專(zhuān)利名稱(chēng)：：制備可溶性多跨膜蛋白的方法制備可溶性多跨膜蛋白的方法
背景技術(shù)：
復(fù)雜的跨膜蛋白質(zhì)難以在宿主細(xì)胞中表達(dá)。一般地，這些蛋白對(duì)于宿主是有毒的，而且各種表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生表達(dá)蛋白的量低。此外，這些跨膜多肽難以溶解，聚集和變性給產(chǎn)生數(shù)量和質(zhì)量足以有效使用的蛋白產(chǎn)物造成了困難?？缒さ鞍踪|(zhì)的一個(gè)實(shí)例是四結(jié)構(gòu)域亞族A(MS4A)基因家族，其包括CD20、高親和性IgE受體卩鏈、HTm4等等。這些蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的，至少在細(xì)胞表面中四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域中(Ishibashietal.，2001，Gene264:87-93)。雖然在MS4A家族的多肽中總體氨基酸序列同一性在25-40%之間，但相比于整個(gè)多肽，前三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸有更高的同一性和同源性(Ishibashietal.,2001，同上；Liangetal.，2001,Genomics72:119-127)。在結(jié)構(gòu)上，MS4A多肽還共有胞外環(huán)通用基序。MS4A多肽的N-和C-末端都出現(xiàn)于細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)(Ishibashietal.，2001，同上)。N-和C-末端在MS4A基因家族的多肽之中顯示了大得多的序列差異(Ishibashietal.,2001，同上)。盡管MS4A基因家族的多肽有許多結(jié)構(gòu)相似性，但它們?cè)趩蝹€(gè)細(xì)胞類(lèi)型中不是均一表達(dá)的(Liangetal.,2001,同上)。CD20專(zhuān)門(mén)在B細(xì)胞中表達(dá)(Stashenkoetal.，1980，J.Immunol.,125:1678-1685)。高親和性IgE受體p鏈(FcsRI卩)專(zhuān)門(mén)在肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞中表達(dá)(Kinet,1999，Annu.Rev.Immunol.,17:931-972)。FcsRI(3結(jié)合IgE并介導(dǎo)由抗原結(jié)合觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)(即，脫顆粒作用(degranulation))(Dombrowiczetal.,1998，Immunity,8:517-529;Linetal.，1996,Cell,85:985-995)。HTm4在造血組織中表達(dá)并充當(dāng)造血細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物(Donatoetal.,2002，J.Clin.Invest.，109:51-58)。這些蛋白質(zhì)確實(shí)有共同特征跨膜肽復(fù)雜結(jié)構(gòu)。這個(gè)特征使得該蛋白質(zhì)非常難以在宿主細(xì)胞中表達(dá)，也非常難于將其以"天然"構(gòu)型從細(xì)胞膜溶解出來(lái)?？缒ざ嚯?，例如CD20>是疾病例如癌癥和自體免疫疾病的治療中治療劑的潛在靶點(diǎn)。CD20在20多年前首次;故鑒定為B細(xì)胞標(biāo)記物，現(xiàn)在證實(shí)其是大多數(shù)B細(xì)胞淋巴瘤上存在的標(biāo)記物。CD20是非Hodgkins淋巴瘤(NHL)的治療中單克隆抗體療法的靶點(diǎn)，具體地，它是NHL治療中的主要治療劑嵌合抗體rituximab(RITUXAN)的靶點(diǎn)。Rituximab識(shí)別B細(xì)胞上表達(dá)的CD20。rituximab的結(jié)合是構(gòu)象依賴(lài)性的，結(jié)合CD20,所述CD20具有在第三和第四跨膜螺旋區(qū)域之間的含有位置167和183處的半胱氨酸殘基的附屬的環(huán)形結(jié)構(gòu)。在開(kāi)發(fā)靶向跨膜多肽例如CD20的治療劑中的重要障礙是不能在宿主細(xì)胞中、特別是在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生足量的這些多肽，以及不能產(chǎn)生處于天然構(gòu)象的純化的重組或天然跨膜多肽。人們需要產(chǎn)生和溶解處于天然構(gòu)象的天然和/或重組跨膜多肽的方法。發(fā)明概述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，跨膜多肽，例如由單個(gè)或多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的那些跨膜多肽，可以高效地在細(xì)菌細(xì)胞宿主中產(chǎn)生以及從細(xì)菌細(xì)胞膜溶解，產(chǎn)量良好并具有足夠的天然構(gòu)象以用作免疫原和配體，例如，用于定量分析中。通過(guò)在此描述的方法，可以產(chǎn)生、分離和溶解具有有用的數(shù)量和有用的"天然"構(gòu)象的跨膜多肽。產(chǎn)生跨膜多肽的方法包括在細(xì)胞中、例如在細(xì)菌細(xì)胞中在受?chē)?yán)密調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子例如大腸桿菌(E.coli)中的phoA啟動(dòng)子之下進(jìn)行表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，受?chē)?yán)密調(diào)控的啟動(dòng)子含有正調(diào)控元件和負(fù)調(diào)控元件，并且可以含有多個(gè)這些元件。所述啟動(dòng)子可以是突變啟動(dòng)子，例如，其中插入了異源的正或負(fù)調(diào)控元件。所述啟動(dòng)子可以進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄終止子，例如、轉(zhuǎn)錄終止子，其位于防止?jié)撛诘纳嫌螁?dòng)子可能的通讀(read-through)的位置。對(duì)于大腸桿菌中的蛋白質(zhì)表達(dá)，啟動(dòng)子可以是，例如，phoA，或者其含有添加的負(fù)調(diào)控元件的變體，例如phac和tphac，在以下的實(shí)施例中^>開(kāi)的含有添加的/ac操縱基因(operator)的突變啟動(dòng)子。用于表達(dá)跨膜多肽的載體包括處在嚴(yán)密調(diào)控的啟動(dòng)子的控制下、編碼跨膜多肽的多核苷S吏序列。這種多肽包括，例如，具有至少四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的那些，例如以下的實(shí)施例中公開(kāi)的CD20和C2S-CD20突變體。編碼的多肽可以具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、爿\個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)、十二個(gè)或二十四個(gè)或更多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步的實(shí)例包括具有七個(gè)3夸膜結(jié)構(gòu)域的EG-VEGF受體GPR73、高親和性IgE受體卩鏈(FcsRI卩)、HTm4、MS4A4A、MS4A6、MS4A7和RAlc。所述載體還可以包括宿主細(xì)菌細(xì)胞的稀有密碼子tRNA基因，和/或位于第一密碼子鄰近，編碼增強(qiáng)翻譯起始的前導(dǎo)肽的多核苦酸序列。前導(dǎo)序列一般含有強(qiáng)翻譯起始序列(TIS)和用于高效延伸的間隔序列。翻譯起始序列在本申請(qǐng)中被稱(chēng)為T(mén)IS，但也可稱(chēng)為翻譯起始區(qū)域(TIR)。在一個(gè)實(shí)施方式中，前導(dǎo)序列含有強(qiáng)TIS,編碼trp前導(dǎo)序列的至少一部分，例如，約6到約12個(gè)氨基酸。間隔區(qū)序列將翻譯起始序列與第一跨膜區(qū)域分隔開(kāi)來(lái)，而且，它一般編碼某種已知在宿主細(xì)胞中經(jīng)常表達(dá)的蛋白質(zhì)(例如大腸桿菌中的"E"蛋白)內(nèi)部的小部分。間隔區(qū)序列一般是非結(jié)構(gòu)化的(unstructured)，并大多是親水的。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于表達(dá)可溶的、多跨膜蛋白質(zhì)的載體含有嚴(yán)密調(diào)控的啟動(dòng)子，例如phoA啟動(dòng)子或其突變體，負(fù)和/或正調(diào)節(jié)元件，并含有編碼前導(dǎo)序列的多核苷酸序列，所述前導(dǎo)序列含有強(qiáng)翻譯起始序列和位于TIS和所述蛋白質(zhì)的第一跨膜區(qū)之間的翻譯延伸間隔區(qū)序列。載體可以含有，例如，p/2o丄p/ac或0/7ac啟動(dòng)子，負(fù)調(diào)控元件例如lac操縱基因，編碼翻譯起始序列的前導(dǎo)序列，例如trp前導(dǎo)區(qū)的一部分如九氨基酸序列KAIFVLKGS，和編碼翻譯延伸序列的間隔區(qū)序列，例如trpE基因的一部分，例如在此描述的LE前導(dǎo)區(qū)(SEQIDNO:25)或sLE前導(dǎo)區(qū)(SEQIDNO:26)中發(fā)現(xiàn)的?？缒ざ嚯目梢酝ㄟ^(guò)溶解在洗滌劑中來(lái)從寄主細(xì)胞膜收獲和純化。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用非離子或兩性離子洗滌劑，例如正十二烷基磷酸膽堿、DDPC來(lái)溶解跨膜多肽。分離的多跨膜(multi-membranespanning)多肽例如CD20可以溶于這些洗滌劑。分離的、可溶的多跨膜多肽含有足夠的"天然"結(jié)構(gòu)，從而可被識(shí)別細(xì)胞表面上表達(dá)的所述多肽的抗體所識(shí)別，而且可以用作免疫原和測(cè)定配體。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1是呈現(xiàn)在B細(xì)胞膜中的CD20的示意圖。相對(duì)于細(xì)胞表面膜來(lái)呈現(xiàn)CD20的序列和建議的總體拓樸結(jié)構(gòu)。圖2顯示了帶His標(biāo)簽的CD20的抗His-標(biāo)簽Western印跡分析。畫(huà)面a)中顯示的是在大腸桿菌細(xì)胞膜的蔗糖梯度浮選(sucrosegradientflotation)之后的含CD20的級(jí)分。將來(lái)自蔗糖梯度的該級(jí)分的等份(由頂部的編號(hào)標(biāo)明)在SDS-PAGE凝膠上電泳。使用抗His標(biāo)簽抗體對(duì)凝膠進(jìn)行印跡和探查。從最低的蔗糖密度到最高的蔗糖密度取級(jí)分。畫(huà)面b)顯示了用不同洗滌劑提取大腸桿菌膜之后Western印跡上帶His標(biāo)簽的CD20的水平。來(lái)自不同洗滌劑提取物的上清液標(biāo)記為(S)，離心沉淀標(biāo)記為(P)。(WC)表示全細(xì)胞提取物(對(duì)照)。編號(hào)l-7代表測(cè)試的不同洗滌劑，即SDS(l)、正月桂基肌氨酸(2)、正十二烷基-N，N-二曱胺-N-氧化物(LAD0)(3)、正十二烷基磷酸膽堿(DDPC)(4)、正十二烷基-卩-D-麥芽糖苷(n-dodecyl-卩-D-maltoside，DDM)(5)、Triton-X100(6)和CHAPS(7)。畫(huà)面c)顯示，對(duì)于表達(dá)帶His標(biāo)簽的天然人類(lèi)CD20和C2S突變CD20的大腸桿菌細(xì)胞，使用抗His標(biāo)簽抗體從Western印跡中檢測(cè)的帶His標(biāo)簽的CD20多肽水平。泳道1和4顯示對(duì)照、空載體，泳道2和5顯示帶His標(biāo)簽的人類(lèi)CD20，泳道3和6顯示C2S突變CD20。泳道1、2和3中的樣品在非還原條件下泳動(dòng)，泳道4、5和6中的樣品用100mMDTT還原。每個(gè)泳道含有根據(jù)光密度歸一化的等體積的細(xì)月包。圖3顯示了純化的人帶His標(biāo)簽的人CD20、C2S突變體和鼠CD20的Comassie染色的SDS凝月交泳道。畫(huà)面a)的泳道1、2和3含有非還原蛋白質(zhì)人CD20(泳道1)、C2S突變體(;永道2)和鼠CD20(泳道3)。泳道4含有分子量標(biāo)記物(Mark12，Invitrogen)。泳道5、6和7顯示還原的蛋白質(zhì)人CD20(泳道5)、C2S突變體(泳道6)和鼠CD20(泳道7)。泳道8和10分別顯示非還原和還原的純化鼠CD20。泳道9含有分子量標(biāo)記物。每個(gè)泳道含有2路(微克)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記物的分子量是200、116、97、66、55、36、30、22、14和6kDa。圖4是顯示結(jié)合帶His標(biāo)簽的人CD20(實(shí)心正方形)、還原和烷基化(alkylated)的hCD20(實(shí)心圓圈)、還原和再氧化的hCD20(空心正方形)和PBS對(duì)照(空心圓圈)的二硫4建依賴(lài)性(disulfidedependent)rituximab抗體的圖表。圖5是顯示rituximab和人帶His標(biāo)簽的CD20之間的結(jié)合的BIAcoresensogram。人CD20與固定化rituximab的結(jié)合發(fā)生在5^M、2.5pM、1.25pM、0.63pM、0.31pM、0.16pM、0.08jiM和0.04的CD20濃度。前4個(gè)樣品的濃度在標(biāo)記sensogram上。各個(gè)濃度下均顯示了對(duì)非協(xié)同(non-cooperative)模型的計(jì)算理論擬合。圖6顯示了CD20蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜。畫(huà)面(a)顯示的是在0.1DDPC存在下(黑線(xiàn))；0.1。/。DDPC和10mMJ3-巰基乙醇中(短劃線(xiàn))；和在1%SDS存在下熱掃描到95。C之后(灰線(xiàn))的人CD20突變C2S的譜圖。畫(huà)面(b)顯示的是在存在0.1%DDPC(短劃線(xiàn))、0.1%十二烷基-麥芽糖苦(DDM)的情況下(灰線(xiàn))；以及在添加1%SDS和|3-巰基乙@|的0.1%DDM中并在95。C加熱2分鐘之后(黑線(xiàn))的鼠CD20的譜圖。數(shù)據(jù)表示為摩爾橢圓率。圖7顯示了結(jié)合分離的正常人類(lèi)B細(xì)胞的rituximabIgG和Fab的典型的置換曲線(xiàn)(displacementplots)。在這個(gè)測(cè)定中天然CD20的EQo是9.5nM。通過(guò)未標(biāo)記的rituximabIgG與"5l-IgG對(duì)供體l(畫(huà)面a)或未標(biāo)記的rituximabFab與1251-Fab對(duì)供體4(畫(huà)面b)的竟?fàn)巵?lái)測(cè)定結(jié)合。每個(gè)供體的受體的親和力和數(shù)目參見(jiàn)表4。圖8顯示了表達(dá)載體構(gòu)建體和Western印跡，其顯示了MS4A家族多肽，包括MS4A6A、MS4A7和MS4A4A多肽在大腸桿菌中的表達(dá)。圖9是用抗His標(biāo)簽抗體檢測(cè)的Western印跡，顯示從非誘導(dǎo)的p/zoJ啟動(dòng)子(pEfRAIC)和突變啟動(dòng)子p/zac(pEfRAlCr)滲漏表達(dá)(leakage)而產(chǎn)生的RAlc多肽。圖10是顯示由phoA啟動(dòng)子(pEfRAlC)啟動(dòng)的RAlc多肽表達(dá)的時(shí)程的Western印跡，所述表達(dá)是通過(guò)在磷酸鹽/酯限制培養(yǎng)基中稀釋而誘導(dǎo)的。圖11是顯示由phac啟動(dòng)子(pEfRAlCr)啟動(dòng)的RAlc多肽表達(dá)的時(shí)程的Western印跡，所述表達(dá)是通過(guò)在磷酸鹽/酯限制培養(yǎng)基中稀釋和通過(guò)添加IPTG而i秀導(dǎo)的。圖12是比較來(lái)自誘導(dǎo)的phoA和phac啟動(dòng)子的RAlc最大表達(dá)的Western印跡。圖13是顯示大腸桿菌中表達(dá)的EG-VEGF受體GPR73多肽的Western印跡，所述表達(dá)是從非誘導(dǎo)phoA啟動(dòng)子(中間泳道)和突變啟動(dòng)子phac(右側(cè)泳道)滲漏而導(dǎo)致的。圖14是顯示從phoA啟動(dòng)子啟動(dòng)的GPR73多肽表達(dá)的時(shí)程的Western印跡，所述表達(dá)是通過(guò)在磷酸鹽/酯限制培養(yǎng)基中稀釋而誘導(dǎo)的。圖15是顯示從phac啟動(dòng)子啟動(dòng)的GPR73多肽表達(dá)的時(shí)程的Western印跡，所述表達(dá)是通過(guò)在磷酸鹽/g旨限制培養(yǎng)基中稀釋和通過(guò)添加IPTG而誘導(dǎo)的。圖16是比較從誘導(dǎo)的//zo4和；^ac啟動(dòng)子啟動(dòng)的GPR73最大表達(dá)的Western印跡。