專利名稱：用于親和分離的微泡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于親和分離、親和純化和親和分析的基于親和分子包衣微泡的方法、組合物及試劑盒。
背景技術(shù)：
細胞、病毒、細菌和水溶性分子的分離領(lǐng)域已使用了各種微粒作為固相來吸附或結(jié)合所關(guān)注的目標物質(zhì)。例如，配體(如抗體)包衣的磁性微粒可以結(jié)合到靶細胞或水溶性蛋白質(zhì)上。目標物質(zhì)通過結(jié)合到磁性微粒上，實現(xiàn)了其與他類細胞或蛋白質(zhì)的分離。目前對該原創(chuàng)性工作已有各種改進，且多年前就出現(xiàn)有商業(yè)化產(chǎn)品。
其他研究者曾經(jīng)使用過橡膠顆粒、脂質(zhì)體、乳脂球和塑料顆粒(如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、尼龍等)。作為捕獲載體，這些物質(zhì)都具有其各自的特性和問題。對非目標細胞或蛋白質(zhì)的非特異性吸附是這些方法中最常見的問題，從而導(dǎo)致分離不良。此外，大多數(shù)方法在結(jié)合步驟以后都需要至少一個附加步驟以實現(xiàn)未結(jié)合樣品和微粒結(jié)合物之間的分離，如磁性微粒需要施加磁場；有時需要通過離心或過濾將微粒從溶液中分離。
微粒結(jié)合目標細胞或蛋白質(zhì)所需的時間通常與其表面積和單位體積溶液中的微粒數(shù)相關(guān)。顆粒越小，表面積越大，從而結(jié)合越快。然而，大的表面積通常會增加非特異性結(jié)合。
分離方法可能會根據(jù)其本身的性質(zhì)或原理共同分離不同的微粒。這在基于重力離心法(gravity centrifugation)的分離中尤為明顯，在此過程中微粒、細胞或其它物質(zhì)可能會共同形成丸狀(co-pellet)。此外，某些細胞類型如巨噬細胞和單核細胞，它們本身可以非特異性吞噬這些微粒，從而和目標細胞一起被分離。盡管通過一定的步驟或預(yù)防措施可以將以往技術(shù)中的個別問題最小化或避免，但某些局限性是內(nèi)在的且是不可能徹底克服的。目前不同的方法獲得了不同程度的成功，這表明需要尋找一個更好的解決該問題的辦法。
最理想的分離制劑應(yīng)該具有無窮大的表面積而完全沒有非特異性相互作用，從而保證結(jié)合過程可以快速進行，并將其與非目標細胞或水溶性分子的結(jié)合降至最低。理想的分離劑應(yīng)當(dāng)在不捕獲非目標細胞或分子的前提下達到其和細胞懸液或可溶性分子溶液間的分離。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于親和分離或親和分析的組合物，其包括親和分子共價包衣的微泡。本發(fā)明的一個實施方式中，所述微泡為蛋白質(zhì)微泡，如白蛋白微泡。通過向蛋白質(zhì)溶液中引入氣體，如采用超聲處理，可以制得蛋白質(zhì)微泡。作為本發(fā)明的一個方面，通過包括加熱蛋白質(zhì)溶液的方法可以向其中引入氣體。在另一實施方式中，通過蛋白質(zhì)變性或以Cr+++處理，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)微泡。
本發(fā)明的另一實施方式中，所述微泡為玻璃微泡。作為本發(fā)明的一個方面，所述玻璃微泡的密度約為0.6g/cc，平均直徑為30μm左右。
本發(fā)明中的親和分子可以是受體、配體或抗體?；蛘撸撚H和分子也可以是生物素、抗生物素蛋白或鏈親和素。
可通過例如使用異雙功能試劑，如4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯，將親和分子直接連接到微泡上。在本發(fā)明另一實施方式中，親和分子通過例如和至少另一個分子相互作用，間接連接到微泡上。作為本發(fā)明的一方面，微泡直接連接到鏈親和素上，而親和分子是生物素化的，通過鏈親和素和生物素的相互作用將親和分子連接到微泡上。
在本發(fā)明的一個實施方式中，親和分子可以通過微泡上的環(huán)氧包衣連接到微泡上。在另一實施方式中，親和分子通過微泡上的胺基官能團連接到微泡上。
作為本發(fā)明的一方面，玻璃微泡經(jīng)處理產(chǎn)生具有反應(yīng)活性的表面殘基，該殘基和3-氨丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)，產(chǎn)生胺。另一方面，玻璃微泡具有順式-二醇包衣，通過該順式-二醇(cis-diol)包衣，親和分子可以直接連接到玻璃上?？衫缛缦庐a(chǎn)生順式-二醇包衣處理玻璃微泡以產(chǎn)生具有反應(yīng)活性的表面羥基殘基，使該殘基與3-環(huán)氧丙氧基三甲氧基硅烷反應(yīng)產(chǎn)生環(huán)氧官能團，用酸處理該環(huán)氧官能團，使該環(huán)氧官能團轉(zhuǎn)化為順式-二醇官能團。
本發(fā)明也提供了一種產(chǎn)生用于親和分離或親和分析的蛋白質(zhì)微泡的方法。一方面，該方法包括加熱蛋白質(zhì)溶液。在該方法的另一方面，通過超聲處理蛋白質(zhì)溶液，向其中引入氣體，從而制得蛋白質(zhì)微泡。在該方法的另一方面，在一種氣體或混合氣體的存在下對蛋白質(zhì)溶液進行機械處理。
作為本發(fā)明的另一個方面，所述氣體為空氣，所述蛋白質(zhì)為白蛋白。通過例如Cr+++處理可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)微泡。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生用于親和分離或親和分析的微泡的方法，所述方法包括提供微泡；和對微泡進行親和分子包衣。
在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了特定樣品(species)的親和分離或親和分析的方法。根據(jù)這些實施方式，該方法包括以下步驟提供親和分子包衣的微泡的溶液，樣品與親和分子在溶液中的相互作用使微泡與在溶液中與親和分子相互作用的樣品接觸，從而產(chǎn)生樣品包衣的微泡；通過使微泡漂浮到溶液表面而達到樣品與溶液分離的目的。
作為該實施方式的一方面，樣品可以是受體、配體或抗原。在一個實施方式中，樣品為分析物。而在其它實施方式中，樣品為病毒或細胞。
作為本發(fā)明的另一方面，蛋白質(zhì)微泡，尤其是白蛋白微泡，可以在去垢劑、壓力或真空的作用下釋放樣品。
發(fā)明的詳細描述應(yīng)理解前述的總體描述和隨后的詳細描述僅用作范例和闡述，而并不用于限定本發(fā)明。如本文所用，如非特別指出，單數(shù)形式包含了復(fù)數(shù)形式。如本文所用，如非特別指出，“或”表示“和/或”的意思。此外，術(shù)語“包括(including)”及其其它形式，如“包括(includes)”或“包括(included)”的使用，是非限制性的。如本文所用，如非特別指出，“可以”表示“可能”。
每部分的標題僅用于全文的結(jié)構(gòu)布局，而并不影響主題的描述。本申請引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于專利、專利申請、文獻、書籍、手冊或論文，為了任何目的以其全文作為參考納入本文。
定義在進一步描述本發(fā)明的具體實施方式
以前，將對一系列術(shù)語進行詳盡的定義和闡述。
除非提供特定的定義，本發(fā)明中使用的術(shù)語，試驗過程、技術(shù)和方法均是其所屬技術(shù)領(lǐng)域中已知。標準化學(xué)符號與縮寫可互換使用，該化學(xué)符號可以代表其全名。因此，例如，“碳”和“C”被認為具有相同的含義?；瘜W(xué)合成、化學(xué)修飾、化學(xué)分析、藥物的配制、制劑、遞送和患者的治療可依據(jù)標準技術(shù)進行。重組DNA方法、寡聚核苷酸合成、組織培養(yǎng)等可依據(jù)標準技術(shù)進行。反應(yīng)和純化技術(shù)可如本領(lǐng)域普遍所接受地進行操作或根據(jù)本文描述進行操作例如根據(jù)廠商的說明書使用試劑盒。前述的技術(shù)和步驟基本可以依據(jù)各種概括性或詳細的參考文獻所報道的常規(guī)方法進行，這些方法在本文通篇中有引用和討論。例如，參見Sambrook等，Molecular CloningA laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))(分子克隆實驗手冊(第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989))；Harlow&Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1988))(抗體實驗手冊(冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1988))，為了任何目的以其全文作為參考納入本文。
如本文所用，所述的“氣泡”，是指一種小的、空心的、輕質(zhì)小球，尤指包裹在薄膜中的具有小球體積的氣體。氣泡內(nèi)部可以含有任何氣體，包括但不限于氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣、碳氟化合物氣體和它們的各種混合氣體，如空氣。薄膜可以是任何能夠包裹少量體積氣體的物質(zhì)，如不溶的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)；聚合物或非聚合物材料；固體，如金屬；固體玻璃、陶瓷或類似材料；或者是塑料，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、尼龍等。作為優(yōu)選的實施方式，該薄膜為白蛋白。作為另一優(yōu)選的實施方式，所述薄膜為硼硅酸鹽玻璃。在某一實施方式中，薄膜對其所處的環(huán)境和溶液穩(wěn)定。在另一實施方式中，薄膜可以選擇性的爆裂、壓碎或溶解?！拔⑴荨笔切〉臍馀?，其直徑通常在0.1μm到100μm的范圍內(nèi)，典型地在1μm到50μm的范圍內(nèi)，常常為2μm到20μm或2μm到30μm的范圍內(nèi)。
如本文所用，術(shù)語“分析物”是指分析中的待檢測且可能存在于樣品中的任何物質(zhì)。分析物可以是任何物質(zhì)，對此并無限制。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，分析物包括具有天然抗體的物質(zhì)或可制備得到抗體的物質(zhì)。分析物可以是例如蛋白質(zhì)、多肽、半抗原、碳水化合物、脂質(zhì)、藥物、細胞、細胞亞組分或細胞器(如溶酶體、線粒體)，或任意一種其它生物或非生物分子、復(fù)合物或它們的組合。在另一實施方式中，分析物為一種抗體。而在另一實施方式中，分析物為核酸(DNA、RNA、PNA、以及它們的混合物或包括核苷衍生物或類似物的核酸)。
可利用本發(fā)明中的組合物、方法或試劑盒檢測的多價配體分析物通常為聚氨基酸，即多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核酸以及它們的組合。這種組合包括細胞組分、組織、細菌、病毒、細胞壁、細胞膜、細胞器、染色體、基因、線粒體、細胞核等等。根據(jù)本發(fā)明的一方面，特定的分析物不包含核酸。
利用本發(fā)明中的方法可以有利地檢測各種蛋白質(zhì)分析物。這些蛋白質(zhì)可以根據(jù)其家族(每個家族中的蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)構(gòu)特性)、生物學(xué)功能、以及與特定微生物的關(guān)系(尤其是致病微生物)等等進行分類。本發(fā)明尤為關(guān)注的蛋白質(zhì)家族包括例如免疫球蛋白、細胞因子、酶、激素、癌抗原、營養(yǎng)標記物(nutritional marker)、組織特異性抗原以及生物戰(zhàn)劑。這些蛋白質(zhì)分析物可能存在于血液、血清、血漿、脊髓液、滑液、唾液、尿液、精液、修復(fù)液(prostheticfluid)、細胞或組織中。
