專(zhuān)利名稱(chēng)：：檢測(cè)糖類(lèi)的傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及傳感器、制備傳感器的方法和使用傳感器的方法。該傳感器可以用于測(cè)量分析物的存在或濃度，所述分析物可以是組織液的組分，例如葡萄糖。該傳感器特別適用于必須精密地監(jiān)測(cè)葡萄糖水平和/或必須重復(fù)地測(cè)量葡萄糖的情況，例如在糖尿病監(jiān)護(hù)中。
背景技術(shù)：
：在糖尿病監(jiān)護(hù)中，血液中葡萄糖的常規(guī)測(cè)量是必要的，以便保證恰當(dāng)?shù)囊葝u素劑量。另外，已經(jīng)表明在糖尿病患者的長(zhǎng)期護(hù)理中較好地控制血糖水平可以延緩，如果不能預(yù)防，視網(wǎng)膜病、循環(huán)問(wèn)題和其它通常與糖尿病相關(guān)聯(lián)的變性疾病的發(fā)作。因此，糖尿病患者需要可靠地和精確地自我監(jiān)測(cè)血糖水平。希望測(cè)量可能在糖尿病患者中出現(xiàn)的濃度范圍內(nèi)的血糖，即，0~35mM或甚至更高。雖然在此廣泛地將葡萄糖作為相應(yīng)的例子，但是應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的原理廣泛地適用于大范圍的分析物。目前，糖尿病患者利用可商業(yè)得到的比色測(cè)試條或電化學(xué)生物傳感器(例如酶電極)來(lái)監(jiān)測(cè)血糖，但是它們?cè)诿看螠y(cè)量時(shí)都需要常規(guī)地使用柳葉刀型的工具以取出合適量的血液。大多數(shù)糖尿病患者平均每天要使用這種工具測(cè)量血糖兩次。但是，美國(guó)NationalInstitutesofHealth推薦每天應(yīng)該進(jìn)行至少四次血糖測(cè)試，美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(AmericanDiabetesAssociation)已經(jīng)認(rèn)可了該推薦。血糖測(cè)試頻率的增加給糖尿病患者施加了相當(dāng)大的負(fù)擔(dān)，不僅在金錢(qián)方面而且在疼痛和不適方面，尤其是不得不常規(guī)地使用柳葉刀從指尖采血的長(zhǎng)期糖尿病患者。因此，毫無(wú)疑問(wèn)地，需要不用從患者采血的較好的長(zhǎng)期葡萄糖監(jiān)測(cè)體系。已經(jīng)有許多不需要從患者采血的葡萄糖測(cè)量技術(shù)的提議。觀察到分析物在皮下流體中的濃度與所述分析物在血液中的濃度相關(guān)聯(lián)，因此已經(jīng)有幾個(gè)使用位于皮下位置的葡萄糖監(jiān)測(cè)裝置的報(bào)告。對(duì)可以遠(yuǎn)程訊問(wèn)的葡萄糖竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的使用是尤其感興趣的。一種測(cè)定竟?fàn)幗Y(jié)合的方法為使用基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)(proximity國(guó)basedsignalgenerating/modulatingmoietypair)(在US6232120中討論)，所述部分對(duì)通常是能量轉(zhuǎn)移供體-受體對(duì)(包含能量供體部分和能量受體部分)。能量供體部分是光致發(fā)光的(通常是熒光的)。在該方法中，使能量轉(zhuǎn)移供體-受體對(duì)與待分析的樣品接觸(例如皮下流體)。然后樣品發(fā)光并且檢測(cè)到所產(chǎn)生的發(fā)射。供體-受體對(duì)的或者能量供體部分或者能量受體部分與受體載體結(jié)合，而供體-受體對(duì)的另一部分(結(jié)合到配體載體)和存在的任何分析物竟?fàn)幵谑荏w栽體上的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)使供體和受體在一起時(shí)它們之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，這產(chǎn)生能量供體部分的可檢測(cè)的熒光壽命變化(減少)。另外，由能量供體部分發(fā)射的部分熒光信號(hào)猝滅。通過(guò)分析物的竟?fàn)幗Y(jié)合使壽命變化減少或甚至消失。因此，通過(guò)測(cè)量明顯的發(fā)光壽命，例如通過(guò)相調(diào)制熒光計(jì)或時(shí)間分辨熒光計(jì)(參見(jiàn)Lakowicz,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,PlenumPress,1983，第3章)，可以測(cè)定樣品中分析物的量。應(yīng)當(dāng)注意能量轉(zhuǎn)移的效率取決于供體的量子產(chǎn)率、供體的發(fā)射光鐠與受體的吸收光鐠的重疊、和供體與受體之間的相對(duì)距離和方向。在EP0561653中，乂^開(kāi)了一種如上所述的i禮問(wèn)受體和配體的方法。供體-受體能量轉(zhuǎn)移的例子為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(F6rster共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET),其是從初始激發(fā)的供體(D)到受體(A)的非輻射的激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移。供體通常以較短波長(zhǎng)發(fā)射，并且它的發(fā)射光鐠與受體的吸收光譜重疊。不出現(xiàn)光子地發(fā)生能量轉(zhuǎn)移并且是供體和受體之間的長(zhǎng)程偶極-偶極相互作用的結(jié)果。術(shù)語(yǔ)共振能量轉(zhuǎn)移(RET)是更準(zhǔn)確的，這是因?yàn)镕RET方法不包括光子的出現(xiàn)。但是FRET和RET通?？梢蕴鎿Q使用。FRET的重要特性在于它可以在相當(dāng)于生物大分子尺寸的距離上發(fā)生。被稱(chēng)為F6rster距離的FRET50。/。有效的距離，通常為20~60A。20-90A的F6rster距離^f更于竟?fàn)幗Y(jié)合研究。用供體(D)標(biāo)記分析物結(jié)合部分并用受體(A)標(biāo)記分析物類(lèi)似物，或者反之亦然，將會(huì)產(chǎn)生能夠產(chǎn)生基于供體-受體距離的可測(cè)量響應(yīng)的檢測(cè)物。因此，D-"分析物結(jié)合部分"到A-"分析物類(lèi)似物"的結(jié)合導(dǎo)致供體強(qiáng)度或壽命的降低。樣品中的分析物在D-"分析物結(jié)合部分"上竟?fàn)幏治鑫锝Y(jié)合部分，從受體(A)釋放D-"分析物結(jié)合部分"。因此期望供體的強(qiáng)度衰減時(shí)間和相位角隨葡萄糖濃度的增加而增加。將這些原理用于通過(guò)能量轉(zhuǎn)移的葡萄糖感測(cè)。WO91/09312描述了一種采用基于通過(guò)光學(xué)裝置遠(yuǎn)程訊問(wèn)的葡萄糖(引入能量轉(zhuǎn)移供體-受體對(duì))的親和力分析的皮下方法和裝置。每個(gè)例子W097/19188、WO00/02048、WO03/006992和WO02/30275描述通過(guò)產(chǎn)生可以被遠(yuǎn)程讀取的光學(xué)信號(hào)的能量轉(zhuǎn)移來(lái)感測(cè)葡萄糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解受體可以是熒光團(tuán)。在用能量受體部分的吸收光鐠內(nèi)的波長(zhǎng)的入射輻射束激發(fā)后，由能量受體部分發(fā)射的任何熒光信號(hào)未受到FRET過(guò)程的影響。因此，可以將由能量受體部分發(fā)射的熒光信號(hào)的強(qiáng)度用作內(nèi)參比信號(hào)，例如在傳感器的連續(xù)校準(zhǔn)中，或者用以監(jiān)測(cè)傳感器降級(jí)的程度，并因此指示需要植入或注入新的傳感器。該信號(hào)下降到可接受的基線(xiàn)水平之下表明需要植入或注入新的傳感器。但是，能量受體部分可以是非熒光染料。在這種情況下用具有熒光猝滅性能的化合物代替特定的能量受體部分。由Tyagi等人NatureBiotechnology(1998)18:49頁(yè)給出強(qiáng)有力的和非特異性的熒光猝滅劑的例子。目前已知的體液內(nèi)葡萄糖水平的非侵入分析的局限性為能夠精確地測(cè)量分析的葡萄糖濃度范圍。據(jù)說(shuō)WO91/09312的皮下植入能夠測(cè)量在0.5~18mgmr1(2.6~94mM)范圍內(nèi)的葡萄糖濃度，其覆蓋了除細(xì)胞內(nèi)液葡萄糖濃度測(cè)量必需的目標(biāo)范圍的較低端值之外的所有范圍。在非常低的葡萄糖濃度下的精確測(cè)量在糖尿病控制中是特別重要的，這是因?yàn)樗鼘?duì)應(yīng)于〗氐血糖。在WO98/05589中報(bào)告了類(lèi)似的裝置，并且據(jù)說(shuō)具有測(cè)量0.05~5mgmr1(0.26~26mM)范圍內(nèi)的葡萄糖濃度的能力，其覆蓋了細(xì)胞內(nèi)液葡萄糖濃度測(cè)量所需的較低端值。在WO00/16099中z〉開(kāi)了第三種裝置。上述裝置使用了竟?fàn)帣z測(cè)物，其包含分析物類(lèi)似物、和能夠竟?fàn)幍亟Y(jié)合感興趣的分析物和分析物類(lèi)似物的結(jié)合劑。從結(jié)合劑取代分析物的分析物能力取決于分析物、配體和結(jié)合劑的一致性。檢測(cè)物產(chǎn)生的可測(cè)量的響應(yīng)與分析物結(jié)合到結(jié)合劑的比例相關(guān)聯(lián)。因此，對(duì)于特定的檢測(cè)物，將存在可以被測(cè)量的分析物濃度范圍。該范圍將通過(guò)從結(jié)合劑取代分析物類(lèi)似物的所需的分析物最小濃度、和用來(lái)從結(jié)合劑取代所有的分析物類(lèi)似物的分析物最大濃度來(lái)限定。配制一種檢測(cè)物，以在所有感興趣的分析物濃度范圍內(nèi)產(chǎn)生可測(cè)量的響應(yīng)，尤其是當(dāng)存在必須被考慮的檢測(cè)物的其它特性(例如壽命、成本、毒性)時(shí)，是困難的和可能昂貴的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種克服濃度范圍局限性的方法，在所述濃度范圍內(nèi)的分析是精確的。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了用于感測(cè)分析物濃度的傳感器，所述傳感器包含適當(dāng)竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的至少兩個(gè)不同的變化形式(variant),通過(guò)該檢測(cè)物的變化形式，所述傳感器能夠精確地感測(cè)所需范圍的分析物濃度，其中所述檢測(cè)物的變化形式的每一種都能夠精確地感測(cè)所需分析物濃度范圍的僅僅一部分，并且所述檢測(cè)物的變化形式被選擇用于感測(cè)覆蓋所述整個(gè)所需范圍的重疊或鄰接濃度范圍。合適地，檢測(cè)物變化形式在它們能夠精確地感測(cè)的分析物濃度范圍內(nèi)具有最佳靈敏度。優(yōu)選地，該傳感器能夠在比任何單一檢測(cè)物變化形式(assayvariant)能夠感測(cè)濃度的范圍更寬的濃度范圍內(nèi)感測(cè)分析物濃度。檢測(cè)物變化形式能夠在寬度上相似或不同、和在IQo值上相似或不同的濃度范圍內(nèi)感測(cè)分析物濃度。使用能夠在寬度上不同的濃度范圍內(nèi)感測(cè)分析物濃度的檢測(cè)物變化形式的結(jié)合是特別有用的，這是因?yàn)樗芨艿乇O(jiān)測(cè)全部濃度范圍的某些部分(見(jiàn)下文)。優(yōu)選地，傳感器適于檢測(cè)或測(cè)量在體液內(nèi)，例如皮下流體中的分析物。希望傳感器適合于在體內(nèi)使用，并且下文將更詳細(xì)地討論這一點(diǎn)。優(yōu)選待通過(guò)分析檢測(cè)或測(cè)量的分析物為糖類(lèi)、更優(yōu)選為單糖，高度優(yōu)選為葡萄糖。優(yōu)選地，傳感器能夠測(cè)量0~35mM葡萄糖范圍的至少一部分內(nèi)的血糖濃度，例如025mM葡萄糖的范圍內(nèi)。例如，一個(gè)檢測(cè)物變化形式可以具有7~8mM的ICs。值，另一個(gè)檢測(cè)物變化形式可以具有大約18mM的ICso值。更優(yōu)選地，傳感器能夠在210mM葡萄糖范圍內(nèi)測(cè)量葡萄糖濃度。希望在該范圍內(nèi)的劑量-響應(yīng)曲線(xiàn)盡可能地接近直線(xiàn)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，傳感器包含兩個(gè)竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的變化形式，一個(gè)變化形式能夠感測(cè)在015mM范圍內(nèi)的葡萄糖濃度，另一個(gè)變化形式能夠感測(cè)在10~35mM、10~25mM或15~35mM范圍內(nèi)的葡萄糖濃度。優(yōu)選使用重疊范圍，因?yàn)槊總€(gè)檢測(cè)物變化形式在IC5Q值附近具有最佳靈敏度。例如，本發(fā)明人已經(jīng)制備了具有相當(dāng)于0.08。pr.mMGlc的7.5相位度(phasedegrees)的0~100mM范圍內(nèi)的葡萄糖響應(yīng)的單個(gè)檢測(cè)物。