圖17是表達(dá)的MS4A4A多肽的Western印跡，所述表達(dá)是從非誘導(dǎo)的p/2oJ啟動(dòng)子(中間泳道)和突變啟動(dòng)子(右側(cè)泳道)的滲漏而導(dǎo)致的。圖18是顯示從phoA啟動(dòng)子啟動(dòng)的MS4A4A多肽表達(dá)的時(shí)程的Western印跡，所述表達(dá)通過(guò)在磷酸鹽/酯限制培養(yǎng)基中稀釋而誘導(dǎo)的。圖19是顯示從tphac啟動(dòng)子啟動(dòng)的MS4A4A多肽表達(dá)的時(shí)程的Western印跡，所述表達(dá)是通過(guò)在磷酸鹽/酯限制培養(yǎng)基中稀釋和通過(guò)添加IPTG而誘導(dǎo)的。圖20是比較從誘導(dǎo)的；/za4和/p/wc啟動(dòng)子啟動(dòng)的MS4A4A最大表達(dá)的Western印跡。圖21是用于表達(dá)多跨膜多肽的表達(dá)構(gòu)建體的示意圖。標(biāo)明了表達(dá)栽體的示范性的組件。圖22顯示trpLE和sLE前導(dǎo)區(qū)的氨基酸序列。圖23顯示了用于表達(dá)CD20的表達(dá)載體的示意圖，和顯示大腸桿菌細(xì)胞中CD20和LE.CD20的表達(dá)和產(chǎn)量的Coomassie藍(lán)染色的;疑膠。圖24所示的Western印跡和Coomassie藍(lán)染色的凝月交展示了大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的LE.CD20的4是耳又。圖25所示是用于表達(dá)RAlc或GPR73的表達(dá)載體的示意圖，以及顯示與對(duì)照蛋白相比的LE.RAlc和LE.GPR73的表達(dá)的Western印跡。圖26是顯示從大腸桿菌細(xì)胞膜表達(dá)和提取的LE.RAlc蛋白質(zhì)的Coomassis藍(lán)凝膠。圖27是顯示從大腸桿菌細(xì)胞膜提取的LE.GPR73的Western印跡。圖28是顯示CD20構(gòu)象特異性抗體rituximab對(duì)LE.CD20和sLECD20的結(jié)合的圖表，其中所述LE.CD20和sLECD20是在大腸桿菌中表達(dá)并如實(shí)施例10所述提取的。對(duì)于sLE和LE樣品，通過(guò)凝血酶消化來(lái)除去LE標(biāo)簽，并通過(guò)透析將樣品氧化。空心圓圈帶LE標(biāo)簽表達(dá)的hCD20,空心三角形帶sLE標(biāo)簽表達(dá)的hCD20，實(shí)心圓圈帶HQ標(biāo)簽表達(dá)的hCD20(在LE前導(dǎo)區(qū)上)；x:PBS對(duì)照。序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>28(ATG)AAACACCAACACCAACAA(TIS)DNA圖2129AA339-408trpE(LE間隔區(qū))蛋白質(zhì)實(shí)施例730trpE的38個(gè)不連續(xù)氨基酸(sLE間隔區(qū))蛋白質(zhì)實(shí)施例731LVPRGS(;疑血酶識(shí)別位點(diǎn))蛋白質(zhì)實(shí)施例732DYKDDDDK(flag標(biāo)簽)蛋白質(zhì)實(shí)施例833MGSS朋HH朋肽2934ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCATDNA2935ATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAAGGTTCADNA30詳細(xì)i兌明I.定義"親和力成熟的，，抗體是在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)中具有一處或多處改變，導(dǎo)致抗體對(duì)抗原的親和力與不具有這些改變的親本抗體相比有所改善的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將對(duì)靶抗原具有納摩爾或甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗體可通過(guò)已知方法生成。例如VH和VL結(jié)構(gòu)域改組(Marks等，1992,所o/7fec/zm/ow10:779-783)，CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變(Barbas等，1994,尸rac,淑USA91:3809-3813;Scier等，1995，Gene169:147-155;Yelton等,1995，/聽(tīng),/.155:1994-2004;Jackson等，1995,J./m/"w"o/.154(7):3310-9;Hawkins等，1992,J.Mol.Biol.226:889-896。術(shù)語(yǔ)"抗體，，和"免疫球蛋白"可在最廣泛的意義上互換使用，包括單克隆抗體(全長(zhǎng)或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、人源化的、多價(jià)的抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性)和抗體片段。"抗體片段，，含有完整抗體的一部分，一般地含有完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、Fd'片段、Fv片段、Fd片段、F(ab，)2片段、dAb片段、無(wú)鉸鏈的(hingeless)抗體、單鏈抗體、雙抗體、單臂抗原結(jié)合分子(含有輕鏈、重鏈和N-末端截短的重鏈恒定區(qū)，其足以形成能提高單臂抗原結(jié)合分子的半衰期的FC區(qū))，和線(xiàn)性抗體。此處使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體，，是指從基本上同質(zhì)的抗體中獲得的抗體，即，除了可能在抗體的生產(chǎn)期間出現(xiàn)的變體以外，包含所述群體的單獨(dú)的抗體是基本上相同的。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"特別地包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，在"嵌合"抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)源于特定種群或?qū)儆谔囟贵w種類(lèi)或亞種的抗體中的相應(yīng)序列同一或同源，而^r連的其余部分與來(lái)源于另一個(gè)種群或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體種類(lèi)或亞種的抗體中的相應(yīng)序列同一或同源，還包括這種抗體的片段，只要它們顯示出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567;和Morrison等，Prac.Ato/.爿cadUSA,81:6851-6855)。術(shù)語(yǔ)"生物樣品，，是指來(lái)自任何動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，例如人類(lèi)的身體樣品。例如，生物樣品可以從血管病、糖尿病或癌癥患者獲得。生物樣品可以是，例如，生物液體，如血清、血漿、玻璃體液(vitreousfluid)、淋巴液、滑液、卵泡液(follicularfluid)、精液、羊水、乳液、全血、尿、腦脊液、唾液、痰、淚液、汗液、粘液和組織培養(yǎng)基，以及組織提取物例如經(jīng)勻漿的組織、細(xì)胞提取物，或完整的細(xì)胞或組織。生物樣品可以是，例如，血清、血漿或尿。如在此使用的，"緩沖液"是指通過(guò)其酸堿共軛成分的作用抵抗pH值變化的緩沖的溶液。術(shù)語(yǔ)"CD20突變體，，或"CD20變體"是指含有不同于參比CD20氨基酸序列的氨基酸序列，或由不同于參考CD20核酸序列的核酸序列編碼的CD20多肽。CD20突變包括可以通過(guò)在參考序列中取代、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而產(chǎn)生的氨基酸序列改變。術(shù)語(yǔ)"捕獲試劑"(capturereagent)是指能夠結(jié)合并捕獲樣品中的目標(biāo)分子的試劑。捕獲試劑-目標(biāo)分子復(fù)合物可以在適合的條件下與其余的樣品分離。捕獲試劑可以是固定化的，或是可固定的。例如，在夾心法免疫測(cè)定(sandwichimmunoassay)中，捕獲試劑可以是針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體或不同抗體的混合物。術(shù)語(yǔ)"洗滌劑"(detergent)是指可以包含長(zhǎng)鏈脂肪族堿或酸的鹽、或親水性部分例如糖類(lèi)，并兼有親水和疏水性質(zhì)的試劑。由于同時(shí)具有親水和疏水性質(zhì)，洗滌劑可以發(fā)揮特別的效果。如在此使用的，洗滌劑具有破壞細(xì)胞膜和溶解多肽的能力。術(shù)語(yǔ)"可檢測(cè)的抗體"是指可以通過(guò)由檢測(cè)手段放大(amplify)的標(biāo)記來(lái)直接檢測(cè)、或通過(guò)例如另一標(biāo)記抗體來(lái)間接檢測(cè)的抗體。直接標(biāo)記一般是將抗體與可通過(guò)某種手段檢測(cè)的部分偶聯(lián)?？贵w一般可以用可檢測(cè)的標(biāo)記，包括但不限于熒光標(biāo)記、；改射性同位素、或酶-底物標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。標(biāo)記可以間接地與抗體偶聯(lián)。例如，可以將抗體與生物素偶聯(lián)，并將上述三類(lèi)標(biāo)記中的任一種與抗生物素蛋白偶聯(lián)，反之亦然。生物素選擇性地結(jié)合抗生物素蛋白，因而，可以通過(guò)這種間接的方式將標(biāo)記與抗體偶聯(lián)。作為選4奪，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記與抗體的間接結(jié)合，將抗體與小的半抗原(例如，地高辛(digoxin))偶聯(lián)，并將上述不同類(lèi)型的標(biāo)記之一與抗半抗原抗體(例如，抗地高辛抗體)偶聯(lián)。術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)試劑"是指用于檢測(cè)標(biāo)記的存在的部分或試劑，包括對(duì)固定化的標(biāo)記，例如微量滴定板上捕獲的標(biāo)記加以放大的檢測(cè)試劑。檢測(cè)手段可以是例如檢測(cè)試劑，例如用熒光或發(fā)色團(tuán)部分標(biāo)記的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)標(biāo)簽，，是指這樣的肽序列或標(biāo)記，它們?nèi)诤系匠墒於嚯牡腘或C末端，或與成熟多肽中的特定殘基偶聯(lián)，提供鑒定和/或分離表達(dá)的多肽的手段。表達(dá)標(biāo)簽可以被編碼為載體的成分，或包含插入到表達(dá)載體中的多肽編碼序列的一部分。表達(dá)標(biāo)簽的實(shí)例包括但不限于，聚His標(biāo)簽(美國(guó)專(zhuān)利No.4,569,794)、FLAG、myc、生物素、抗生物素蛋白，等等。這些標(biāo)簽是公知的和商業(yè)上可獲得的(參見(jiàn)，例如Qiagen，Valencia,CA)。術(shù)語(yǔ)"異源，，是指元件出現(xiàn)在它們通常不存在的地方。例如，啟動(dòng)子可以與異源核酸序列，例如發(fā)現(xiàn)通常不與啟動(dòng)子可搡作連接的序列連接。當(dāng)在本文中用"異源"來(lái)描述啟動(dòng)子元件時(shí)，"異源"的意思是啟動(dòng)子元件與通常發(fā)現(xiàn)與天然啟動(dòng)子可操作連接的啟動(dòng)子元件在序列、種類(lèi)或數(shù)目上存在不同。例如，啟動(dòng)子序列中的異源調(diào)控元件可以是為了增強(qiáng)啟動(dòng)子控制而添加的另一啟動(dòng)子的控制/調(diào)節(jié)元件，或者是同一啟動(dòng)子的其他調(diào)控元件。如在此使用的，短語(yǔ)"誘導(dǎo)表達(dá)"是指通過(guò)將含有特定基因的細(xì)胞暴露于效應(yīng)物或誘導(dǎo)物試劑或條件，來(lái)提高從該基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的量或速度。"誘導(dǎo)物，，(inducer)是化學(xué)或物理的因素，當(dāng)其施用于細(xì)胞群體時(shí)，將提高從特定基因轉(zhuǎn)錄的量。它們通常是對(duì)特定操縱子(operon)或基因群組有特異性作用的小分子，可以包括糖類(lèi)、磷酸鹽/酯(phosphate)、醇類(lèi)、金屬離子、激素、熱、冷，等等。例如，異丙基-(3-D-硫代半乳糖芬(IPTG)和乳糖是tacll啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物，L-阿拉伯糖是阿拉伯糖啟動(dòng)子的合適誘導(dǎo)物。p/2o基因啟動(dòng)子，例如p/7a4(Changetal.，1987,Gene，55:189-196)和p/zo5,可以被培養(yǎng)基中的低磷酸鹽/酉旨濃度誘導(dǎo)。通過(guò)試劑的功能基團(tuán)和固相表面上的反應(yīng)性基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，試劑可以"固定，，在支持物之上或之中。在其他實(shí)施方式中，試劑通過(guò)吸附和離子結(jié)合"固定"在固相上，或被捕捉(entrap)在固相中，例如在細(xì)胞或晶格型聚合物或微嚢(microcapsule)中(參見(jiàn),Holenbergetal.，于《EnzymesasDrugs》中，JohnWiley&SonsNY(1981),第396-411頁(yè))。一旦固定到固相上，試劑應(yīng)當(dāng)基本上保持其結(jié)合和/或修飾目標(biāo)多肽的能力。術(shù)語(yǔ)"分離的"用于描述此處公開(kāi)的各種多肽和抗體時(shí)，意思指已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分中被鑒定、分離和/或回收了的多肽。分離的多肽至少不與一種其天然伴隨的組分相伴隨。其天然環(huán)境的污染組分是通常千擾該多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶和其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。分離的多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)原位的多肽。然而，通常，分離的多肽將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備。如在此使用的，"分離的CD20"是指沒(méi)有細(xì)胞或膜的CD20蛋白質(zhì)，并可以處于例如洗滌劑溶液中的可溶形式。"分離的，，核酸分子或多核苷酸是從至少一種雜質(zhì)核酸分子鑒定和分離而來(lái)的核酸分子，其中該核酸分子在天然來(lái)源中通常與所述雜質(zhì)核酸分子相伴隨。分離的核酸可以，例如，與所有和它天然相伴隨成分均不相伴隨。分離的核酸分子不同于其天然存在的形式或環(huán)境(setting)。"IPTG"是化合物"異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷"，在此用作/ac操縱子的誘導(dǎo)物。IPTG結(jié)合/gc阻抑物(repressor)，引起/ac阻抑物中構(gòu)象變化，導(dǎo)致/ac阻抑物從&c操縱子上解離。未結(jié)合/ac阻抑物時(shí)，可操作連接的啟動(dòng)子活化，下游的基因得以轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)'7"c操縱基因"是指可以被/ac阻抑物/ac/結(jié)合的核Si序列，例如，在Jacobetal.，1961,/Mo/.所o/.，3:318-356中描述的。當(dāng)/"c阻抑物結(jié)合到/ac操縱基因時(shí)，啟動(dòng)子不活化。當(dāng)/flc阻抑物被誘導(dǎo)而從操縱基因解離時(shí)，啟動(dòng)子活化。術(shù)語(yǔ)"前導(dǎo)序列"是指位于目標(biāo)編碼序列的上游的核酸序列。前導(dǎo)在此描述的前導(dǎo)序列含有特異性序列，已知該特異性序列高效結(jié)合核糖體，從而帶來(lái)某些多核苷酸更高的翻譯起始效率。如在此描述的，前導(dǎo)序列含有翻i奪起始序列和用于增強(qiáng)在此定義的翻譯延伸的間隔區(qū)序列。如在此使用的術(shù)語(yǔ)"低磷酸鹽/酯培養(yǎng)基"或"磷酸鹽/酯限制培養(yǎng)基"是指含有溶液中低濃度的磷酸鹽/酉旨的培養(yǎng)基。例如，當(dāng)磷酸鹽/酯的培養(yǎng)基濃度下降至約4(xM(微摩爾)或更低時(shí)，phoA啟動(dòng)子開(kāi)啟。然而，磷酸鹽/酯限制培養(yǎng)基設(shè)計(jì)為含有超過(guò)4pM(微摩爾)的磷酸鹽/酯，以給予細(xì)胞在啟動(dòng)子開(kāi)啟前生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)。磷酸鹽/酯限制培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限于，Simmonsetal.