以下列出了用本發(fā)明的組合物、方法及試劑盒可以檢測的在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)分析物種類的例子魚精蛋白(protamines)組蛋白(histones)白蛋白(albumins)球蛋白(globulins)硬蛋白(scleroproteins)磷蛋白(phosphoproteins)粘蛋白(mucoproteins)以下列出的存在于人血漿中的，具有重要臨床意義的蛋白質(zhì)的例子，可以用本發(fā)明中的組合物、方法及試劑盒對其進行檢測α1-脂蛋白(α1-Lipoprotein)α1-抗胰蛋白酶(α1-Antitrypsin)皮質(zhì)激素傳遞蛋白(Transcortin)4.6S-后白蛋白(4.6S-Postalbumin)色氨酸缺陷蛋白(Tryptophan-poor)α1-糖蛋白(α1-Glycoprotein)α1x-糖蛋白(α1x-Glycoprotein)甲狀腺素結(jié)合球蛋白(Thyroxin-binding globulin)α-間胰蛋白酶抑制劑(Inter-α-trypsin-inhibitor)Gc-球蛋白(Gc-globulin)
(Gc 1-1)(Gc 2-1)(Gc 2-2)結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin)(Hp 1-1)(Hp 2-1)(Hp 2-2)血漿銅藍蛋白(Ceruloplasmin)乙酰膽堿酯酶(Cholinesterase)α2-脂蛋白(α2-Lipoprotein(s))肌紅蛋白(Myoglobin)C-反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein)α2-巨球蛋白(α2-Macroglobulin)α2-HS-糖蛋白(α2-HS-glycoprotein)Zn-α2-糖蛋白(Zn-α2-glycoprotein)α2-神經(jīng)胺酸糖蛋白(α2-Neuramino-glycoprotein)促紅細胞生成素(Erythropoietin)β-脂蛋白(β-lipoprotein)轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)血液結(jié)合素(Hemopexin)纖維蛋白原(Fibrinogen)血纖維蛋白溶酶原(Plasminogen)β2-糖蛋白 I(β2-glycoprotein I)β2-糖蛋白 II(β2-glycoprotein II)免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)(IgG)或γG-球蛋白(IgG orγG-globulin)分子式γ2k2或γ2λ2免疫球蛋白A(IgA)或γA球蛋白(IgA or γA-globulin)分子式(α2κ2)n或(α2κ2)n免疫球蛋白M(IgM)或γM球蛋白(IgM orγM-globulin)分子式(μ2κ2)5或(μ2λ2)5
免疫球蛋白D(IgD)或γD球蛋白(γD)(IgD or γD-globulin)分子式(.δ.2κ2)或(.δ.2λ2)免疫球蛋白E(IgE)或γE球蛋白(γE)(IgE or γE-globulin)分子式(ε2κ2)或(ε2λ2)游離的κ和λ輕鏈(Free κ and λ light chains)補體因子(Complement factors)C′1C′1qC′1rC′1sC′2C′3β1Aα2DC′4C′5C′6C′7C′8C′9用本發(fā)明的組合物、方法及試劑盒可以檢測的重要凝血因子包括下表中列出的例子表1凝血因子


利用本發(fā)明中的組合物、方法及試劑盒可以檢測的重要的蛋白質(zhì)激素包括肽和蛋白質(zhì)激素(Peptide and Protein Hormones)甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone(parathromone))降鈣素(Thyrocalcitonin)胰島素(Insulin)胰高血糖素(Glucagon)恥骨松弛激素(Relaxin)促紅細胞生成素(Erythropoietin)促黑素細胞激素(黑素細胞刺激激素；中葉素)(Melanotropin(melanocyte-stimulating hormone；intermedin)生長激素(Somatotropin(growth hormone))促腎上腺皮質(zhì)激素(Corticotropin(adrenocorticotropic hormone))促甲狀腺素(Thyrotropin)卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone)黃體生成素(促間質(zhì)細胞激素)(Luteinizing hormone(interstitialcell-stimulating hormone))催乳激素(Luteomammotropic hormone(luteotropin，prolactin))促性腺激素(絨毛膜促性腺激素)(Gonadotropin(chorionic gonadotropin))組織激素(Tissue Hormones)分泌素(Secretin)胃泌素(Gastrin)血管緊張素I和II(Angiotensin I and II)舒緩激肽(Bradykinin)人胎盤催乳激素(Human placental lactogen)細胞因子(Cytokines)
IL 1IL 2IL 4IL 6Il 8Il 10EGFTNFNGF癌抗原(Cancer Antigens)PSACEAα-胎蛋白(α-fetoprotein)酸性磷酸酶(Acid phosphatase)CA19.9CA125組織特異性抗原(Tissue Specific Antigens)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)肌紅蛋白(myoglobin)CPK-MB肌鈣蛋白(Troponin)BNP原BNP降鈣素(Calcitonin)髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein)神經(jīng)垂體來源的肽類激素(Peptide Hormones from the Neurohypophysis)催產(chǎn)素(Oxytocin)抗利尿激素(Vasopressin)釋放因子(RF，Releasing factors)CRF，LRF，TRF，生長激素釋放因子(Somatotropin-RF)，GRF，F(xiàn)SH-RF，PIF，MIF蓖麻蛋白(Ricin)
白喉毒素(Diptheria toxin)肉毒桿菌毒素(Botulism toxin)葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcus enterotoxin B)細菌和病毒也可以作為分析物，用本發(fā)明中的組合物、方法及試劑盒進行檢測。包括以下生物分析物棒狀桿菌(Corynebacteria)白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)肺炎球菌(Pneumococci)肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)鏈球菌((Streptococci)化膿鏈球菌(Streptococcus pyrogenes)唾液鏈球菌(Streptococcus salivarus)葡萄球菌(Staphylococci)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)奈瑟氏菌(Neisseria)腦膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitides)淋球菌(Neisseria gonorrhea)腸細菌(Enterobacteriaciae)大腸桿菌(Caliform)大腸埃希桿菌(Escherichia coli)產(chǎn)氣腸桿菌(Aerobacter aerogenes)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)沙門氏菌(Salmonellae)傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhosa)豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)志賀氏菌(Shigellae)痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteria)施米茨氏志賀氏菌(Shigella schmitzii)
膠醇志賀氏菌(Shigella arabinotard)弗萊克斯納氏志賀氏菌(Shigella flexneri)鮑伊德氏志賀氏菌(Shigella boydii)宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigella sonnei)其它腸道桿菌(Other enteric bacilli)普通變形桿菌(Proteus vulgaris)奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)不動桿菌屬(Proteus species)摩根氏變形桿菌(Proteus morgani)綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)嗜血-伯德特氏群(Hemophilus-Bordetella Group)流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza)杜克雷嗜血桿菌(Hemophilus ducryi)嗜血桿菌(Hemophilus hemophilus)埃及嗜血桿菌(Hemophilus aegypticus)副流感嗜血菌(Hemophilus parainfluenza)百日咳伯德特氏菌(Bordetalla pertussis)巴斯德氏菌(Pasteurellae)鼠疫巴斯德氏桿菌(Pasteurella pestis)土拉巴斯德氏桿菌(Pasteurella tulareusis)布魯氏菌(Brucellae)羊布魯氏菌(Brucella melitensis)流產(chǎn)布氏桿菌(Brucella abortus)豬布魯氏菌(Brucella suis)需氧芽孢桿菌(Aerobic Spore-forming Bacilli)炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)
厭氧芽孢桿菌(Anaerobic Spore-forming Bacilli)肉毒梭菌(Clostridium botulium)破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)諾維氏梭菌(Clostridium novyi)腐敗梭菌(Clostridium septicum)溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)第三梭菌(Clostridium tertium)雙酶梭菌(Clostridium bifermentans)產(chǎn)孢梭菌(Clostridium sporogenes)分支桿菌(Mycobacteria)人結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis hominis)牛分支桿菌(Mycobacterium bovis)鳥分支桿菌(Mycobacterium avium)麻風(fēng)分支桿菌(Mycobacterium leprae)副結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium paratuberculosis)放線菌(類真菌樣細菌)(Actinomycetes(fungus-like bacteria)伊斯雷爾氏放線菌(Actinomyces Isaeli)牛放線菌(Actinomyces bovis)奈斯隆迪氏放線菌(Actinomyces naeslundii)星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroids)巴西諾卡氏菌(Nocardia brasiliensis)螺旋體(The Spirochetes)梅毒密螺旋體(Treponema pallidum)細弱密螺旋體(Treponema pertenue)品它病密螺旋體(Treponema carateum)回歸熱螺旋體(Borrelia recurrentis)黃疸出血鉤端螺旋體(Leptospira icterohemorrhagiae)犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)錐蟲體(Trypanasomes)支原體(Mycoplasmas)
肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)其它病原體(Other pathogens)立克次氏體(類細菌樣諸蟲)(Rickettsiae(bacteria-like parasites))普瓦基克氏立克次氏體(Rickettsia prowazekki)莫賽爾氏立克次氏體(Rickettsia mooseri)立氏立克次氏體(Rickettsia rickettsii)康諾爾氏立克次氏體(Rickettsia conori)澳大利亞立克次氏體(Rickettsia australis)西伯利亞立克次氏體(Rickettsia sibiricus)小蛛立克次氏體(Rickettsia akari)恙蟲熱立克次氏體(Rickettsia tsutsugamushi)衣原體(不可歸類的寄生細菌或病毒)(Chlamydia(unclassifiableparasitesbacterial/viral))衣原體因子(不確定命名)(Chlamydia agents(naming uncertain))真菌(Fungi)新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)莢膜組織胞漿菌(Hisoplasma capsulatum)粗球孢子菌(Coccidioides immitis)巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)白色念珠菌(Candida albicans)煙曲霉菌((Aspergilus fumigatus)傘狀毛霉菌(傘枝犁頭霉)(Mucor corymbifer(Absidia corymbifera))米根霉(Rhizopus oryzae)無根根霉菌(Rhizopus arrhizua)藻菌(Phycomycetes)黑色根霉菌(Rhizopus nigricans)申克氏孢子絲菌(Sporotrichum schenkii)裴氏著色霉(Flonsecaea pedrosoi)緊密著色芽生菌(Fonsecacea compact)
皮炎著色芽生菌(Fonsecacea dermatidis)卡氏枝孢霉(Cladosporium carrionii)疣狀瓶霉(Phialophora verrucosa)構(gòu)巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)足馬杜拉分支菌(Madurella mycetomi)灰馬杜拉分支菌(Madurella grisea)波伊德霉樣真菌(Allescheria boydii)瓊?cè)麪柮肥掀棵咕?(Phialophora jeanselmei)石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)須發(fā)癬菌(Trichophyton mentagrophytes)埃吉羅氏角質(zhì)線菌(Keratinomyces ajelloi)犬小孢子菌(Microsporum canis)奧杜盎氏小孢子菌(Microsporum adouini)紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)病毒(Viruses)腺病毒(Adenoviruses)皰疹病毒(Herpes Viruses)單純皰疹(Herpes simplex)水痘(禽痘)(Varicella(Chicken pox))帶狀皰疹(Herpes Zoster(Shingles)病毒B(Virus B)細胞巨化病毒(Cytomegalovirus)痘病毒(Pox Virus)天花(Variola(smallpox))牛痘(Vaccinia)牛痘病毒(Poxvirus bovis)副牛痘(Paravaccinia)傳染性軟疣(Malluscum contagiosum)微小核糖核酸病毒(Picornaviruses)脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)
柯薩奇病毒(Coxsachievirus)艾柯病毒(Echoviruses)鼻病毒(Rhinoviruses)黏病毒(Myxoviruses)副流感病毒(1-4)(Parainfluenza(1-4))腮腺炎病毒(Mumps Virus)新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)麻疹病毒(Measles Virus)牛瘟病毒(Rinderpest Virus)犬瘟病毒(Canine Distemper Virus)呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)風(fēng)疹病毒(Rubella Virus)蟲媒病毒(Arboviruses)東部馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus)西部馬腦炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus)辛德畢斯病毒(Sindbis Virus)奇孔岡雅病毒(Chikugunya Virus)塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)梅阿羅病毒(Mayora Virus)圣路易腦炎病毒(St.Louis Encephalitis Virus)普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)加利福利亞腦炎病毒(Califrnia Encephalitis Virus)科羅拉多蜱傳熱病毒(Colorado Tick Fever Virus)黃熱病病毒(Yellow Fever Virus)登革病毒(Dengue Virus)呼吸道腸道病毒(Reoviruses)呼吸道腸道病毒1-3型(Reovirus Types 1-3)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(Retroviruses)人類免疫缺陷病毒I和II型(HIV)(Human Immunodeficiency VirusesI and II (HIV))人嗜T淋巴細胞病毒I和II型(HTLV)(Human T-cell LymphotrophicVirus I & II(HTLV))肝炎(Hepatitis)甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus)乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)癌病毒(Cancer Viruses)勞舍爾氏白血病病毒(Rauscher Leukemia Virus)格勞斯氏病毒(Gross Virus)馬龍尼氏白血病病毒(Maloney Leukemia Virus)人乳突瘤病毒(Human Papilloma Virus)此外，需要檢測患者的正常或患病的組織或細胞。例如，特定循環(huán)癌細胞或其它細胞的存在或缺失，對于疾病可能具有診斷價值。因此，病人的內(nèi)源性細胞可作為分析物，通過本發(fā)明中的組合物、方法及試劑盒可以方便的對其進行檢測。
本文所述的“親和分子”指的是可以特異性結(jié)合另一分子的任意分子。在本發(fā)明的某一實施方式中，所述親和分子為抗體。在本發(fā)明的另一實施方式中，所述親和分子為抗原。在其它實施方式中，親和分子包括但不限于核酸(DNA、RNA、PNA、以及它們的混合物，或包含核苷酸衍生物或類似物的核酸)；生物受體分子(如胰島素受體)；受體的對應(yīng)配體(如對應(yīng)于胰島素受體的胰島素)；對另一分子具有親和力的生物分子、化學(xué)分子及其它分子，如生物素和抗生物素蛋白。本發(fā)明中的親和分子不一定包含完整的天然分子，而可以僅由天然分子或非天然分子的一個部份、一個片段或一個亞單元組成，如抗體的Fab片段。此外，所述親和分子也包含可檢測的標記。
親和分子可以通過本領(lǐng)域中任何已知的方法產(chǎn)生。例如，抗體可存在于抗血清中，可以從雜種瘤組織培養(yǎng)液上清中或腹水液中制備得到，或可通過本領(lǐng)域中熟知的重組表達系統(tǒng)制得。通過化學(xué)反應(yīng)、酶促反應(yīng)或其它反應(yīng)可以制得抗體、受體或其它組分的片段、部分或亞單位，如眾所周知的分子(如Fab，F(xiàn)ab′)或新的分子。本發(fā)明中的親和分子還包括重組分子、嵌合分子和雜交分子，如人源化抗體、靈長源化抗體以及其它非天然抗體形式分子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以發(fā)現(xiàn)，上述的關(guān)于各種抗體形式的非限制性例子還可以拓展到適用于本發(fā)明方法的其它親和分子，包括重組分子、嵌合分子、雜交分子、截斷分子等形式的非抗體分子。
如本文所用，術(shù)語“特異性地結(jié)合”和“特異性結(jié)合”指的是抗體或其它分子，尤其是本發(fā)明中的親和分子，其在本發(fā)明中的特定條件下，對目標分子(如抗原、配體和其它分析物)的親和力高于對其它分子的親和力。本領(lǐng)域中已知的抗體或抗體片段，為具有可結(jié)合其它分子(如抗原)的區(qū)域的多肽分子。在本發(fā)明的各個實施方式中，“特異性結(jié)合”指的是抗體或其它親和分子結(jié)合目標分析物分子的能力至少是其結(jié)合與目標分子不相關(guān)的其它分子的能力的106倍，優(yōu)選的倍數(shù)至少約為107，更優(yōu)選的倍數(shù)至少約為108，最優(yōu)選的倍數(shù)至少約為109。通常，特異性結(jié)合指的是親和力比非特異性結(jié)合高約106-109倍多。在某些實施方式中，特異性結(jié)合的特征為其親和力是非特異性結(jié)合的109倍多。本文所述的任意范圍，如“1-10或一到十”，表示的是該給定范圍內(nèi)的任意整數(shù)或非整數(shù)單位，沒有任何限制。因此，“1-10”表示的是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及其間的任意亞單位。
“多克隆抗體”或“PAb”，為抗體分子的異質(zhì)性群體，其來源于接受抗原或抗原功能性衍生物免疫的動物血清。通過注射抗原或半抗原-載體結(jié)合物，并任選地添加佐劑，以免疫宿主動物(如兔、小鼠或羊)，從而生產(chǎn)多克隆抗體。多克隆抗體可以是未純化、純化或部分純化，從而除去抗血清中的其它組分。多克隆抗體的制備和純化技術(shù)為本領(lǐng)域中熟知的方法，并在各類概述性的或詳盡的參考文獻中均有描述，包括但不限于Kabat & Mayer，ExperimentalImmunochemistry，2d ed.，(Thomas，Springfield，IL(1961)(《實驗免疫化學(xué)》，第二版)；Harlow & Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988))(《抗體實驗手冊》(冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1988)；Weir，Handbook of ExperimentalImmunology，5thed.(Blackwell Science，Cambridge，MA(1996))(《實驗免疫學(xué)手冊》，第五版).
