專(zhuān)利名稱(chēng)：馬血紅蛋白的單克隆和多克隆抗體以及采用這些抗體和/或過(guò)氧化物酶反應(yīng)的用于鑒定 ...的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2004年12月4日提交的第60/633,167號(hào)美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其標(biāo)題為“馬珠蛋白和血紅素的抗體以及在馬的潰瘍的鑒定和定位中利用該抗體的裝置和方法”，所述申請(qǐng)?jiān)诖巳囊胱鳛閰⒖肌?br> 背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及診斷和檢測(cè)裝置和方法，更具體的涉及馬血紅蛋白和血紅素的抗體及其在檢測(cè)和定位馬的胃和結(jié)腸潰瘍的檢測(cè)裝置、試劑盒和方法中的應(yīng)用。
在討論檢測(cè)和診斷馬的潰瘍之前，有必要討論一下馬獨(dú)特的消化道解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)導(dǎo)致馬消化道潰瘍的高發(fā)病率。在人和其他大多數(shù)動(dòng)物中，胃酸的分泌是胃對(duì)進(jìn)食的反應(yīng)。與此相反，千百年來(lái)馬已進(jìn)化為滴流攝食動(dòng)物(吃得慢，但整天大部分時(shí)間或多或少不斷的吃)，它們的消化系統(tǒng)已適應(yīng)這種飲食方式，不斷產(chǎn)生胃液和肝分泌的膽汁進(jìn)入前腸。因此，無(wú)論馬是否正在進(jìn)食，馬胃都可視為整天或多或少不斷產(chǎn)生胃酸的酸泵。
表演馬的消化道潰瘍的發(fā)病率已急劇升高，從1920年的約20％上升到近十年的約90％或更高。例如，在賽馬中，據(jù)報(bào)道多達(dá)97％的賽馬患有消化道潰瘍，患消化道潰瘍的展示馬的百分率緊隨其后。甚至表演馬駒也已罹患該病癥，約60％的表演馬駒患有消化道潰瘍。雖然娛樂(lè)馬消化道潰瘍的發(fā)病率比展示馬低，但是近二十年來(lái)消化道潰瘍?cè)絹?lái)越高的發(fā)病率在所有類(lèi)型的馬包括娛樂(lè)馬中都顯著升高。
最近一項(xiàng)馬的隨機(jī)交叉科學(xué)研究顯示，大約55％的受試馬患有胃潰瘍，40％的受試馬患有結(jié)腸潰瘍。胃和結(jié)腸潰瘍的發(fā)病率不相同，表明一些馬僅患有胃潰瘍，另一些馬僅患有結(jié)腸潰瘍。然而，大多數(shù)患有結(jié)腸潰瘍的馬也患有胃潰瘍，作為一個(gè)整體的馬群中只有不到30％既不患結(jié)腸潰瘍，也不患胃潰瘍。如上所述，展示馬和賽馬消化道潰瘍的發(fā)病率與一般馬群的這些統(tǒng)計(jì)數(shù)字相比甚至更高。
本領(lǐng)域存在大量解決馬消化道潰瘍問(wèn)題的方法。這些解決方法包括使用抗酸劑暫時(shí)中和胃中的酸，使用藥物抑制胃酸的產(chǎn)生，以及延長(zhǎng)休息和草料的進(jìn)食。最近，開(kāi)發(fā)了一種新的和非常有效的食料添補(bǔ)劑用于治療和/或預(yù)防胃潰瘍和結(jié)腸潰瘍，如2003年5月9日提交的第10/435,367號(hào)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)所公開(kāi)的，其標(biāo)題為“在馬和其他動(dòng)物中用于治療和預(yù)防消化道潰瘍的食料添補(bǔ)劑及其方法”，該專(zhuān)利申請(qǐng)被指派給本發(fā)明的代理人，該專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖巳囊胱鳛閰⒖肌?br> 盡管存在這種治療方法，但是準(zhǔn)確診斷馬的胃潰瘍?nèi)匀环浅＠щy，而診斷馬的結(jié)腸潰瘍根本就不可能。最常用的診斷馬潰瘍的方法，就是利用癥狀(這經(jīng)常是模糊的，非特異的跡象例如體重減輕，食欲不振，嗜睡，或者間歇性發(fā)燒)與治療觀察的結(jié)果聯(lián)合，這被發(fā)現(xiàn)幾乎是完全不可靠的。這是因?yàn)橛性S多可能的原因造成相同的癥狀，并且不是所有的馬都顯示相同或者甚至顯著的潰瘍癥狀。因此，使用這種技術(shù)的效果通常不比競(jìng)猜游戲更好。
診斷馬胃潰瘍的唯一可靠的方法是使用3米視頻內(nèi)窺鏡，但其具有顯著缺點(diǎn)昂貴、耗時(shí)和壓力大(對(duì)馬和訓(xùn)練員/馬主都是)。購(gòu)買(mǎi)3米視頻內(nèi)窺鏡的費(fèi)用很高，其價(jià)格是馬主和所有訓(xùn)練員(除了最杰出的外)高得買(mǎi)不起的。除了內(nèi)窺鏡的費(fèi)用之外，操作步驟也是繁瑣和費(fèi)時(shí)的。沒(méi)有3米視頻內(nèi)窺鏡的馬主、訓(xùn)練員和獸醫(yī)必須求助于擁有內(nèi)窺鏡的診所或獸醫(yī)。這需花費(fèi)額外的時(shí)間和費(fèi)用，對(duì)馬的壓力更大，而且易產(chǎn)生挫折感，因?yàn)轳R不再是在馬主、訓(xùn)練員或平常獸醫(yī)的照顧下。
此外，即使擁有和使用了3米視頻內(nèi)窺鏡，結(jié)果也不是結(jié)論性的，因?yàn)榧词故亲顝?fù)雜的內(nèi)窺鏡也會(huì)錯(cuò)過(guò)75英尺的消化道—完整的后腸。利用內(nèi)窺鏡不能看到后腸，因?yàn)檫€沒(méi)有足夠長(zhǎng)度的內(nèi)窺鏡，而且內(nèi)窺鏡的使用需要完全排空后腸，這極有可能殺死馬匹。事實(shí)上，只是在最近才記載了馬結(jié)腸潰瘍的高發(fā)病率，這完全是通過(guò)死后觀察分析的使用完成的。