，2002,//wmw"o/.M^/zo&,263:133-147中描述的C.R.A.P.培養(yǎng)基(由于來(lái)自酵母提取物和其他來(lái)源的痕量染污物，含有約1.9M起始磷酸鹽/酯濃度)和Changetal.,1987，55:189-196中描述的培養(yǎng)基。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物"是指任何被分類(lèi)為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包括人類(lèi)、家養(yǎng)動(dòng)物和農(nóng)畜、和動(dòng)物園、體育或玩賞動(dòng)物，例如犬、馬、貓、牛，等等。例如，哺乳動(dòng)物可以是人類(lèi)。術(shù)語(yǔ)"MS4A多肽，，是指由跨膜四結(jié)構(gòu)域亞族A(MS4A)基因家族的基因編碼的多肽。參見(jiàn)，例如，Ishibashietal.，2001，G麼，264:87-93。MS4A多肽可以是天然存在的，或者是天然存在的MS4A多肽的變體。MS4A基因家族的成員有具有結(jié)構(gòu)相似性的多肽。每個(gè)跨越細(xì)胞膜四次，N和C-末端都位于細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)，都含有長(zhǎng)度為大約50個(gè)氨基酸的胞外環(huán)。MS4A多肽包括CD20、高親和性IgE受體卩鏈、HTm4、MS4A4A、MS4A7,等等。該術(shù)語(yǔ)還包括由MS4A基因編碼的多肽的變體和同種型。這個(gè)基因家族在哺乳動(dòng)物中是保守的，"MS4A多肽"包括人類(lèi)、小鼠、大鼠和諸如此類(lèi)的多肽。MS4A多肽的"變體(突變體)"是指含有不同于參考序列的氨基S殳序列、或由不同于參考序列的核酸序列編碼的氨基S吏序列的MS4A多肽。參考序列可以是全長(zhǎng)的天然MS4A多肽序列、MS4A多肽的胞外域、或全長(zhǎng)MS4A多肽序列的任何其他片段。在某些實(shí)施方式中，參考序列是天然存在的CD20的核酸序列或氨基酸序列，例如SEQIDNO:l(氨基S吏序列)或SEQIDNO:2(核酸序列)。MS4A多肽變體一般與參考序列具有至少約80%的氨基酸序列同一性。MS4A多肽變體包括"天然存在的"變體，包括等位變體，以及通過(guò)改變一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸而制備的變體。變體多肽可以通過(guò)》務(wù)飾MS4A多肽的核酸序列或氨基酸序列來(lái)制備。例如，變體可以通過(guò)核苦酸或氨基酸的添加、取代和/或缺失來(lái)制備。在本發(fā)明的方法中有用的變體MS4A多肽與例如MS4A參考序列，例如與人類(lèi)CD20的參考序列，例如SEQIDNO:1,可以具有至少80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93°/。、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97°/。、至少約98%、至少約99%的序列同一性。術(shù)語(yǔ)"跨膜蛋白質(zhì)"或"穿膜(transmembrane)蛋白質(zhì)，，是指包含包埋在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中的一個(gè)或多個(gè)片段的多肽。跨膜蛋白可以進(jìn)一步包含細(xì)月包內(nèi)域、胞外域，或兩者。細(xì)胞膜可以是細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等等的膜。術(shù)語(yǔ)"跨膜結(jié)構(gòu)域，，或"穿膜結(jié)構(gòu)域"是指跨膜蛋白質(zhì)的包埋在細(xì)胞膜磷脂雙分子層中的部分。術(shù)語(yǔ)"天然構(gòu)象"是指多肽在其自然狀態(tài)下的三維形狀。天然構(gòu)象可以指多肽的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。如在此使用的，溶解的跨膜多肽的"天然構(gòu)象"足以允許該溶解的多肽用作免疫原來(lái)產(chǎn)生識(shí)別細(xì)胞中所述跨膜多肽的抗體，或用作結(jié)合配體來(lái)結(jié)合識(shí)別細(xì)胞中所述跨膜多肽的抗體。術(shù)語(yǔ)"非離子的"(non-ionic)是指在溶液中不離子化的分子，即，是"離子"(ionically)惰性的。當(dāng)核酸序列或多核苷酸被置于與另一個(gè)核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，該核酸序列或多核苷酸是"可搡作連接的"。例如，如果某個(gè)前序列或分泌前導(dǎo)區(qū)的DNA被表達(dá)為參與某個(gè)多肽分泌的前蛋白(preprotein),則該前序列或分泌前導(dǎo)區(qū)的DNA與該多肽的DNA是可操作連接的；如果某個(gè)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響某個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與該序列是可操作地連接的；或者，如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于促進(jìn)翻譯的位置，則它與編碼序列是可操作地連接的。一般地，"可操作地連接"意思指被連接的DNA序列是連續(xù)的，而且，對(duì)分泌前導(dǎo)區(qū)而言，是連續(xù)且符合閱讀框的。連接可以通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行連接反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)。如果不存在這種位點(diǎn)，則4要照通常的做法使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。"質(zhì)粒"由小寫(xiě)字體"p"及其之前和/或之后的大寫(xiě)字母和/或#1字來(lái)指示。本文中的起始質(zhì)粒是商業(yè)上可獲得的，公眾可在無(wú)限制的基礎(chǔ)上獲得的、或者是可以根據(jù)公開(kāi)的步驟從可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建的。此外，與描述的那些等價(jià)的質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的，對(duì)于普通熟練技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。對(duì)于本文中確認(rèn)的多肽，"百分比(％)氨基酸序列同一性"定義為在不把任何保守性取代考慮為序列同一性的一部分的情況下，比對(duì)候選序列和參考序列，且必要時(shí)引入缺口(gap)，從而達(dá)到最大的百分比序列同一性之后，候選序列中與參考序列中的氨基酸殘基一致的氨基酸殘基的百分比。為了確定氨基酸序列同一性百分比的比對(duì)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的各種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如，使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域:技術(shù)人員可以確定用于測(cè)量比對(duì)的合適參數(shù)，包括在被比較的序列全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最大序列匹配(alignment)所需的任何算法。公眾可通過(guò)Genentech，Inc.,SouthSanFrancisco，California獲得ALIGN-2程序。為本文的目的，給定氨基S交序列A與、和或?qū)?to，withoragainst)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(也可表述為給定氨基酸序列A具有或包含與、和或?qū)o定氨基酸序列B的一定的％氨基酸序列同一性)如下計(jì)算100乘以分?jǐn)?shù)X/Y，其中X是序列比對(duì)程序?qū)和B的比對(duì)中，該程序計(jì)為一致匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。要理解的是，當(dāng)氨基S^f列A的長(zhǎng)度不等于氨基酸序列B的長(zhǎng)度時(shí)，A與B的o/。氨基酸序列同一性不會(huì)等于B與A的％氨基酸序列同一性。"核酸序列同一性百分比(％)"定義為將候選序列與編碼多肽的參考核酸序列進(jìn)行比對(duì)，且必要時(shí)引入缺口，從而達(dá)到最大百分比序列同一性之后，候選序列中與編碼多肽的參考核酸序列的核苷酸一致的核苷酸的百分比。以確定百分比核酸序列同一性為目的的比對(duì)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的各種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如，使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。通過(guò)已知的方法，可以確定用于測(cè)量比對(duì)的合適參數(shù)，包括在被比較的序列全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最大序列匹配所需的任何算法。為本文的目的，給定核酸序列C與、和或?qū)o定核酸序列D的％核酸序列同一性(或表述為給定核酸序列C具有或包含與、和或?qū)o定核酸序列D的一定的％核酸序列同一性)如下計(jì)算100乘以分?jǐn)?shù)W/Z，其中W是序列比對(duì)程序?qū)和D的比對(duì)中，該程序計(jì)為一致匹配的核苷酸的數(shù)目，Z是D中核苷酸的總數(shù)。要理解的是，當(dāng)核酸序列C的長(zhǎng)度的長(zhǎng)度不等于核S吏序列D的長(zhǎng)度時(shí)，C與D的％核酸序列同一性不會(huì)等于D與C的％核酸序列同一性。術(shù)語(yǔ)"/7/7W啟動(dòng)子，，是指堿性磷酸酶;/za4的結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子。多種細(xì)菌，特別是腸桿菌科(五"tera6acteWaceae),具有p/70J基因和p/zc^啟動(dòng)子。本文中例示了大腸桿菌p/zW啟動(dòng)子，其具有SEQIDNO:5的核酸序列。術(shù)語(yǔ)"突變啟動(dòng)子"或"變體啟動(dòng)子"是指具有不同于參考序列的核酸序列的啟動(dòng)子。例如，突變的phac和tphac啟動(dòng)子不同于phoA參考啟動(dòng)子，如表5所示。啟動(dòng)子的核酸序列中的改變可能是取代、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)核酸的結(jié)果。術(shù)語(yǔ)》/wyf，是指編碼堿性磷酸酶金屬酶的基因。在大腸桿菌中，p/2"酶是磷酸鹽調(diào)節(jié)子(phosphateregulon)的部分，其中在無(wú)機(jī)磷酸鹽饑餓時(shí)p/w^表達(dá)被上調(diào)超過(guò)100倍。(參見(jiàn)，例如，Kriakovetal.,2003,/Bflc/en'o/.，185:4983-4991)。大腸桿菌以外的細(xì)菌物種具有phoA同源物(例如，克雷伯氏菌屬菌種(尺/^1^/&wp.)，志賀氏菌屬菌種(57^^/&w;.)，恥垢分枝桿菌(A^co6acter/ww纖egw加'力)。術(shù)語(yǔ)"聚-His"泛指包含多個(gè)組氨酸殘基、一般6-10個(gè)組氨酸殘基的氨基酸殘基。多個(gè)組氨酸殘基常被用作表達(dá)標(biāo)簽，因而稱(chēng)為"聚-His標(biāo)簽，，(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.4,569,794)。聚-his標(biāo)簽可以用于檢測(cè)和/或純化多肽，例如通過(guò)將樣品施加到親和柱，例如^:柱上。如在此使用的，"多肽，，一般是指具有超過(guò)約十個(gè)氨基酸的肽和蛋白質(zhì)。多肽可以是"外源的"，是指它們是"異源的"，即，對(duì)于使用的宿主細(xì)胞是外來(lái)的，例如由細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的人類(lèi)多肽。"靈長(zhǎng)類(lèi)，，解釋為意指任何哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)、猿、猴和相關(guān)的形式，侈'B口3瓜賓吳(lemurs)禾口別寸浙吳(tarsiers)。"純化"是指通過(guò)從組合物中(完全地或部分地)除去至少一種雜質(zhì)來(lái)提高組合物中例如跨膜多肽的純度。"純化步驟，，可以是產(chǎn)生"基本上純的"組合物的總體純化過(guò)程的部分。以該組合物的總重量計(jì)，基本上純的組合物含有至少約90%按重量計(jì)的目標(biāo)多肽，并可以含有至少約95%按重量計(jì)的所述多肽。術(shù)語(yǔ)"稀有密碼子"或"次要tRNA"(minortRNA)是指在特定細(xì)胞類(lèi)型中低豐度的特定密碼子或tRNA。參見(jiàn)，例如，Dongetal.，1996,JMo/.5/o/.，260:649-663，其描述了大腸桿菌細(xì)胞中的tRNA豐度和密碼子用法。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)元件"或"調(diào)控元件"是指控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列?？刂苹蛘{(diào)節(jié)元件的實(shí)例包括，但不限于，TATA盒、操縱基因、增強(qiáng)子，等等。調(diào)節(jié)或調(diào)控元件包括負(fù)調(diào)控元件和正調(diào)控元件。負(fù)調(diào)控元件是為了轉(zhuǎn)錄活化而被去除的元件。許多這種負(fù)調(diào)控元件是已知的，例如操縱基因/阻抑物系統(tǒng)。例如，IPTG與/flc阻抑物的結(jié)合使其從/ac操縱基因上解離，從而活化和允許轉(zhuǎn)錄。其他負(fù)元件包括大腸桿菌trp和、系統(tǒng)。正調(diào)控元件是為了轉(zhuǎn)錄活化而被添加的元件。已知有許多這樣的正調(diào)控元件，包括大腸桿菌pho盒和結(jié)合phoB的pho盒變體、MalTDNA結(jié)合位點(diǎn)、AraCDNA結(jié)合位點(diǎn)，等等。例如，phoB與p/70J啟動(dòng)子的pho盒的結(jié)合誘導(dǎo)該啟動(dòng)子的活化。天然地含有正和負(fù)調(diào)節(jié)元件二者的啟動(dòng)子是很少的。metE啟動(dòng)子是一個(gè)實(shí)例。參見(jiàn),例^口,Neidhardt編,1996，Esc/7en、/z/aco//a"<i5"a/mo"e〃a,第二版，第1300-1309頁(yè)。已知的正和負(fù)調(diào)控元件的說(shuō)明可以在例如這個(gè)參考文獻(xiàn)中找到。在某些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子兼具正和負(fù)調(diào)控元件，為基礎(chǔ)表達(dá)的直接控制提供了條件。將正或負(fù)調(diào)控元件置于啟動(dòng)子內(nèi)部或鄰近啟動(dòng)子的位置以實(shí)現(xiàn)對(duì)啟動(dòng)子的進(jìn)一步調(diào)節(jié)是已知的，例如，在^c/zen'W/aco/Zfo/w匿〃a(同上)第1232-1245頁(yè)中對(duì)此有描述。術(shù)語(yǔ)"rituximab"或"RITUXAN⑧"在本文中是指針對(duì)CD20抗原的基因工程化嵌合鼠源/人源單克隆抗體，在美國(guó)專(zhuān)利No.5,736,137(在此明確地將其SI用并入本文)中稱(chēng)其為"C2B8"。該抗體是含有鼠源輕鏈和重鏈可變區(qū)序列以及人源恒定區(qū)序列的IgG,k免疫球蛋白。Rituximab對(duì)CD20抗原具有大約8.0nM的結(jié)合親和性。術(shù)語(yǔ)"溶解，，(solubilizing)是指將分子溶解在溶液中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)菌宿主中表達(dá)的重組穿膜多肽被溶解在非離子或兩性離子洗滌劑中。術(shù)語(yǔ)"間隔區(qū)序列"是指編碼位于翻譯起始序列和第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列的多核苷酉餅列。術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)密調(diào)控的啟動(dòng)子"或"緊密調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子"是指表現(xiàn)很少或沒(méi)有可操作連接的基因的基礎(chǔ)表達(dá)的啟動(dòng)子。