“單克隆抗體”或“Mab”為針對某一特定抗原的抗體分子的同質(zhì)性群體，其可以通過制備抗體分子的任意技術(shù)制得，如通過細胞株的連續(xù)培養(yǎng)。這些技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)(Kohler & Milstein，Nature，256495-7(1975)；美國專利美國專利4,376,110))，人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，Immunology Today，472(1983)；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，802026-30(1983))，EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(《單克隆抗體與癌癥治療》)，Alan R.Liss，Inc.，New York，第77-96頁(1985))。這些抗體可屬于任何免疫球蛋白類，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其亞類。本發(fā)明中用于產(chǎn)生MAb的雜交瘤可以在體內(nèi)或體外培養(yǎng)。鑒于體內(nèi)所得的MAb的高滴定度，該方法為目前優(yōu)選的生產(chǎn)MAb的方法。
此外，本發(fā)明也可以使用用于產(chǎn)生“嵌合抗體”而開發(fā)的技術(shù)(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855(1984)；Takeda等，Nature，314452-54(1985))，該方法通過將具有適宜抗原特異性的鼠源抗體分子基因和具有特定生物活性的人源抗體基因進行剪接，制得“嵌合抗體”。“嵌合抗體”分子中的不同部分來源于不同的動物種類，如同時含有來源于鼠MAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體分子。
或者，單鏈抗體制備技術(shù)(美國專利4,946,778；Bird，Science 242423-26(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-83(1988)；Ward等，Nature，334544-46(1989))也適用于制備本發(fā)明的基因-單鏈抗體。單鏈抗體通常是通過將Fv區(qū)的重鏈和輕鏈以氨基酸鍵連接從而產(chǎn)生單鏈多肽來形成的。
識別特定抗原表位的抗體片段可以通過現(xiàn)有技術(shù)制得。例如，這些片段包括但不限于通過用胃蛋白酶消化抗體分子所得的F(ab′)2片段，通過還原F(ab′)2片段間的二硫鍵所得的Fab片段。此外，可以構(gòu)建Fab表達文庫(Huse等，Science，2461275-81(1989))，以保證以所需的特異性對單克隆Fab片段進行快速、簡便的識別。
本文所述“半抗原”是指可以被抗體識別的小的蛋白質(zhì)(proteinaceous)或非蛋白質(zhì)抗原決定簇。通常，半抗原在動物體內(nèi)不引起抗體形成，除非較大的部分種類。例如，小肽半抗原通常和載體蛋白如鑰孔血藍蛋白相結(jié)合，以產(chǎn)生抗半抗原抗體應(yīng)答。“抗原”為在動物體內(nèi)可以引起抗體應(yīng)答的大分子，其可以被所得抗體識別?？乖桶肟乖辽侔粋€抗原決定簇或“抗原表位”，作為抗原或半抗原結(jié)合抗體的部位。通常，半抗原上的抗原表位為整個分子。
“受體”或“生物受體”常特指細胞內(nèi)部或表面的一種分子結(jié)構(gòu)，其可選擇性的結(jié)合特定的物質(zhì)(如配體)并伴隨結(jié)合產(chǎn)生特定的生理效應(yīng)。受體的例子包括細胞表面的肽類激素受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體、抗原受體、補體片段受體和免疫球蛋白受體、以及胞質(zhì)中的甾體類激素受體。本發(fā)明所述的受體通常是指可以被分離純化的，而無需影響或能夠影響生理或其它生物效應(yīng)的受體。本發(fā)明的方法利用了受體對特異性物質(zhì)的選擇性結(jié)合。
術(shù)語“配體”廣義上為可以結(jié)合受體的分子。更具體的說，配體為可溶性的小分子，如激素或神經(jīng)遞質(zhì)。
“固體支持物”指任何可以用于固定諸如分析物、抗體或復(fù)合物的固相。本領(lǐng)域中常見的合適的固體支持物有反應(yīng)槽(如微量滴定板)的槽壁、試管壁、聚苯乙烯珠粒、順磁性或無磁性珠粒、硝化纖維素膜、尼龍膜、微粒(如橡膠微粒)、以及羊(或其它動物)的紅細胞。固體支持物的代表性材料包括但不限于聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯、纖維素、尼龍、橡膠以及其衍生物。此外，可以對固體支持物進行包衣、衍生化或修飾，以促進期望分子(如分析物)的附著和/或防止非特異性結(jié)合或其它非期望的相互作用。對特定“固體支持物”的選擇并不嚴格，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所用分析方法進行選擇。因此，橡膠顆粒、微粒、順磁性或無磁性珠粒、膜、塑料試管、微量滴定板壁、玻璃或硅芯片、以及紅細胞都可用作合適的固體支持物?？紤]到使用的便利，可以根據(jù)不同的檢測方法來選擇固體支持物。例如，選用96孔板或384孔板用于自動分析，如自動化工作站，和/或通過例如讀板器進行測定的分析方法。當(dāng)本發(fā)明的方法涉及到采用基于薄膜顯影的放射自顯影或化學(xué)發(fā)光檢測步驟時，可以選用薄膜作為固體支持物，如硝化纖維素膜或尼龍膜。本發(fā)明的某一實施方式中，通常選擇反應(yīng)槽孔的槽壁用于雙抗體夾心免疫分析。而在本發(fā)明的其它實施方式中，可以選用順磁性珠粒作為固體支持物。將分子固定于固體相上的方法包括離子作用、疏水作用、共價作用等，以及它們的組合作用。然而，固定的方法并非特別重要，其中可能涉及到一些不明的吸附機理。本文中所述的“固體支持物”，可以指任何不溶性物質(zhì)，或是可以通過后續(xù)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘奈镔|(zhì)。可以根據(jù)固體支持物吸附和固定捕獲劑的固有能力，對其進行選擇?；蛘?，固體相上可以保留一個附加的受體，該受體具有吸附和固定捕獲劑的能力。該附加的受體可含有和捕獲劑本身或接合在捕獲劑上的帶電體帶相反電荷的物質(zhì)。在本發(fā)明的另一實施方式中，該附加受體分子可以是任意一個特異性結(jié)合成分，其固定(或連接)在固體相上，并能通過特異性結(jié)合反應(yīng)將捕獲劑固定化。該附加的受體分子在分析前或分析過程中，可以間接地將捕獲劑固定在固體相上。因此固體相可以是塑料、塑料衍生物、順磁性或非磁性金屬、試管的玻璃或硅表面、微量滴定板、薄片、珠粒、微粒、芯片、或其它本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的元件。
“肽”廣義上指通過肽鍵連接的短鏈氨基酸。典型的肽鏈含有約2-100個氨基酸，更典型的含有4-50個氨基酸，最常見的為6-20個氨基酸?！岸嚯摹蓖ǔＶ搁L度長于肽，的單個直鏈或帶側(cè)鏈的氨基酸序列。“多肽”的長度通常為至少具有約100-1000個氨基酸，更典型的至少具有約150到600個氨基酸，而常常至少具有約200-500個氨基酸?！暗鞍踪|(zhì)”包括單個多肽和多個多肽鏈的復(fù)合物，其中每個多肽鏈可能相同或不同。蛋白質(zhì)中的多個多肽鏈，可以根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)進行辨別；它們可通過某種方式如二硫鍵相結(jié)合；它們也可包括了合成后修飾，如糖基化、磷酸化、截短或其它方法等，但不僅限于上述修飾?？贵w，如IgG蛋白，典型地具有四條通過二硫鍵相互結(jié)合的多肽鏈(即兩條輕鏈，兩條重鏈)。此外，蛋白質(zhì)可以包含附加成分，如結(jié)合的金屬(如鐵、銅和硫)和其它部分。本文關(guān)于肽、多肽和蛋白質(zhì)的定義，包括但不限于其生物活性形式和無活性形式；天然形式和變性形式；以及它們的變異、修飾、截短、雜交和嵌合形式。本發(fā)明中的肽、多肽和蛋白質(zhì)可以為任何來源或可通過任何方式獲得，包括但不限于從天然組織或其它物質(zhì)中提??；在宿主生物體(如細菌、真菌、植物、昆蟲或動物細胞)中重組生產(chǎn)；以及運用本領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟知的方法進行化學(xué)合成。
本文所述的“接合物”指通過共價結(jié)合或其它方式連接在一起的兩個分子。在某一實施方式中，通過將核酸共價結(jié)合到蛋白質(zhì)、多肽或其它親和分子上，制備了核酸結(jié)合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，蛋白質(zhì)、多肽或其它親和分子通過連接基團共價結(jié)合到核酸上，以形成結(jié)合物。
本文所述用于檢測樣品中分析物的存在的“試劑盒”可例如至少包括一個容器，其內(nèi)裝有可以特異性地結(jié)合待測分析物的結(jié)合對。該試劑盒還可包括其它容器，其內(nèi)裝有以下物質(zhì)樣品檢測必需的緩沖液、溶液或其它試劑和物質(zhì)；有助于擴增結(jié)合對中核酸探針的試劑；擴增后用于檢測核酸成分的存在的試劑。優(yōu)選的試劑盒還應(yīng)包括使用說明。如果用于疾病診斷，試劑盒還應(yīng)包括FDA的使用批準文件及其使用說明。