因此，本發(fā)明的主要目標(biāo)是提供一種馬潰瘍檢測(cè)試劑盒以及使用該檢測(cè)試劑盒的相關(guān)方法，該試劑盒和方法可有效診斷馬的胃潰瘍和結(jié)腸潰瘍。本發(fā)明的一相關(guān)目標(biāo)是為胃潰瘍或結(jié)腸潰瘍或兩者的存在提供高度特異的指標(biāo)。本發(fā)明的另一相關(guān)目標(biāo)是既能準(zhǔn)確鑒定馬潰瘍的存在又能準(zhǔn)確鑒定馬潰瘍的類(lèi)型，而且不會(huì)產(chǎn)生過(guò)度假陽(yáng)性顯示。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是檢測(cè)可以方便快捷的進(jìn)行，不要求檢測(cè)的操作者具有專(zhuān)門(mén)的技術(shù)或者接受培訓(xùn)。本發(fā)明的另一目標(biāo)是它是完全自給自足的，不需要實(shí)驗(yàn)室分析或者其他處理裝備，這樣的話它可以作為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)在任何地點(diǎn)使用。本發(fā)明的另一目標(biāo)是快速提供檢測(cè)結(jié)果，只需幾分鐘而不是很長(zhǎng)的時(shí)間。
本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒的構(gòu)成還必須是持久耐用的，而且應(yīng)該無(wú)需要特殊的保存條件就可確保較長(zhǎng)的貯存期。為增強(qiáng)本發(fā)明馬潰瘍檢測(cè)試劑盒的市場(chǎng)吸引力，其構(gòu)成應(yīng)該不昂貴從而使之具有最廣闊的潛在市場(chǎng)。最后，還有一個(gè)目標(biāo)是本發(fā)明馬潰瘍檢測(cè)試劑盒及方法的所有上述優(yōu)點(diǎn)和目標(biāo)的獲得不應(yīng)附帶造成任何嚴(yán)重的缺點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明克服了上述背景技術(shù)中討論的缺點(diǎn)和限制。本發(fā)明提供了馬潰瘍檢測(cè)試劑盒及使用該檢測(cè)試劑盒的方法，所述試劑盒和方法能夠以高度的靈敏度和特異性鑒定馬的胃潰瘍或結(jié)腸潰瘍或這二種潰瘍，因?yàn)楸景l(fā)明馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法可以清楚的區(qū)分胃潰瘍和結(jié)腸潰瘍。本發(fā)明的潰瘍檢測(cè)是一種糞便血液檢測(cè)，因?yàn)樗b定被測(cè)馬的糞便中所含的血液成分。
根據(jù)本發(fā)明所述，已經(jīng)鑒定出兩種血液成分，它們分別對(duì)胃潰瘍或結(jié)腸潰瘍的存在具有高度的指征性。本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)確定，糞便中包含的完整珠蛋白其最有可能的來(lái)源是結(jié)腸。這是基于以下事實(shí)來(lái)自胃潰瘍的血液(和其他任意在十二指腸之前的血液，就此而言)會(huì)被胃中的酸和肽降解，產(chǎn)生血紅素(它是由兩個(gè)亞鐵血紅素(heme)分子連接在一起構(gòu)成的分子)等產(chǎn)物。
因此，糞便中完整珠蛋白的存在表明有結(jié)腸潰瘍，而血紅素的存在則表明有胃潰瘍。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以看出，以血紅素和珠蛋白作為指標(biāo)的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法將為檢測(cè)和定位馬體內(nèi)一處或多處潰瘍提供很好的指標(biāo)。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法的優(yōu)選形式是用于檢測(cè)血紅素指標(biāo)和珠蛋白指標(biāo)的免疫分析，具體的說(shuō)，本發(fā)明馬潰瘍檢測(cè)的優(yōu)選實(shí)施例是酶聯(lián)免疫吸附分析(“ELISA”檢測(cè))，這是生物化學(xué)中經(jīng)常用于檢測(cè)樣品中是否存在特定物質(zhì)的方法。
ELISA檢測(cè)是一種快速的免疫化學(xué)檢測(cè)，涉及抗體或抗原(免疫學(xué)分子)和酶(催化生化反應(yīng)的蛋白)。ELISA檢測(cè)被用于檢測(cè)具有抗原性的物質(zhì)，主要是蛋白(不同于葡萄糖和鉀之類(lèi)小分子和離子)，諸如抗體、細(xì)菌抗原和激素。所謂的“快速”ELISA檢測(cè)由一張具有液體路徑的膜組成，該路徑由連接于液體源頭的一段制止連接于液體吸收池的另一端，沿膜有三個(gè)分離且獨(dú)立的區(qū)域。
第一個(gè)區(qū)域包含標(biāo)記抗體，即連接有染色試劑的抗體，所述染色劑諸如染料或者膠體金。標(biāo)記抗體隨流體的流動(dòng)從第一個(gè)區(qū)域向第二個(gè)和第三個(gè)區(qū)域移動(dòng)，最終流向液體吸收池。如果感興趣的物質(zhì)存在于流體中，它將結(jié)合標(biāo)記抗體。第二個(gè)區(qū)域，通常是一條跨膜橫線，其中包含結(jié)合到膜上的抗體。