嚴(yán)密調(diào)控或調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子在具體確定并受控的條件下活化表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄終止子"是指給RNA聚合酶提供信號(hào)來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的核g^/f列。轉(zhuǎn)錄終止子是公知的，包括但不限于，例如，lambaM)(taozero)轉(zhuǎn)錄終止子(SEQIDNO:17)、大腸桿菌miB/77和mxB272轉(zhuǎn)錄終止子、和強(qiáng)His操縱子終止子。在此使用的術(shù)語(yǔ)"翻譯起始增強(qiáng)子序列"或"翻譯起始序列"(TIS)是指可以決定基因翻譯起始的位點(diǎn)和效率的核酸序列(參見(jiàn)，例如，McCarthyetal.，1990,7>e"&Gw油'"，6:78-85)。"翻譯起始序列"也可以被稱(chēng)為翻譯起始區(qū)(TER)。術(shù)語(yǔ)"兩性離子的"或"偶極的"(dipolar)是指分子具有相反極性的帶電基團(tuán)。II.實(shí)施本發(fā)明的方法A.跨膜多肽跨膜多肽，例如CD20、MS4A4A、RAlc、GPR73等等，是疾病和紊亂例如癌癥的治療中治療劑的潛在靶點(diǎn)。CD20是非Hodgkins淋巴瘤的治療中重要的治療劑嵌合抗體rituximab(RITUXAN)的靶點(diǎn)。rituximab識(shí)別B細(xì)胞上表達(dá)的天然構(gòu)象的CD20。rituximab的結(jié)合取決于CD20的第三和第四跨膜螺旋區(qū)域之間的環(huán)形結(jié)構(gòu)，其在167和183位含有半胱氨酸殘基(參見(jiàn)附圖1)。在以跨膜多肽例如CD20為靶標(biāo)的治療劑的開(kāi)發(fā)中，一個(gè)嚴(yán)重的障礙是無(wú)法產(chǎn)生有用的、經(jīng)分離和純化的重組跨膜多肽或天然存在的跨膜多肽。例如，要可以用作免疫原或結(jié)合抗原，分離和純化的多肽應(yīng)當(dāng)具有足夠的"天然"構(gòu)象被結(jié)合配偶體識(shí)別。多肽保持足夠天然的構(gòu)象來(lái)被配體識(shí)別，所述配體的結(jié)合取決于該多肽天然構(gòu)象中呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)特征。本發(fā)明提供了包含用于在細(xì)菌宿主中生產(chǎn)跨膜多肽的新啟動(dòng)子的載體、在細(xì)菌宿主中生產(chǎn)跨膜多肽的方法、以及從細(xì)菌宿主分離跨膜多肽的方法。本發(fā)明的方法提供了高產(chǎn)率的、具有足夠"天然，，構(gòu)象以用作例如免疫原和結(jié)合抗原的跨膜多肽?？缒ざ嚯暮幸粋€(gè)或多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，可以具有l(wèi)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或24或更多個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，5爭(zhēng)膜多肽具有至少四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中，跨膜多肽具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，例如EG-VEGF受體、GPR73和RAlc受體。具有四個(gè)^爭(zhēng)膜結(jié)構(gòu)域的跨膜多肽包括，例如，MS4多肽家族的成員。在另一個(gè)實(shí)施方式中，跨膜多肽是CD20多肽或其變體。以下的描述使用CD20作為本發(fā)明中有用的跨膜多肽的一個(gè)實(shí)例。其他多肽也同樣可以用于此處描述的表達(dá)和溶解方法中，包括在以下實(shí)施例中公開(kāi)的以及其他未公開(kāi)的跨膜多肽。1.CD20CD20是一種約35kDa的磷蛋白，在超過(guò)90%的來(lái)自外周血或淋巴器官的的B細(xì)胞表面上均有發(fā)現(xiàn)。在文獻(xiàn)中CD20的其他名稱(chēng)包括"B淋巴細(xì)胞限制性抗原，，(B-lymphocyte-restrictedantigen)和"Bp35，，。例如，在Clarketal.,1985，尸roc.淑/jca""'.USA，82:1766-1770中描述了CD20。CD20在早期前B細(xì)胞發(fā)育期間表達(dá)，并保持直到漿細(xì)胞分化。B細(xì)胞活化引起CD20表達(dá)的進(jìn)一步增加(Valentineetal.,1987，A^/.」c^/.USA，84:8085-8097)。CD20不在漿細(xì)胞中表達(dá)。CD20存在于正常的以及惡性的B細(xì)月包上。本發(fā)明提供了分離的哺乳動(dòng)物CD20,其不含細(xì)胞和細(xì)胞膜，并保持了足夠的天然構(gòu)象以結(jié)合rituximab或其抗原結(jié)合片段。哺乳動(dòng)物CD20的實(shí)例包括但不限于，以下表2中SEQIDNO:1和3所示的人CD20和鼠CD20。編碼人類(lèi)CD20(NCBI登記號(hào)No.BC002807)和鼠CD20(NCBI登記號(hào)No.NM—007641)的參考核酸序列可見(jiàn)于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)www.ncbi.gov中。人CD20以多種磷酸化狀態(tài)存在于例如B細(xì)胞中，但是沒(méi)有已知的剪接變體。如圖1所圖示的，CD20是四次跨膜(tetra-spanningmembrane)多肽，兩個(gè)末端都在細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)。在第一和第二跨膜結(jié)構(gòu)域之間形成第一胞外環(huán)(環(huán)A)，在第三和第四跨膜結(jié)構(gòu)域之間形成第二胞外環(huán)(環(huán)B)。環(huán)B大于環(huán)A。環(huán)A從跨膜結(jié)構(gòu)域突出得不多。環(huán)B長(zhǎng)度約46個(gè)氨基酸，從跨膜結(jié)構(gòu)域突出較多。環(huán)B從大約Asnl40延伸到大約Serl85，在Cysl67和Cysl83之間含有二硫鍵。rituximab對(duì)CD20的結(jié)合依賴(lài)于環(huán)B。參見(jiàn)，例如，Polyak和Deans,2002,別ood99:3256-3262。本發(fā)明的CD20多肽可溶于非離子或兩性離子洗滌劑，并在洗滌劑中保持足夠的"天然"環(huán)B結(jié)構(gòu)，從而使得rituximab或抗原結(jié)合性rituximab片段可以結(jié)合所述多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離的CD20中保留了第三和第四跨膜結(jié)構(gòu)域之間形成的環(huán)。該環(huán)在Cys167和Cys183之間含有二硫鍵，并且包括，例如，CD20的殘基I164到Y(jié)184，如圖1所示。所述環(huán)形可以含有，例如，約40到約60個(gè)氨基酸，可以為約40到約50個(gè)氨基酸長(zhǎng)、約45到約50個(gè)氨基酸長(zhǎng)，或約46個(gè)氨基酸長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述環(huán)從Asnl40延伸到Serl85，并含有Cysl67和Cysl83之間的二硫鍵。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述環(huán)可以被rituximab或其抗原結(jié)合片段結(jié)合。2.變體跨膜多肽本發(fā)明還提供了跨膜多肽例如CD20的變體，其可以是天然存在的或重組的。變體包括，例如，在哺乳動(dòng)物參考序列中氨基酸殘基的缺失、插入或取代。變體跨膜多肽含有與哺乳動(dòng)物參考序列具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列。例如，CD20參考序列可以是鼠或人類(lèi)CD20序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，CD20參考序列是SEQIDNO:l的序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，CD20參考序列是SEQIDNO:3的序列。包括第三和第四跨膜結(jié)構(gòu)域以及這些結(jié)構(gòu)域之間形成的環(huán)(環(huán)B)的CD20片段可以是參考序列，例如包括殘基K116到N214。CD20參考序列包含，例如，環(huán)B殘基I164到Y(jié)184。CD20片段可以包括，例如，SEQIDNO:1的殘基X到Y(jié)，其中X是相應(yīng)于附圖1所示的人CD20序列的T104到1128序列的任何殘基，Y是序列V196到P297的任何殘基，其中在非還原條件下殘基C167和C183之間具有二硫鍵。例如，CD20片段可以包括圖1的殘基N140到S185，其中在非還原條件下殘基C167和C183之間具有二硫鍵?？缒ぷ凅w，例如CD20的變體，可以溶于非離子或兩性離子洗滌劑，例如DDPC,并在洗滌劑中保持足夠的"天然"環(huán)結(jié)構(gòu)，以結(jié)合已知的檢測(cè)抗體，如結(jié)合CD20變體的rituximab(例如，RITUXAN)或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，跨膜變體包括胞外域中的環(huán)，例如在CD20中，第三和第四跨膜結(jié)構(gòu)域之間形成的環(huán)。例如，環(huán)可以是約30到約100個(gè)氨基酸長(zhǎng)、約40到約60個(gè)氨基酸長(zhǎng)、約40到約50個(gè)氨基酸長(zhǎng)、約45到約50個(gè)氨基酸長(zhǎng)、或約46個(gè)氨基酸長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述環(huán)形含有二硫4建，例如，對(duì)于CD20,在相應(yīng)于SEQIDNO:1的Cysl67和Cysl83的殘基處的二硫鍵?？缒ぷ凅w多肽可以包括改善該多肽表達(dá)的氨基酸取代，例如在以上討i侖的全長(zhǎng)CD20或截?cái)嗤蛔凅w中的取代。例如，取代CD20的Cyslll和Cys220的一個(gè)或多個(gè)可改善人CD20的表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例1)。因而，一種有用的CD20變體包含這樣的氨基酸序列其在與SEQIDNO:1所示的人CD20氨基酸序列中Cyslll和Cys220對(duì)應(yīng)的殘基之一或二者處發(fā)生了取代。半胱氨酸殘基可以被非保守地取代以防止可能的二硫鍵連。在以下的實(shí)施例中，Cys被Ser取代。CD20的C2S-CD20(也稱(chēng)為"C2S")突變體(SEQIDNO:6)(參見(jiàn)表2)包含Cysl11Ser和Cys220Ser雙取代。CD20變體可以通過(guò)取代、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的任何已知方法來(lái)產(chǎn)生，例如通過(guò)突變編碼CD20的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，保持了足以維持抗體與環(huán)B結(jié)合的"天然"CD20結(jié)構(gòu)。氨基酸插入包括氨基和/或羧基末端融合(fusion)，其長(zhǎng)度為一個(gè)殘基到含有一百個(gè)或更多殘基的多肽不等，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)(intrasequence)插入。序列內(nèi)插入(即，CD20序列內(nèi)部的插入)可以是例如約l到IO個(gè)殘基、l到5個(gè)殘基、或1到3個(gè)殘基不等。例如，氨基酸序列缺失可以是1到30個(gè)殘基、或1到10個(gè)殘基不等，并且一般是連續(xù)的。通過(guò)將跨膜多肽(例如CD20)的序列與已知的同源蛋白質(zhì)分子(例如具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)和/或功能域的同源蛋白質(zhì)分子)的序列相比較，并且使高同源性(例如大于50。/。、55%或60%的氨基酸同一性)區(qū)域中發(fā)生的氨基酸改變的數(shù)目最小化，可以指導(dǎo)人們來(lái)確定要插入、取代或缺失而不會(huì)對(duì)抗體或抗體片段(例如針對(duì)CD20的rituximab)的結(jié)合造成不利影響的氨基酸殘基。例如，人CD20和鼠CD20有72。/。的氨基S吏序列同一性，在跨膜結(jié)構(gòu)域三和四(環(huán)B)之間的胞外環(huán)中有63%的同一性。使用參考序列例如人CD20(SEQIDNO:1)和鼠CD20(SEQIDNO:3)來(lái)比對(duì)和比較高和低同源性的同一性區(qū)域。在已知與^爭(zhēng)膜多肽(例如CD20)具有同源性的多肽中也可識(shí)別出功能域?？梢詫⒐δ苡虻男蛄信c其他已知序列，例如CD20或MS4A家族多肽的序列來(lái)比較和比對(duì)。CD20、IgE受體(3鏈和HTm4共同具有帶N-和C-末端結(jié)構(gòu)域的四次跨膜結(jié)構(gòu)。一種大約50個(gè)氨基酸的胞外環(huán)是MS4A基因家族內(nèi)的另一種共有基序。此外，這種結(jié)構(gòu)是不同的物種，例如人類(lèi)和小鼠之間共有的。這三個(gè)基因在人類(lèi)中定位于11ql2-ql3.1,在小鼠中定位于染色體19(Adra"a/.，1989，戶(hù)rac.Ato/.爿cao.USA，91:10178-10182;Huppetal.,l卿，J/畫(huà),/.,143:3787-3791;Tedderetal.，1988,/./w"謂。/.，141:4388-4394;Tedderetal.，1989，/mww"o/.,142:2555-2559)。這三個(gè)基因被認(rèn)為是/人共同的前體進(jìn)化而來(lái)的(Liangetal.，2001,同上)。氨基酸取代的候選位置被確定為這樣的位置其顯示高度氨基酸可變性，即在比對(duì)和比較不同的序列時(shí)該位置上可出現(xiàn)至少3種不同的氨基酸；或者其具有較低的序列同一性百分比，即低于90%的序列同一性。當(dāng)比對(duì)序列時(shí)，顯示可變性的位置可以有保守的或非保守的氨基酸取代?？梢杂靡?jiàn)于天然存在的蛋白質(zhì)中相同位置的同類(lèi)取代來(lái)對(duì)具有保守性氨基酸取代的位置進(jìn)行取代。這種取代的實(shí)例在表1中示出。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>多肽(例如CD20)的生物學(xué)性質(zhì)中的實(shí)質(zhì)性修飾是通過(guò)對(duì)多種取代進(jìn)行選擇而實(shí)現(xiàn)的，這些取代在維持(a)取代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層構(gòu)象、螺旋構(gòu)象或環(huán)構(gòu)象，(b)分子在目標(biāo)位點(diǎn)處的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積的效果上有顯著的不同。天然存在的殘基根據(jù)共同的側(cè)鏈性質(zhì)分為幾組(1)疏水性正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性親7jc性cys、ser、thr;(3)酸性asp、glu;(4)堿性asn、gln、his、lys、arg;(5)影響鏈取向的殘基gly、pro;和(6)芳香族trp、tyr、phe。非保守性取代涉及這些類(lèi)別之一的成員交換為另一類(lèi)別。也可以將這樣的取代殘基引入保守性取代位點(diǎn)或剩余的(非保守)位點(diǎn)中。跨膜多肽變體，例如CD20變體可以使用已知的重組方法來(lái)產(chǎn)生，例如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn))誘變、丙氨酸掃描、PCR誘變、定點(diǎn)誘變(Zolleretal.，1987,iVwc/.爿cz'Ai仏，10:6487-6500)、盒式誘變(cassettemutagenesis)(Wellsetal.，1985,GWe,34:315)、卩艮制選擇誘變(restrictionselectionmutagenesis)(Wellsetal.,1986,7hms.i.5bc.LondonSerA，317:415)等等。B.表達(dá)系統(tǒng)1.宿主細(xì)月包本發(fā)明提供了在宿主細(xì)胞中、特別是在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)跨膜多肽的方法。對(duì)于生產(chǎn)跨膜多肽有用的細(xì)菌宿主包括埃希氏菌屬(&c/zen'c/z/a)、腸桿菌屬(五"fera^c^0、芽孑包桿菌屬(5acz7/ws)、々支單月包菌屬(i^ewcfomcwas)、克雷伯氏菌屬(《feZwW/")、變形菌屬(尸ratew)、沙門(mén)氏菌屬(5Wwowe〃a)、沙雷氏菌屬(&rra^)、志賀氏菌屬(幼/ge/to),等等。適合的細(xì)菌宿主包括腸細(xì)菌O"tera6acten'o)，例如大腸4干菌(五sc/zen'c/z/aco//)、痢疾志賀氏菌(57z/ge〃ac()Asewtan'ae)、月申炎克雷4白氏菌(A7e6w'e〃a;wewmom'ae)等等。