如果最佳地使用合適的竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的兩個(gè)變化形式，那么在相當(dāng)于0.5°pr.mMGlc的0~15mMGlc范圍內(nèi)得到7.5相位度，并且在另一個(gè)檢測(cè)物中在相當(dāng)于0.5°pr.mMGlc的10~25mM的Glc范圍內(nèi)得到7.5相位度。能夠在0~35mM葡萄糖范圍內(nèi)感測(cè)葡萄糖濃度的檢測(cè)物變化形式與能夠在0~10mM葡萄糖的較窄范圍內(nèi)感測(cè)葡萄糖濃度的檢測(cè)物變化形式的結(jié)合是特別優(yōu)選的，這是因?yàn)樵?10mM葡萄糖范圍內(nèi)更靈敏的檢測(cè)物將會(huì)降低通常與其它葡萄糖連續(xù)監(jiān)測(cè)裝置相關(guān)聯(lián)的假血糖過(guò)低報(bào)警的次數(shù)。優(yōu)選地，傳感器還包含能夠感測(cè)25~50mM范圍內(nèi)的葡萄糖濃度的竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物第三變化形式。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用竟?fàn)帣z測(cè)物，其中分析物類(lèi)似物可以在許多位點(diǎn)非共價(jià)地結(jié)合到分析物結(jié)合劑上。通常在分析物類(lèi)似物的分析物類(lèi)似部分處形成鍵。取代分析物類(lèi)似物所需的分析物濃度將取決于分析物類(lèi)似物對(duì)分析物結(jié)合劑的親合力(整體結(jié)合能力)。對(duì)于指定的分析物結(jié)合劑，影響分析物類(lèi)似物親合力的參數(shù)包括-分析物類(lèi)似部分的數(shù)目；—分析物類(lèi)似部分對(duì)凝集素的親合力(單獨(dú)的結(jié)合能力)；-鈣濃度；和-分析物類(lèi)似物的柔性。生理釣濃度不能控制。但是，可以選擇其它參數(shù)。具有給定親合力的分析物類(lèi)似部分的數(shù)目越多，配體對(duì)分析物結(jié)合劑的親合力越大，取代它所需的分析物濃度越大。類(lèi)似地，給定數(shù)目的分析物類(lèi)似部分的親合力越大，配體對(duì)分析物結(jié)合劑的親合力越大，取代它所需的分析物濃度越大。因此，通過(guò)改變分析物類(lèi)似部分的數(shù)目、一些或全部分析物類(lèi)似部分的性質(zhì)和分析物類(lèi)似物的柔性，可通過(guò)檢測(cè)物變化形式感測(cè)的濃度范圍可以在較高和較低的分析物濃度之間變化。因此，可以使用檢測(cè)物變化形式的結(jié)合，每個(gè)所述檢測(cè)物變化形式包含對(duì)于分析物結(jié)合劑具有不同親合力的分析物類(lèi)似物，選擇所述檢測(cè)物變化形式使得單個(gè)檢測(cè)物變化形式的范圍重疊或鄰接且，當(dāng)放在一起時(shí)，覆蓋感興趣的分析物濃度的全部范圍。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物包含分析物結(jié)合劑；和包含至少一個(gè)分析物類(lèi)似部分的分析物類(lèi)似物；其中分析物結(jié)合劑結(jié)合分析物類(lèi)似物的至少一個(gè)分析物類(lèi)似部分以形成復(fù)合物，所述分析物從所述復(fù)合物取代分析物類(lèi)似物，和其中不同檢測(cè)物的區(qū)別在于分析物類(lèi)似物包含的分析物類(lèi)似部分的數(shù)目或性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解檢測(cè)物變化形式除了具有不同的分析物類(lèi)似物之外，其它方面也可以不同。例如，可以使用不同的分析物結(jié)合劑。檢測(cè)優(yōu)選地，檢測(cè)物變化形式產(chǎn)生可與分析物濃度相關(guān)聯(lián)的可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)，例如光能激發(fā)產(chǎn)生熒光。合適的檢測(cè)技術(shù)包括FRET、熒光能量轉(zhuǎn)移、熒光偏振、熒光猝滅、磷光、發(fā)光增強(qiáng)、發(fā)光猝滅、衍射、或等離激元共振。結(jié)合檢測(cè)物產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)應(yīng)該優(yōu)選為可逆的，以^t可以實(shí)現(xiàn)波動(dòng)水平分析物的連續(xù)監(jiān)測(cè)。該可逆性是使用結(jié)合檢測(cè)物形式的特別優(yōu)點(diǎn)，在其中不消耗檢測(cè)物組分。優(yōu)選地，使用基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)來(lái)產(chǎn)生可檢測(cè)的或可測(cè)量的光學(xué)信號(hào)。當(dāng)使所述對(duì)的第一元與所述對(duì)的第二元緊緊地接近時(shí)，產(chǎn)生或調(diào)制信號(hào)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用一個(gè)基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)來(lái)標(biāo)記分析物結(jié)合劑，并且用另一個(gè)基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)來(lái)標(biāo)記分析物類(lèi)似物，并且當(dāng)分析物類(lèi)似物和分析物結(jié)合劑形成復(fù)合物時(shí)和當(dāng)分析物從復(fù)合物取代分析物類(lèi)似物時(shí)，在信號(hào)中存在可檢測(cè)的差異。優(yōu)選地，基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)為能量供體部分和能量受體部分對(duì)。能量供體部分和能量受體部分也分別指供體和受體發(fā)色團(tuán)(或光吸收物質(zhì))。不發(fā)射熒光的能量受體稱(chēng)為猝滅部分。在這種情況下，用能量供體和能量受體部分對(duì)中的一個(gè)來(lái)標(biāo)記凝集素，用能量供體和能量受體部分的另一個(gè)對(duì)來(lái)標(biāo)記分析物類(lèi)似物。信號(hào)中可檢測(cè)的差異對(duì)應(yīng)于在從能量供體部分到能量受體部分的能量轉(zhuǎn)移中的可檢測(cè)的差異。更優(yōu)選地，分析物類(lèi)似物具有能量受體部分，和分析物結(jié)合劑具有能量供體部分合適地，本發(fā)明的傳感器引入了使用FRET技術(shù)產(chǎn)生光學(xué)讀出的檢測(cè)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的變化形式包含用第一光吸收物質(zhì)標(biāo)記的分析物結(jié)合劑；用第二光吸收物質(zhì)標(biāo)記并包含至少一個(gè)分析物類(lèi)似部分的大分子；其中分析物結(jié)合劑綴合大分子的所述至少一個(gè)分析物類(lèi)似部分以形成復(fù)合物，所述分析物從所述復(fù)合物取代所述大分子，和其中所述復(fù)合物能夠吸收光能，所述被吸收的光能能夠在一種光吸收物質(zhì)和另一種光吸收物質(zhì)之間被非輻射地轉(zhuǎn)移，與當(dāng)所述分析物從所述復(fù)合物中取代所述大分子時(shí)它們的所述熒光特性相比當(dāng)所述大分子存在于所述復(fù)合物中時(shí)所述光吸收物質(zhì)的熒光特性隨后具有可測(cè)量的變化，和其中通過(guò)可以進(jìn)行熒光壽命或熒光強(qiáng)度測(cè)量?？梢酝ㄟ^(guò)相位調(diào)制技術(shù)測(cè)量熒光壽命。當(dāng)將檢測(cè)物用于體內(nèi)時(shí)，希望供體在550到大約700nm處發(fā)熒光，受體在大約650nm處吸收光。這避免了供體熒光和體內(nèi)較短波長(zhǎng)的自身熒光之間的重疊。AlexaFluor594，(例如作為琥珀酰亞胺酯)是用于體內(nèi)的具有合適發(fā)射光鐠的能量供體部分。該染料在594nm處吸收并在620nm處發(fā)熒光。在WO05/059037中描述的HMCV染料是用于本發(fā)明的合適的能量受體部分。這些染料是穩(wěn)定的碳正離子。一個(gè)例子是六曱氧基-結(jié)晶紫琥珀酰亞胺酯(HMCV-1)。作為可替代方案，可以將QSY21tm用作能量受體部分，將AlexaFluor594tm用作能量供體部分?？梢赃M(jìn)行熒光壽命或熒光強(qiáng)度測(cè)量?？梢酝ㄟ^(guò)相位調(diào)制技術(shù)測(cè)量熒光壽命(下文討論)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用AlexaFluor594TM標(biāo)記分析物結(jié)合劑作為能量供體部分，用HMCV-1標(biāo)記分析物類(lèi)似物作為能量受體部分，并且通過(guò)相位調(diào)制技術(shù)測(cè)量熒光壽命。在這種類(lèi)型的檢測(cè)物中，保持檢測(cè)物組分的物質(zhì)優(yōu)選為能量供體和能量受體部分提供足夠的空間，以便在彼此不結(jié)合時(shí)將其分開(kāi)使得可以終止能量轉(zhuǎn)移。分析物結(jié)合劑優(yōu)選地，分析物結(jié)合劑為凝集素。術(shù)語(yǔ)"凝集素"包括不明顯地涉及糖類(lèi)代謝的和不屬于任何免疫球蛋白主類(lèi)的任何綴合糖的蛋白。凝集素通過(guò)糖類(lèi)識(shí)別域(carbohydraterecognitiondomains(CRDs))表現(xiàn)出對(duì)糖類(lèi)的選擇性結(jié)合。凝集素以單體或多聚體形式天然存在，后者通常包含許多子單元，每個(gè)子單元具有幾個(gè)CRDs。因此，當(dāng)分析物為糖類(lèi)時(shí)使用凝集素分析物結(jié)合劑是特別合適的。上述基于FRET的體系基于伴刀豆球蛋白A(ConA)作為葡萄糖結(jié)合劑。伴刀豆球蛋白A源于植物的凝集素。在分析條件下伴刀豆球蛋白A不是長(zhǎng)期穩(wěn)定的(參見(jiàn)要求GB0426823.1的優(yōu)先權(quán)的同時(shí)提交的申請(qǐng))。另外，伴刀豆球蛋白A是有毒的和可能產(chǎn)生免疫性的(但是，它以在人體中被認(rèn)為是安全的小量用于葡萄糖分析)。上面提及的我們同時(shí)未決的申請(qǐng)基于獲悉需要發(fā)現(xiàn)不具有與ConA相關(guān)的缺點(diǎn)的葡萄糖綴合部分。已經(jīng)研究了可替代的葡萄糖結(jié)合部分的使用，并且令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物凝集素、尤其是人類(lèi)凝集素可以用作葡萄糖結(jié)合部分。因此，凝集素優(yōu)選為動(dòng)物凝集素，盡管不排除使用植物凝集素例如ConA。凝集素優(yōu)選為C-型(釣依賴(lài)型)凝集素。動(dòng)物凝集素優(yōu)選為脊推動(dòng)物凝集素，例如哺乳動(dòng)物凝集素，更優(yōu)選人類(lèi)或人源化凝集素。但是，作為可替代方案，它可以是鳥(niǎo)凝集素、魚(yú)凝集素或無(wú)脊推動(dòng)物凝集素例如昆蟲(chóng)凝集素。合適地，凝集素為源于人體的人類(lèi)凝集素。作為可替代方案，凝集素可以是重組制造的凝集素。作為另外的可替代方案，凝集素可以是人源化的動(dòng)物凝集素，例如人源化的牛凝集素。這應(yīng)用于存在相應(yīng)的人類(lèi)凝集素的情況?？梢砸灶?lèi)似于抗體的方式人源化凝集素。合適地，凝集素為多聚體形式。多聚體凝集素可以源于人或動(dòng)物體。作為可替代方案，凝集素可以為單體形式?？梢酝ㄟ^(guò)重組法或通過(guò)破壞在源于人或動(dòng)物體的天然多聚體凝集素中的子單元之間的結(jié)合來(lái)形成單體凝集素。在US6232130中描述了上述的例子。優(yōu)選地，凝集素具有三個(gè)或更多個(gè)CRDs。更優(yōu)選地，凝集素具有6、9、12、15或更多個(gè)CRDs。優(yōu)選地，凝集素為膠原凝素(膠原狀的凝集素)。這些是具有膠原狀序列(Gly-Xaa-Yaa三聯(lián)體(triplet))的C型動(dòng)物凝集素。MBL是C型膠原凝素而伴刀豆球蛋白A是C型凝集素。可以通過(guò)膠原酶的作用來(lái)制備單體膠原凝素CRDs。優(yōu)選地，凝集素為甘露糖綴合凝集素、膠固素或膠原凝素-43(例如牛CL-43)(全血清膠原凝素)或肺表面活性蛋白(肺膠原凝素)。已經(jīng)證明甘露糖綴合凝集素(也被稱(chēng)為甘露聚糖綴合凝集素或甘露聚糖綴合蛋白質(zhì)，MBL，MBP)例如人類(lèi)MBL是特別有益的。MBL為在"花束，，(bouquet)排列中包含幾個(gè)(通常是3~4個(gè)(MALDI-MS)，盡管很可能出現(xiàn)1~6個(gè)的分布(SDS-PAGE))子單元的膠原狀防御分子(defencemolecule),每個(gè)所述子單元由三個(gè)相同的多肽組成。每個(gè)子單元具有大約75kDa的分子量，并可以任選地與一個(gè)或多個(gè)MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MASPs)復(fù)合。每個(gè)多肽包含CRD。