第二個(gè)區(qū)域的抗體對(duì)感興趣的物質(zhì)具有親合力(將吸引和鎖定該物質(zhì))，與標(biāo)記抗體以及在與第二個(gè)區(qū)域中的抗體結(jié)合的感興趣的物質(zhì)一起形成“三明治”，從而產(chǎn)生一個(gè)作為陽(yáng)性顯示的色線，表明存在感興趣的物質(zhì)。流體中包含越多的感興趣的物質(zhì)，越多的被感興趣的物質(zhì)所結(jié)合標(biāo)記抗體與第二個(gè)區(qū)域的抗體結(jié)合。
第三個(gè)區(qū)域，通常也是一條跨膜的橫線，利用另一種不同的抗體/抗原反應(yīng)，如果達(dá)到足夠的流速和流量，該反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生一根色線，不論是否存在感興趣的物質(zhì)。這作為對(duì)照表明檢測(cè)系統(tǒng)運(yùn)行正常。第三個(gè)區(qū)域相對(duì)于第一區(qū)域位于第二個(gè)區(qū)域的另一側(cè)，指示接受檢測(cè)的液體已經(jīng)流過(guò)第二個(gè)區(qū)域，從而表明檢測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)接受了足量的使檢測(cè)系統(tǒng)得以正常運(yùn)行被測(cè)流體。
May等人的第5,602,040號(hào)美國(guó)專(zhuān)利描述了一種這樣的檢測(cè)系統(tǒng)，它以兩種抗體為基礎(chǔ)。包括第一組抗體的顆粒粘附于有色乳膠或金膠體顆粒的表面，它們被干燥在硝酸纖維素膜的第一端，代表上文所述的第一個(gè)區(qū)域。第二組抗體以線條形式粘附于硝酸纖維素膜，代表上文所述的第二個(gè)區(qū)域。
通過(guò)在第一端讓液體樣品被硝酸纖維素膜吸收來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。第一個(gè)區(qū)域的顆粒被液體流動(dòng)釋放，被測(cè)分析物與所述顆粒上的抗體結(jié)合。在第二個(gè)區(qū)域，被測(cè)分析物又與線上存在的另一抗體結(jié)合，形成一道可見(jiàn)的色線，顯示所述分析物的存在。這種免疫層析檢測(cè)技術(shù)基于過(guò)膜流動(dòng)，又稱(chēng)為“膠體金免疫層析試紙技術(shù)(lateral flow technique)”。本發(fā)明參考了第5,602,040號(hào)美國(guó)專(zhuān)利，本發(fā)明還參考了Kouvonen等人的第5,712,170號(hào)美國(guó)專(zhuān)利，后者很好地概括了該領(lǐng)域該技術(shù)。
快速ELISA檢測(cè)制備起來(lái)相對(duì)便宜，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，提供一種不需要實(shí)驗(yàn)室裝備的快速檢測(cè)方法。ELISA檢測(cè)中的抗體通常用以下方式獲得給動(dòng)物接種感興趣的物質(zhì)，然后動(dòng)物產(chǎn)生抗那種物質(zhì)的抗體。這種生化關(guān)系進(jìn)而被用作分離和檢測(cè)感興趣的物質(zhì)的機(jī)制。ELISA檢測(cè)既靈敏又具有特異性，堪與放射免疫分析(“RIA”)檢測(cè)相比。ELISA檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)還在于不需要放射性同位素或者放射性計(jì)量裝置。
本發(fā)明馬潰瘍檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選實(shí)施例包括包含在一個(gè)或兩個(gè)塑料盒體中的兩個(gè)檢測(cè)試紙條。將接受檢測(cè)的馬的糞便放入諸如桶或罐或塑料袋的容器中，加入溶液(可以是水或加有緩沖劑如鹽的水)，然后利用渦旋、攪動(dòng)或攪揉將混合物充分混勻。用點(diǎn)樣器(如滴眼液滴管)從容器中取數(shù)滴液體加到盒體中的檢測(cè)試紙條上。
經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，優(yōu)選約5分鐘到約30分鐘，兩個(gè)檢測(cè)試紙條將呈現(xiàn)一個(gè)代表對(duì)照指標(biāo)的可見(jiàn)標(biāo)記，如果有被測(cè)指標(biāo)存在，還將呈現(xiàn)表示檢測(cè)到了分別指示胃潰瘍和/或結(jié)腸潰瘍的指標(biāo)的可見(jiàn)標(biāo)記。本發(fā)明使用兩種指標(biāo)，其中一種標(biāo)示胃潰瘍，另一種標(biāo)示結(jié)腸潰瘍。胃潰瘍指標(biāo)可利用過(guò)氧化物酶反應(yīng)(諸如潛血反應(yīng)(guaiac reaction)或四甲基聯(lián)苯胺酶(TMB)反應(yīng))取代抗體反應(yīng)。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，如果測(cè)到就表明有結(jié)腸潰瘍的感興趣物質(zhì)是馬珠蛋白，而如果測(cè)到就表明有胃潰瘍的感興趣物質(zhì)是馬血紅素或亞鐵血紅素。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法由此可以診斷胃潰瘍和/或結(jié)腸潰瘍，及時(shí)提供治療基礎(chǔ)。