適合的大腸桿菌宿主包括菌抹W3110(ATCC登記號(hào)No.27,325)、294(ATCC登記號(hào)No.31,446)、B，X1776(ATCC登記號(hào)31,537)、58F3,等等。也可以采用任何上述細(xì)菌的突變細(xì)胞。來(lái)此例示的是宿主細(xì)胞大腸桿菌菌抹58F3(W3110-fhuAA(tonAA)phoAAE151onAgalErpoHts(htpRts)AclpPlaclqAompTA(nmpc-fepE)AslyD)。預(yù)期的是，可以類(lèi)似地使用和修飾載體、啟動(dòng)子等等，以允許在其他細(xì)菌宿主中高效生產(chǎn)跨膜蛋白質(zhì)例如CD20。當(dāng)選擇用于本發(fā)明的方法的細(xì)菌時(shí)，考慮復(fù)制子在該細(xì)菌中的可復(fù)制性。例如，當(dāng)4吏用公知的質(zhì)粒例如pBR322、pBR325、pACYC177、pKN410等等來(lái)提供復(fù)制子時(shí)，可以適宜地使用大腸桿菌、沙雷氏菌屬和沙門(mén)氏菌屬物種作為宿主。2.啟動(dòng)子為了在宿主細(xì)胞中，例如在細(xì)菌細(xì)胞中有效地和高效地產(chǎn)生復(fù)雜的跨膜多肽，對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行選擇以獲得低的基礎(chǔ)活性。由于跨膜多肽一般是對(duì)宿主細(xì)胞有毒的，即使是啟動(dòng)子的基礎(chǔ)活性所致的低表達(dá)都可能影響宿主細(xì)胞的健康，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)降低、蛋白質(zhì)產(chǎn)量減少、產(chǎn)率下降。理想的是使啟動(dòng)子僅"開(kāi)啟"較短的一段時(shí)間，而讓宿主細(xì)胞充分地生長(zhǎng)，^v而使蛋白質(zhì)的高產(chǎn)量和良好產(chǎn)率成為可能。因而，在本文中對(duì)啟動(dòng)子加以選4奪和/或工程化(engineer)以獲得最小的基礎(chǔ)活性。有兩個(gè)常用的啟動(dòng)子在例如細(xì)菌細(xì)胞中是強(qiáng)的而且據(jù)說(shuō)是嚴(yán)密調(diào)控的，它們基于天然的T7和lambdaPL啟動(dòng)子。pET載體(Novagen,Stratagene等)中的強(qiáng)T7啟動(dòng)子是商業(yè)上可獲得的，強(qiáng)T7啟動(dòng)子還用于染色體中整合有T7RNA聚合酶基因的菌抹中LambdaDE3溶源菌林)。T7RNA聚合酶處在lac啟動(dòng)子4喿縱基因的控制下，最終，用IPTG誘導(dǎo)與目標(biāo)基因可操作連接的T7啟動(dòng)子。這個(gè)系統(tǒng)本身是相當(dāng)容易滲漏的，有毒蛋白質(zhì)，例如多跨膜蛋白質(zhì)造成問(wèn)題，包括誘導(dǎo)之前生長(zhǎng)缺乏。為了加緊控制并降低基礎(chǔ)水平表達(dá)，可以在同一細(xì)胞中不同的相容性質(zhì)粒上(Novagen的pLysS和pLysE)共表達(dá)T7RNA聚合酶的阻抑物T7溶菌酶。所得的表達(dá)系統(tǒng)(pET/DE3菌抹/pLys)在添加IPTG時(shí)仍被誘導(dǎo)，從而高水平的T7RNA聚合酶壓倒水平的T7溶菌酶阻抑物的作用，開(kāi)啟T7啟動(dòng)子。lambdaPL啟動(dòng)子是另一種強(qiáng)啟動(dòng)子，其使用得少些。它可以在商業(yè)性載體pLEX(Invitrogen)上獲得。與目標(biāo)基因可操作連接的PL啟動(dòng)子位于pLEX質(zhì)粒中，控制PL啟動(dòng)子的cl阻抑物整合到菌抹染色體中。cl阻抑物處在trp啟動(dòng)子/操縱基因的控制之下。已知的可誘導(dǎo)細(xì)菌啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明的方法中，只要該啟動(dòng)子具有低的基礎(chǔ)活性，或被工程化而降低了基礎(chǔ)活性，如在此描述的。一些實(shí)例包括P-內(nèi)酰胺酶、乳糖和色氨酸啟動(dòng)子。適用于特定的宿主細(xì)胞系統(tǒng)的其他啟動(dòng)子一般是已知且可獲得的，并且可工程化而降低基礎(chǔ)活性，如在此描述的。3.調(diào)控元件p/zd啟動(dòng)子是大腸桿菌中受?chē)?yán)密調(diào)控并具有低基礎(chǔ)活性的啟動(dòng)子?！獑?dòng)子通過(guò)結(jié)合活化劑j9/zoB的p/zo盒而受到正調(diào)節(jié)(參見(jiàn)表5)。啟動(dòng)子活性被培養(yǎng)基中磷酸鹽/酉旨的耗盡(例如通過(guò)在限制磷酸鹽/酯培養(yǎng)基中稀釋)所開(kāi)啟。盡管p/wj啟動(dòng)子有這樣的控制機(jī)制，它確實(shí)還是表現(xiàn)一定的基礎(chǔ)活性。經(jīng)過(guò)選^^和工程化，啟動(dòng)子可以含有一個(gè)或多個(gè)負(fù)調(diào)控元件和一個(gè)或多個(gè)正i周4空元4牛。參見(jiàn)，侈'H口，在Neidhardt纟扁，1996,Eyc/7en、/2/aco//cwd5b/mo"e〃a,第二版，ASMPress,WashingtonD.C.中記載的正和負(fù)調(diào)控元件。同時(shí)具有正和負(fù)調(diào)控元件的啟動(dòng)子是很少出現(xiàn)的。一個(gè)實(shí)例是metE啟動(dòng)子。參見(jiàn),例^口,Neidhardt編，1996,Esc/^ni/n-aco/z.iSa/mo"e〃a,第二片反，第1300-1309頁(yè)。已知的正和負(fù)調(diào)控元件的+兌明可以在例如這個(gè)參考文獻(xiàn)中找到。在某些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子具有至少一個(gè)正調(diào)控元件和至少一個(gè)負(fù)調(diào)控元件，便于對(duì)基礎(chǔ)表達(dá)進(jìn)行直接控制。將正或負(fù)調(diào)控元件置于啟動(dòng)子內(nèi)或鄰近啟動(dòng)子的位置來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)啟動(dòng)子的進(jìn)一步調(diào)節(jié)是已知的，例如，在五sc/2els/n.aco//am/Sa/mo"e〃a(同上)第1232-1245頁(yè)中有描述。負(fù)調(diào)控元件包括，例如，/ac阻抑物〃ac操縱基因、大腸桿菌trp阻抑物/trp操縱基因、lambda阻抑物/操縱基因，等等。正調(diào)控元件包括，例如，結(jié)合p/w5的p/7a4啟動(dòng)子的pho盒和變體，麥芽糖操縱子啟動(dòng)子的MalTDNA結(jié)合位點(diǎn)、阿拉伯糖操縱子啟動(dòng)子的AraCDNA結(jié)合位點(diǎn)，等等。例如，具有pho盒作為正調(diào)控元件的phoA啟動(dòng)子可以接受工程化而包含異源負(fù)調(diào)控元件，例如/ac操縱基因。lac操縱基因被IPTG的添加所誘導(dǎo)。常用的兩個(gè)啟動(dòng)子正調(diào)控元件是PhoB/p/zo盒和AraC/ara/DNA結(jié)合位點(diǎn)。它們和許多其他的正和負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列在例如Neidhardt，同上中都有描述。常用的負(fù)調(diào)控元件包括〗ac阻抑物/lac操縱基因、trp阻抑物/trp操縱基因和lambda阻抑物/lambda操縱基因。4.轉(zhuǎn)錄終止子為了避免來(lái)自不同啟動(dòng)子系統(tǒng)的通讀，可以放置一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子，使轉(zhuǎn)錄通讀到達(dá)與要表達(dá)的核酸序列可操作連接的啟動(dòng)子之前停止。例如，可以把Lambda轉(zhuǎn)錄終止子序歹llAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATT(SEQIDNO:17)插入p/zoyl啟動(dòng)子的上游。其他轉(zhuǎn)錄終止子序列是已知的，例如His操縱基因，并且可以使用。插入的調(diào)控元件的位置使得它們與其他啟動(dòng)子元件可操作連接，以供^爭(zhēng)膜多肽的受控表達(dá)。用引起快速和緊密受控的"打開(kāi)，，并且不損害宿主細(xì)胞的作用劑來(lái)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，也是啟動(dòng)子系統(tǒng)理想的特性。p/7a4啟動(dòng)子為大腸桿菌和相關(guān)細(xì)菌中的表達(dá)提供了緊密的表達(dá)控制。如以下的實(shí)施例中所示，當(dāng)進(jìn)行突變而添加了負(fù)調(diào)控元件如/ac操縱基因和上游Lambda轉(zhuǎn)錄終止子時(shí)，啟動(dòng)子的基礎(chǔ)表達(dá)基本上被消除了。有用的p/zo4啟動(dòng)子包括天然p/wJ啟動(dòng)子(SEQIDNO:5)和含有一個(gè)或多個(gè)負(fù)調(diào)控元件的突變-oA例如在突變的啟動(dòng)子p/wc(SEQIDNO:15)中，和/或一個(gè)或多個(gè)上游轉(zhuǎn)錄終止子，例如在突變啟動(dòng)子ifp/7ac(SEQIDNO:16)中。經(jīng)過(guò)工程化而降低了基礎(chǔ)啟動(dòng)子活性的突變啟動(dòng)子是可以使用的。在除大腸桿菌以外的細(xì)菌宿主中，用功能等同的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子替換—"啟動(dòng)子可能是有用的其中所述啟動(dòng)子以低基礎(chǔ)活性為目的經(jīng)過(guò)了選擇或工程化，并且已知與所選用的細(xì)菌宿主相容。合適的啟動(dòng)子包括但不限于，(3-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸啟動(dòng)子系統(tǒng)，或雜合啟動(dòng)子，例如toc或^C啟動(dòng)子，其可以被突變而降低基礎(chǔ)啟動(dòng)子活性。對(duì)所選啟動(dòng)子也可以加以突變而使其同時(shí)含有正和負(fù)調(diào)節(jié)元件。例如，對(duì)于天然受負(fù)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，可以這樣進(jìn)行工程化來(lái)添加正調(diào)節(jié)用-非35共有序列替換-35盒序列，然后添加正調(diào)節(jié)序列元件例如pho盒。用已知相容于所選細(xì)菌宿主的稀有密碼子tRNA基因來(lái)替換可選的稀有密碼子tRNA基因可能是有用的做法。5.載體對(duì)于表達(dá)跨膜多肽有用的載體一般含有與編碼跨膜多肽的多核苷酸可操作連接的嚴(yán)密調(diào)控啟動(dòng)子。例如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410等質(zhì)?？梢杂米鬏d體的骨架。在一個(gè)實(shí)施方式中，質(zhì)粒pBR322形成骨架。表達(dá)跨膜多肽的載體一般包括強(qiáng)啟動(dòng)子、負(fù)和正調(diào)控元件、轉(zhuǎn)錄終止子、和用于嚴(yán)密調(diào)控和高效表達(dá)和翻譯的其他元件。載體可以包括一段短序列，其編碼正好位于編碼的多肽的第一密碼子之前的氨基酸前導(dǎo)區(qū)的。前導(dǎo)序列幫助適當(dāng)?shù)姆g起始，一般含有約6到12個(gè)氨基酸，并可含有，例如，6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸，盡管它可以含有更多。一個(gè)例子是序列MKHQHQQ(SEQIDNO:7)，其由例如核酸序列(ATG)AAACACCAACACCAACAA(SEQIDNO:28)編碼，如圖21所示。更長(zhǎng)的前導(dǎo)序列，例如30-50或更多氨基酸，對(duì)于幫助跨膜多肽的翻譯延伸是有用的。參見(jiàn)，例如，圖22所示的frpLE前導(dǎo)區(qū)LE和sLE，其含有翻譯起始序列(TIS)和間隔區(qū)序列來(lái)幫助翻譯延伸。載體也可以包括宿主細(xì)胞的稀有密碼子tRNA基因。大腸桿菌的稀有密碼子tRNA基因的實(shí)例包括但不限于awt/、g/少r和pra2。6.前導(dǎo)序列在表達(dá)跨膜多肽的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，前導(dǎo)序列含有強(qiáng)翻譯起始序列(TIS)和位于TIS和第一跨膜片段(TM-1)之間的間隔區(qū)序列。對(duì)大腸桿菌中表達(dá)多跨膜多肽有用的一個(gè)前導(dǎo)區(qū)含有trpLE前導(dǎo)區(qū)的部分。參見(jiàn)，例如，以下實(shí)施例中公開(kāi)的編碼大腸桿菌trpE蛋白質(zhì)的N-末端區(qū)域的一部分的LE和sLE前導(dǎo)區(qū)。7.翻i奪起始序列可使用已知的翻譯起始序列來(lái)增強(qiáng)基因翻譯的起始效率。翻譯起始增強(qiáng)子序列可以延伸至包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)5'和3'方向的序列。核糖體結(jié)合位點(diǎn)限定為至少包括Shine-Dalgamo區(qū)域和起始密碼子，以及二者之間的任何堿基。此外，翻譯起始增強(qiáng)子序列可以包括非翻譯前導(dǎo)區(qū)或上游順?lè)醋拥哪┪?，因此也可包括翻譯終止密碼子。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利No.5,840,523。獲得高水平的翻譯起始速率有許多途徑，包括使用在宿主細(xì)胞中高度表達(dá)的蛋白質(zhì)的前6-12個(gè)左右的密碼子。例如，在大腸桿菌中，編碼序列的開(kāi)始處具有良好的翻譯起始區(qū)域的幾個(gè)蛋白質(zhì)前導(dǎo)區(qū)包括(3-半乳糖苷酶(Rutheretal.,1983,五細(xì)OJ，2:1791-1794))、蛋白A(Nilssonetal.1990,A/ef/w^五"z少mo/.,185:144-161)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Smithetal.,1988，Ge"e，67:31-40),等等。另一個(gè)實(shí)例是序列MGSSHHHHHH(SEQIDNO:33),其由例如核酸序歹寸ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCAT(SEQIDNO:34)編碼。這樣的前導(dǎo)區(qū)的一般性綜述還可參見(jiàn):Lavallieetal.,1995，CWrew/B/o/ogy，6:501-506。作為選才奪，可以按照例如19卯，yWef/zoc^/"E"zymo/，185:89-119中所描述那樣i殳計(jì)強(qiáng)TIS。還可以按照例如Yansuraetal.,1992，tW^/zoA.v!ccwpam'ontoil/eAot^￡>72ymo/cgy,4:151-158中所描述的那樣選4奪強(qiáng)TIS。"強(qiáng)翻譯起始序列"一般是編碼約6到約12個(gè)氨基酸(例如，6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸)的密碼子的序列。所述序列可以是天然的或工程化的，并可能實(shí)現(xiàn)高的翻i奪起始速率。在一個(gè)實(shí)施方式中，強(qiáng)翻i奪起始序列含有/rp前導(dǎo)區(qū)的前九個(gè)氨基酸(M)KAIFVLKGS(SEQIDNO:27)，其由核酸序列ATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAAGGTTCA(SEQIDNO:35)編碼。其他的包括編碼p-半乳糖苷酶的前6到12個(gè)氨基酸的核苷酸序列。8.間隔區(qū)序列將TIS與翻譯的蛋白質(zhì)的TM-1分隔開(kāi)來(lái)的間隔區(qū)序列對(duì)于幫助跨膜多肽的翻譯延伸是有用的。有用的間隔區(qū)序列含有最少的延伸障礙，例如最少的稀有氨基酸；難以結(jié)合核糖體；并且通常是非結(jié)構(gòu)化的，例如不折疊，以在必要時(shí)容許跨膜轉(zhuǎn)位；因而它為快速的翻譯延伸提供了可能。有假說(shuō)認(rèn)為，"間隔區(qū)序列"起緩沖空間的作用，使得翻譯可在第一跨膜片段處減慢而不損失TIS處的核糖體載量，且延伸繼續(xù)進(jìn)行。間隔區(qū)必須足夠長(zhǎng)以有效地分隔TIS和TM-l,而又不能過(guò)長(zhǎng)以致容許翻譯的多肽的折疊。間隔區(qū)序列為有效和快速的翻譯延伸提供了可能，而不妨礙蛋白質(zhì)的正常膜插入。所述間隔區(qū)序列可以包含，例如，50個(gè)或更多個(gè)氨基酸的序列，例如60個(gè)或更多、70個(gè)或更多、80個(gè)或更多氨基酸，優(yōu)選少于120個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，"間隔區(qū)序列"是親水性的，并可以含有約20%到約50%的帶電氨基酸，例如約30%到約40%的帶電氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，間隔區(qū)序列包含至少一部分細(xì)菌基因，并且可以來(lái)自宿主細(xì)胞中天然存在的序列，例如用于在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)多肽的大腸桿菌//p操縱子的E基因。