具體而言，間隔試劑盒包括任何試劑盒，其中試劑分別裝在獨立的容器中。這些容器包括小玻璃容器、塑料容器、塑料條或紙條。這樣的容器布局保證使用時試劑可以有效地從一個隔間(compartment)轉(zhuǎn)移到另一隔間，從而使得樣品與試劑不會交叉污染，同時每個單獨容器中的試劑或溶液可以定量的從一個隔間加入到另一隔間。這樣的容器包括可以容納待測樣品的容器、裝有分析所需的探針或底物的容器；裝有緩沖液或試劑(如磷酸緩沖鹽溶液、Tris緩沖液等)的容器；裝有用于檢測核酸標記、擴增后樣品的試劑的容器，等等。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以輕易地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中制備結(jié)合對所必需的結(jié)合對/物質(zhì)、原料或試劑可以輕易地加入本領(lǐng)域中熟知的試劑盒形式中。
根據(jù)本發(fā)明的方法，用于使DNA連接至抗體上或其它親和分子上的試劑盒可至少包括一個裝有凍干的、活化的DNA的容器。該試劑盒也可以包括其它容器，其中裝有以下物質(zhì)中的一種或多種試劑、緩沖液、反應(yīng)后用于檢測核酸存在的試劑。優(yōu)選的試劑盒還應(yīng)包括使用說明書。用于制備或利用本發(fā)明的新組合物的試劑盒和對分析物進行分離分析所用的方法可包括已制備的微泡或用于產(chǎn)生微泡的薄膜。同樣，試劑盒中的微泡可以是連接了親和分子的或未連接親和分子的。所述試劑盒中還可以包括裝有一種或多種以下物質(zhì)的其它容器試劑、緩沖液、用于產(chǎn)生微泡的試劑或?qū)⑽⑴萦糜谟H和分離、純化、濃縮的試劑等。優(yōu)選的試劑盒還應(yīng)包括使用說明書。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以很容易地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中的組合物和方法可以簡便的適用于本領(lǐng)域中已確定的試劑盒形式。
本發(fā)明提供了新型的組合物和方法，其可用于分析物也包括細胞、病毒、細胞亞組分和溶液中可溶性分子等的分離和分析。本發(fā)明基于包衣微泡，其可以特異性結(jié)合到目標分析物(細胞、病毒、細胞亞組分或可溶性分子)上。本發(fā)明中的微泡為親和分子包衣，或?qū)⒂H和分子展示于其外表面。本發(fā)明新穎的組合物和方法也可用于濃縮分析物，包括但不限于抗體、抗原、蛋白質(zhì)和核酸。
在某一實施方式中，親和分子包衣的微泡還含有可檢測的標記。在另一實施方式中，親和分子本身為可檢測的標記。在這些實施方式中，通過該標記可以檢測分析物、樣品或微泡的數(shù)量或存在與否，或?qū)ζ溥M行定量。在某一實施方式中，微泡上的所述標記為核酸，其可以為被擴增并檢測。檢測技術(shù)包括而不僅局限于PCR、核苷酸測序、PCR測序、分子信標技術(shù)(molecular beacon)、雜交、PCR后的雜交、熒光、放射性同位素標記、磷光和吸光。用于檢測的試劑的例子包括而不僅局限于放射性同位素、酶標記(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)、熒光素、磷光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光素、親和標記(如生物素、抗生物素蛋白、鏈親和素)以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的試劑。上述實施方式為非限制性的，可以預(yù)見其它適用于本發(fā)明的實施方式。
在本發(fā)明的某一實施方式中，微泡為蛋白質(zhì)微泡，其可以由任意肽、多肽、蛋白質(zhì)或其混合物組成。人工合成的或天然的肽、多肽、蛋白質(zhì)或它們的組合均符合本發(fā)明。在某一實施方式中，可以采用通入氣體來輕易制得蛋白質(zhì)微泡。在某一實施方式中，所述蛋白質(zhì)為白蛋白。
本發(fā)明中通常通過向蛋白質(zhì)溶液中引入氣體(如超聲)，可以制得蛋白質(zhì)微泡。微泡內(nèi)可以含有任何氣體，包括但不限于氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣、碳氟化合物及其各種組合，如空氣。作為本發(fā)明的一個方面，可以通過包括加熱蛋白質(zhì)溶液步驟的方法向其中引入氣體。通過加熱使蛋白質(zhì)變性，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)微泡，但并不僅局限于該理論。在另一實施方式中，可例如通過蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)固定、蛋白質(zhì)交聯(lián)或以Cr+++處理，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)微泡。作為本發(fā)明的另一方面，用醛類化合物，如戊二醛或甲醛進行交聯(lián)，可以穩(wěn)定微泡。
蛋白質(zhì)微泡的直徑一般在0.1μm到100μm的范圍內(nèi)，通常是在1μm到50μm的范圍內(nèi)，常見是在2μm到20μm或2μm到30μm的范圍內(nèi)。
本發(fā)明中的親和分子可以是受體、配體或抗體。或者，親和分子還可以是生物素、抗生物素蛋白或鏈親和素。在本發(fā)明的某一實施方式中，以鏈親和素對生物素化的微泡進行包衣，從而制得一種可以輕易被生物素化配體(如抗體)包衣的微泡。在另一實施方式中，微泡為配體包衣的微泡。
微泡的親和分子包衣過程可以選用本領(lǐng)域中的任何已知方法。有利的是，蛋白質(zhì)含有氨基官能團，其可以作為很多修飾反應(yīng)或連接反應(yīng)的基礎(chǔ)，如和醛類化合物反應(yīng)。而且，技術(shù)人員可以發(fā)現(xiàn)，可對組成微泡的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、玻璃等，進行化學(xué)衍生化或功能化，從而使其可以和各種親和分子相互作用。技術(shù)人員熟知多種用于將蛋白質(zhì)或其它分子連接到微泡上的市售試劑、產(chǎn)品和試劑盒。親和分子可以直接連接到蛋白質(zhì)上，例如通過使用異雙功能試劑，如4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯。
在本發(fā)明的另一實施方式中，親和分子通過和至少一個其它分子相互作用，間接連接到蛋白質(zhì)上。作為本發(fā)明的一個方面，微泡直接連接到鏈親和素上，而親和分子是生物素化的，從而通過鏈親和素和生物素的相互作用將親和分子連接到蛋白質(zhì)上。生物素和抗生物素蛋白/鏈親和素的相互作用，以及將上述分子連接到其它樣品上的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。也可參考概括性的或具體的教科書或?qū)嶒炇沂謨?，其中描述了生物素、抗生物素蛋白和鏈親和素的化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)及其相互作用，和/或?qū)⑸锼睾涂股锼氐鞍?鏈親和素連接到其它分子上的方法。參見例如Avidin-Biotin ChemistryA Handbook(Savage等編PierceChemical Co.，Rockford，IL，1992)(《抗生物素蛋白-生物素化學(xué)手冊》)。
作為本發(fā)明的另一方面，包衣微泡是用玻璃微泡(如由3MTM提供的微泡)制備的。硼硅酸鹽玻璃泡經(jīng)氫氧化鈉處理后，暴露出其硅表面，隨后和硅烷化劑(silanating agent)如3-氨基-丙基-三乙氧基硅烷反應(yīng)，得到伯胺包衣的表面。微泡可以和NHS-生物素反應(yīng)制得生物素化的玻璃微泡，根據(jù)需要可以對其進行鏈親和素包衣。然后可很容易地使該鏈親和素微泡與生物素化的配體(如生物素化抗體)反應(yīng)；或者，可使環(huán)氧化物包衣的玻璃微泡直接與配體反應(yīng)，或根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法對其進行直接或間接的包衣。
本發(fā)明的另一實施方式提供了樣品的親和分離或親和分析的方法。這些實施方式的方法包括下列步驟提供用親和分子包衣的微泡溶液；將樣品與該微泡接觸，所述樣品能與該親和分子在溶液中相互作用，從而制得樣品包衣的微泡；使樣品包衣的微泡和溶液分離。優(yōu)選的實施方式為使樣品包衣的微泡浮到溶液上部，從而從溶液中分離該樣品。根據(jù)這個方法，可以對所有類型的樣品進行親和分離和分析，包括蛋白質(zhì)(抗原、抗體、配體、受體、激素)、核酸、脂蛋白、脂肪、甘油三酯、糖類、碳水化合物、病毒、細胞、細胞組分、亞細胞器、亞細胞器中的組分、及其合成物。
本發(fā)明的另一實施方式提供了對樣品進行親和濃縮的方法。這些實施方式的方法包括下列步驟提供親和分子包衣的微泡溶液；將樣品與該微泡接觸，所述樣品能與該親和分子在溶液中相互作用，從而制得樣品包衣的微泡；使樣品包衣的微泡和溶液分離。優(yōu)選的實施方式為使樣品包衣的微泡浮到溶液上方，從而使該樣品與溶液分離。根據(jù)這個方法，可以濃縮各種類型的樣品，包括蛋白質(zhì)(抗原、抗體、配體、受體、激素)、核酸、脂蛋白、脂肪、甘油三酯、糖類、碳水化合物、病毒、細胞、細胞組分、亞細胞器、亞細胞器中的組分、及其合成物。
可被分離、分析、純化和濃縮的樣品可以是任何類型的物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)(抗原、抗體、配體、受體、激素)、核酸(RNA、DNA、核酸類似物及其混合物等)、脂蛋白、脂肪、甘油三酯、糖類、碳水化合物、病毒、細胞、細胞組分(溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)、亞細胞器(線粒體等)、亞細胞器中的組分、及其合成物。作為該實施方式的一方面，樣品為受體、配體或抗原。在某一實施方式中，樣品為分析物。在其它實施方式中，樣品為病毒或細胞。