因此可以看出，本發(fā)明介紹了一種馬潰瘍檢測(cè)試劑盒及使用該試劑盒的相關(guān)方法，它們可有效診斷馬的胃潰瘍和結(jié)腸潰瘍。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法可高度特異性地指示胃潰瘍或結(jié)腸潰瘍或這兩種潰瘍。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法即能準(zhǔn)確鑒定馬潰瘍的存在又能準(zhǔn)確鑒定馬潰瘍的類(lèi)型，而且不會(huì)產(chǎn)生過(guò)度假陽(yáng)性顯示。
本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法使用起來(lái)方便快捷，不要求檢測(cè)的操作者具有專(zhuān)門(mén)的技術(shù)或者接受培訓(xùn)。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法是完全自給自足的，不需要實(shí)驗(yàn)室分析或者其他處理裝備，從而使它可以作為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)在任何地點(diǎn)進(jìn)行。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法可以快速提供檢測(cè)結(jié)果，只需幾分鐘而不是很長(zhǎng)的時(shí)間。
本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒的構(gòu)造持久耐用，試劑盒不需要特殊的保存條件，具有較長(zhǎng)的貯存期。本發(fā)明馬潰瘍檢測(cè)試劑盒的構(gòu)成不昂貴，從而提供了最廣闊的潛在市場(chǎng)。最后，本發(fā)明馬潰瘍檢測(cè)試劑盒及方法的所有上述優(yōu)點(diǎn)和目標(biāo)的獲得不會(huì)附帶造成任何嚴(yán)重的缺點(diǎn)。
附圖描述參考附圖，可最好地理解本發(fā)明的這些和其他優(yōu)點(diǎn)，其中

圖1是顯示馬消化道解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖2是等角投影視圖，顯示根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建和使用的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒，它具有包含胃潰瘍檢測(cè)試紙條的第一盒體和包含結(jié)腸潰瘍檢測(cè)試紙條的第二盒體。
圖3是等角投影視圖，顯示同樣根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建和使用的另一馬潰瘍檢測(cè)試劑盒，它只有一個(gè)既包含胃潰瘍檢測(cè)試紙條又包含結(jié)腸潰瘍檢測(cè)試紙條的單一盒體。
優(yōu)選實(shí)施例的詳述在討論本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法之前，有必要簡(jiǎn)要的論述馬消化系統(tǒng)的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)附圖1，該圖展示了馬20的側(cè)視圖，以圖形顯示說(shuō)明了馬的消化道。馬20的消化道可分為前腸，總體以參考數(shù)字22表示，和后腸，總體以參考數(shù)字24表示。
馬20的消化道從其口26開(kāi)始，按順序延伸通過(guò)食管28進(jìn)入胃30，然后到小腸32，它們一起構(gòu)成了馬20的前腸22。馬20的前腸22大約占馬20消化道相對(duì)容量的35-40％。
從小腸32起，消化道延伸通過(guò)盲腸34、大結(jié)腸36和小結(jié)腸38，至直腸40。馬20消化道的這些元件一起構(gòu)成馬20的后腸24。后腸24大約占馬20消化道相對(duì)容量的60-65％。
本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選實(shí)施例如圖2所示。圖中顯示了第一盒體50，它包含用于檢測(cè)胃潰瘍的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒。第一盒體50有一個(gè)孔52，待分析的液體由該空引入。第一盒體50還有觀察窗54，通過(guò)該觀察窗54可以看到定位在那里的具有試驗(yàn)指示區(qū)58和對(duì)照指示區(qū)60的檢測(cè)試紙條膜56。當(dāng)感興趣物質(zhì)被檢測(cè)到時(shí)，試驗(yàn)指示區(qū)58將有可見(jiàn)顯示，從而表明有胃潰瘍。
圖2還顯示第二盒體70，它包含用于檢測(cè)結(jié)腸潰瘍的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒。第二盒體70有一個(gè)孔72，待分析的液體由該孔引入。第二盒體70還具有觀察窗74，通過(guò)該觀察窗可以看到定位在那里的具有試驗(yàn)指示區(qū)78和對(duì)照指示區(qū)80的檢測(cè)試紙條膜76。當(dāng)感興趣物質(zhì)被檢測(cè)到時(shí)，試驗(yàn)指示區(qū)78將有可見(jiàn)顯示，從而表明存在結(jié)腸潰瘍。盡管圖中顯示它們緊靠在一起，但是在圖2所示的實(shí)施例中，第一盒體50和第二盒體70是彼此獨(dú)立的。