因此，每個(gè)子單元存在三個(gè)糖類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)。三聚MBL和四聚MBL(其為存在于人血清中的主要形式，Teillet等人，JournalofImmunology,2005，2870-2877頁(yè))分別存在九個(gè)和十二個(gè)糖類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)。MBL作為先天免疫系統(tǒng)的一部分天然地存在于體內(nèi)，其中它結(jié)合覆蓋在細(xì)菌表面的甘露糖部分。人類(lèi)MBL是無(wú)毒的并且對(duì)人是不產(chǎn)生免疫性的。期望其它物種的MBL是產(chǎn)生免疫性的但對(duì)人類(lèi)是無(wú)毒的。人MBL是以源于人體的形式和以重組制造的形式可商業(yè)得到的。在被認(rèn)為對(duì)傳染性疾病具有增加易感性的MBL缺乏患者的治療中將它用作替代治療。合適地，凝集素基本上是三聚和/或四聚形式的MBL。如上說(shuō)明，認(rèn)為三聚MBL和四聚MBL是天然地存在于人血清中的主要的多聚體形式。作為可替代方案，凝集素可以是選自SP-A和SP-D的肺表面活性蛋白。這些蛋白與MBL相似。它們是在先天宿主防御功能(host-defencefunction)中作為鉀依賴(lài)型糖綴合蛋白質(zhì)的水溶性的膠原凝素。SP-D也結(jié)合脂質(zhì)。SP-A具有與MBL相似的"花束型"結(jié)構(gòu)(Kilpatrick，D.C.(2000)HandbookofAnimalLectins,37頁(yè)，JApplPhysiol51,1-8，AmJRespirCellNolBiol4，88-94)。SP-D具有四聚體的"X，，結(jié)構(gòu)，在"X"的每一端具有CRDs。其它合適的動(dòng)物凝集素為如下所示的那些PC-凝集素(US20030216300、US20040265898)*CTL-l(US179528/10)角質(zhì)形成細(xì)胞膜(Keratinocytemembrane)凝集素(ParfuemerieundKosmetik74,164-80)CD94(EurJImmunol25,2433-7)參P35(又名人類(lèi)L-纖維膠凝蛋白(ficolin)、一組凝集素)(ImmunolLett67,109-12)ERGIC國(guó)53(又名MR60)(Mo1BiolCell,7,483-93)HIP/PAP(EurJBiochem267，1665-71)參CLECSF8(EurJImmunol34,210-20)DCL(凝集素組)(申請(qǐng)No.00231996/US)GLUT家族蛋白，尤其是GLUT1、GLUT4和GLUT11(PNAS97，1125-30)其它合適的動(dòng)物凝集素列于"HandbookofAnimalLectins:PropertiesandBiomedicalApplications",DavidC.Kilpatrick，Wiley2000的附錄A、B和C。如上所述，可以將不同的分析物結(jié)合劑用于不同的檢測(cè)物變化形式。Teillet等人(J.Immunol.,2005，2870-2877頁(yè))證明三聚(9CRDs)MBL對(duì)糖類(lèi)的結(jié)合不如四聚(12CRDs)MBL強(qiáng)。使用具有不同凝集素的檢測(cè)物，或者如此處的可以改變不同MBL多聚體的情況，以用以改變靈敏度。因此，可以通過(guò)具有不同凝集素分析物結(jié)合劑來(lái)區(qū)分不同的檢測(cè)物變化形式。不同的凝集素分析物結(jié)合劑優(yōu)選為不同的MBL類(lèi)，例如具有不同數(shù)目CRDs的MBL類(lèi)(例如上述的9CRDs和12CRDs)。優(yōu)選如上所述地標(biāo)記分析物結(jié)合劑。分析物類(lèi)似物分析物類(lèi)似物優(yōu)選為葡萄糖似物。分析物類(lèi)似物優(yōu)選包含結(jié)合到分析物結(jié)合劑的結(jié)合位點(diǎn)的多個(gè)糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬的分析物類(lèi)似部分。術(shù)語(yǔ)"糖類(lèi)"包括蔗糖。合適的糖類(lèi)的模擬部分包括肽，例如模擬N-乙酰基葡糖胺的角蛋白肽(SFGSGFGGGY)。已經(jīng)表明角蛋白肽可以抑制MBL(Mantacto等人2001J.Immunol.166，4148-4153)。合適地，糖類(lèi)分析物類(lèi)似部分為單糖或寡糖(寡聚物)。分析物類(lèi)似物本身可以為寡糖(見(jiàn)下文)。合適的單糖為任選衍生的丁糖、戊糖、己糖、庚糖或較高的同源的醛糖或酮糖，例如任選衍生的D-葡萄糖、D-甘露糖、N-乙?；?D-葡糖胺、L-巖藻糖、D-果糖、D-塔格糖或D-山梨糖醇。合適的低聚物可以為直鏈的或帶支鏈的均低聚物或混合的低聚物，例如包含2~50個(gè)糖單元。優(yōu)選的糖基化為1—6或1—2，因?yàn)橥茰y(cè)1—3和1—4糖基化會(huì)妨礙MBL綴合。例如，推測(cè)壬(1—6)-a-葡萄糖(葡聚糖1500Da)比1,3-p-D-葡萄糖(如，laminanarihexaose)對(duì)MBL具有更高的親合力。合適的寡糖包括潘糖(pannose)、麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、D-明串珠菌二糖、伊爾糖(erlose)、D-帕拉金糖(D-palatinose)、D-水i^二糖或1~250kDa的葡聚糖(優(yōu)選l40kDa的葡聚糖，例如lkDa、1.5kDa、5kDa、6kDa、10kDa、12kDa、20kDa、25kDa或40kDa的葡聚糖)。優(yōu)選地，至少一個(gè)檢測(cè)物變化形式的分析物類(lèi)似部分選自D-果糖、D-明串珠菌二糖、N-乙?；?葡糖胺、D-甘露糖、L-巖藻糖、N-乙?；?甘露糖胺、D-阿拉伯糖、肌醇、D-塔格糖、伊爾糖、D-葡萄糖、D-帕拉金糖、D-松二糖、D-核糖、D-山梨糖醇。合成的帶支鏈的糖類(lèi)的例子為用于構(gòu)建樹(shù)枝狀高分子(例如源于具有胺連接基的三糖的TRIS，如下所示)的樹(shù)枝狀高分子"楔"。該"楔"能夠綴合在蛋白例如HSA(人血清白蛋白)上，例如通過(guò)雙官能團(tuán)胺連接基。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)普通糖類(lèi)部分對(duì)MBL的親合力如下D-甘露糖、N-乙?；?D-甘露糖胺、D-果糖、D-明串珠菌二糖、伊爾糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、L-巖藻糖》肌醇、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-帕拉金糖、D-松二糖、D-山梨糖醇、D-核糖、D-塔格糖〉D-來(lái)蘇糖》乳糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以使用該列表選擇變化形式被分析物，其中分析物類(lèi)似物包含對(duì)分析物結(jié)合劑具有不同親合力的分析物類(lèi)似部分。例如，具有甘露糖分析物類(lèi)似部分的分析物類(lèi)似物對(duì)作為分析物結(jié)合劑的MBL具有比具有相同數(shù)目的葡萄糖分析物類(lèi)似部分的分析物類(lèi)似物更高的親合力。因此，包含甘露糖的分析物類(lèi)似物將需要較多的葡萄糖分析物以被從MBL中取代，并且該檢測(cè)物與使用包含分析物類(lèi)似物的葡萄糖的檢測(cè)物相比，將在更高的葡萄糖濃度范圍內(nèi)具有最佳靈敏度。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解可以制備包含多于一種類(lèi)型的分析物類(lèi)似部分的分析物類(lèi)似物。這使得能更大地控制最佳葡萄糖敏感度范圍。優(yōu)選地，至少一個(gè)檢測(cè)物變化形式的分析物類(lèi)似部分包含至少一個(gè)葡萄糖部分和/或至少一個(gè)N-乙?；咸前凡糠趾?或至少一個(gè)甘露糖部分，因?yàn)檫@些部分對(duì)MBL和其它動(dòng)物凝集素具有高的親合力。最優(yōu)選地，至少一個(gè)檢測(cè)物變化形式的分析物類(lèi)似部分為D-葡萄糖。優(yōu)選地，分析物類(lèi)似物包含大分子。優(yōu)選地，大分子為天然聚合物。更優(yōu)選地，大分子是直鏈的。對(duì)于分析物類(lèi)似物，三種不同類(lèi)型的結(jié)構(gòu)特別有意義。首先，分析物類(lèi)似物可以為糖類(lèi)-蛋白綴合物或糖類(lèi)-樹(shù)枝狀高分子綴合物，因此大分子為蛋白或樹(shù)枝狀高分子。在兩者的任一情況下，可以用糖類(lèi)模擬部分代替糖類(lèi)部分作為分析物類(lèi)似部分、或除糖類(lèi)部分之外作為分析物類(lèi)似部分。用于綴合物中的優(yōu)選蛋白是具有至少10kDa分子量的人類(lèi)蛋白，優(yōu)選至少20kDa。蛋白優(yōu)選具有非球狀的整體三級(jí)結(jié)構(gòu)。認(rèn)為這輔助在多于一個(gè)的結(jié)合位點(diǎn)處結(jié)合，導(dǎo)致高的親合力。單克隆抗體例如赫賽汀(herceptin)和RemicadeTM(具有帶有非球狀"Y，，形整體三級(jí)結(jié)構(gòu)的幾個(gè)球狀域的免疫球蛋白)是合適的。其它可替代的合適的蛋白為人凝血酶、人乳鐵蛋白和因子X(jué)III。作為糖類(lèi)-蛋白綴合物的另一個(gè)例子，蛋白可以是源于凝集素的蛋白，例如具有除去CRDs的凝集素。合適地，綴合物可以為糖類(lèi)-白蛋白綴合物。例如，綴合物可以為甘露糖-HSA綴合物或甘露糖-BSA(牛血清白蛋白)綴合物。但是，該類(lèi)型綴合物是非優(yōu)選的，這是因?yàn)槿缟纤鲆呀?jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)MBL的綴合依賴(lài)于鈣濃度。在生理釣濃度下，發(fā)現(xiàn)具有20個(gè)甘露糖殘基的70kDa甘露糖-HSA綴合物不與MBL綴合。對(duì)鉤濃度的依賴(lài)隨甘露糖基化的增加而降低。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道這種類(lèi)型綴合物的合成路線(xiàn)。作為例子，N-異氰硫基-4-氨基苯基-0-a-D-吡喃甘露糖苷(Man-ITC)可以綴合在HSA上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在每個(gè)竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物變化形式中，大分子為HSA且分析物類(lèi)似部分為葡萄糖或甘露糖，并且竟?fàn)幗Y(jié)合分析的每個(gè)變化形式包含含有不同數(shù)目葡萄糖或甘露糖部分的HSA-葡萄糖或甘露糖綴合物。合適地，在該實(shí)施方案中，分析物綴合劑為MBL。用于本發(fā)明的樹(shù)枝狀高分子優(yōu)選具有胺官能化的、羧酸官能化的或羥基官能化的表面。優(yōu)選地，樹(shù)枝狀高分子為聚酰胺胺(PAMAM)或聚丙烯亞胺(polypropylenimine)(DAB)型。優(yōu)選地，分子量小于60kDa，例如約2~10kDa。該樹(shù)枝狀高分子可以通過(guò)腎清除(Kobayashi等人,2004，J.Mag.Reson.Imaging20(3)512-518)。第二，分析物類(lèi)似物可以為糖類(lèi)和/或糖類(lèi)模擬部分(二者都包括在在此使用的術(shù)語(yǔ)"多糖"內(nèi))的任意衍生的聚合物。葡聚糖(葡萄糖聚合物，聚(1—6)-a-葡萄糖)極強(qiáng)地綴合到MBL和類(lèi)似的凝集素上。本發(fā)明人認(rèn)為這是大量葡萄糖殘基(在70kDa葡聚糖中大約430個(gè)殘基)和葡聚糖的柔性的結(jié)果。因此，從MBL中取代葡聚糖所需的葡萄糖的濃度是高的?；谄暇厶呛蚆BL的葡聚糖檢測(cè)物變化形式可以最佳地測(cè)量約30mM的葡萄糖濃度。這比血液中正常的5mM的葡萄糖濃度高得多。該檢測(cè)物變化形式可以測(cè)量0~10mM的葡萄糖濃度，其具有全部相位響應(yīng)(phaseresponse)的僅約三分中的一個(gè)的靈敏度。因此，本發(fā)明人尋找可以不太強(qiáng)地綴合MBL和類(lèi)似凝集素的可替代的分析物類(lèi)似物，以便得到在0~10mM葡萄糖范圍內(nèi)可具有多于三分中的一個(gè)全部相位響應(yīng)的檢測(cè)物變化形式。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用高碘酸鹽(其在2和3位或3和4位碳之間氧化地打開(kāi)的葡萄糖吡喃糖環(huán)以形成二醛)處理葡聚糖可以用來(lái)降低葡聚糖對(duì)MBL和類(lèi)似凝集素的親合力。這似乎是因?yàn)槿缟险f(shuō)明的MBL綴合到葡萄糖的3和4位平伏羥基?？梢砸云渌绞?例如通過(guò)氧化、還原、烷基化、取代、糖基化或酯化)使3和4位羥基失活。本發(fā)明人非常驚奇地發(fā)現(xiàn)高碘酸鹽處理的葡聚糖-MBL綴合沒(méi)有被生理鉀濃度阻止。這和上面討論的甘露糖-HSA綴合物的MBL綴合相反。本以為高碘酸鹽處理的葡聚糖-MBL綴合會(huì)被生理鈣濃度阻止，尤其是因?yàn)槠暇厶堑钠咸烟遣糠謱?duì)MBL具有比甘露糖部分小的親合力。理論上，每個(gè)葡萄糖單元能夠消耗兩個(gè)當(dāng)量的高碘酸鹽(每個(gè)二醇一個(gè))。