R-29<400>32agtagaaccc gagatgccct 20
權(quán)利要求
1.一種評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制的方法，該方法包括下列步驟(i)到(iv)(i)獲取來(lái)源于腎細(xì)胞癌病人的DNA樣品的步驟，(ii)利用在上述步驟(i)中獲得的DNA樣品，制備選自STAT3基因、SSI3基因、IL-4R基因、IRF2基因、ICSBP基因、PTGS1基因、PTGS2基因和TAP2基因的至少一種基因的基因組DNA或者其互補(bǔ)鏈的步驟，(iii)分析基因組DNA或其互補(bǔ)鏈的DNA序列并確定其基因多態(tài)性的步驟，和(iv)利用上述步驟(iii)中確定的至少一種基因多態(tài)性作為標(biāo)記評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制的步驟。
2.權(quán)利要求1的評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制的方法，其中基因多態(tài)性是選自STAT3基因、IL-4R基因、IRF2基因和TAP2基因的至少一種基因的多態(tài)性。
3.權(quán)利要求1的評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制的方法，其中基因多態(tài)性是選自下列(a)到(p)的至少一種多態(tài)性(a)在STAT3基因的位置4243095處具有基因型C/T或T/T的基因多態(tài)性(STAT3-2)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1905341表示，(b)在STAT3基因的位置4264926處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(STAT3-3)，用參考的SNP ID編號(hào)rs4796793表示，(c)在STAT3基因的位置4204027處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(STAT3-17)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2293152表示，(d)在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(STAT3-18)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2293153表示，(e)在SSI3基因的位置10246541處具有基因型A/C的基因多態(tài)性(SSI3-1)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2280148表示，(f)在IL-4R基因的位置18686025處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IL-4R-22)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1805011表示，(g)在IRF2基因的位置17736877處具有基因型A/A的基因多態(tài)性(IRF2-67)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2797507表示，(h)在IRF2基因的位置17744613處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IRF2-82)，用參考的SNP ID編號(hào)rs796988表示，(i)在ICSBP基因的位置390141處具有基因型A/A或A/C的基因多態(tài)性(ICSBP-38)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2292982表示，(j)在PTGS1基因的位置26793813處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-3)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1213264表示，(k)在PTGS1基因的位置26794182處具有基因型C/T的基因多態(tài)性(PTGS1-4)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1213265表示，(l)在PTGS1基因的位置26794619處具有基因型A/G的基因多態(tài)性(PTGS1-5)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1213266表示，(m)在PTGS2基因的位置15697329處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(PTGS2-12)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2745557表示，(n)在TAP2基因的位置23602539處具有基因型G/G的基因多態(tài)性(TAP2-5)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2071466表示，(o)在IL-4R基因的位置18686068處具有基因型C/C的基因多態(tài)性(IL-4R-14)，用參考的SNP ID編號(hào)rs2234898表示，(p)在IL-4R基因的位置1868553處具有基因型T/T的基因多態(tài)性(IL-4R-29)，用參考的SNP ID編號(hào)rs1801275表示。
4.權(quán)利要求3的評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制的方法，其中基因多態(tài)性是權(quán)利要求3的(a)、(f)、(h)、(n)、(o)和(p)中的任何一個(gè)。
5.權(quán)利要求1的評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制的方法，其中IFN選自天然IFN-α、重組IFN-α和重組IFN-γ。
6.權(quán)利要求1的評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌病人的腫瘤抑制的方法，其中基因多態(tài)性是通過(guò)選自直接測(cè)序、等位基因特異的寡核苷酸(ASO)-斑點(diǎn)印跡分析、單核苷酸引物延伸法、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、PCR限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析、侵入方法、定量實(shí)時(shí)PCR和使用質(zhì)譜儀的質(zhì)量陣列中的至少一種方法確定的。
7.權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)侵入方法或直接測(cè)序確定基因多態(tài)性。
8.權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)PCR-RFLP分析確定基因多態(tài)性。
9.權(quán)利要求8的方法，其中PCR-RFLP分析是利用限制性內(nèi)切酶Msp1檢測(cè)人STAT3基因內(nèi)含子4204027處的G到C突變r(jià)s2293152。