現(xiàn)在參見(jiàn)圖3，該圖顯示本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的另一種實(shí)施例，只有單一盒體90。盒體90具有單一(但更寬)的孔92，待分析的液體由該孔引入。盒體90還具有第一和第二觀察窗94和96，分別位于盒體90相對(duì)的兩邊。通過(guò)第一觀察窗94可見(jiàn)的是定位于那里的具有試驗(yàn)指示區(qū)100和對(duì)照指示區(qū)102的檢測(cè)試紙條膜98。當(dāng)感興趣物質(zhì)被檢測(cè)到時(shí)，試驗(yàn)指示區(qū)100將有可見(jiàn)顯示，從而表明存在胃潰瘍。當(dāng)足量液體通過(guò)孔92流入盒體90后，對(duì)照指示區(qū)102將有可見(jiàn)顯示。
通過(guò)第二觀察窗96可見(jiàn)的是定位于那里的具有試驗(yàn)指示區(qū)106和對(duì)照指示區(qū)108的檢測(cè)試紙條膜104。當(dāng)感興趣物質(zhì)被檢測(cè)到時(shí)，試驗(yàn)指示區(qū)106將有可見(jiàn)顯示，從而表明存在胃潰瘍。當(dāng)足量液體通過(guò)孔92流入盒體90后，對(duì)照指示區(qū)108將有可見(jiàn)顯示。
圖2中檢測(cè)試紙條56和76以及圖3中檢測(cè)試紙條98和104的構(gòu)建是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。相似的，具有不同盒體設(shè)計(jì)的不同類(lèi)型其他檢測(cè)試劑盒的構(gòu)建也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。圖2和圖3所示檢測(cè)裝置的關(guān)鍵部分是用于檢測(cè)胃潰瘍和結(jié)腸潰瘍的抗體的類(lèi)型和來(lái)源(derivation)，見(jiàn)下文。
討論之前，先簡(jiǎn)要描述圖2和圖3所示的試劑盒的操作。獸醫(yī)、馴馬師或馬主采集接受檢測(cè)的馬的糞便樣本(優(yōu)選全部的排糞)。將糞便樣本放于諸如桶或罐或塑料袋的容器中，然后通過(guò)渦旋、攪動(dòng)或攪揉與水溶液(可以是水或加有緩沖劑如鹽的水)混合。利用滴眼液滴管或其他任何方便的器械，獸醫(yī)、馴馬師或馬主將幾滴液體通過(guò)圖1所示盒體50和70中的孔52和72或通過(guò)圖2所示盒體90中的孔92加入檢測(cè)裝置中。
幾分鐘后，圖1所示實(shí)施例中，對(duì)照指示區(qū)60和80出現(xiàn)可見(jiàn)顯示，或者，圖2所示實(shí)施例中，對(duì)照指示區(qū)102和108出現(xiàn)可見(jiàn)顯示，表明試劑盒運(yùn)作正確。如果檢測(cè)到珠蛋白，圖1實(shí)施例中，試驗(yàn)指示區(qū)58出現(xiàn)可見(jiàn)顯示，或者，圖2實(shí)施例中，試驗(yàn)指示區(qū)100出現(xiàn)可見(jiàn)顯示。相似的，如果檢測(cè)到血紅素，圖1實(shí)施例中，試驗(yàn)指示區(qū)78出現(xiàn)可見(jiàn)顯示，或者，圖2實(shí)施例中，試驗(yàn)指示區(qū)106出現(xiàn)可見(jiàn)顯示。該檢測(cè)由此可以診斷出胃潰瘍或結(jié)腸潰瘍，如果檢測(cè)到其中一種或兩種潰瘍，該檢測(cè)就提供了及時(shí)治療的基礎(chǔ)。
雖然如圖2和3所示，圖2所示實(shí)施例采用彼此獨(dú)立的檢測(cè)試紙條膜56和76，圖3所示實(shí)施例采用彼此獨(dú)立的檢測(cè)試紙條膜98和104，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能立即想到可將兩條檢測(cè)試紙條膜整合在同一張膜上。
本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法的優(yōu)選實(shí)施例中，若檢測(cè)到則指示結(jié)腸潰瘍的感興趣的物質(zhì)是馬珠蛋白，而若檢測(cè)到則指示胃潰瘍的感興趣的物質(zhì)是馬血紅素或者亞鐵血紅素。選擇馬珠蛋白來(lái)指示結(jié)腸潰瘍可提供特異性，因?yàn)轳R糞便中檢測(cè)到的珠蛋白只可能來(lái)源于結(jié)腸。這是因?yàn)?，?lái)自胃潰瘍的血液(和其他任意十二指腸之前的血液，就此而言)會(huì)被胃中的酸和肽降解，因此，糞便中檢測(cè)到的珠蛋白不大可能來(lái)源于胃潰瘍。
但是，胃中酸和肽的作用會(huì)產(chǎn)生包括血紅素或者亞鐵血紅素在內(nèi)的多種物質(zhì)。糞便中檢測(cè)到的血紅素或者亞鐵血紅素幾乎肯定來(lái)源于胃，而不是結(jié)腸(或者在胃之后的血液，就此而言)，因此，糞便中檢測(cè)到的血紅素不大可能來(lái)源于結(jié)腸潰瘍。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解，本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法由此提供診斷胃潰瘍和/或結(jié)腸潰瘍的機(jī)制和方法，為展開(kāi)對(duì)這些潰瘍的治療提供了可信依據(jù)。