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)于70kDa葡聚糖1100當(dāng)量的高碘酸鹽是合適的。用氨或胺處理二醛隨后還原(例如用氰基硼氫化鈉)可以用來(lái)得到氨化的葡聚糖。還可以使用其中胺化二醛隨后任選地催化氫化以得到游離胺的方法。在這種情況下千胺是可用的胺。4吏用分光光度技術(shù)，可以用節(jié)胺衍生的胺化葡聚糖來(lái)估計(jì)高碘酸鹽裂解的程度。如果通過(guò)催化氫化除去千基，可以將能量供體或能量受體部分連接到剩余的胺上。作為替代方案，如上所述，可以合成基于多糖的分析物類(lèi)似物，其包含對(duì)于MBL和類(lèi)似凝集素具有不同親合力的不同的糖或糖模擬分析物類(lèi)似部分。在Ballerstadt等人,DiabetesTechnology&Therapeuticsvol.6，no.2，2004中公開(kāi)了在伴刀豆球蛋白AFRET檢測(cè)物中用甘露糖部分衍生葡聚糖，以調(diào)節(jié)葡萄糖的檢測(cè)范圍。半乳糖以非常低的親合力綴合到MBL。因此，包含半乳糖部分(例如半乳糖衍生的葡聚糖)的分析物類(lèi)似物對(duì)MBL具有比未衍生的分析物類(lèi)似物更低的親合力。N-乙?；?葡糖胺對(duì)MBL具有高的親合力。因此包含N-乙?；?葡糖胺部分(例如GlcNAc衍生的直鏈淀粉)的分沖斤物類(lèi)似物對(duì)MBL具有比未衍生的分析物類(lèi)似物更高的親合力。在該實(shí)施方案中，分析物類(lèi)似物優(yōu)選地選自任選地衍生的葡聚糖、甘露聚糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、透明質(zhì)酸酯(鹽)、軟骨素、肝素、糊精、菊粉、木聚糖、果聚糖和殼多糖。由于半乳糖對(duì)MBL具有非常低的親合力，所以半乳糖的未衍生的聚合物例如瓊脂糖作為分析物類(lèi)似物不是優(yōu)選的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道用糖類(lèi)部分衍生多糖的方法。作為例子，可以方便地衍生胺官能化的多糖(例如氨基葡聚糖，其是由CarboMer，SanDiego，California,USA,Cat.No.5-00060或MolecularProbes,Eugene,Oregon,USA,CatNo.D1862可商業(yè)得到的)或上面提及的胺化葡聚糖。作為替代方案，可以用二乙烯基砜連接多糖中的醇基和糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分中的胺基。在EP594772中公開(kāi)了衍生葡聚糖的方法。用于衍生多糖的合適的糖類(lèi)分析物類(lèi)似部分的例子為如上關(guān)于糖類(lèi)-蛋白和糖類(lèi)-樹(shù)枝狀高分子綴合物所述的那些。在優(yōu)選實(shí)施方案中，分析物為葡萄糖，并且在竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的每個(gè)變化形式中大分子和分析物類(lèi)似部分一起形成衍生的葡聚糖，并且竟?fàn)幗Y(jié)合分析的每個(gè)變化形式包含如此衍生的葡聚糖使得結(jié)合到葡聚糖中的分析物類(lèi)似部分的數(shù)目是不同的。合適地，在該實(shí)施方案中分析物結(jié)合劑為MBL。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在每種情況下衍生的葡聚糖任選地為高碘酸鹽處理的葡聚糖。第三，分析物類(lèi)似物可以為合成的聚合物。人造聚合物的合成，而不是蛋白或多糖的衍生，使得易于控制聚合物的參數(shù)(例如分子柔性、水溶性、分子量、糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分的性質(zhì)、糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分的數(shù)目、基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分的數(shù)目)以改善檢測(cè)物性能并提供合適的檢測(cè)物變化形式。與多糖相比，合成聚合物具有可以獨(dú)立于聚合物長(zhǎng)度地控制糖類(lèi)分析物類(lèi)似部分?jǐn)?shù)目的優(yōu)點(diǎn)。此外，與葡聚糖相比，在聚合物中使用不含環(huán)的單體例如丙烯酸2-羥乙酯(HEA)得到增加的分子轉(zhuǎn)動(dòng)柔性。不希望被該理論限制，本發(fā)明人認(rèn)為基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分接近于結(jié)合部分以產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)是至關(guān)重要的。球狀配體將結(jié)合部分和基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分集中在球面上，使得它們是接近的。在直鏈葡聚糖中，主鏈由結(jié)合部分組成，并因此不能控制結(jié)合是接近或遠(yuǎn)離基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分。在合成聚合物中這可以通過(guò)將結(jié)合部分接近地定位于基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分來(lái)控制。在該實(shí)施方案中，分析物類(lèi)似物優(yōu)選為具有糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬的分析物類(lèi)似部分側(cè)鏈的非糖的柔性的水溶性聚合物。術(shù)語(yǔ)"柔性的"包含能夠顯著地單體間轉(zhuǎn)動(dòng)的聚合物。優(yōu)選地，除了糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬的分析物類(lèi)似部分和基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分側(cè)鏈之外(下面討論)，聚合物不包含大基團(tuán)(例如環(huán)結(jié)構(gòu)、叔丁基或其它空間位阻的大基團(tuán))。優(yōu)選地，該聚合物在主鏈結(jié)構(gòu)中具有很少的雙鍵(例如少于10%)。合適地，該聚合物不具有球狀三級(jí)結(jié)構(gòu)，盡管它們可能具有這種結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，聚合物是無(wú)支鏈的(與上面討論的樹(shù)枝狀高分子不同)。這改善了聚合物的柔性。但是，聚合物可以是在一定程度上支化的或交聯(lián)的，前提是這不會(huì)導(dǎo)致水凝膠的形成。例如，在100kDa總分子量的聚合物中，1~5個(gè)支鏈?zhǔn)强梢越邮艿?。術(shù)語(yǔ)"水溶性的，，包含在室溫下具有至少4mg/ml水溶解度的聚合物，優(yōu)選至少25mg/ml，更優(yōu)選至少50mg/ml，例如至少100mg/ml。在體溫下溶解度將更高。聚合物是水溶性的是重要的，以便當(dāng)用于下面討論的體內(nèi)傳感器時(shí)它可以溶于組織液。甚至當(dāng)被結(jié)合到糖結(jié)合分子例如MBL時(shí)聚合物應(yīng)該是水溶性的。優(yōu)選地，聚合物包含不多于1到5種類(lèi)型的單體單元，更優(yōu)選不多于3種單體單元。合適地，聚合物為包含具有糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分側(cè)鏈的第一單體單元?dú)埢途哂谢诮咏缘男盘?hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分側(cè)鏈的第二單體單元?dú)埢墓簿畚铩Ｗ鳛樘娲桨富蚋郊臃桨?，可以使用具有糖?lèi)或糖類(lèi)模擬部分側(cè)鏈和基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分側(cè)鏈的單一類(lèi)型的單體單元?dú)埢?。?yōu)選使用第一和第二單體單元，這是因?yàn)榭梢元?dú)立地控制糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分與基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分的量。優(yōu)選地，共聚物為無(wú)規(guī)共聚物。但是，也可以為交替共聚物。具有大嵌段的嵌段共聚物的使用不是優(yōu)選的。但是，可以使用具有低分子量(例如1~3kDa)嵌段的嵌段共聚物。優(yōu)選地，當(dāng)用于具有MBL作為糖結(jié)合分子的檢測(cè)物時(shí)，聚合物在OmM葡萄糖下結(jié)合到MBL至少相當(dāng)于氨基葡聚糖結(jié)合強(qiáng)度的50%，更優(yōu)選至少和氨基葡聚糖的強(qiáng)度一樣，但是易于被抑制。在0~35mM葡萄糖范圍內(nèi)，尤其是在215mM范圍內(nèi)，聚合物很容易地被抑制是特別重要的。這提供比使用氨基葡聚糖作為葡萄糖似物的相似檢測(cè)物更靈敏的在特定生理意義的葡萄糖濃度內(nèi)的檢測(cè)物?？梢源嬖诰哂刑穷?lèi)或糖類(lèi)模擬部分的多于一種類(lèi)型的單體單元?dú)埢Ｌ穷?lèi)或糖類(lèi)模擬部分可以是不同的，對(duì)MBL和類(lèi)似凝集素具有不同的親合力。合適地，每個(gè)第一單體單元(或單個(gè)單體單元)為糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分的含雙鍵的衍生物。但是，每個(gè)第一單體單元(或單個(gè)單體單元)可以為包含官能團(tuán)的含雙鍵分子，在聚合后糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分可以合適地連接到所述官能團(tuán)上。優(yōu)選地，糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分的含雙鍵的衍生物為糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分的含烯丙基或乙烯基的衍生物。其它合適的糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分的含雙鍵衍生物包括烯丙基衍生物的同系物，例如3-丁烯基或4-戊烯基衍生物，或在4位具有糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分的苯乙烯衍生物。糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分的其它合適的含雙鍵的衍生物包括基于HEA、甲基丙烯酸2-羥乙酯(HEMA)或乙烯醇(VA)的衍生物。糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分可以連接到第一單體單元(或單個(gè)單體單元)的胺、酸、醇和/或砜官能團(tuán)上。例如，可以使用二乙烯基砜連接單體單元中的醇基和糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分中的胺基。當(dāng)糖類(lèi)為甘露糖時(shí)，不應(yīng)該通過(guò)C3-OH或C4-OH基團(tuán)連接，因?yàn)檫@些基團(tuán)對(duì)MBL的結(jié)合是重要的。在這種情況下，二乙烯基砜連接可能是不合適的?？梢酝ㄟ^(guò)二糖的還原胺化產(chǎn)生氨基衍生的糖部分。這使糖部分在其異頭位置(C1)處連接?？梢酝ㄟ^(guò)費(fèi)歇爾(Fischer)苷化將糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分連接到醇基(例如在HEA中的)上。第一單體單元(或單個(gè)單體單元)不必需包含雙鍵。用于共聚物的合適的糖類(lèi)的例子如上述關(guān)于糖類(lèi)-蛋白綴合物討論的。合適地，每個(gè)第二單體單元(或單個(gè)單體單元)為包含官能團(tuán)的含雙鍵的分子，在聚合后基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分可以合適地連接到所述官能團(tuán)上。合適的官能團(tuán)包括酸、醇和/或砜。聚合后的連接有助于使昂貴的能量供體和能量受體部分的損耗最小化。但是，第二單體單元(或單個(gè)單體單元)可以包含基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分。在這種情況下，應(yīng)用上面討論的合適的可聚合的基團(tuán)和連接。在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)第二單體單元為N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺或其衍生物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)單個(gè)單體單元為含雙鍵的、含糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分的賴(lài)氨酸衍生物。例子如下所示(多步反應(yīng)路線(xiàn))在該反應(yīng)路線(xiàn)中原料為曱基丙烯?；?L-賴(lài)氨酸，得自PolysSciencesEurope(Eppelheim，Germany).