如下面實(shí)施例中描述的，LE和sLE前導(dǎo)區(qū)含有trpE基因的一部分。9.表達(dá)標(biāo)簽一般地，表達(dá)標(biāo)簽可以是載體的組分，或可以是插入到載體中的多肽DNA的一部分。表達(dá)標(biāo)簽用來(lái)鑒定和分離表達(dá)的蛋白質(zhì)。實(shí)例包括，但不限于，聚-His標(biāo)簽(美國(guó)專(zhuān)利No.4,569,794)、HisGln標(biāo)簽、生物素、抗生物素蛋白，等等。這些標(biāo)簽是公知且商業(yè)上可獲得的(參見(jiàn)，例如，Qiagen，Valencia,CA)。聚-His標(biāo)簽含有多個(gè)組氨酸殘基，一般為6-10個(gè)組氨酸殘基。帶His標(biāo)簽的多肽可以通過(guò)將樣品施加到與抗His標(biāo)簽抗體偶if關(guān)的柱或鎳柱上來(lái)檢測(cè)。圖8、21和22圖示了示范性的表達(dá)構(gòu)建體，它們含有在本發(fā)明的方法中對(duì)表達(dá)跨膜多肽有用的序列。例如，在圖8中顯示下列可搡作連接的序列啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、跨膜蛋白質(zhì)基因、表達(dá)標(biāo)簽、轉(zhuǎn)錄終止子(lambdato)和tRNA基因，以下的實(shí)施例演示了使用這些表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行CD20、RAlc、GPR73和MS4A4A的表達(dá)。C.跨膜多肽在細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)的跨膜多肽以天然構(gòu)象與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合。通過(guò)例如密度梯度離心或其他已知的方法，可以確定跨膜多肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的定位。在已知的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌宿主。除了碳、氮和無(wú)機(jī)磷酸鹽源之夕卜，還包含合適濃度的任何培養(yǎng)基補(bǔ)充物，這些補(bǔ)充物單獨(dú)地引入，或作為與另一種補(bǔ)充物或培養(yǎng)基(例如復(fù)合氮源)的混合物來(lái)引入。在適合的溫度下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。例如，大腸桿菌可以在約20。C到約39°C，例如25。C到37。C，或約3(TC生長(zhǎng)。培養(yǎng)基的pH值可以是約5-9的任何pH值，取決于宿主生物體。大腸桿菌的培養(yǎng)基可以具有約6.8到約7.4,例如約7.0的pH值。編碼跨膜多肽的多核苷酸可以通過(guò)已知的重組方法制備。這些方法包括，但不限于，從天然來(lái)源分離、PCR、寡核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn)的)誘變、丙氨酸掃描、PCR誘變、定點(diǎn)誘變(Zolleretal.，1987，jc/^y版，10:6487-6500)、盒式誘變(Wellsetal.，1985,G匿，34:315)、限制選擇誘變(Wellsetal.,1986，尸/n7oy.Tra肌i.5bc.丄o"^w,317:415)等等。編碼跨膜多肽的多核苷酸可以直接表達(dá)，或作為與另一個(gè)多肽的融合物表達(dá)，或作為成熟多肽C-末端有特異性裂解位點(diǎn)的多肽表達(dá)。本發(fā)明的方法利用標(biāo)準(zhǔn)的重組方法來(lái)生產(chǎn)跨膜多肽。將編碼跨膜多肽的異源多核苷酸(例如，cDNA或基因組DNA)插入到用于細(xì)菌中表達(dá)的可復(fù)制載體中?？捎糜诖四康牡妮d體有很多，且合適載體的選擇主要取決于要插入載體的核酸的大小和要用載體轉(zhuǎn)化的特定宿主細(xì)胞。取決于載體的功能(DNA的擴(kuò)增或DNA的表達(dá))以及與之相容的特定宿主細(xì)胞，每種載體含有多種組件。用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的載體組件一般包括，但不限于，下列的一項(xiàng)或多項(xiàng)復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)記基因，和可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。本文中描述了適合的載體的實(shí)例。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，載體含有與編碼跨膜多肽的基因可操作連接，受高度調(diào)控的啟動(dòng)子。在此描述了適合的啟動(dòng)子的實(shí)例，包括p/zo4、p/wc和/;/7ac啟動(dòng)子，和其他這樣的處于嚴(yán)密調(diào)控之下，例如正和負(fù)調(diào)控元件嚴(yán)密調(diào)控之下的啟動(dòng)子。如在此描述的，載體也可以含有強(qiáng)翻譯起始序列和間隔區(qū)序列來(lái)增強(qiáng)多跨膜多肽的延伸。一般使用這樣的質(zhì)粒載體，其含有來(lái)自與細(xì)菌宿主細(xì)胞相容的物種的復(fù)制子和控制序列。載體通常帶有復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如，一般使用來(lái)自大腸桿菌物種的質(zhì)粒pBR322來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(參見(jiàn)，例如Bolivaretal.,1977,Ge"e，2:95)。質(zhì)粒pBR322含有氨千青霉素和四環(huán)素抗性的基因，因而提供了鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡(jiǎn)易手段。pBR322質(zhì)粒或其他微生物質(zhì)?；蚴删w還通常含有，或經(jīng)過(guò)修飾而含有可供微生物體用于選擇標(biāo)記基因表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體和克隆載體都包含使載體能夠在一種或多種所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。一般地，在克隆載體中，這種序列是使得載體能夠獨(dú)立于宿主染色體DNA復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點(diǎn)和自主復(fù)制序列。對(duì)于多種細(xì)菌，此類(lèi)序列是公知的。來(lái)自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌。表達(dá)載體和克隆載體一般也含有選擇基因，也稱(chēng)為選^4示記。這種基因編碼在選擇性培養(yǎng)基中培育的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞存活和生長(zhǎng)所必需的蛋白質(zhì)。沒(méi)有被含選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞將不能在培養(yǎng)基中存活。典型的選擇基因所編碼的蛋白質(zhì)(a)給予對(duì)抗生素或其他毒素例如氨千青霉素、新霉素、氨曱蝶呤、或四環(huán)素的抗性，(b)補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)缺陷，或(c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中得不到的關(guān)鍵性營(yíng)養(yǎng)物，例如，芽孢桿菌屬某些種編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個(gè)實(shí)例利用藥物來(lái)延滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。被異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞產(chǎn)生賦予抗藥性的蛋白質(zhì)，因而經(jīng)歷了選擇程序后仍存活下來(lái)。啟動(dòng)子可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)誘導(dǎo)。參見(jiàn)，例如，Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)。一般地，培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞直到達(dá)到一定光密度，此時(shí)根據(jù)所選啟動(dòng)子的要求通過(guò)添加誘導(dǎo)物、耗盡培養(yǎng)基成分或二者兼用來(lái)啟動(dòng)誘導(dǎo)。p/z"啟動(dòng)子被磷酸鹽/酯的耗盡所誘導(dǎo)，像例如Changetal.，1987,Gewe，55:189-196;Simmonsetal.，2002，//薩圃/.MefWs,263:133-147;和/或美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,304,472和5,342,763中所述的那樣。當(dāng)啟動(dòng)子既含正負(fù)調(diào)控元件又含負(fù)調(diào)控元件，例如，突變啟動(dòng)子p/zac和中所含的p/zo盒和/ac操縱基因時(shí)，最好通過(guò)這兩種調(diào)控元件協(xié)調(diào)啟動(dòng)子的誘導(dǎo)。例如，可以將通過(guò)添加IPTG除去/ac操縱基因處的負(fù)調(diào)控元件的誘導(dǎo)，與培養(yǎng)基磷酸鹽/S旨耗盡時(shí)的低點(diǎn)相協(xié)調(diào)，使得兩種調(diào)控元件同時(shí)或盡可能在時(shí)間上接近地"打開(kāi)"啟動(dòng)子活性，通常對(duì)啟動(dòng)子指導(dǎo)下表達(dá)的持續(xù)時(shí)間加以限制以維持表達(dá)細(xì)胞的健康，例如，少于3小時(shí)、少于2小時(shí)，或1到2小時(shí)的范圍內(nèi)的一定時(shí)間。表達(dá)持續(xù)時(shí)間可以隨宿主細(xì)胞和所表達(dá)的特定多肽而改變。裂解細(xì)胞，分離可溶和不溶的級(jí)分，并從不溶的膜級(jí)分提取跨膜多肽。以下討論了示范性的溶解方法。樣品中的基因表達(dá)可以間接地測(cè)量，例如，通過(guò)常規(guī)northern印跡定量mRNA的轉(zhuǎn)錄(Thomas,1980,Prac.A^f/.爿c^/.Sd.USA，11:5201-5205)?？梢圆捎酶鞣N標(biāo)記，最常用的是放射性同位素，特別是32P。也可以采用其他技術(shù)，例如生物素標(biāo)記。引入多核苷酸中的生物素修飾核苷酸可以充當(dāng)與抗生物素蛋白或抗體結(jié)合的位點(diǎn)，其中所述抗生物素蛋白或抗體可以用很多種標(biāo)記，例如放射性核苷酸、焚光劑(fluorescers)、酶等等來(lái)標(biāo)記?；虮磉_(dá)也可以通過(guò)分析表達(dá)的多肽，例如使用Western印跡，來(lái)直接測(cè)量。D.跨膜多肽的分離和純化跨膜多肽可以通過(guò)本文描述的方法從宿主細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞分離，不含細(xì)胞或細(xì)胞的膜，可溶于洗滌劑中，且保持足夠的"天然"構(gòu)象使得所述多肽可以被識(shí)別為免疫原或被配體結(jié)合。分離的多肽保持了足夠的"天然"構(gòu)象以結(jié)合這樣的配體該配體的結(jié)合依賴(lài)于所述多肽的天然構(gòu)象中呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)特征。例如，rituximab對(duì)CD20的結(jié)合依賴(lài)于CD20天然構(gòu)象中胞外環(huán)B(例如，當(dāng)CD20表達(dá)在細(xì)胞膜上時(shí))。如本文所述溶于非離子或兩性離子洗滌劑的CD20在洗滌劑中含有足夠的"天然，，環(huán)B結(jié)構(gòu)，以結(jié)合rituximab或其抗原結(jié)合片段，例如Fab片段。1.宿主細(xì)胞的破碎可以通過(guò)各種物理或化學(xué)方法破碎攜帶表達(dá)的跨膜多肽的宿主細(xì)胞，包括但不限于凍融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎、細(xì)胞裂解劑，等等。可以使用適合的洗滌劑或通過(guò)酶切割來(lái)從細(xì)胞或細(xì)胞膜釋放跨膜多肽?？梢酝ㄟ^(guò)洗滌劑溶解來(lái)從破碎的細(xì)胞回收跨膜多肽。2.溫和的非變性洗滌劑溶解膜蛋白的常用方法是^f吏用溫和的非變性洗滌劑，例如十二烷基麥芽糖苦(Dodecyl-maltoside)、正十二烷基-N,N，-二曱胺-N-氧化物(n-Dodecyl陽(yáng)N,N-Dimethylamine-N-Oxide),正十二烷基磷酸膽石成(FOS-Choline-12)和tritonX-IOO。這種方法的一種變化是使用由洗滌劑和脂質(zhì)組成的混合的膠束(一般以10:1的比例)。這種方法近來(lái)被用于Kvl.2鉀通道的分離和結(jié)晶。(Longetal.，2005，Sc/e臟309(5736):897-903和Longetal.，2005，&&臟309(5736):903-8)。強(qiáng)變性洗滌劑，例如SDS，雖然不是優(yōu)選的，可以用它來(lái)溶解和變性多肽。然后一般在生化研究之前將該蛋白質(zhì)復(fù)原(re-constitute)到更溫和的洗滌劑、或脂質(zhì)體或其他非洗滌劑環(huán)境中。然而，蛋白質(zhì)暴露于變性洗滌劑之后恢復(fù)正常功能可能是困難的。3.非離子型和兩性離子型洗滌劑在一個(gè)實(shí)施方式中，將跨膜多肽溶解于非離子型或兩性離子型洗滌劑中。可用于溶解復(fù)雜的跨膜多肽例如CD20的非離子型洗滌劑的實(shí)例包括但不限于TRITON⑧和十二烷基麥芽糖苷。可用于溶解復(fù)雜的跨膜蛋白質(zhì)例如CD20的兩性離子型洗滌劑的實(shí)例包括^旦不限于zwittergents,例如zwittergent3-08、3-10、3-12、3-16(CalBioChem)、ASB-14、ASB-16、ASB-C80(Anatrace)、PMAL-B100和磷酸膽堿(phosphochoine)4汙生物，例如十二烷基磷酸膽堿(DDPC)，等等。磷酸膽堿洗滌劑含有膽堿，其中帶正電荷的季胺與離子型且極性的磷酸結(jié)合。衍生物含有附著于磷酸的非極性烴鏈，例如DDPC的十二烷基。有用的磷酸膽堿衍生物包括例如溶血磷脂DDM、DM、LADO、DDPC、DHPC、LOPC、LMPC、DLPC、LLPG(可從AvantiPolarLipids(Alabaster,AL)禾口/或AnatraceInc.(Maumee，OH)獲得)，和正姿基-N，N畫(huà)二曱胺-N-fU匕物(n-decyl-N，N陽(yáng)dimethylamine-N-oxide)。4.離子型或變性洗滌劑用離子型或變性洗滌劑提取可能不會(huì)產(chǎn)生保持足夠的有用"天然"構(gòu)象的分離跨膜多肽。將所述分離多肽重懸在非離子型或兩性離子型洗滌劑中，該多肽即可以重構(gòu)(resh叩e)并產(chǎn)生呈有用的"天然"構(gòu)象的跨膜多肽。例如，可以使用離子型去污劑從細(xì)胞膜提取跨膜多肽。為了能用于例如免疫測(cè)定中，可以用非離子或兩性離子洗滌劑替換離子型洗滌劑。5.小規(guī)模純化溶解和純化的方法可根據(jù)提取和純化的規(guī)模而不同。對(duì)于小規(guī)模提取和純化，例如多至約1g纟田月包，可以將離心沉淀的細(xì)胞(cellpellet)在洗滌劑中溫育并回收可溶和不溶于洗滌劑的級(jí)分，而不用進(jìn)一步的純化步4聚。6.大規(guī)模純化對(duì)于大規(guī)模提取和純化，例如約100g或更多細(xì)胞的提取和純化，可以將細(xì)胞與洗滌劑混合并離心。所得上清液可以使用已知的方法純化，包括但不限于離子交換柱上分級(jí)；親和層析，例如抗His-標(biāo)簽或抗CD20抗體；乙醇沉淀；反相HPLC;在硅石(silica)或在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂例如DEAE上層析；層析聚焦；SDS-PAGE;石危酸銨沉淀；凝膠過(guò)濾，例如使用SephadexG-75;ProteinASepharose柱來(lái)除去雜質(zhì)例如IgG;金屬螯合柱來(lái)結(jié)合附加表位形式的所述多肽，疏水性親和樹(shù)脂、使用固定在基質(zhì)上的合適配體的配體親和，蔗糖密度梯度離心，等等。各種蛋白質(zhì)純化方法是已知的并且可以采用。參見(jiàn)1"列長(zhǎng)口Deutscher，1990，■MeAcxis￡>zz_ymo/cgy，182;Scopes,1982，于《/Vofez'"尸w7yca/7'ow.'