珠蛋白檢測(cè)珠蛋白檢測(cè)是一種高度靈敏的單克隆/多克隆免疫分析。這種免疫分析包括四個(gè)不同步驟，即免疫接種、融合、克隆和制備。第一階段是免疫接種，其中，給兔子、小鼠、大鼠、豚鼠或其他合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射來(lái)自馬血的馬珠蛋白。這將在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中誘發(fā)免疫反應(yīng)，從而在其血液和脾中產(chǎn)生大量抗體。
大約6周后，從動(dòng)物取血，用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體。這涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液在體外與馬血清相互反應(yīng)。如果存在抗體，ELISA將變色。如果存在的抗體水平不足，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需要一次或多次馬珠蛋白的加強(qiáng)免疫注射。這些首次放出的血可用于制備多克隆抗體。這一階段通常需要大約3個(gè)月。
第二階段是融合，其中，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)它們的脾進(jìn)行浸漬裂解以釋放出產(chǎn)生馬抗體的細(xì)胞?？蓪⑦@些細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合以使其無(wú)限繁殖化，如Stanker等人的第5,552,295號(hào)美國(guó)專(zhuān)利所述，該專(zhuān)利在此引入作為參考。無(wú)限繁殖化后，這些細(xì)胞可以無(wú)限培養(yǎng)以提供持續(xù)的抗體源。
將雜交瘤(融合細(xì)胞)接種于幾塊96孔孔板上。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行另一次ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，那些顯示正確抗體反應(yīng)的細(xì)胞在更多微孔中擴(kuò)增。再用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這些細(xì)胞以提供產(chǎn)生所需抗體的純細(xì)胞系，這個(gè)階段通常需要大約5至6周。
第三階段是克隆，其中，在第二階段檢測(cè)呈陽(yáng)性的細(xì)胞被克隆，再用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)?？赡苄枰M(jìn)行多輪克隆來(lái)得到穩(wěn)定克隆。然后將這些克隆注射到小鼠腹腔，在那里產(chǎn)生腹水。從腹水液體中純化單克隆抗體，備用。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常清楚，這種技術(shù)將產(chǎn)生特異抗馬珠蛋白的單克隆抗體。第三個(gè)步驟通常需要大約3個(gè)月。
或者，可用抗原免疫雞，接受免疫的雞將在雞蛋的蛋黃中產(chǎn)生抗體。這種技術(shù)不需要上述克隆步驟，因?yàn)殡u可以下足夠的蛋以提供抗體。但是，這些抗體的純化步驟與上面所述的相似。
第四步也是最后一步是制備檢測(cè)試劑盒。將抗體涂布于本領(lǐng)域常用的多孔硝酸纖維素或尼龍膜。當(dāng)馬珠蛋白置于檢測(cè)裝置上時(shí)，它通過(guò)毛細(xì)作用通過(guò)膜，帶走攜有著色劑的標(biāo)記抗體，最終被試驗(yàn)指示區(qū)上的抗體捕獲。在那里，標(biāo)記抗體的濃集造成清晰的顏色變化，表明在接受檢測(cè)的馬的糞便中存在馬珠蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，這種新型抗體檢測(cè)是極其靈敏的(靈敏度可達(dá)到大約百萬(wàn)分之一(1微克每毫升))，并對(duì)馬珠蛋白特異。
血紅素檢測(cè)血紅素是由兩個(gè)亞鐵血紅素分子連接在一起組成的分子。因?yàn)閬嗚F血紅素是高度保守的(在所有哺乳動(dòng)物中基本是相同的)，因此實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不可能產(chǎn)生針對(duì)它的抗體。(如果產(chǎn)生了抗體，它們將攻擊動(dòng)物自身血液并且殺死它。)因?yàn)檫@個(gè)原因，在優(yōu)選的實(shí)施例中，用雞蛋來(lái)制備血紅素的抗體。這個(gè)過(guò)程包括四個(gè)步驟，即接種、收集、純化和制備。
第一步是接種，其中，在產(chǎn)蛋前給雞肌內(nèi)注射馬血紅素。以這種方式注射的雞通常會(huì)產(chǎn)生含有所需抗體的雞蛋。
第二步是收集，其中，收集接種母雞產(chǎn)的雞蛋，標(biāo)記并冷藏(refrigerate)。每個(gè)雞蛋在蛋黃中包含多達(dá)150毫克抗體。
第三步是純化，其中，打破雞蛋，用親和層析純化蛋黃。然后用ELISA檢測(cè)分析進(jìn)一步純化洗脫液。