本發(fā)明的包衣微泡結(jié)合到包括細胞、病毒、分析物或其它分子在內(nèi)的目標樣品上，隨后漂浮到溶液表面，從而達到與接觸溶液和非目標樣品分離的效果。在分離時間為重要參數(shù)的實施方式中，通過離心含有微泡的溶液或使用氣泡捕獲物，可以進一步縮短分離時間。
本發(fā)明中的白蛋白微泡具有如下有用的特性當(dāng)壓力或真空作用于溶液上，或加入少量去污劑或表面活性劑時，該微泡可輕易被破壞并從視野中消失。本發(fā)明的該方面在需要分離不含捕獲性微泡的目標樣品時尤為有用。例如，可能需要研究親和分離細胞的表型，或需要將分離后的細胞釋放出來用于后續(xù)分析或增殖。在本發(fā)明的某些實施方式中提供了一種簡單的方法，其可以在避免使用潛在的破壞性試劑(如酶、烈性化學(xué)試劑以及極端的pH條件)的條件下，將樣品從捕獲性微泡中釋放出來。而在其它實施方式中，分析物或樣品則通過酶解作用或化學(xué)手段從微泡中釋放出來。
玻璃微泡的優(yōu)勢在于可以用硼硅酸鹽玻璃制得，因而很大程度上不含污染物。在常規(guī)操作中，該物質(zhì)也可抗破損或毀壞。
本發(fā)明中的微泡在親和應(yīng)用方面相比固體顆粒具有額外的優(yōu)勢，即微泡的重力法向力和浮力具有不同的方向，從而顯著減少了分離過程中對那些通常向反應(yīng)容器底部沉降的樣品的非特異性結(jié)合與包裹。在不會對微泡造成不良影響的條件下，通過低離心力場和適當(dāng)?shù)碾x心速率，有助于迫開未結(jié)合的細胞，以提高分離效果。
根據(jù)后面實施例部分中的描述，將抗細菌抗體包衣的白蛋白微泡和細菌懸液混合后，所有細菌都和微泡一起被分離，使得懸液被滅菌。類似的，在對照實驗中，不含特異性抗體的微泡對細菌只有少量非特異性吸附，從而在分離后，微泡與細菌的協(xié)同純化作用低不可測。
本發(fā)明還提供了用于親和分離或親和分析的微泡的制備方法，所述方法包括步驟提供微泡；和對微泡進行親和分子包衣。
值得注意的是，根據(jù)本文的介紹，本領(lǐng)域中具有基本常識的技術(shù)人員有能力將本發(fā)明應(yīng)用于特定的問題和情況。下面的非限制性實施例進一步說明了本發(fā)明。下面的實施例，包括實驗方法和結(jié)果，僅用于說明本發(fā)明，本發(fā)明并不限于這些實施例中。
實施例白蛋白微泡實施例1 白蛋白微泡的制備室溫下用空氣飽和的生理鹽水將5％的人白蛋白溶液(USP，BayerCorporation，Elkhart，IN)稀釋到1％。取20毫升稀釋后溶液，加入到50毫升的玻璃燒杯中，使燒杯25毫升刻度以下浸沒在85℃的水浴中。利用數(shù)字溫度計監(jiān)測白蛋白溶液的溫度，并輕輕攪拌溶液。在73℃的處理溫度下將BransonDigital Sonifer450型探針(Branson Ultrasonics Corp.，Danbury，CT)加到白蛋白溶液表面，立即在80％振幅條件下超聲10秒。從水浴中取出燒杯，置于碎冰中，輕輕攪拌至溶液冷卻到40℃。室溫下將白蛋白微泡懸液轉(zhuǎn)移至150毫升的軟質(zhì)酸瓶(flexible carboy)中(FlexboyBag，Stedim，Cncord，CA)。用新鮮的溶液重復(fù)上述步驟多次，直至酸瓶裝滿。調(diào)節(jié)微泡懸液至疊氮鈉濃度為0.05％，將該酸瓶垂直置于冰箱中，放置至少24小時。超聲過程約可以將5％的可溶性白蛋白轉(zhuǎn)化為不可溶的、充滿空氣的白蛋白微泡。
實施例2 鉻穩(wěn)定白蛋白微泡的制備在一些實驗中，用Cr+++處理，以穩(wěn)定白蛋白微泡。使白蛋白微泡浮起，并除去液相，代之以5mM硫酸鉻鉀溶液。輕微震搖，使微泡保持懸液狀態(tài)，在60℃水浴中孵育30分鐘。孵育后，同下法洗掉鉻溶液，代之以1％人血清白蛋白的生理鹽水溶液。對鉻處理過的白蛋白微泡的處理方式與未用鉻處理過的白蛋白微泡相同。
實施例3 生物素包衣的白蛋白微泡的制備吸棄微泡漂浮層下方的未轉(zhuǎn)化的白蛋白溶液，代之以預(yù)冷的、空氣飽和的含0.2％的聚乙烯醇(分子量30,000到70,000)的PBS(磷酸緩沖液，pH 7.4)溶液(PVA/PBS)。輕微震搖重新懸浮微泡，并轉(zhuǎn)移至底部具塞的一次性塑料注射器中。4℃，200xg反復(fù)離心，每次5分鐘，吸棄下層液體，用新鮮的、預(yù)冷的、空氣飽和的PVA/PBS重懸浮，以洗去殘余的可溶性白蛋白。洗滌后的白蛋白微泡以PVA/PBS懸浮，濃度約為25％，室溫下與濃度為0.01到1.0mg/ml的磺基琥珀酰亞胺-6-生物素酰胺己酸酯(磺基-NHS-LC-生物素；EZ-LinkTMsulfo-NHS-LC-biotin，Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)反應(yīng)至少1小時，其間輕微震搖。4℃多次離心，以預(yù)冷的、空氣飽和的PVA/PBS洗去未反應(yīng)的生物素。以含0.1％Triton-X 100的PVA/PBS溶解等分的懸浮后的微泡，通過測定其蛋白質(zhì)濃度(BCA Protein Assay，Pierce)和生物素(2-(4′-羥基偶氮苯)-苯甲酸分析法)濃度，評估生物素標記程度。白蛋白微泡的生物素化反應(yīng)的通常得率范圍為生物素/白蛋白(摩爾比)在40％到500％間。通過觀察生物素微泡和BioMag無核酶鏈親和素順磁微粒(Polysciences，Inc.，Warrington，PA)在懸液中的自發(fā)結(jié)合確定白蛋白微泡表面生物素的利用度。將生物素包衣的白蛋白微泡冷藏在含0.05％疊氮鈉的PVA/PBS溶液中。
實施例4 鏈親和素包衣的白蛋白微泡的制備將生物素微泡和過量的鏈親和素(Prozyme，San Leandro，CA)接觸，間接制備充滿空氣的鏈親和素包衣的白蛋白微泡。在此條件下，避免了微泡的交聯(lián)。也可通過雙功能團蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，直接將鏈親和素包衣到白蛋白微泡上。
對以PVA/PBS懸浮生物素包衣的白蛋白微泡進行完全的處理，并迅速加入10mg/ml鏈親和素溶液，其間不斷的旋渦混合，使之終濃度為1mg/ml，進行間接包衣。反復(fù)離心洗滌，方法同上，以洗去未反應(yīng)的鏈親和素。鏈親和素為四價的，從而保證了生物素結(jié)合位點的有效性。
或者，使用4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(s-SMCC)對白蛋白微泡進行直接的鏈親和素包衣。用5倍-10倍(摩爾比)的過量S-乙酸硫代乙酸正琥珀酰亞胺酯(SATA)在室溫下處理10mg/ml鏈親和素的PBS溶液(pH 7.4)至少一小時。采用以PBS平衡的Sephadex G-25樹脂通過FPLC將從鏈親和素中去除未反應(yīng)的SATA，冷凍儲藏純化的蛋白質(zhì)。修飾的鏈親和素在使用前用PBS(含50mM羥胺和2.5mM EDTA，pH 7.5)在室溫下處理2小時，以除去其上的保護性乙酰基基團。同時，用0.01-1mg/ml的s-SMCC溶液在室溫下處理白蛋白微泡的PVA/PBS懸液30分鐘，其間不斷輕微震搖。通過4次離心洗滌立刻除去過量的s-SMCC試劑，并使s-SMCC微泡與巰基修飾的鏈親和素相結(jié)合。通過馬來酰亞胺官能團和新暴露出的鏈親和素上巰基基團間的反應(yīng)，將鏈親和素共價結(jié)合到白蛋白微泡的表面。通過反復(fù)的離心洗滌除去微泡中過量的鏈親和素，以預(yù)冷的、空氣飽和的PBS(含0.05％疊氮鈉)懸浮后，置于冰箱保存。
實施例5 抗體包衣的白蛋白微泡大腸桿菌(E.coli)0157H7親和純化抗體，購自KPL公司(Gaithersburg，MD)，并按下述步驟進行生物素化。以PBS(pH 7.4)溶解抗體，加熱至37℃，30min。室溫下用過量的8-12倍摩爾量的6-生物素酰亞胺己酸磺基琥珀酰亞胺酯(EZ-LinkTMsulfo-NHS-LC-biotin)處理兩小時。采用G-25Sephadex凝膠過濾層析，以PBS洗脫，除去過量的生物素。采用MicroconY(jié)M-30過濾設(shè)備(Millipore，Bedford，MA)對生物素化的抗體進行超濾濃縮，濃縮后樣品置冰箱保存，加入疊氮鈉為保護劑。輕微震搖重懸抗生物素蛋白包衣的白蛋白微泡，加入1摩爾過量的生物素標記的抗體溶液(溶于PBS)。同上法，通過反復(fù)離心和重懸，除去不溶性微泡中的過量物質(zhì)。將抗體包衣的白蛋白微泡在4℃條件下保存于含疊氮鈉的PVA/PBS溶液中。
實施例6 以抗體包衣的微泡捕獲細菌細胞大腸桿菌(E.coli 0157H7)購自美國典型微生物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)，37℃條件下以LB液體培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中的菌液以預(yù)冷無菌PVA/PBS溶液或含0.2％牛血清白蛋白的PBS溶液(BSA/PBS)梯度稀釋至菌密度約為5,000個細胞/毫升。向細胞懸液中加入1/10體積的微泡懸液，室溫下輕微震蕩數(shù)分鐘。10分鐘內(nèi)微泡在固有浮力的作用下漂浮至混合液表面。以微量移液槍吸取10微升的不含漂浮微泡的下層液體，劃線接種到LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。以細菌懸液為陽性對照，可產(chǎn)生約50個菌落/平板。而經(jīng)抗體包衣的微泡處理過的細菌懸液中不存在可產(chǎn)生菌落的細胞。可通過輕搖微泡懸液，取10μl接種到LB平板上，從微泡中回收細菌細胞，而經(jīng)培養(yǎng)過夜，在所得平板上可觀察到有菌落形成則證實了該回收。上述結(jié)果表明細菌細胞為抗體包衣的白蛋白微泡所捕獲。以未包衣的白蛋白微泡或鏈親和素包衣的白蛋白微泡處理細菌懸液，不能除去其中的細菌細胞。