尸n'w")/es1"wd尸ra"/ce》中，Springer-Verlag,NewYork;Ausubeletal.編，1998,于《CW簡(jiǎn)fPratoco/""Mj/ecw/ar飾/ogy》中，JohnWiley&Sons。7.His-標(biāo)簽在一個(gè)實(shí)施方式中，所述跨膜多肽是帶His標(biāo)簽的?？梢允谷芙獾南礈靹┘?jí)分通過(guò)金屬螯合柱例如金屬螯合Ni-NTA柱，或含有固定化的抗His抗體的柱子，來(lái)實(shí)現(xiàn)帶His標(biāo)簽的多肽的純化。在捕獲之后，使用合適的緩沖液洗脫帶His標(biāo)簽的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，緩沖液含有0.1%正十二烷基-(3-D-麥芽糖芬、150mMNaCl和20mM檸檬酸鈉，pH3.5。8.親和純4匕在另一個(gè)實(shí)施方式中，使溶解的洗滌劑級(jí)分通過(guò)固定有結(jié)合i爭(zhēng)膜多肽"天然"結(jié)構(gòu)的配體的柱子，從而從該級(jí)分中親和純化出該跨膜多肽。例如，可以使用rituximab從洗滌劑中純化CD20。含有跨膜多肽的洗脫級(jí)分可以通過(guò)凝膠過(guò)濾、親和純化等等來(lái)進(jìn)一步濃縮和純化。蛋白質(zhì)濃度可以通過(guò)各種/>么口的方法測(cè)定，例如BCA測(cè)定(Smithetal.，1985,加/.腸c/7亂,150:76-85)。9.非洗滌劑操作一旦純化了蛋白質(zhì)，如果希望的話(huà)可以在非洗滌劑環(huán)境中搡作它們。最常用的非洗滌劑環(huán)境是脂質(zhì)體，其比洗滌劑膠束更近似地模擬了天然的細(xì)胞環(huán)境。脂質(zhì)體主要由長(zhǎng)鏈脂質(zhì)組成。參見(jiàn)，例如，Rigaudetal.,1995,B/oc/z/m爿cta.1231(3):223-46禾口Ollivonetal.,2000,5z.oc/z/w^zbp/zjj^1508(1-2):34-50。Bicelles是脂質(zhì)體的變體，其主要是由成雙分子層脂質(zhì)與短鏈脂質(zhì)混合而形成的。參見(jiàn)，例如，CzerskiandSanders,2000,肌oc/zem.284(2):327-33。E使用分離的蛋白的方法1.親和力成熟/抗體選擇可以使用如本文所述表達(dá)、分離和/或純化的，具有有用的"天然"構(gòu)象的跨膜多肽作為目標(biāo)抗原，用于使用噬菌體展示來(lái)選擇抗體可變區(qū)，及用于抗體的親和力成熟?？贵w可變區(qū)噬菌體展示方法以及選擇抗原的特異性結(jié)合物的方法是已知的。"親和力成熟的"(affinitymatured)抗體在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)中含有一個(gè)或多個(gè)改變，導(dǎo)致與不具有所述改變的親本抗體相比，該抗體對(duì)抗原的親和性改善。親和力成熟的抗體對(duì)于目標(biāo)抗原可具有納摩爾乃至皮摩爾的親和力。噬菌體展示是將變體多肽作為與外殼蛋白的至少一部分所成的融合蛋白展示在噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上的技術(shù)。噬菌體展示的用處之一在于可以快速高效地從大型隨機(jī)蛋白變體文庫(kù)中分選高親和力結(jié)合目標(biāo)抗原的那些序列。人們已經(jīng)使用肽和蛋白質(zhì)庫(kù)在噬菌體上的展示來(lái)從數(shù)百萬(wàn)個(gè)多肽中篩選具有特定結(jié)合性質(zhì)的多肽。已經(jīng)使用多價(jià)噬菌體展示方法，通過(guò)與絲狀p藍(lán)菌體的基因III或基因VIII融合來(lái)展示小的隨機(jī)肽和小的蛋白質(zhì)。WellsandLowman，Cwr.S/ra".所o/.，3:355-362(1992)，和本文引用的參考文獻(xiàn)。在單價(jià)噬菌體顯示中，將蛋白質(zhì)或肽文庫(kù)與基因m或其部分融合，并在野生型基因ni蛋白質(zhì)存在下低水平表達(dá)，使得噬菌體顆粒展示一個(gè)拷貝的融合蛋白或不展示融合蛋白。相對(duì)于多價(jià)噬菌體親和作用得以降低，從而分選是基于本身的配體親和性；并且使用噬菌粒載體，筒化了DNA4喿"f乍。LowmanandWells，Methods:Jcow/aw/owfoAfe^70(is五"zymo/ogy,3:205-0216(1991).抗體可變區(qū)的噬菌體顯示的示范性方法可以在美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)No.2005-0119455-Al中找到，通過(guò)引用將其并入本文。Marksetal.，1992,歷o/Tec/2"o/ogy,10:779-783,描述了通過(guò)VH和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力成熟。由Barbasetal.,1994，尸rac.^cadSW.USA,91:3809-3813;Scieretal.,1995,Gwe,169:147-155;Yeltonetal,1995，//mm歸/.,155:1994-2004;Jacksonetal.，1995，/mm畫(huà)/.，154:3310-3319;和Hawkinsetal.，1992,J.M/.腸/.，226:889-896描述了CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變。'M吏用p盆菌體顯示的親和力成熟"(Affinitymaturationusingphagedisplay,AMPD)是指Lowmanetal.，1991,所oc/z函勿30(45):10832-10838中描述的一種方法。還參見(jiàn)Hawkinsetal.,1992，/Mo/.5/o/,226，889-896和美國(guó)專(zhuān)利No.6,172,213。這種方法可以簡(jiǎn)要地如下描述，但并不嚴(yán)格受限于以下的說(shuō)明突變幾個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如，6-7個(gè)位點(diǎn))來(lái)在每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。由此產(chǎn)生的抗體突變體作為與封裝在每個(gè)顆粒中的M13基因III產(chǎn)物的融合物，以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上。表達(dá)各種突變體的噬菌體可以經(jīng)過(guò)數(shù)輪結(jié)合選擇循環(huán)，隨后對(duì)顯示高親和性的那些突變體進(jìn)行分離和測(cè)序。在WO92/09690中也描述了這種方法。在Cunningham,etal.，1994,￡細(xì)0/13(11)，2508-2515中描述了一種經(jīng)修改的方法，涉及合并親和力展示(pooleda伍nitydisplay)。借助噬菌體展示的親和力成熟為選擇新的結(jié)合多肽提供了可能，例如，使用以下的步驟進(jìn)行選擇a)構(gòu)建可復(fù)制的表達(dá)載體，其包含編碼多肽的第一基因；編碼天然或野生型噬菌體外殼蛋白的至少一部分的第二基因，其中第一基因與第二基因異源；以及與第一和第二基因可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，從而形成編碼融合蛋白的基因融合物；b)在所述第一基因內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)選定的位置突變載體，從而形成相關(guān)質(zhì)粒家族；c)用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適合的宿主細(xì)胞；d)用具有編碼噬菌體外殼蛋白的基因的輔助噬菌體感染轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；e)在適合于形成重組噬菌粒顆粒的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化感染的宿主細(xì)胞，所述重組噬菌粒含有質(zhì)粒的至少一部分并能夠轉(zhuǎn)化宿主，調(diào)節(jié)所述條件使得僅有次要量的噬菌粒顆粒在顆粒表面上展示所述融合蛋白的超過(guò)一個(gè)拷貝；f)使噬菌粒接觸目標(biāo)分子，從而噬菌粒顆粒的至少一部分與所述目標(biāo)分子接觸；和g)將結(jié)合的噬菌粒顆粒與不結(jié)合的噬菌粒顆粒分離。親和力成熟方法可以進(jìn)一步包括用結(jié)合目標(biāo)分子的重組噬菌粒顆粒轉(zhuǎn)化適合的宿主細(xì)胞，并重復(fù)步驟d)到g)—次或多次。作為選擇，所述方法包括由多于一個(gè)的亞基構(gòu)成的多肽，其中包含與編碼目標(biāo)亞基的DNA可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的可復(fù)制表達(dá)載體與噬菌體外殼蛋白融合。作為選捧，多價(jià)噬菌體(McCaffertyetal.,1990，A^w348，552-554;Clacksoneta1.,1991,A^ww352,624-628)也可以用于表達(dá)隨才幾點(diǎn)突變，例如通過(guò)使用易錯(cuò)(error-prone)DNA聚合酶產(chǎn)生的突變，來(lái)產(chǎn)生噬菌體抗體片段文庫(kù)，然后可以根據(jù)對(duì)抗原的親和性來(lái)篩選該文庫(kù)(Hawkinsetal.，1992,>/Mo/.飼.226:889-896)。2.篩選測(cè)定對(duì)用于鑒定和/或定量感興趣的目標(biāo)分子，例如人源、人源-嵌合或人源化的抗體，或這些抗體的片段，可以實(shí)現(xiàn)精確和高度靈敏的篩選。例如，按本文所述制備的跨膜多肽，作為目標(biāo)特異性捕獲試劑。一種有用的測(cè)定方法一般包含以下步驟(1)使跨膜多肽與樣品中存在的目標(biāo)分子反應(yīng)；和(2)測(cè)定結(jié)合的目標(biāo)分子。跨膜多肽可以固定在表面上作為捕獲試劑。3.ELISA免疫測(cè)定系統(tǒng)包括，例如，固相ELISA和捕獲ELISA(captureELISA)。在捕獲ELISA中，通過(guò)已知的方法將跨膜多肽固定到固相?？梢詫⒍嚯奈皆诎瑴y(cè)定表面或基質(zhì)的固相上(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利No.3,720,760)。在支持物預(yù)先活化或不活化的條件下，可以將多肽非共價(jià)地或共價(jià)地偶聯(lián)到測(cè)定表面。作為捕獲試劑的跨膜多肽也可以通過(guò)免疫沉淀來(lái)安置，例如，在結(jié)合樣品抗體之后。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將多肽溶液稀釋到低于臨界膠束值來(lái)固定跨膜多肽?？扇艿鞍踪|(zhì)在測(cè)定表面上的安置可以在輕微的變性條件下，例如溫和的堿性或酸性條件下實(shí)現(xiàn)。作為選擇，可以通過(guò)測(cè)定表面上的共價(jià)鍵捕獲蛋白質(zhì)，或通過(guò)置于測(cè)定表面上的蛋白質(zhì)，例如抗體來(lái)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，捕獲試劑是跨膜多肽例如CD20，其處于由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的、分離而天然的構(gòu)象。也可以使用該多肽的片段。所述跨膜多肽結(jié)合來(lái)自樣品的抗體。性支持物或載體，包括例如表面、顆粒、多孔基體等等形式的支持物。常用的支持物的實(shí)例包括小的薄片、Sephadex、聚氯乙烯、塑料珠子、微顆粒、測(cè)定平板、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯制造的試管，等等。這類(lèi)支持物包括96孔微量滴定板，以及顆粒材料，例如濾紙、瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖和其他多糖。作為選擇，可以適當(dāng)?shù)夭捎梅磻?yīng)性的水不溶性基質(zhì)，例如溴化氰活化的碳水化合物和美國(guó)專(zhuān)利NO.3,969,287;3,691,016;4,195,128;4,247,642;4，229，537和4,330,440中描述的反應(yīng)性的基質(zhì)用于捕獲試劑固定。固定的捕獲試劑可以包被在微量滴定板上。固相可以是多孔微量滴定板，其可以用于一次分析數(shù)個(gè)樣品。固相用捕獲試劑包被，如所希望的，捕獲試劑可通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)相互作用或物理連接來(lái)連接。連接的技術(shù)包括在美國(guó)專(zhuān)利NO.4，376,110和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述的那些技術(shù)。如果使用聚苯乙烯或聚丙烯平板，可以通過(guò)下述方式用捕獲試劑(一般稀釋在緩沖液如0.05M碳酸鈉中)包被平板中的孔在溫度約4-2(TC、例如4-8。C,pH值8-12、例如9-10的范圍或約9.6的條件下，孵育至少約IO小時(shí)，例如過(guò)夜。如果希望包被時(shí)間較短(1-2小時(shí))，可以在37。C包被平板，或平板可以包含硝酸纖維素濾膜底部，例如可以使用MilliporeMULTISCREEN(Billerica,MA)的平板?？梢詫⒖缒さ鞍踪|(zhì)作為洗滌劑中的可溶蛋白質(zhì)施加到測(cè)定表面。將洗滌劑稀釋到低于臨界膠束值將導(dǎo)致多肽沉淀到測(cè)定表面上。包被的平板通常用封閉劑處理，封閉劑與結(jié)合位點(diǎn)非特異性結(jié)合并使之飽和，以防止游離配體與平板孔上過(guò)量的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生不希望的結(jié)合。封閉處理一^l在環(huán)境溫度下發(fā)生約1-4小時(shí)，例如，在1.5到3小時(shí)的范圍內(nèi)。在包被和封閉之后，根據(jù)需要稀釋要分析的血清樣品，并將其添加到固定化相上。稀釋率一般是按體積約5-15%，例如10%。為了足夠的敏感性，固定化的捕獲試劑對(duì)于適當(dāng)稀釋后的樣品中分析物的預(yù)期最大摩爾濃度可以是摩爾過(guò)量的。對(duì)孵育樣品和捕獲試劑的條件進(jìn)行選擇，使測(cè)定的敏感性最大化并使解離最小化。孵育時(shí)間主要取決于溫度。用洗滌溶液從固定化的捕獲試劑分離樣品，以從該系統(tǒng)中除去未被捕獲的分析物。洗滌溶液一般是緩沖液。一般地，系統(tǒng)可以洗滌三次。洗滌溶液的溫度通常是約0-40°C，例如在4-30。C的范圍。可以使用自動(dòng)化平板洗滌器。洗滌溶液可以加入交聯(lián)劑或其他適合的試劑，以使捕獲的被分析物共價(jià)連接到捕獲試劑上。在從系統(tǒng)除去未被捕獲的分析物分子之后，將捕獲的分析物分子在例如室溫下與檢測(cè)試劑例如抗體接觸。分析物與檢測(cè)試劑接觸的溫度和時(shí)間主要取決于采用的檢測(cè)手段。例如，當(dāng)使用綿羊抗小鼠IgG偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化酶(HRP)作為檢測(cè)手段時(shí)，可以將檢測(cè)試劑與捕獲的分析物孵育約0.5-2小時(shí)，例如約1小時(shí)。如上所迷洗滌系統(tǒng)來(lái)從系統(tǒng)除去未結(jié)合的檢測(cè)試劑，并添加過(guò)氧化物酶底物，將平板在室溫下孵育約5分鐘或直到可見(jiàn)良好顏色為止，來(lái)將系統(tǒng)顯色。從系統(tǒng)洗去未結(jié)合的分析物之后，可以向系統(tǒng)添加摩爾過(guò)量的檢測(cè)試劑。檢測(cè)試劑可以是多克隆或單克隆抗體，或其混合物。檢測(cè)試劑可以是直接或間接可檢測(cè)的。檢測(cè)試劑的親和力足夠高，使得可以檢測(cè)分析物的量。與常規(guī)的比色標(biāo)記相比，焚光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記部分在免疫測(cè)定中具有更高的敏感性。所選的檢測(cè)試劑的結(jié)合親和性必須考慮到捕獲試劑的結(jié)合親和性，使得檢測(cè)試劑不會(huì)將分析物從捕獲試劑上剝離。標(biāo)記部分是不影響捕獲的分析物與檢測(cè)試劑結(jié)合的任何可檢測(cè)的官能性(fonctionality)。適合的標(biāo)記部分的實(shí)例包括可以直接檢測(cè)的部分，例如熒光染料、化學(xué)發(fā)光(chemiluminscent)和放射性標(biāo)記，以及必須發(fā)生反應(yīng)或衍生化方可檢測(cè)的部分，例如酶。這類(lèi)標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于放射性同位素32P、"C、1251、3H和1311，萸光團(tuán)例如稀土螯合物或熒光素和其衍生物、羅丹明和其衍生物、螢光素酶，例如焚火蟲(chóng)荄光素酶和細(xì)菌螢光素酶(美國(guó)專(zhuān)利No.4,737,456)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、利用過(guò)氧化氫來(lái)氧化染料前體的酶，例如HPP、生物素/抗生物素蛋白、生物素/鏈霉抗生物素蛋白，等等。