10.權(quán)利要求6的方法，其中利用選自下列(a)到(p)的至少一種寡核苷酸確定基因多態(tài)性(a)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3基因的位置4243095處具有基因型C/T或T/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1905341表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(b)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3基因的位置4264926處具有基因型C/C的由參考SNP ID編號(hào)rs4796793表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(c)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3基因的位置4204027處具有基因型G/G的由參考SNP ID編號(hào)rs2293152表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(d)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541處具有基因型C/T的由參考SNP ID編號(hào)rs2293153表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(e)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在SSI3基因的位置10246541處具有基因型A/C的由參考SNP ID編號(hào)rs2280148表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(f)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IL-4R基因的位置18686025處具有基因型A/A的由參考SNP ID編號(hào)rs1805011表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(g)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IRF2基因的位置17736877處具有基因型A/A的由參考SNP ID編號(hào)rs2797507表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(h)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IRF2基因的位置17744613處具有基因型C/C的由參考SNP ID編號(hào)rs796988表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(i)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在ICSBP基因的位置390141處具有基因型A/A或A/C的由參考SNP ID編號(hào)rs2292982表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(j)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS1基因的位置26793813處具有基因型C/T的由參考SNP ID編號(hào)rs 1213264表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(k)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS1基因的位置26794182處具有基因型C/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1213265表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(l)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS1基因的位置26794619處具有基因型A/G的由參考SNP ID編號(hào)rs1213266表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(m)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在PTGS2基因的位置15697329處具有基因型G/G的由參考SNP ID編號(hào)rs2745557表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(n)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在TAP2基因的位置23602539處具有基因型G/G的由參考SNP ID編號(hào)rs2071466表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，(o)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IL-4R基因的位置18686068處具有基因型C/C的由參考SNP ID編號(hào)rs2234898表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)，和(p)具有由包含基因多態(tài)性位點(diǎn)的至少10個(gè)連續(xù)堿基組成的序列的寡核苷酸，其中基因多態(tài)性位點(diǎn)是在IL-4R基因的位置1868553處具有基因型T/T的由參考SNP ID編號(hào)rs1801275表示的基因多態(tài)性位點(diǎn)。
11.權(quán)利要求6的方法，其中基因多態(tài)性檢測(cè)引物對(duì)是下列(a)到(p)中的任何一對(duì)(a)由SEQ ID Nos.1和17代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(b)由SEQ ID Nos.2和18代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(c)由SEQ ID Nos.3和19代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(d)由SEQ ID Nos.4和20代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(e)由SEQ ID Nos.5和21代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(f)由SEQ ID Nos.6和22代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(g)由SEQ ID Nos.7和23代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(h)由SEQ ID Nos.8和24代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(i)由SEQ ID Nos.9和25代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(j)由SEQ ID Nos.10和26代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(k)由SEQ ID Nos.11和27代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(l)由SEQ ID Nos.12和28代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(m)由SEQ ID Nos.13和29代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(n)由SEQ ID Nos.14和30代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，(o)由SEQ ID Nos.15和31代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)，和(p)由SEQ ID Nos.16和30代表的序列組成的寡核苷酸引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了對(duì)IFN治療腎細(xì)胞癌反應(yīng)的鑒定標(biāo)記，以及檢測(cè)該標(biāo)記的方法。即，該方法包括從腎細(xì)胞癌病人的標(biāo)本中制備人基因的基因組DNA或其互補(bǔ)鏈，分析基因組DNA或其互補(bǔ)鏈的DNA序列以確定人基因的基因多態(tài)性，以及利用該多態(tài)性作為指示物評(píng)估IFN治療對(duì)腎細(xì)胞癌的腫瘤抑制效果。
文檔編號(hào)G01N27/62GK101048504SQ20058003725
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月28日
發(fā)明者關(guān)豐和, 白土敬之, 小川修, 內(nèi)藤誠(chéng)二, 塚本泰司, 東間纮, 平尾佳彥, 香川征, 野瀨善明, 中村剛 申請(qǐng)人:大塚制藥株式會(huì)社