聚合后，a氛基可以連接到基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分。優(yōu)選地，聚合物還包含不具有糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬或基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分側(cè)鏈的第三單體單元?dú)埢?。這有助于增加柔性。通過(guò)使用無(wú)空間位阻的第三單體單元例如HEA增加柔性。還通過(guò)使用不帶電荷的第三單體單元增加柔性。不包含第三單體單元的聚合物具有大量帶正電荷的銨基，需要使其失活以最小化由靜電排斥導(dǎo)致的柔性降低。聚合物內(nèi)可以包含多于一種類(lèi)型的第三單體。優(yōu)選地，每個(gè)第三單體單元為含親水基團(tuán)例如羥基的含雙鍵的分子。不優(yōu)選第三單體單元為親油的含雙鍵分子例如苯乙烯。在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)第三單體單元為HEA、乙烯基吡咯烷酮、MMA、HEMA、乙烯醇和/或乙二醇。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解存在許多其它可以使用的含親水基團(tuán)的含雙鍵分子。合適地，單體單元通過(guò)加成聚合進(jìn)行反應(yīng)。該加成聚合反應(yīng)可以是自由基引發(fā)的，例如使用過(guò)二硫酸鉀(PPS)或其它過(guò)氧化化合物。其它的可能性為縮合聚合(例如離子縮合聚合)、開(kāi)環(huán)聚合和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解單體單元的性質(zhì)將取決于所需的聚合方法(例如對(duì)于縮合聚合反應(yīng)，含雙鍵的單體單元是不必需的)。合適地，在加入引發(fā)劑前混合單體單元。優(yōu)選地，聚合反應(yīng)進(jìn)行不到兩天。聚合時(shí)間的長(zhǎng)短可以用來(lái)控制共聚產(chǎn)物的分子量。合適地，聚合反應(yīng)在無(wú)氧條件下發(fā)生。合適地，聚合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。當(dāng)不使用單個(gè)單體單元時(shí)，第一單體單元優(yōu)選以2070wto/o的量存在于反應(yīng)混合物中，更優(yōu)選以30~50wt。/o的量。當(dāng)使用第三單體單元時(shí)，它們優(yōu)選以515wt。/。的量存在于反應(yīng)混合物中。應(yīng)當(dāng)理解聚合物的組成不能準(zhǔn)確地反映存在于反應(yīng)混合物中的單體單元的量。這是由于其它因素(例如位阻和溶解度)的影響。在優(yōu)選實(shí)施方案中，分析物為葡萄糖，并且在竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的每個(gè)變化形式中，大分子和分析物類(lèi)似部分一起形成如上所述的聚合物，并且通過(guò)在聚合物中的分析物類(lèi)似部分的數(shù)目或特性來(lái)區(qū)分不同的檢測(cè)物變化形式。優(yōu)選的聚合物包括帶有甘露糖的聚合物，例如那些由烯丙基-a-D-吡喃甘露糖普作為第二單體單元(對(duì)于不同變化形式的聚合物，具有不同量的烯丙基-a-D-吡喃甘露糖苷)制備的聚合物。在該實(shí)施方案中，分析物結(jié)合劑優(yōu)選為MBL。還應(yīng)當(dāng)注意分析物類(lèi)似物可以由一起作為分析物類(lèi)似物的兩種或更多種單獨(dú)的實(shí)體組成。特別地，分析物類(lèi)似物可以由具有至少兩個(gè)分析物類(lèi)似部分的第一實(shí)體和為分析物結(jié)合劑例如凝集素的第二實(shí)體組成。例如，可以將受體標(biāo)記的MBL和供體標(biāo)記的MBL與作為模板的未標(biāo)記的葡聚糖或未標(biāo)記的合成聚合物一起使用，以使受體標(biāo)記的MBL和供體標(biāo)記的MBL彼此接近，使得發(fā)生FRET。(使用ConA的例子由Gestwicki等人在(2002)ChemistryandBiology9，163頁(yè)中給出)。優(yōu)選地，如上所討論地標(biāo)記分析物類(lèi)似物。如上述關(guān)于糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分所述的，基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分可以連接到分析物類(lèi)似物。例如，可以通過(guò)直接的二乙烯基砜連接或通過(guò)胺化(如上所述)隨后偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)葡聚糖的標(biāo)記。當(dāng)將胺衍生的葡聚糖用作分析物類(lèi)似物時(shí)，在能量供體或能量受體部分的連接期間，必須小心以避免交聯(lián)，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致不希望的沉淀。在EP594772中公開(kāi)了用DVS衍生葡聚糖以最小化交聯(lián)的方法。分析物類(lèi)似物應(yīng)該具有足夠高的分子量以防止從傳感器中漏出，分析物類(lèi)似物具有25~250kDa的重量，更優(yōu)選40~250kDa，還更優(yōu)選70~150kDa，高度優(yōu)選100~120kDa,例如優(yōu)選110kDa?；?10kDa葡聚糖的分析物類(lèi)似物是尤其優(yōu)選的。分析物類(lèi)似物和分析物結(jié)合劑是任選地結(jié)合在一起的。傳感器構(gòu)造優(yōu)選地，通過(guò)具有允許分析物擴(kuò)散但不允許檢測(cè)物組分?jǐn)U散的孔徑的材料保留檢測(cè)物組分。但是，這種選擇性可以通過(guò)其它方式實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)使用允許不帶電荷的物質(zhì)擴(kuò)散的材料。優(yōu)選地，傳感器的不同檢測(cè)物變化形式包含在傳感器的單獨(dú)的室中。室可以是宏觀的或微觀的并且優(yōu)選彼此充分地靠近以便通過(guò)單個(gè)測(cè)量裝置同時(shí)訊問(wèn)。但是，檢測(cè)物變化形式可以包含在同一個(gè)室中，盡管這是不優(yōu)選的。優(yōu)選地，通過(guò)殼或基質(zhì)材料保留檢測(cè)物組分?？梢詫⒎治鑫镱?lèi)似物和/或分析物結(jié)合劑接枝到該材料上。更優(yōu)選地，如在WO00/02048中所描述的，材料為可生物降解的。任選地，如在WO03/006992中所描述的，傳感器可以包含由可生物降解材料的殼體保留的微粒子(例如兩種或更多種類(lèi)型粒子的，或包含檢測(cè)物變化形式的兩種或更多種基質(zhì)物質(zhì)的混合物)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)包嚢檢測(cè)物組分的可生物降解材料的殼包嚢保留檢測(cè)物組分，同時(shí)使葡萄糖與檢測(cè)物組分接觸，并且可生物降解材料包括具有疏水和親水單元的共聚物，如WO2005/110207所述。共聚物優(yōu)選為無(wú)規(guī)共聚物。共聚物優(yōu)選具有至少5.0xlO"VmVs的滲透率。術(shù)語(yǔ)"滲透率，，用來(lái)指可以實(shí)驗(yàn)測(cè)量的分析物(葡萄糖)通過(guò)水合共聚物的整體滲透率。優(yōu)選地，一旦被植入體內(nèi)，共聚物就在一周到一年的時(shí)間里降解，例如30天。對(duì)于厚度為5jim的普通聚合物來(lái)說(shuō)，這相當(dāng)于0.17fim/天的降解速率。對(duì)于葡萄糖的流動(dòng)性，可生物降解材料優(yōu)選具有不大于25000Da的分子量截留限。更優(yōu)選可生物降解材料具有不大于10000Da的分子量截留限。疏水單元的重量份數(shù)優(yōu)選占共聚物的10~卯％，更優(yōu)選占共聚物的10~50%。優(yōu)選每個(gè)親水單元的分子量為200~10000Da，更優(yōu)選400~4000Da。優(yōu)選共聚物的每個(gè)親水單元包含聚乙二醇和二元酸的酯。作為聚乙二醇的替代方案，可以使用乙二醇和丙二醇的混合聚合物，和/或可以用疏水和/或親水基團(tuán)取代聚醚主鏈。作為聚乙二醇的其它替代方案，可以使用聚四氫呋喃(聚-THF)。優(yōu)選地，親水單元包含作為二元酸的對(duì)苯二甲酸和/或丁二酸。其它合適的二元酸為草酸、酒石酸、鄰苯二甲酸、天冬氨酸、丙二酸和寡聚或聚合二元酸，例如聚(二聚酸-癸二酸)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，二元酸僅為對(duì)苯二甲酸。在可替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)苯二甲酸與丁二酸的摩爾比為l:2~2:1，合適地為1:1。作為可替代方案，共聚物的親水單元可以包含低聚物。合適的低聚物為曱基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、乙烯吡咯烷酮、乙烯醇、糖類(lèi)、環(huán)氧乙烷和/或2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸的低聚物。當(dāng)親水單元包含HEMA時(shí)，在聚合物中提供可生物降解的連接(例如酯連接，例如對(duì)苯二甲酸酯連接)以增加可生物降解性。優(yōu)選地，每個(gè)疏水單元的分子量為400~5000Da。優(yōu)選地，共聚物的疏水單元包含丁-l，4-二醇和二元酸的酯。作為對(duì)丁-l，4-二醇的替代方案，可以使用戊-l，5-二醇或己-l，6-二醇。優(yōu)選地，疏水單元包含對(duì)苯二甲酸和/或丁二酸作為二元酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)苯二甲酸與丁二酸的摩爾比為1:2~2:1，合適地為1:1。作為可替代方案，疏水單元僅包含對(duì)苯二甲酸作為二元酸。其它合適的二元酸如上所述。作為可替代方案，共聚物的疏水單元可以包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)的寡聚物、聚氨酯和/或聚酰胺(例如尼龍-6、寡聚-N-叔丁基丙烯酰胺或寡聚-N-異丙基丙烯酰胺)。當(dāng)疏水單元包含MMA時(shí)，在聚合物中提供可生物降解的連接(例如酯連接，例如對(duì)苯二甲酸酯連接)以增加可生物降解性。優(yōu)選的聚合物具有通式aPEG(T/S)bPB(T/S)c，其中"a，，表示PEG鏈的分子量，"b，，表示PEG(T/S)(聚對(duì)苯二曱酸乙二醇酯/聚丁二酸乙二醇酯)在所得的聚合物中的重量份數(shù)，"c"表示PB(T/S)(聚對(duì)苯二甲酸丁二酯/聚丁二酸丁二酯)在所得的聚合物中的重量份數(shù)。該聚合物的例子為600PEGT80PBT20、1000PEGT80PBT20、2000PEGT80PBT20、4000PEGT80PBT20、1000PEGT50PBT50和1000PEG(T/S)60PB(T/S)40(T/S50%)。聚合物是可生物降解的、具有高的葡萄糖滲透率，并在大約25000Da時(shí)具有分子量截留性能。在US6383220和EP1247522中公開(kāi)了一些這些聚合物。共聚物的包膜優(yōu)選具有1~50jim的厚度。在第二方面，本發(fā)明涉及一種制備在此描述的傳感器的方法。制備聚合物微嚢的化學(xué)方法包括相分離(凝聚)、溶劑蒸發(fā)和/或萃取。制備聚合物微嚢的合適的物理方法包括噴霧千燥、噴涂、噴霧驟冷、轉(zhuǎn)盤(pán)霧化、流化床涂覆、共擠出(例如固定噴嘴共擠出、離心頭共擠出、或浸入式噴嘴共擠出)和平盤(pán)涂覆(pancoating)。傳感器的使用第三方面，本發(fā)明涉及一種使用在此描述的傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，包括將傳感器植入哺乳動(dòng)物皮膚中并使用外部光學(xué)裝置檢測(cè)或測(cè)量葡萄糖。第四方面，本發(fā)明涉及一種使用上述要求保護(hù)的傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，包括使用外部光學(xué)裝置照射存在于哺乳動(dòng)物皮膚中或皮膚下的所述傳感器來(lái)檢測(cè)或測(cè)量葡萄糖。優(yōu)選地，本方法還包含可生物降解材料在傳感器中的降解?？梢酝ㄟ^(guò)注射將傳感器引入皮膚內(nèi)，優(yōu)選使用注射器，或者通過(guò)其它方法，特別是通過(guò)W000/02048中描述的任何方法。傳感器優(yōu)選具有適于通過(guò)窄規(guī)格針注射的尺寸以最小化患者的不適。傳感器優(yōu)選具有20nmlmm的最大尺寸。但是，可以使用具有更大尺寸的桿形傳感器。可以將傳感器引入到真皮厚度內(nèi)、或真皮下，或者可以引入到表皮，雖然在后面的情況下，其可能在可生物降解材料降解之前可能由于表皮的生長(zhǎng)被排出皮膚。由于傳感器位于皮膚內(nèi)，優(yōu)選經(jīng)皮(即，通過(guò)皮膚的較上層)檢測(cè)傳感器內(nèi)產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)，由此避免可能導(dǎo)致感染的傳感器和外部環(huán)境之間的任何直接接觸的需要。