實施例7 通過先修飾白蛋白后超聲的方法制備微泡通過先對血清白蛋白進行生物素標記，后形成微泡，從生物素化的血清白蛋白制得白蛋白微泡，該微泡可以結(jié)合抗生物素蛋白或鏈親和素。以生理鹽水(含4mM辛酸鈉，4mM色氨酸鈉)配制50mg/ml的牛血清白蛋白(BSA；Bovuminar Cohn Fraction V，Intergen，Purchase，NY)溶液，過濾滅菌后保存于干凈的玻璃容器中，室溫下以熒光照射兩周。該處理過程可以光氧化游離的巰基，該巰基的存在會妨礙微泡的形成。取出20毫升的上述BSA溶液，以1M NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5。加入25毫克s-NHS-LC-生物素并混勻，室溫下反應(yīng)一小時，其間保持pH為8.5。用生理鹽水稀釋反應(yīng)液至白蛋白濃度為1％，根據(jù)上述制備未修飾的白蛋白微泡的方法，進行超聲。所得白蛋白微泡以1％BSA的生理鹽水溶液洗滌數(shù)次，以除去未結(jié)合的生物素。用生物素化白蛋白制備所得的微泡可以同抗生物素蛋白或鏈親和素反應(yīng)，也可根據(jù)上述方法對其進行抗生物素蛋白包衣或鏈親和素包衣。
玻璃微泡實施例8 胺包衣的玻璃微泡的制備使密度約為0.6g/cc，平均直徑約為30μm的3MTMScotchLiteTM玻璃微泡S60HS(St Paul，MN)在水中懸浮，使其漂浮到懸液表面。從底部去除液體層，以除去細粒和碎片。該步驟可以在60毫升的頂部具塞的一次性注射器中方便地進行。反復(fù)多次沖洗。60℃下，以0.25M的NaOH懸浮經(jīng)洗滌的微泡24小時，得到具有反應(yīng)活性的表面羥基，然后用水洗滌除去過量的堿。隨后，室溫下用0.05M HCl處理微泡1小時。以水和無水丙酮依次洗滌，除去酸；將終產(chǎn)物置于60℃烘箱內(nèi)干燥。室溫下以3％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-APS，Sigma)的無水丙酮或甲苯溶液懸浮處理過的干燥玻璃微泡30分鐘，使羥基官能團轉(zhuǎn)化為氨基。以丙酮洗滌數(shù)次除去過量的硅烷，將衍生的微泡置于60℃烘箱內(nèi)干燥。
在某些試驗中，以70％的硫酸和9％的過氧化氫在室溫下懸浮玻璃微泡16小時后，以水反復(fù)洗滌。以現(xiàn)配的3-APS∶水∶乙醇混合溶液(體積比為3∶4∶92)重懸上述酸處理過的微泡。室溫下反應(yīng)30分鐘。用乙醇洗滌除去過量的反應(yīng)試劑，所得玻璃微泡在115℃烘烤1小時。再次用乙醇洗滌該微泡，并置60℃烘箱內(nèi)干燥。
將所得胺包衣的玻璃微泡室溫下干燥保存。采用4-氧-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)丁酸s-琥珀酰酯(Pierce)分析方法，確定了微泡功能性表面胺基基團為2.5-3.0/nm2。
實施例9 抗體包衣的胺玻璃微泡以50mM的碳酸氫鈉和0.1％吐溫TM20的混合溶液(pH 8.5)懸浮胺包衣的玻璃微泡，室溫下與磺基-NHS-LC-生物素反應(yīng)2小時。生物素試劑的用量為有效微泡表面胺的0.1-7倍。以含0.1％吐溫TM20的PBS溶液(PBS/Tween)TM洗滌并保存該玻璃微泡。加入過量的(摩爾數(shù))5mg/ml抗生物素蛋白溶液以飽和有效生物素位點。以PBS/TweenTM洗去殘余的抗生物素蛋白，將該微泡保存于含0.2％牛血清白蛋白和0.05％疊氮鈉的PBS溶液(BSA/PBS)中，置冰箱中貯存。
還可使用s-SMCC交聯(lián)劑，以巰基化抗生物素蛋白對胺玻璃微泡進行包衣。以50mM磷酸鈉溶液(含10％二甲替甲酰胺和2mg/ml s-SMCC，pH 7.5)配制濃度為1∶10(w/v)的胺玻璃微泡懸液，室溫放置1小時。以100％無水乙醇洗滌馬來酰亞胺包衣的玻璃微泡，排干(drain)，置于玻璃瓶中真空干燥，氮氣環(huán)境中-20℃保存。經(jīng)SATA修飾的抗生物素蛋白含有游離的巰基基團(見實施例4)；以羥胺處理過量的該抗生物素蛋白使其脫乙酰化，隨后直接加到干燥的馬來酰亞胺玻璃微泡中，可以得到抗生物素蛋白包衣的微泡。培養(yǎng)過夜后，用PBS/TweenTM洗去過量的抗生物素蛋白。
以1.0毫升PBS/BSA懸浮20毫克抗生物素蛋白包衣的玻璃微泡，加入10μg經(jīng)修飾后含2-6個生物素基團的大腸桿菌0157H7抗體(見實施例5)。冰浴兩小時，該抗體可以容易地連接到抗生物素蛋白表面包衣上，從而制得抗體包衣的玻璃微泡。所得微泡洗滌后以懸液形式置4℃保存，配制懸液所用的緩沖液有助于保持抗體的穩(wěn)定性。加入牛血清白蛋白和疊氮鈉作為穩(wěn)定劑。
實施例10 將大腸桿菌0157捕獲到抗體包衣的玻璃微泡上以預(yù)冷無菌PBS對大腸桿菌菌液進行梯度稀釋至密度為5,000個細胞/毫升，所用PBS中含牛血清白蛋白和疊氮鈉。以1％(v/w)抗體包衣的微泡處理細菌懸液，室溫下振搖數(shù)分鐘。待微泡漂浮至液面后，取10μl下層液體(不含漂浮的微泡)接種到瓊脂平板上，以未經(jīng)處理的菌液為對照進行平行比較。以未包衣的微泡處理過的菌液經(jīng)37℃瓊脂平板培養(yǎng)過夜后，形成的菌落單元相比未經(jīng)微泡處理過的菌液無明顯減少。而經(jīng)抗體包衣玻璃微泡處理過的細菌懸液所形成的菌落數(shù)減少了50％-100％，經(jīng)重懸浮和平板培養(yǎng)回收這些菌落形成單元。上述結(jié)果表明細菌細胞被特異性抗體包衣的玻璃微泡所捕獲。
實施例11 抗體包衣的環(huán)氧化物玻璃微泡以0.1M硼酸鈉和0.15M氯化鈉的混合溶液(pH 9.0)洗滌并懸浮3MTMScotchLiteTM玻璃泡H2O/1000。加入5mg/ml抗生物素蛋白，4℃培養(yǎng)該懸液48小時。以含0.05％疊氮鈉的BSA/PBS洗滌該抗生物素蛋白包衣的玻璃微泡，以除去未結(jié)合的抗生物素蛋白，并以相同溶液保存該玻璃微泡。所得抗生物素微泡具有生物素標記的抗大腸桿菌0157H7抗體包衣，根據(jù)上法可以除去菌液中的細菌。
實施例12 順式-二醇包衣的玻璃微泡的制備根據(jù)實施例6的方法，制得帶有活性羥基基團的玻璃微泡。室溫下，以含6％3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(v/v)的無水丙酮處理干燥的玻璃微泡3小時，使其硅烷化。以丙酮洗去過量的硅烷化試劑后，以0.05M HCl懸浮微泡，60℃，2小時，將環(huán)氧官能團轉(zhuǎn)換為順式-二醇官能團。以丙酮洗去酸，37℃干燥微泡過夜。所得順式-二醇玻璃微泡室溫干燥保存。
室溫下，在密閉容器中以0.3M羰基二咪唑(CDI)的無水丙酮溶液活化25％的順式-二醇包衣的玻璃微泡懸液1小時，每隔10分鐘排氣一次。以無水丙酮洗去過量的試劑后，室溫真空干燥該玻璃微泡?；罨奈⑴菰诘獨猸h(huán)境中-4℃干燥保存。
CDI活化的玻璃微泡與4mg/ml抗生物素蛋白溶液(溶劑為0.1M碳酸鈉，pH 9.5)室溫下培養(yǎng)過夜，對其進行抗生物素蛋白包衣。加入0.2M磷酸二氫鈉，下調(diào)pH至6.5。以含疊氮鈉的BSA/PBS洗滌并保存所得的抗生物素蛋白包衣的玻璃微泡。
采用了含生物素標記的抗大腸桿菌0157H7抗體的微泡，按上述方法從懸液中除去細菌。和對照樣品相比，本實驗所形成的菌落數(shù)減少，證明菌液中細菌減少了50-100％。
在某些實驗中，室溫下用0.2M高碘酸鈉溶液活化順式-二醇包衣的玻璃微泡90分鐘。以水和乙醇依次洗滌產(chǎn)物后室溫干燥。該化學(xué)反應(yīng)使得玻璃微泡表面包有氨基反應(yīng)性醛基官能團。后續(xù)的抗生物素蛋白包衣，生物素化抗體包衣以及相關(guān)測試，步驟同上，結(jié)果相似。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其用于親和分離或親和分析，且包含微泡，其特征在于，所述微泡以親和分子包衣。
2.一種組合物，其用于親和分離或親和分析，且包含蛋白質(zhì)微泡，其特征在于，所述蛋白質(zhì)微泡以親和分子包衣。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為白蛋白。
4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)微泡是通過向蛋白質(zhì)溶液中導(dǎo)入氣體而形成的。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述導(dǎo)入包括超聲。
6.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述導(dǎo)入包括加熱所述蛋白質(zhì)溶液。
7.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)微泡通過蛋白質(zhì)變性和以Cr+++處理中的至少一種方式被穩(wěn)定。
8.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述親和分子選自受體、配體、核酸、或抗體。
9.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述親和分子為生物素。
10.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述親和分子為抗生物素蛋白或鏈親和素。
11.如權(quán)利要求8-10中任一項所述的組合物，其特征在于，所述親和分子直接連接到所述蛋白質(zhì)上。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述親和分子通過使用異雙功能試劑直接連接到所述蛋白質(zhì)上。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述異雙功能試劑為4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯。