第四步是制備，其中一旦純化得到抗體，將它們涂布于本領(lǐng)域常用的多孔硝酸纖維素或尼龍膜。當(dāng)馬血紅素置于檢測(cè)裝置上時(shí)，它通過(guò)毛細(xì)作用通過(guò)膜，帶走攜有著色劑的標(biāo)記抗體，最終被試驗(yàn)指示區(qū)上的抗體捕獲。在那里，標(biāo)記抗體的濃集將造成清晰的顏色變化，表明在接受檢測(cè)的馬的糞便中存在血紅素。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，這種新型抗體檢測(cè)是極其靈敏的(靈敏度可達(dá)到大約百萬(wàn)分之一(1微克每毫升))，并對(duì)血紅素特異。
或者，可用高度靈敏的潛血反應(yīng)(guaiac reaction)或四甲基聯(lián)苯胺酶(TMB)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)亞鐵血紅素或者血紅素。在這個(gè)實(shí)施例中，液體通過(guò)毛細(xì)作用經(jīng)過(guò)愈創(chuàng)木脂(quaiac)或者TMB，將過(guò)氧化物指示劑施加于檢測(cè)窗口，在亞鐵血紅素或者血紅素存在時(shí)，該指示劑將改變顏色。
聯(lián)合檢測(cè)通過(guò)將血紅素檢測(cè)和珠蛋白檢測(cè)組合在同一檢測(cè)試劑盒中，可以得到一種針對(duì)馬潰瘍的簡(jiǎn)單、便宜、高靈敏度且診斷特異性的檢測(cè)方法?；蛘?，可將這兩種檢測(cè)做在不同試劑盒中。在優(yōu)選的實(shí)施例中，將兩個(gè)檢測(cè)試紙條連接到一個(gè)孔，這樣的話只用一份糞便液體就可滿足兩種檢測(cè)的需要。
如果血紅素檢測(cè)呈陽(yáng)性，表明有胃潰瘍。如果珠蛋白檢測(cè)呈陽(yáng)性，表明有結(jié)腸潰瘍。如果兩個(gè)結(jié)果都呈陽(yáng)性，表明同時(shí)存在胃潰瘍和結(jié)腸潰瘍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，這種雙檢測(cè)提供了一種方便、非侵入性的胃潰瘍(目前的胃潰瘍?cè)\斷困難而昂貴)和結(jié)腸潰瘍(目前為止還沒(méi)有準(zhǔn)確的結(jié)腸潰瘍?cè)\斷方法)檢測(cè)。
因此，從以上本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述可以看出，本發(fā)明介紹了一種馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和該檢測(cè)試劑盒的相關(guān)使用方法，所述試劑盒和所述方法可有效診斷馬的胃潰瘍和結(jié)腸潰瘍。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法為胃潰瘍或者結(jié)腸潰瘍或兩者的存在提供了一種高度特異性的指標(biāo)。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法在鑒定馬潰瘍的存在以及馬潰瘍的類(lèi)型方面都非?？煽?，不會(huì)產(chǎn)生過(guò)度假陽(yáng)性顯示。
本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法使用起來(lái)方便快捷，不需要檢測(cè)的操作者具有專(zhuān)門(mén)的技術(shù)或者接受特殊培訓(xùn)。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒是完全自給自足的(self-contained)，不需要實(shí)驗(yàn)室分析或者其他處理裝備，從而使它可以作為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)在任何地點(diǎn)進(jìn)行。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒和方法可以快速提供檢測(cè)結(jié)果，只需幾分鐘而不是很長(zhǎng)的時(shí)間。
本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒的結(jié)構(gòu)使之持久耐用，試劑盒不需要特殊的保存條件，具有較長(zhǎng)的貯存期。本發(fā)明的馬潰瘍檢測(cè)試劑盒的構(gòu)成不昂貴，這增強(qiáng)了其市場(chǎng)吸引力，使之具有最廣闊的潛在市場(chǎng)。最后，獲得所有上述本發(fā)明馬潰瘍檢測(cè)試劑盒及方法的優(yōu)點(diǎn)和目標(biāo)的同時(shí)沒(méi)有附帶造成任何嚴(yán)重的缺點(diǎn)。
雖然已結(jié)合具體實(shí)施例及其應(yīng)用說(shuō)明和描述了本發(fā)明，但是闡述的目的是示例性和描述性的，而不是排他性或者限制本發(fā)明于所公開(kāi)的具體實(shí)施例及其應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，可對(duì)本文所述的本發(fā)明進(jìn)行許多改變、改進(jìn)、變化或替代，這些均不背離本發(fā)明的精神和范圍。選擇和描述具體實(shí)施例及其應(yīng)用是為了對(duì)本發(fā)明原理及其實(shí)際應(yīng)用提供最佳說(shuō)明，以使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠在適合于預(yù)期具體應(yīng)用的各種實(shí)施例和各種改進(jìn)中利用本發(fā)明。因此，當(dāng)公平、合法、公正的解釋其外延含義時(shí)，所有這些改變、改進(jìn)、變化或替代均應(yīng)視為屬于本文所附權(quán)利要求所確定的本發(fā)明范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.特異結(jié)合馬珠蛋白的抗馬珠蛋白抗體。