但是，作為替代方案，檢測(cè)可以通過(guò)中空的或透明的裝置(例如針或光學(xué)纖維)發(fā)生，其使傳感器被外部光學(xué)裝置照射而不通過(guò)皮膚傳遞光。一旦傳感器置于皮膚內(nèi)的位置，則可以進(jìn)行所需次數(shù)的葡萄糖測(cè)量而沒(méi)有副作用。這對(duì)于糖尿病患者的長(zhǎng)期護(hù)理是特別有利的，這是因?yàn)槿绻咸烟菧y(cè)量越頻繁，越可以嚴(yán)格地控制血液中的葡萄糖水平的控制，并且將降低與血糖調(diào)節(jié)不良相關(guān)的病癥發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，例如視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)病、普通的微血管損壞和大血管損壞和循環(huán)不良。由于本發(fā)明的傳感器本身不包含訊問(wèn)檢測(cè)物讀出所需的任何光學(xué)元件(這些優(yōu)選單獨(dú)提供并位于體外)，所以傳感器可以很容易地以具有對(duì)患者最小不適感的可注射的形式提供?？梢酝ㄟ^(guò)供給在能量供體部分的吸收光鐠內(nèi)波長(zhǎng)的入射輻射、并測(cè)量發(fā)射的熒光強(qiáng)度或激發(fā)態(tài)的壽命，來(lái)訊問(wèn)引入使用FRET技術(shù)的檢測(cè)物的傳感器。通常已知的方法為1.穩(wěn)態(tài)測(cè)量2.時(shí)域壽命測(cè)量a.單光子計(jì)數(shù)b.超高速掃描照相機(jī)c.門(mén)控檢測(cè)(Gateddetection)(脈沖取樣)d.上轉(zhuǎn)換3.頻域壽命測(cè)量a.相調(diào)制熒光測(cè)定法(外差檢測(cè))b.相敏檢測(cè)(零差檢測(cè))在Lakowicz,J.R."PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,SecondEdition",1999中可以發(fā)現(xiàn)原理的進(jìn)一步描述。訊問(wèn)檢測(cè)物的優(yōu)選方法為相調(diào)制焚光測(cè)定法。用于訊問(wèn)檢測(cè)物的合適的光學(xué)裝置(圖7)由發(fā)光二級(jí)管(LED)11組成，其在能量供體部分的發(fā)射光鐠內(nèi)發(fā)射光。通過(guò)激勵(lì)電路13操作LED,所述激勵(lì)電路在導(dǎo)致充分相移的頻率下調(diào)制LED,優(yōu)選在45。范圍內(nèi)。對(duì)于具有3ns壽命的熒光團(tuán)，優(yōu)選的頻率為50MHz。LED發(fā)射的光通過(guò)激發(fā)濾光片15過(guò)濾，并通過(guò)二向色分光鏡17導(dǎo)向到傳感器16，并通過(guò)透鏡19聚焦在注射的傳感器16上的傳感器/皮膚上。傳感器發(fā)射的熒光通過(guò)透鏡19收集。光經(jīng)過(guò)二向色分光鏡并通過(guò)發(fā)射濾光片21過(guò)濾。濾過(guò)的光通過(guò)透鏡23聚焦在檢測(cè)器25上，在這種情況下為雪崩光電二極管(APD)。APD通過(guò)APD偏壓電源27反偏壓，所述偏壓電源通過(guò)信號(hào)處理和控制單元29控制。來(lái)自第一APD的信號(hào)通過(guò)跨阻放大器31放大，通過(guò)帶通濾光片33過(guò)濾，并通過(guò)模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器(ADC)35采樣。相應(yīng)地，LED的調(diào)制驅(qū)動(dòng)信號(hào)通過(guò)第二ADC37采樣。在第一ADC35上采集的信號(hào)為Yi(t)-Ai*sin(2*7i:*fAt+cpn+cpjAj為從檢測(cè)物檢測(cè)的信號(hào)的振幅，f為調(diào)制頻率，他為由供體熒光團(tuán)引起的相位滯后，^為由電子和光學(xué)裝置引起的固定相位滯后。在第二ADC37上采集的信號(hào)為Y2(t)-A2*sin(2*^*f*t+q>2)A2為L(zhǎng)ED的調(diào)制驅(qū)動(dòng)信號(hào)的振幅，且92為由電子裝置引起的固定相位滯后。通過(guò)比較兩個(gè)采集的信號(hào)并補(bǔ)償通過(guò)電子和光學(xué)引入的固定的和已知的相位滯后，信號(hào)處理和控制單元驅(qū)動(dòng)由能量供體部分引起的相位滯后通過(guò)使熒光計(jì)接近皮膚并與傳感器對(duì)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)使用相位-分析物-校準(zhǔn)功能，將相位滯后轉(zhuǎn)換為分析物濃度，例如分析物濃度=A+Bx/(k+x),其中A是不存在分析物時(shí)的相位，B是最大響應(yīng)時(shí)的相位，x是所測(cè)量的相位，并且k是受體和分析物類(lèi)似物之間的解離常數(shù)。可替代的測(cè)量技術(shù)為測(cè)量熒光強(qiáng)度。在這種情況下，光學(xué)裝置應(yīng)該提供在能量供體部分的吸收光鐠內(nèi)波長(zhǎng)的第一束入射輻射，和優(yōu)選提供在能量受體部分的吸收光鐠內(nèi)波長(zhǎng)的第二束入射輻射(這適用于能量受體部分也是熒光團(tuán)的情況)。此外，光學(xué)裝置應(yīng)該優(yōu)選能夠在兩個(gè)不同的波長(zhǎng)處測(cè)量在傳感器中產(chǎn)生的光信號(hào)；波長(zhǎng)1在能量供體部分的發(fā)射光鐠內(nèi)(產(chǎn)生的信號(hào)與分析物的測(cè)量有關(guān))，并且波長(zhǎng)2在能量受體部分的發(fā)射光譜內(nèi)(其可能是分析物信號(hào)或內(nèi)參比或校準(zhǔn)信號(hào))。熒光計(jì)分別測(cè)量下列參數(shù)在波長(zhǎng)1處(能量供體部分)激發(fā)光強(qiáng)度，1(1，0)環(huán)境光強(qiáng)度，1(1，1)熒光和環(huán)境光結(jié)合的強(qiáng)度，1(1，2)在波長(zhǎng)2處(能量受體部分)激發(fā)光強(qiáng)度，1(2,0)環(huán)境光強(qiáng)度，1(2，1)熒光和環(huán)境光結(jié)合的強(qiáng)度，1(2,2)再次，通過(guò)使熒光計(jì)接近皮膚并與傳感器對(duì)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)對(duì)在傳感器中產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行經(jīng)皮測(cè)量時(shí)，必須考慮皮膚對(duì)信號(hào)的吸收。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在400nm~900nm范圍內(nèi)人類(lèi)皮膚的吸收率最小。提供的最終輸出為來(lái)自?xún)蓚€(gè)熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度之間的歸一化的比，由下列關(guān)系式定義(方程1):最終輸出=(1(1，2)陽(yáng)1(1，1))*1(2，0)/(1(2，2)畫(huà)1(2,1))*1(1，0)(1)優(yōu)選通過(guò)使用校準(zhǔn)數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)將如上述方程1給出的來(lái)自光學(xué)裝置(例如熒光計(jì))的最終輸出轉(zhuǎn)換為分析物濃度，所述校準(zhǔn)數(shù)據(jù)可以基于在WO00/02048中所述的原理得到。將參照實(shí)施例和附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，在附圖中圖1表示人類(lèi)MBL和HSA甘露糖ELLA檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例1);圖2表示人類(lèi)MBL和高碘酸鹽處理的葡聚糖ELLA檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例2)。圖3表示人類(lèi)MBL和合成聚合物ELLA檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例3)。圖4表示人類(lèi)MBL和合成甘露糖共聚物ELLA檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例3)。圖5表示人類(lèi)MBL和合成聚合物FRET檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例9)。圖6表示人類(lèi)MBL和70kDa葡聚糖FRET檢測(cè)物體系的葡萄糖劑量響應(yīng)(實(shí)施例10);圖7表示訊問(wèn)檢測(cè)物的合適的光學(xué)裝置。實(shí)施例概要使用下列原料對(duì)氨基苯基-a-D-吡喃甘露糖基異硫氰酸酯，牛血清白蛋白-a-D-吡喃甘露糖基異硫氰酸酯(每BSA23摩爾當(dāng)量甘露糖)，人血清白蛋白，高碘酸鈉(Nal04),生物素-N-羥基琥珀酰亞胺，鄰亞苯基二鹽酸鹽(o-phenylenedihydrochloride)，千胺，氨，氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)(Sigma-Aldrich);NuncF96MaxiSorp板(Nunc，Denmark);PD-10柱，Streptavidin-HRP(AmershamBioscience);葡聚糖(Pharmacosmos,Denmark);甘露聚糖綴合凝集素(由幾種來(lái)源得到)；透析管Spectra/Por(SpectrumLaboratories,Inc.,California,USA)。烯丙基a-D-吡喃葡萄糖苷，烯丙基2-乙酰氨基-2-脫氧-a-D-吡喃葡萄糖香(GlyconBiochemicals，Germany)。烯丙基a誦D-吡喃半乳糖苦(Sigma畫(huà)Aldrich)。PBS為20mM的磷酸鹽、150mM的NaCl，pH值為7.4，且TBS為20mM的TRIS、150mM的NaCl、1.25mM的CaCl2，除非另作i兌明pH值為7.4。縮寫(xiě)MBL，甘露聚糖綴合凝集素；PBS,磷酸鹽緩沖鹽水；TBS，TRIS緩沖鹽水；ELLA，酶聯(lián)凝集素檢測(cè)物。生物素化的MBL的制備將生物素-NHS(20fiL，在DMSO中的7mgmL-1，每MBL單體約10~15摩爾當(dāng)量)加到MBL(0.530mg)的PBS(3mL)溶液中。輕輕地?cái)嚢枞芤?h，并且然后轉(zhuǎn)移到透析管(MWCO10-12k)中，并用TBS(2xlL)滲析24h。不需要進(jìn)一步純化，使用所得的生物素化的MBL(在TBS中0.2mgmLT1)。MBLELLA檢測(cè)物在此4吏用的TBS緩沖液為T(mén)RIS(20mM)、NaCl(150mM)、CaCl2(20mM)，pH值為7.4。用每個(gè)都具有在TBS中的抗原(例如HSA-甘露糖，氨基葡聚糖等)(100fiL，20ngmL,的兩個(gè)柱(column)在5。C下包被96孔微量滴定板過(guò)夜。然后通過(guò)加入在TBS(150jiL)中的l%(w/v)HSA阻擋剩余的結(jié)合位點(diǎn)。將葡萄糖(從100mM到OmM)在生物素化的MBL(2ngmL")中的稀釋液加到100nL的總體積。培養(yǎng)2h后，清空并清洗(2x200jiL的TBS)該板。然后洗孔(2x200^L的TBS)。加入在TBS中的0.1。/。(v/v)的Streptavidin-HRP(lOOnL)。隨后培養(yǎng)lh，清空并清洗(3x200jiL的TBS)該板。通過(guò)加入培養(yǎng)基溶液(lmg的鄰亞苯基二鹽酸鹽)使HRP的存在可見(jiàn)，并在2分鐘后用1N的H2S04淬滅。通過(guò)在630nm處消除背景，讀取在490nm處的吸光率來(lái)確定顯色。實(shí)施例1:甘露糖基化的HSA以如下方式制備四種綴合物。將溶于20mM碳酸鹽緩沖液(0.4mL，pH值為9.2)的HSA(10mg)加到四個(gè)2mLEppendorf小瓶的每個(gè)中。通過(guò)制備四種溶液以15x、30x、60x和120x的摩爾過(guò)量加入對(duì)氨基苯基-(i-D-吡喃甘露糖基異硫氰酸酯(Man-ITC，1.6mL)。將Man國(guó)ITC(11.9mg)溶于DMSO(0.1mL)和pH值為9.2的20mM碳酸鹽緩沖液(3.9mL)中。將該溶液(對(duì)應(yīng)于120x的摩爾過(guò)量)的等分檢測(cè)物(1.6mL)加到含有HSA(0.4mL)的Eppendorf小瓶中。將剩下的Man-ITC溶液稀釋到兩倍體積，并且將來(lái)自稀釋體積的等分檢測(cè)物(1.6mL)加到另一個(gè)Eppendorf小瓶中。重復(fù)該步驟直到制備四種不同HSA:Man-ITC的混合物。四種反應(yīng)混合物在室溫下在震動(dòng)器中培養(yǎng)過(guò)夜。所得的糖綴合物(glycoconjugates)在PD-10柱上純化。在純化過(guò)程中，將緩沖液變?yōu)門(mén)BS。使用MALDI-TOF-MS確定綴合度。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表l:使用MALDI-TOF-MS確定綴合度。在半高度附近測(cè)定峰高度估計(jì)值。使用下式測(cè)定甘露糖單元的數(shù)目(在MS-66500中的峰)/313。