14.如權(quán)利要求8-10中任一項所述的組合物，其特征在于，所述親和分子間接連接到所述蛋白質(zhì)上。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述親和分子通過和至少一種其它分子相互作用而間接連接到所述蛋白質(zhì)上。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)直接連接到鏈親和素上，所述親和分子是生物素化的，其中通過所述鏈親和素和生物素的相互作用，將所述親和分子間接連接到所述蛋白質(zhì)上。
17.一種組合物，其用于親和分離或親和分析，且包含玻璃微泡，其特征在于，所述玻璃微泡以親和分子包衣。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述玻璃微泡的密度約為0.6g/cc，平均直徑約為30μm。
19.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述親和分子選自受體、配體、核酸、或抗體。
20.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述親和分子為生物素。
21.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述親和分子為抗生物素蛋白或鏈親和素。
22.如權(quán)利要求19-21中任一項所述的組合物，其特征在于，所述親和分子間接連接到所述玻璃微泡上。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述玻璃微泡以環(huán)氧化物包衣，其所述親和分子通過所述環(huán)氧化物包衣直接連接到玻璃上。
24.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述親和分子通過包括對所述玻璃微泡進行胺官能團包衣的步驟的過程直接連接到玻璃上。
25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述包衣步驟包括處理所述玻璃微泡以產(chǎn)生具有反應(yīng)活性的表面殘基，并使所述表面殘基與3-氨丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)。
26.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述玻璃微泡以順式-二醇包衣，且所述親和分子通過該順式-二醇包衣直接連接到玻璃上。
27.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述的包衣步驟包括處理所述玻璃微泡以產(chǎn)生具有反應(yīng)活性的表面羥基殘基；使所述羥基殘基與3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷反應(yīng)，以產(chǎn)生環(huán)氧官能團；和用酸處理所述環(huán)氧官能團，使其轉(zhuǎn)化為順式-二醇官能團。
28.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述親和分子通過異雙功能試劑直接連接到玻璃上。
29.如權(quán)利要求28所述的組合物，其特征在于，所述異雙功能試劑為4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯。
30.如權(quán)利要求19-21中任一項所述的組合物，其特征在于，所述親和分子通過和至少一種其它分子的相互作用間接連接到所述蛋白質(zhì)上。
31.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述玻璃直接連接到鏈親和素上，且所述親和分子是生物素化的，其中通過所述鏈親和素與生物素的相互作用，將所述親和分子間接連接到所述玻璃微泡上。
32.一種產(chǎn)生用于親和分離或親和分析的蛋白質(zhì)微泡的方法，其特征在于，所述方法包括(a)加熱蛋白質(zhì)溶液；和(b)超聲該溶液，向其中導(dǎo)入氣體，從而產(chǎn)生用于親和分離或親和分析的蛋白質(zhì)微泡。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述氣體為空氣，所述蛋白質(zhì)為白蛋白。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括了用Cr+++穩(wěn)定所述蛋白質(zhì)微泡。
35.一種產(chǎn)生用于親和分離或親和分析的親和修飾的蛋白質(zhì)微泡的方法，其特征在于，所述方法包括(a)提供蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)連接于親和分子；(b)加熱蛋白質(zhì)溶液；和(c)超聲該溶液，向其中導(dǎo)入氣體，從而產(chǎn)生親和修飾的蛋白質(zhì)微泡。
36.一種產(chǎn)生用于親和分離或親和分析的微泡的方法，其特征在于，所述方法包括提供微泡；和對該微泡進行親和分子包衣。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述微泡為蛋白質(zhì)微泡。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述微泡為玻璃微泡。
39.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述親和分子選自受體、配體、核酸、或抗體。
40.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述親和分子為生物素。
41.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述親和分子為抗生物素蛋白或鏈親和素。
42.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述包衣步驟包括將所述親和分子共價結(jié)合到所述微泡上的胺官能團上。
43.如權(quán)利要求36所述的微泡的制備方法，其特征在于，所述包衣步驟包括將所述親和分子共價結(jié)合到所述微泡上的環(huán)氧基團上。
44.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述包衣步驟包括使用異雙功能試劑，將所述親和分子連接到所述微泡上。
45.一種親和分離或親和分析樣品的方法，其特征在于，所述方法包括(a)提供親和分子包衣的微泡的溶液；(b)使所述微泡與樣品接觸，所述樣品在溶液中與所述親和分子相互作用，從而產(chǎn)生樣品包衣的微泡；和(c)使所述樣品包衣的微泡漂浮至液面上，從而將所述樣品包衣的微泡與游離的樣品和溶液分開。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述微泡為玻璃微泡。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述微泡為蛋白質(zhì)微泡。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為白蛋白。
49.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述親和分子選自受體、配體、或抗體。
50.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述親和分子為生物素。
51.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述親和分子為抗生物素蛋白或鏈親和素。
52.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述樣品為受體、配體或抗原。
53.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述樣品為分析物。
54.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述樣品為病毒、細胞或它們的亞組分。
55.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述樣品以生物素、抗生物素蛋白或鏈親和素修飾。
56.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括離心所述微泡和溶液，其中所述樣品在重力作用下形成丸狀，從而有助于所述樣品包衣的微泡與游離樣品和溶液的分離。
57.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述方法進一步向所述樣品包衣的微泡施加壓力或真空，從而使所述微泡破裂。
58.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括以去污劑處理所述樣品包衣的微泡，從而使所述微泡破裂。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于親和分離、親和純化和親和分析的基于親和分子包衣微泡的方法、組合物及試劑盒。具體而言，本發(fā)明提供了親和分子包衣的蛋白質(zhì)微泡。此外，本發(fā)明還提供了親和分子包衣的玻璃微泡。本發(fā)明特別提供了應(yīng)用本發(fā)明微泡對分析物和細胞進行分離的方法。
文檔編號G01N33/547GK101065497SQ200580038082
公開日2007年10月31日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者T·亞當(dāng)斯, E·雅布隆斯基 申請人:盧卡迪亞技術(shù)股份有限公司