2.權(quán)利要求1所述的抗馬珠蛋白抗體，其中所述抗馬珠蛋白抗體與馬珠蛋白結(jié)合的靈敏度等于或超過(guò)大約百萬(wàn)分之一(1微克每毫升)。
3.權(quán)利要求1所述的抗馬珠蛋白抗體，其中抗馬珠蛋白抗體是單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1所述的抗馬珠蛋白抗體，其中抗馬珠蛋白抗體是多克隆抗體。
5.權(quán)利要求1所述的抗馬珠蛋白抗體，其中抗馬珠蛋白抗體是從被接種的兔、小鼠、大鼠或者豚鼠的脾浸漬裂解物中分離的。
6.特異結(jié)合馬血紅素的抗馬血紅素抗體。
7.權(quán)利要求6所述的抗馬血紅素抗體，其中所述抗馬血紅素抗體與馬血紅素結(jié)合的靈敏度等于或超過(guò)大約百萬(wàn)分之一(1微克每毫升)。
8.權(quán)利要求6所述的抗馬血紅素抗體，其中抗馬血紅素抗體是單克隆抗體。
9.權(quán)利要求6所述的抗馬血紅素抗體，其中抗馬血紅素抗體是多克隆抗體。
10.權(quán)利要求6所述的抗馬血紅素抗體，其中抗馬血紅素抗體是從被接種的雞蛋中分離的。
11.產(chǎn)生和分泌與馬珠蛋白特異結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
12.產(chǎn)生和分泌與馬血紅素特異結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
13.制備與馬珠蛋白特異結(jié)合的抗體的方法。
14.權(quán)利要求13所述的制備抗馬珠蛋白抗體的方法，包括表達(dá)來(lái)自免疫細(xì)胞的珠蛋白抗體，所述免疫細(xì)胞已與無(wú)限繁殖化的骨髓瘤細(xì)胞系雜交。
15.權(quán)利要求14所述的制備抗馬珠蛋白抗體的方法，其中所述免疫細(xì)胞從被接種的兔、小鼠、大鼠或者豚鼠的脾浸漬裂解物中分離。
16.制備與馬血紅素特異結(jié)合的抗體的方法。
17.權(quán)利要求16所述的制備抗馬血紅素抗體的方法，包括表達(dá)來(lái)自免疫細(xì)胞的血紅素抗體，所述免疫細(xì)胞已與無(wú)限繁殖化的骨髓瘤細(xì)胞系雜交。
18.權(quán)利要求16所述的制備抗馬血紅素抗體的方法，其中所述免疫細(xì)胞從被接種的雞蛋中分離。
19.一種用于檢測(cè)和定位馬潰瘍的快速檢測(cè)試劑盒，其包含用于快速免疫分析或者過(guò)氧化物酶反應(yīng)以檢測(cè)馬胃潰瘍的第一檢測(cè)試紙條；和用于快速免疫分析以檢測(cè)馬結(jié)腸潰瘍的第二檢測(cè)試紙條。
20.權(quán)利要求19所述的快速檢測(cè)試劑盒，其中所述第一檢測(cè)試紙條檢測(cè)血紅素，所述血紅素指示馬胃潰瘍。
21.權(quán)利要求19所述的快速檢測(cè)試劑盒，其中所述第一檢測(cè)試紙條還包含用于表明檢測(cè)運(yùn)作正確的對(duì)照指標(biāo)。
22.權(quán)利要求19所述的快速檢測(cè)試劑盒，其中所述第二檢測(cè)試紙條檢測(cè)馬珠蛋白，所述馬珠蛋白指示馬結(jié)腸潰瘍。
23.權(quán)利要求22所述的快速檢測(cè)試劑盒，其中所述第二檢測(cè)試紙條還包含用于表明檢測(cè)運(yùn)作正確的對(duì)照指標(biāo)。
24.一種用于檢測(cè)和定位馬潰瘍的快速檢測(cè)試劑盒，其包含用于快速免疫分析或者過(guò)氧化物酶反應(yīng)以檢測(cè)血紅素的第一檢測(cè)試紙條，所述血紅素指示馬胃潰瘍；和用于快速免疫分析以檢測(cè)馬珠蛋白的第二檢測(cè)試紙條，所述馬珠蛋白指示馬結(jié)腸潰瘍。
25.權(quán)利要求24所述的快速檢測(cè)試劑盒，其中所述第一檢測(cè)試紙條還包含用于表明檢測(cè)運(yùn)作正確的對(duì)照指標(biāo)，所述第二檢測(cè)試紙條還包含用于表明檢測(cè)運(yùn)作正確的對(duì)照指標(biāo)。
26.權(quán)利要求24所述的快速檢測(cè)試劑盒，其中所述第一和第二檢測(cè)試紙條包含用于檢測(cè)血紅素和馬珠蛋白的單一檢測(cè)試紙條。
全文摘要
公開(kāi)了一種診斷檢測(cè)裝置和相關(guān)使用方法，獲得了抗馬珠蛋白和血紅素的抗體并將這些抗體用于檢測(cè)和定位馬胃潰瘍和結(jié)腸潰瘍的檢測(cè)裝置、試劑盒及方法。將受試馬的糞便與經(jīng)緩沖的溶液一起放于大容器中，充分混勻，然后取容器中的幾滴液滴置于檢測(cè)試劑盒。檢測(cè)試劑盒中的可見(jiàn)標(biāo)記顯示作為指標(biāo)的血紅素和馬珠蛋白的檢測(cè)結(jié)果，這兩個(gè)指標(biāo)分別指示胃潰瘍和/或結(jié)腸潰瘍。
文檔編號(hào)G01N33/72GK101072796SQ200580041509
公開(kāi)日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2005年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月4日
發(fā)明者F·L·佩里格里尼, S·C·安德森 申請(qǐng)人:自由健康有限公司