當(dāng)在竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物中使用時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的糖綴合物對(duì)MBL具有不同的親合力，并且因此在不同的葡萄糖濃度范圍的存在下竟?fàn)幍亟Y(jié)合。上述MBLELLA檢測(cè)物用來(lái)確定甘露糖基化程度對(duì)葡萄糖抑制的動(dòng)態(tài)范圍的作用，并且結(jié)果如圖l所示。對(duì)于圖1中的特定的綴合糖類(lèi)，在劑量響應(yīng)曲線(xiàn)為線(xiàn)性的葡萄糖濃度范圍對(duì)應(yīng)于包含糖綴合物的竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物變化形式可以精確地檢測(cè)葡萄糖的葡萄糖濃度范圍。由圖l可以看出，在本發(fā)明傳感器內(nèi)的三種竟?fàn)帣z測(cè)物變化形式中使用的三種糖綴合物HSA-Man15、HSA-Man30和HSA-Man60，可以在0~50mM葡萄糖的范圍內(nèi)精確測(cè)量葡萄糖的濃度。實(shí)施例2:用于ELLA檢測(cè)物的高碘酸鹽氧化的葡聚糖高碘酸鹽氧化的葡聚糖的制備將70k的葡聚糖(200mg，2.86mmol)溶于水(2.8mL)中并加到在水(2.8mL)中的NaIO4(100mM，100x摩爾過(guò)量)中。混合物在室溫下在黑暗中攪拌lh。將所得的混合物轉(zhuǎn)移到透析管(MWCO10-12k)中，并用5L水透析過(guò)夜。滲析后，將體積調(diào)整到8mL。將高碘酸鹽氧化的葡聚糖分成兩個(gè)等分檢測(cè)物(每個(gè)4mL，100mg)并分別用28。/。氨水(200nL)和千胺(300nL)處理30min。然后在室溫和pH值大約為10下用NaBH3CN(45mg)還原亞胺和亞胺镥衍生物過(guò)夜。第二天用2xlL的20mM的TRIS透析反應(yīng)混合物。使用元素分析法測(cè)定引入高碘酸鹽氧化的葡聚糖中的胺的程度。MBLELLA檢領(lǐng)'J物除了用含有1.25mM的CaCl2(生理Ca濃度)的TRIS緩沖液之外，使用上述分析。包含氨基葡聚糖、在10x摩爾過(guò)量的高碘酸鹽存在下氧化的和使用節(jié)胺還原胺化的葡聚糖、和在100x摩爾過(guò)量的高碘酸鹽存在下氧化的和使用千胺還原胺化的葡聚糖的ELLA檢測(cè)物比較結(jié)果如圖2所示。由圖2的觀察可以看出，當(dāng)結(jié)合使用三種竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物時(shí)可以精確地測(cè)量葡萄糖濃度的范圍為035mM葡萄糖，每個(gè)所述三個(gè)竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物包含三種氨基葡聚糖中的一個(gè)。發(fā)現(xiàn)氨基葡聚糖對(duì)MBL的綴合基本上是不依賴(lài)于Ca"的，并且因此可以在生理Ca^濃度下使用這些檢測(cè)物。實(shí)施例3:在ELLA檢測(cè)物中使用的合成聚合物烯丙基a-D-吡喃甘露糖苷基本上如在Pekari等人(2004)J.Org.Chem,66(22)，7432-7442中所述。在BF3-OEt2(0.58ml)存在下，在干燥的烯丙基乙醇(140ml)中回流D-甘露糖(12.1g，67mmol)過(guò)夜。第二天用Et3N(1.8ml)中和反應(yīng)混合物，并蒸發(fā)溶劑。干柱減壓色鐠(id6cm;100ml份；在DCM(v/v)中的0~45%的MeOH-ll份，5%增量+100%)得到為無(wú)色糖漿的9.38g(63。/o)產(chǎn)物。TLC(DCM國(guó)MeOH，9:l)Rf0.3;iH-NMR(300MHz，128次掃描，在700^1的D20中4mg)S3,27(s，2H，烯丙基)，3.52國(guó)4.21(m，6H)，4.84(bs，1H，aH)，5.16-5.34(m,2H，烯丙基)，5.82國(guó)5.98(m，1H，烯丙基)。共聚合下列實(shí)施例說(shuō)明甘露糖50%共聚物是如何制備的。所有其它共聚物的制備參見(jiàn)表2和3。在PBS(50mM，pH值為7.4)中制備烯丙^J^(AS)和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽(NAMH)的原液(100mg/ml)。在螺旋蓋塑料試管中將過(guò)二硫酸鉀(PPS)(150mg)溶于PBS緩沖液(50mM，pH值為7.4;7.8ml)中。按照下列順序向該溶液中加入烯丙基a-D-吡喃甘露糖香(烯丙基糖；AS)(2.20ml;220mg)、丙烯酸2-羥乙酯(HEA)(llOjil),N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽(NAMH)(卵nl)和N，N，N，，N，-四甲基乙二胺(TMEDA)(lOOjil)。用氮?dú)獯祾呋旌衔?分鐘以除去溶解的氧。在定軌振蕩器中在RT下聚合過(guò)夜。過(guò)濾反應(yīng)混合物并在甲醇(100ml)中沉淀。通過(guò)離心法(4000rpm，3分鐘)收集聚合物，并且然后用甲醇(3xl0ml)洗。在脫水器中干燥最終得到的聚合物粒過(guò)夜。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表3-用于共聚合的四種不同的單糖MBLELLA檢領(lǐng)'J物除了用含有1.25mM的CaCl2(生理Ca濃度)的TRIS緩沖液之外，使用上述檢測(cè)物。結(jié)果如圖3所示，其與由甘露糖、N-乙St^-葡糖胺、葡萄糖和半乳糖制成的20種共聚物比較。高吸收對(duì)應(yīng)于MBL對(duì)配體的綴合。基線(xiàn)吸收對(duì)應(yīng)于MBL對(duì)配體沒(méi)有綴合。AmDex為150kDa的氨基葡聚糖(實(shí)施例5)。這表明在合成聚合物中使用的單糖單元與葡萄糖(ICs。~18mM)相比，需要對(duì)MBL具有更高的親合力，并優(yōu)選與甘^瞎(ICs。~8111]\1)或]\-乙酰基-葡糖胺(ICs。~6mM)。較低親合力的糖單體單元例如萃乳糖(IC5Q36mM)在生理鈣濃度下(1.25mM)沒(méi)有得到MBL綴合。制備了一系列甘露糖共聚物(表4)并使用MBLELLA檢測(cè)物來(lái)分析。發(fā)現(xiàn)35%的甘露糖共聚物是最佳的。在0mM葡萄糖時(shí)對(duì)MBL的綴合與氨基葡聚糖一樣強(qiáng)，但比氨基葡聚糖更容易被抑制。由抑制曲線(xiàn)(圖4)可以計(jì)算氨基葡聚糖和最優(yōu)的共聚物(表5)的ICs。值。ICs。值僅對(duì)該特定的檢測(cè)物有效。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實(shí)施例4:MBL的染色將人類(lèi)MBL緩沖變?yōu)?通過(guò)透析)含有150mM的NaCl和1.25mM的Ca2+、pH值為8.7的10mM的NaHC03。用于染色的染料為AlexaFluorTM594琥珀酰亞胺酯(AF594國(guó)SE)(MolecularProbes,Eugene,Oregon,USA),將染料溶于干燥的DMSO中，并緩慢地(IO分鐘)加到在碳酸氫鹽緩沖液中的MBL中。使反應(yīng)進(jìn)行l(wèi)h。用15倍摩爾過(guò)量(對(duì)多肽單元)的染料進(jìn)行染色。通過(guò)對(duì)pH值為7.4、150m麗aCI和1.25mMCa2+的10mM的Tris緩沖液透析進(jìn)行純化。通過(guò)UV光鐠測(cè)定得到的染色蛋白的標(biāo)記度為每MBL子單元2.3個(gè)染料。實(shí)施例5:氨基葡聚糖的制備將150kDa葡聚糖(6.00g,0.4jimol)溶于pH值為11.5的250mM的K2HPO4(600mL)+。加入硼氳化鈉(3g，0.08mol),隨后加入二乙烯基砜(15ml，0.15mol)。在用濃鹽酸中和到pH值為7.2之前，反應(yīng)混合物在RT下攪拌30分鐘。攪拌30分鐘后，所得的混合物在水(3x25L)中透析(MWCO10-12kDa)。將內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到Erlenmeyer燒瓶中并加入24。/。氨水(200mL)。2h后，將pH值調(diào)到10.5，并攪拌反應(yīng)過(guò)夜。通過(guò)在水(8x25L)中透析(MWCO10-12k)除去過(guò)量的氨，并且凍干全部?jī)?nèi)含物，以得到為白色絨毛狀物質(zhì)的氨基葡聚糖5.75g(78。/。，基于MW185kDa的氨基葡聚糖)。使用元素分析法進(jìn)行分子量、胺引入、和引入二乙烯基諷的量的粗略估計(jì)。(發(fā)現(xiàn)C39.86;H6.26;N0.16;S3.08%葡聚糖150k，~22DVS-NH2，~160DVS-OH,和~7201120，理論C39.55;H6.60;N0.16;S3.07%)。實(shí)施例6:六曱氧基-結(jié)晶紫琥珀酰亞胺酯(HMCV-l)的制備HMCV-1的合成摩爾質(zhì)tB陣):711摩爾質(zhì)量(CI-):757合成路線(xiàn)l:1)4-(N-甲基M)-丁酸鹽酸鹽(1當(dāng)量)、二異丙基乙胺，在乙腈中，20。C，20h。II)二甲胺(過(guò)量)。III)TSTU、二異丙基乙胺，在乙腈中，20。C，2h。4a(BF4):將4-(甲基氨基)丁酸鹽酸鹽(1.36g;8.8mmol)、1(5.0g;8.3mmo1)、和二異丙基乙胺(5mL)溶于乙腈(120mL)中。在千燥的氮?dú)夥障略?035。C下攪拌反應(yīng)混合物22h。加入二甲胺水溶液(40mL的40%溶液)并再攪拌反應(yīng)混合物四天。在真空下除去溶劑和過(guò)量的二甲胺，并將剩下的物質(zhì)溶于氯仿。在蒸發(fā)溶劑和由CH2Ch/乙醚再沉淀產(chǎn)物之前，用鹽水洗氯仿溶液兩次并用MgS04干燥。產(chǎn)量4.4g(70。/。)深藍(lán)色粉末。MS(FAB+):m/z624(M+)iH-NMR(400MHz，DMSO-d6):88.34(1H，bs)，6.03(2H,s)，5.83(4H，s)，3.49(2H，m)，3.46(6H，s)，3.44(12H，s),3.12(3H，s(掩蔽的))，3.08(12H,s),1.94(2H，t)，1.70(2H，m)。HMCV-l(Cr):將TSTU(2-琥珀酰亞氨基-l,l,3，3-四曱基脲四氟硼酸鹽；0.8g，2.6mmol)加到4a(0.9g，1.26mmol)和二異丙基乙胺(0.55g，4.5mmol)在乙腈(15mL)中的溶液中。在將反應(yīng)混合物傾入用HCl-水溶液(4mL,2M)酸化的冰冷卻的接近飽和的NaCl溶液(大約150mL)中之前，在封閉的燒瓶中攪拌2h。用氯仿(2xl50mL)萃取水相。用鹽水(2x50mL)洗合并的氯仿相并用MgS04干燥。蒸發(fā)溶劑并由CH2CV乙醚再沉淀，得到深藍(lán)色粉末(0.80g,84%)。MS(FAB+):m/z721(M+)^-NMRiH畫(huà)NMRbr.(400MHz,DMSO-d6):35.88(2H，s)，5.85(4H，s)，3.60(2H，s)，3.46(12H，s)，3.45(6H，s)，3.15(12H，s)，3.12(3H，s)，2.85(4H，s),2.80(2H，t)，1.95(2H,m)。實(shí)施例7:氨基葡聚糖的染色將通過(guò)與實(shí)施例2類(lèi)似的方法制備的70kDa氨基葡聚糖(0.5mmo1的NH2/g葡聚糖，即，每摩爾葡聚糖35摩爾胺)用HMCV-1(實(shí)施例5)在pH值為8.5的10mM的NaHC03、150mM的NaCl中染色。將染料溶于干燥的DMSO中，并緩慢地(IO分鐘)加入到在碳酸氫鹽緩沖液中的葡聚糖中。使反應(yīng)進(jìn)行l(wèi)h。用8倍摩爾過(guò)量的染料進(jìn)行染色。通過(guò)用pH值為7.4、150mM的NaCl、1.25mM的Ca2+、2mM的NaN3的10mM的Tris緩沖液透析進(jìn)行提純。通過(guò)UV光諳測(cè)定得到的染色蛋白的標(biāo)記度為每葡聚糖7.0個(gè)染料。實(shí)施例8:HMCV-1葡聚糖的葡萄糖測(cè)量在TBS緩沖液(同上)中混合AF外4染色的人類(lèi)MBL(實(shí)施例1)和HMCVl-葡聚糖(如實(shí)施例7制備的)到10jiM的兩種組分的濃度。將檢測(cè)物的化學(xué)混合物吸入中空纖維(再生纖維素，直徑為0.2mm)中。在KOALA自動(dòng)采樣室(ISS，ChampaignIL)中進(jìn)行熒光壽命測(cè)量(頻域)，并通過(guò)改變?cè)诤袡z測(cè)物的化學(xué)品的中空纖維周?chē)木彌_液(TBS)來(lái)改變葡萄糖濃度。表6AF594-MBL和HMCV1-Dex70的絕對(duì)相移。PMT計(jì)數(shù)反映體系的強(qiáng)度增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實(shí)施例9:合成聚合物的葡萄糖測(cè)量共聚物的合成通過(guò)如下的乳液聚合制備甘露糖共聚物(~40%)。將Span80表面活性劑(5.7g;HLB[親水親油平衡值4.3,基于曱苯的10%w/w)、AIBN(30mg)和甲苯(57.3g)加到配有機(jī)械攪拌器和氮?dú)夤艿?50ml三口圓底燒瓶中。密封燒瓶、用氮?dú)獯祾卟⒃谡麄€(gè)聚合過(guò)程中保持在氮?dú)夥障?。將烯丙基a-D-吡喃甘露糖苦(3.52g)、丙烯酸2-羥乙酯(2.552g)、和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽(0.178g)溶于水(12.7g)，并過(guò)濾以除去不溶解的物質(zhì)。通過(guò)橡膠隔膜將該混合物加到在圓底燒瓶中的劇烈攪拌的混合物中。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物直到形成穩(wěn)定的乳狀液(30分鐘)，然后在60'C下4h。通過(guò)隔膜注入VA-044溶液(lml，60mg/ml),并且繼續(xù)聚合過(guò)夜(17h)。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，并加入丙酮破乳。這導(dǎo)致聚合物沉淀，收集沉淀、再溶于水、并加入丙酮沉淀。產(chǎn)物在真空下干燥過(guò)夜，以得到3.2g(50。/。)粗淺黃色聚合物。將部分粗聚合物(1.0g)溶于水(10ml),并在水中透析(MWCO[分子量截留]25,000)以除去低分子量物質(zhì)。冷凍干燥得到0.46g(46V。)毛絨狀的白色聚合物。類(lèi)似地制備45%甘露糖共聚物。共聚物的染色通常地，共聚物的標(biāo)記遵循由MolecularProbes(產(chǎn)品信息MP00143，Rev.June2001)提供的描述。將共聚物(88.6mg)溶于lOmM的NaHC03溶液(3ml;pH值為8.5)。將聚合物溶液平均地分到三個(gè)E卯endorf小瓶中。將HMCV-1(實(shí)施例3)(19.6mg;26.1nmol)溶于干燥的DMSO(600fil)中。將染料以每30秒lOjtl等分檢測(cè)物加到聚合物溶液中，以這樣的方式使得第一小瓶總共得到lOOjil、第二小瓶總共得到200jil，第三小瓶總共得到300jil。在加入最后一份后，輕輕地?cái)嚢栊∑縧h,之后在10mM的TRIS緩沖液中透析溶液(MWCO10-12,000)，并幾次換緩沖液，并且直到在透析緩沖液中看不見(jiàn)顏色(通常72h換6~8次500ml緩沖液)。FRET檢測(cè)物在TBS緩沖液(同上)中混合AF594染色的人類(lèi)MBL(實(shí)施例4)和HMCVl-共聚物到兩種組分為10fiM的濃度(使用MBL-AF594糖類(lèi)識(shí)別域的濃度、CRD、每個(gè)具有大約25kDa的Mw)。將檢測(cè)物的化學(xué)混合物吸到中空纖維(再生纖維素，直徑為0.2mm)中。在KOALA自動(dòng)樣品室(ISS,ChampaignIL)中進(jìn)行熒光壽命測(cè)量(頻域)。在水浴中將所有溶液預(yù)熱到34'C，并且在34"C下記錄在KOALA儀器中的所有測(cè)量值。將包含纖維和纖維固定器裝置的熒光池置于KOALA的樣品固定器中，并且熒光池充滿(mǎn)含有葡萄糖的緩沖液。測(cè)量的相位是至少四十個(gè)相角記錄的平均值。測(cè)量完成后，^L用吸液管清空熒光池，并再次充滿(mǎn)含有下一濃度葡萄糖的緩沖液。在測(cè)量之間間隔20min以4吏檢測(cè)物的化學(xué)達(dá)到平衡。為了生成葡萄糖劑量-響應(yīng)曲線(xiàn)，在0、5、10、30、100和500mM葡萄糖處測(cè)量相位。在500mM葡萄糖處測(cè)量相角后，在60分鐘時(shí)間內(nèi)用10mM的TRIS緩沖液洗幾次纖維。此時(shí)，對(duì)OmM葡萄糖得到相同的相角。這表明分析的可逆性。結(jié)果如表7和圖5所示。表7AF594-MBL和HMCVl-共聚物的絕對(duì)相移。慮Glc□□@61MHz甘露糖40%共聚物□□@61MHz甘露糖化％共聚物00-00.051.80.4104.31.1309.53，810013.98.950015.214.2可以看出在05mM、5~10mM、10~30mM的Glc區(qū)域內(nèi)，甘露糖40%共聚物的斜率比甘露糖45%共聚物更陡(更響應(yīng))。但是，在30~100mM和100~500mM的Glc區(qū)域內(nèi)，甘露糖45%共聚物的斜率更陡。這使甘露糖40%共聚物在0~30mM的Glc內(nèi)更靈敏，而甘露糖45%共聚物在30~500mM的Glc內(nèi)更靈敏。實(shí)施例10:傳感器的配制和植入通過(guò)將直徑為700nm的玻璃棒浸入在二氯曱烷中的15%w/w的聚合物(1000PEGT80PBT20，申請(qǐng)no.P9738GB)溶液中，并4吏其在室溫下干燥制造纖維。這得到外部尺寸為900jim且內(nèi)徑為700nm的中空纖維。該纖維充滿(mǎn)希望濃度的檢測(cè)物組分[例如5jiM的AlexaFluor594tm染色的MBL(關(guān)于糖類(lèi)識(shí)別域表示濃度)和20pM的HMCV1染色的150kDa的氨基葡聚糖。加熱聚合物使其熔化以封閉纖維末端。在測(cè)試和插入之前測(cè)試該焊接纖維的滲漏性?？梢酝ㄟ^(guò)使用針將該類(lèi)型纖維置于皮膚的上部。合適尺寸(足夠大以包含濕纖維)的針以大約lmm深度平行于皮膚表面放置，使得針通過(guò)皮膚作為陰影可見(jiàn)。將纖維(仍然是濕的)置于針內(nèi)并且移走針。在插入步驟完成之后，在插入位置處通常觀察不到出血。當(dāng)纖維在適當(dāng)?shù)奈恢脮r(shí)，將讀取裝置直接置于纖維上方并可以開(kāi)始測(cè)量。可以使用時(shí)間分辨熒光光鐠測(cè)量葡萄糖響應(yīng)，相應(yīng)于如圖6所示的響應(yīng)。雖然參照優(yōu)選實(shí)施方案說(shuō)明了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解可以在本發(fā)明范圍內(nèi)進(jìn)行各種修改.權(quán)利要求1.一種用于感測(cè)分析物濃度的傳感器，包含合適競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)物的至少兩種不同的變化形式，通過(guò)該檢測(cè)物的變化形式，所述傳感器能夠精確地感測(cè)所需范圍的分析物濃度，其中所述檢測(cè)物的變化形式的每一種都能夠精確地感測(cè)所需分析物濃度范圍的僅僅一部分，并且所述檢測(cè)物的變化形式被選擇用于感測(cè)覆蓋所述整個(gè)所需范圍的重疊或鄰接濃度范圍。2.權(quán)利要求l的傳感器，其中所述分析物為糖類(lèi)。3.權(quán)利要求2的傳感器，其中所述分析物為葡萄糖。4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中所述傳感器產(chǎn)生與所述分析物濃度相關(guān)的可測(cè)量的光響應(yīng)。5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中每個(gè)所述竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物包含分析物結(jié)合劑；和包含至少一個(gè)分析物類(lèi)似部分的分析物類(lèi)似物；其中所述分析物結(jié)合劑結(jié)合所述分析物類(lèi)似物的所述至少一個(gè)分析物類(lèi)似部分以形成復(fù)合物，所述分析物可從所述復(fù)合物取代所述分析物類(lèi)似物，和其中通過(guò)由所述分析物類(lèi)似物包含的分析物類(lèi)似部分的數(shù)目或性質(zhì)來(lái)區(qū)別不同的檢測(cè)物。6.權(quán)利要求5的傳感器，其中用基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)中的一個(gè)來(lái)標(biāo)記所述分析物結(jié)合劑，用基于接近性的信號(hào)產(chǎn)生/調(diào)制部分對(duì)中的另一個(gè)來(lái)標(biāo)記所述分析物類(lèi)似物，和其中當(dāng)所述分析物類(lèi)似代所述分析物類(lèi)似物時(shí)，在信號(hào)方面存在可檢測(cè)的差異。7.權(quán)利要求5或6的傳感器，其中所述分析物結(jié)合劑為凝集素。8.權(quán)利要求7的傳感器，其中所述分析物結(jié)合劑為甘露糖綴合凝集素(MBL)。9.權(quán)利要求5~8任一項(xiàng)的傳感器，其中所述至少一個(gè)分析物類(lèi)似部分為糖類(lèi)或糖類(lèi)模擬部分。10.權(quán)利要求9的傳感器，其中所述至少一個(gè)分析物類(lèi)似部分為單糖或寡糖部分。11.權(quán)利要求5~10任一項(xiàng)的傳感器，其中所述分析物類(lèi)似物包含大分子。12.權(quán)利要求ll的傳感器，其中所述大分子為蛋白質(zhì)、樹(shù)枝狀高分子、多糖或合成聚合物。13.權(quán)利要求12的傳感器，其中所述大分子為血清白蛋白。14.權(quán)利要求12的傳感器，其中所述多糖被衍生以減少結(jié)合的分析物類(lèi)似部分的數(shù)目。15.權(quán)利要求513任一項(xiàng)的傳感器，其中在每個(gè)竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物變化形式中，所述分析物結(jié)合劑為MBL，所述大分子為HSA且所述分析物類(lèi)似部分為甘露糖，和其中所述竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的每個(gè)變化形式包含含有不同數(shù)目甘露糖部分的HSA-甘露糖綴合物。16.權(quán)利要求5~12和14任一項(xiàng)的傳感器，其中所述分析物為葡萄糖，在所述竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的每個(gè)變化形式中，所述分析物結(jié)合劑為MBL,且所述大分子和分析物類(lèi)似部分一起形成衍生的葡聚糖，和其中所述竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的每個(gè)變化形式包含如此衍生的葡聚糖使得引入所述葡聚糖中的所述分析物類(lèi)似部分的數(shù)目是不同的。17.權(quán)利要求16的傳感器，其中所述傳感器包含兩個(gè)竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的變化形式，一個(gè)變化形式能夠感測(cè)在0~10mM范圍內(nèi)的葡萄糖濃度，另一個(gè)變化形式能夠感測(cè)在0~25mM范圍內(nèi)的葡萄糖濃度。18.權(quán)利要求17的傳感器，還包含第三竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物的變化形式，其能夠感測(cè)在1540mM范圍內(nèi)的葡萄糖濃度。19.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中所述不同的檢測(cè)物變化形式包含在傳感器內(nèi)的分離的室內(nèi)。20.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器，其中所述傳感器包含至少兩類(lèi)粒子，每類(lèi)粒子包含不同的竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物變化形式。21.權(quán)利要求19或20任一項(xiàng)的傳感器，其中制造所述粒子或室的材料是可生物降解的。22.權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)的傳感器，其中所述粒子或室將檢測(cè)物的組分保留在殼或基質(zhì)材料內(nèi)。23.權(quán)利要求1922任一項(xiàng)的傳感器，其中所述粒子或室能透過(guò)所述分析物，并使所述分析物自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)和擴(kuò)散出所述傳感器并接觸所述檢測(cè)物組分，但是不能透過(guò)所述竟?fàn)幗Y(jié)合檢測(cè)物變化形式的組分。24.—種在活體中使用前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的傳感器的方法，其中將所述傳感器植入到對(duì)象的皮膚表面之下，使其浸在組織液中；留出時(shí)間使得所述分析物濃度在所述組織液中和在所述傳感器中平衡；給所述傳感器提供光能；測(cè)量檢測(cè)物的分析物濃度依賴(lài)性的熒光性能；將所述測(cè)量值轉(zhuǎn)化為分析物濃度的讀出值。25.—種在活體中使用權(quán)利要求1~23任一項(xiàng)的傳感器的方法，其中留出時(shí)間使得所述分析物濃度在被植入到對(duì)象的皮膚表面之下的傳感器中和組織液中平衡；給所述傳感器提供光能；測(cè)量檢測(cè)物的分析物濃度依賴(lài)性的熒光性能；將所述測(cè)量值轉(zhuǎn)化為分析物濃度的讀出值。全文摘要一種用于感測(cè)分析物濃度的傳感器，包含合適的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)物的至少兩個(gè)不同的變化形式，通過(guò)該檢測(cè)物的變化形式，所述傳感器能夠精確地感測(cè)所需范圍的分析物濃度，其中所述檢測(cè)物的變化形式的每一種都能夠精確地感測(cè)所需分析物濃度范圍的僅僅一部分，并且所述檢測(cè)物的變化形式被選擇用于感測(cè)覆蓋所述整個(gè)所需范圍的重疊或鄰接濃度范圍。文檔編號(hào)G01N33/543GK101103273SQ200580046294公開(kāi)日2008年1月9日申請(qǐng)日期2005年12月7日優(yōu)先權(quán)日2004年12月7日發(fā)明者余藝華,克勞斯·格里戈里厄斯,卡斯珀·斯特魯韋,耶斯佩爾·斯文寧·克里斯滕森申請(qǐng)人:帕瑞薩森思公司