標(biāo)記部分與檢測(cè)劑例如抗體的偶聯(lián)，是免疫測(cè)定技術(shù)中標(biāo)準(zhǔn)的操作方法。參見(jiàn)，例如，O'Sulli糧etal.1981，MefW"w73:147-166。有常規(guī)方法將標(biāo)記部分共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)或多肽上。與捕獲試劑結(jié)合的分析物的量可以這樣測(cè)定從固定化相上洗去未結(jié)合量。在一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)記部分是酶。對(duì)于酶部分來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生的顏色的量是被捕獲的分析物的量的直接量度。例如，當(dāng)HRP是標(biāo)記部分時(shí)，通過(guò)定量650nm吸光度的光密度(O.D.)來(lái)檢測(cè)顏色。在另一個(gè)實(shí)施方式中，與捕獲試劑結(jié)合的分析物的量可以間接地測(cè)定。4.抗體制備溶解在洗滌劑中的跨膜多肽例如CD20可以直接用作免疫原來(lái)產(chǎn)生抗跨膜抗體。其他產(chǎn)生抗體的方法也可以使用，包括本文描述的噬菌體展示方法。針對(duì)來(lái)自第一哺乳動(dòng)物物種的抗原產(chǎn)生抗體，例如，第一哺乳動(dòng)物物種可以是人類(lèi)。然而，其他哺乳動(dòng)物也在考慮之內(nèi)，例如農(nóng)場(chǎng)、寵物或動(dòng)物園動(dòng)物，例如當(dāng)抗體要用于治療這些哺乳動(dòng)物時(shí)。為了產(chǎn)生抗體突變體，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基改變(例如，取代、缺失、添加)是已知的。(i)抗原制備。用于抗體生產(chǎn)的跨膜抗原可以是，例如，可溶形式的全長(zhǎng)多肽或其片段，例如溶解的全長(zhǎng)分子或片段，例如跨膜多肽的胞外域。(ii)多克隆抗體。一般通過(guò)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑在動(dòng)物中產(chǎn)生多克隆抗體。將相關(guān)抗原與在要免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)(例如鑰孔血藍(lán)素、血清白蛋白等等)偶聯(lián)可能是有用的。通過(guò)將例如100嗎或5嗎蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別對(duì)于兔或小鼠)與3倍體積弗氏完全佐劑組合，并在多個(gè)位點(diǎn)皮內(nèi)注射該溶液，可以對(duì)動(dòng)物進(jìn)行針對(duì)抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物的免疫。一個(gè)月后，用弗氏不完全佐劑中1/5到1/10初始量的肽或偶聯(lián)物多個(gè)位置皮下注射來(lái)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7到14天后，對(duì)動(dòng)物抽血，測(cè)定血清的抗體效i"介。對(duì)動(dòng)物進(jìn)4亍加強(qiáng)免疫直到效價(jià)平臺(tái)(plateau)。例如，可以用相同抗原與不同蛋白質(zhì)偶聯(lián)的和/或通過(guò)不同交聯(lián)試劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物來(lái)強(qiáng)化動(dòng)物。偶聯(lián)物也可作為蛋白質(zhì)融合物在重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備。此外，聚集劑(aggregatingagent)例如明礬適用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。(iii)單克隆抗體。單克隆抗體可以通過(guò)由Kohler等，iVaft^e，256:495(1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或可以通過(guò)重組DNA方法制備，例如美國(guó)專(zhuān)利No4,816,567中描述的方法，或其他已知的方法來(lái)制備。在雜交瘤方法中，如上文中描述地那樣免疫小鼠或其他適當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物，例如倉(cāng)鼠或恒河猴，而引發(fā)出淋巴細(xì)胞，所述淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體。然后利用適合的融合劑，例如聚乙二醇，將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress)。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種到并培育在適合的培養(yǎng)基中，例如含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或生存的物質(zhì)的培養(yǎng)基中。在鑒定了產(chǎn)生期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞之后，通過(guò)限制性稀釋程序?qū)λ隹寺∵M(jìn)行亞克隆，并用標(biāo)準(zhǔn)方法培育(Goding，1986,同上)。通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化程序，例如ProteinASepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、親和層析等等，適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基、腹水或血清分離所述亞克隆分泌的單克隆抗體。編碼單克隆抗體的DNA使用常規(guī)程序容易地分離和測(cè)序。在一個(gè)實(shí)例中，使用能夠特異性結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針。雜交瘤細(xì)胞可以充當(dāng)這種DNA的來(lái)源。可以通過(guò)例如Munson等，1980，^wa/.所oc/ze肌，107:220描述的Scatchard分析來(lái)確定單克隆抗體的結(jié)合親和力。(iv)人源化和氨基酸序列變體。在美國(guó)專(zhuān)利No.6,037,454(抗-CDlla抗體)、美國(guó)專(zhuān)利No.6,329,509(抗IgE抗體)、美國(guó)專(zhuān)利No.5,821,337(抗pl85HE"抗體)和WO98/45331(抗VEGF抗體)中公開(kāi)了抗體人源化的方法的實(shí)例，通過(guò)引用并入本文。如之前描述的，可以利用許多方法來(lái)選擇特異于本文所述的跨膜蛋白質(zhì)的抗體，例如噬菌體展示、常規(guī)免疫、親和力成熟和其他方法。所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利文件均通過(guò)引用并入本文，如同將它們分別通過(guò)引用合并一樣。已經(jīng)參考各種特定的和優(yōu)選的實(shí)施方式和技術(shù)描述了本/>開(kāi)。然而，要理解的是，可以進(jìn)行許多改變和》務(wù)改，而保持在本公開(kāi)的精神和范圍之內(nèi)。實(shí)施例參照下文實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例是示范性的，絕非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1:使用phoA啟動(dòng)子的CD20的克隆和表達(dá)材料所有洗滌劑獲自AnatraceInc.,Maumee,OH。除非另作說(shuō)明，所有化學(xué)物質(zhì)獲自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO。全長(zhǎng)rituximab抗體獲自GenentechManufacturing。RituximabFab在大腸桿菌中表達(dá)，并通過(guò)蛋白A和陽(yáng)離子交換層析純化。下文實(shí)施例中所使用的表達(dá)構(gòu)建體在附圖8和21中圖示性地顯示，有用的前導(dǎo)序列在附圖22中示出。除非另外指出，大腸桿菌細(xì)胞是菌株58F3?？寺『捅磉_(dá)<吏用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Ausubeletal.編，2003,CurrentProtocolsinMolecularBiology,4Vols.，JohnWiley&Sons)將人類(lèi)和鼠CD20的cDNA亞克隆到含有(3-內(nèi)酰胺酶基因和三個(gè)稀有大腸桿菌密碼子的tRNA基因(argU、glyT和pro2)的pBR322衍生的質(zhì)粒中。在CD20的N-末端添加短多核苷酸來(lái)編碼前導(dǎo)序列MKHQHQQ(SEQIDNO:7)以確保高翻譯起始，在C-末端添加短多核苷酸來(lái)編碼標(biāo)簽序列8xHis(SEQIDNO:8)以幫助所表達(dá)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和純化?；蜣D(zhuǎn)錄在phoA啟動(dòng)子的控制下，通過(guò)限制磷酸鹽來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)。飽和的LB羧千青霉素培養(yǎng)基稀釋到C.R.A.P.磷酸鹽限制培養(yǎng)基(Simmonsetal,，2002，J.Immunol.Methods,263:133-147)中。然后培養(yǎng)物在3CTC培養(yǎng)24小時(shí)。產(chǎn)生了突變型CD20,通過(guò)定點(diǎn)誘變用絲氨酸替代殘基Cys111和Cys220來(lái)形成C2S突變體。測(cè)試突變體與未突變的CD20相比改善的蛋白質(zhì)特性，包括聚集、表達(dá)、溶解和天然構(gòu)象的保持。CD20的發(fā)酵表達(dá)如Simmonsetal.,2002，同上所述進(jìn)行。蛋白質(zhì)分離為了分析各種洗滌劑溶解大腸桿菌中表達(dá)的His標(biāo)記人類(lèi)CD20的能力，使用Polytron(Brinkmann，Westbury,NY)在50mLH沖液A(20mMTrispH8.0,5mMEDTA)中重懸浮5g細(xì)胞，并在125，000xg離心1小時(shí)。然后細(xì)胞沉淀物重懸浮在緩沖液A中，使用微流化儀(MicrofluidicsCorp，Newton,MA)通過(guò)細(xì)胞破壞來(lái)裂解，在125,000xg離心1小時(shí)。在不含EDTA的相同緩沖液中洗滌沉淀物一次，如前所述進(jìn)行沉淀。沉淀物重懸浮于20mL緩沖液B(20mMTrispH8.0，300mMNaCl)，等分，將測(cè)試洗滌劑以如下濃度添加到各等份中1%SDS;1%正-十二烷基肌氨酸；1%正-十二烷基-N，N-二曱胺-N-氧化物(LADO);1%十二烷基磷酸膽堿(DDPC，F(xiàn)os-Choline12);1%正-十二烷基-P-D-麥芽糖苷(DDM);1%TritonX-100;2.5%CHAPS。沉淀物在4。C提取過(guò)夜，只是SDS樣品在室溫提取。第二天離心樣品并除去上清液。沉淀物和上清液重懸浮在還原性SDS加載緩沖液中到相等體積，通過(guò)SDS-PAGE和用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗His抗體(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)探查硝酸纖維素膜上的免疫印跡來(lái)分析。對(duì)于大規(guī)模提取，如前所述裂解100到200g細(xì)胞，制備不溶的級(jí)分。為了從不溶級(jí)分提取CD20，根據(jù)起始的濕細(xì)胞重量以大約1:2.5wt/vol將最終的沉淀物重懸浮在緩沖液B中，DDPC添加到1。/。，溶液在4。C攪拌過(guò)夜。次日，洗滌劑不溶的級(jí)分通過(guò)在125,000xg超速離心1小時(shí)來(lái)沉淀。上清液加載到已經(jīng)用緩沖液B和5mMDDPC預(yù)平《軒的Ni-NTASuperflow柱(QiagenInc.,Valencia,CA)上。用10倍柱體積含有20mM咪唑的緩沖液A洗滌柱，用含有250mM咪唑的緩沖液A洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。在4。C進(jìn)行直到柱加載的所有純化步驟。濃縮含有CD20的洗脫的級(jí)分，并加載到在具有5mMDDPC的緩沖液A中予貞平4耔的Superdex200柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)上。His標(biāo)記人類(lèi)CD20和鼠CD20在5mLHiTrapHPQ柱(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)上進(jìn)一步純化，然后凝月交過(guò)濾。為了洗滌劑交換，使樣品通過(guò)緩沖液C(0.1%DDM，150mMNaCl,20mMHEPSpH7.2)中的Superdex200柱。或者，樣品結(jié)合到小型Ni-NTA柱上，用緩沖液C洗滌，用含300mM咪唑的緩沖液C洗脫。然后相對(duì)于緩沖液C透析這些樣品以除去。米唑。為了人類(lèi)CD20的親和純化，rituximab以6mg/ml固定在10mLActigelALDSuperflow樹(shù)月旨(Sterogene，Carlsbad，CA)上。這個(gè)樹(shù)脂置于柱中，并在緩沖液(0.1%DDM,150mMNaCl，20mMHEPESpH7.2)中平衡。如上文關(guān)于天然人類(lèi)CD20所述，表達(dá)和純化人類(lèi)的突變型CD20,C2S。純化的C2S突變體通過(guò)柱，通過(guò)在緩沖液B中廣泛的洗滌來(lái)除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在0.1%DDM，15QmMNaCl和20mM檸檬酸鈉pH3.5中洗脫。洗脫的樣品立即中和，濃縮并相對(duì)于緩沖液C透析。如Smithetal.，1985，Anal.Biochem.，150:76-85(PierceBiotechnology,Rockford，IL61101)所述，通過(guò)BCA測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。樣品在使用前保存在-80。C。密度梯度離心通過(guò)在離心管中疊放用150mMNaCl和20mMHEPESpH7.2緩沖的1.9M、1.4M和0.8M蔗糖溶液，產(chǎn)生不連續(xù)的蔗糖梯度。表達(dá)CD20蛋白質(zhì)的細(xì)胞在含有ImMEDTA的緩沖液A中通過(guò)細(xì)胞破壞來(lái)裂解。不溶的級(jí)分通過(guò)在38,000xg離心1小時(shí)來(lái)分離。丟棄上清液，沉淀物以1:5wt/vol重懸浮在添加了0.25M蔗糖的裂解緩沖液中，100|iL(微升)這種重懸浮物與0.9mL1.9M蔗糖溶液混合。產(chǎn)生的混合物具有1.75M蔗糖的終濃度。然后將這種混合物置于離心管的底部，lmL其余兩種蔗糖溶液疊放在上。然后添加最后一層200[iL(微升)0.25M蔗糖溶液到管的頂部。樣品ii入SW55轉(zhuǎn)子，在100，000xg旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。小心地從管頂部取出200|aL(微升)等分量的樣品，通過(guò)SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素，并用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗His抗體探查。ELISA分析使用lOO^L(微升)1微克/mL溶于PBS的CD20,將CD20蛋白包被在96孔板上于4°C過(guò)夜，所述PBS含有稀釋到低于其臨界膠團(tuán)濃度的增溶洗滌劑。然后用含有0.05%Tween-20的PBS(PBST)洗滌平板三次，在室溫下用200pL含0.5%BSA的PBST(封閉和分析緩沖液)封閉45分鐘。平板用PBST再洗滌三次，用一抗探查。150^L(微升)60嗎/mL(微克/mL)溶于分析緩沖液的rituximab添加到合適的孔中，在隨后的孔中通過(guò)從第一孔采集50jiL并與100pL(微升)分析緩沖液在下一個(gè)和隨后的孔中混合，來(lái)進(jìn)行三倍連續(xù)稀釋?zhuān)酱蠹s2ng/mL的終濃度。在室溫下溫育90分鐘之后，平板用PBST洗滌，用100pL在分析緩沖液中1:2000稀釋的辣4艮過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗人F(ab')2(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc,WestGrove，PA)^企觀寸纟吉合的rituximab,用PBST洗滌六次，用100pL/孔根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)混合的TMBMicrowell過(guò)氧化物酶D底物系統(tǒng)(KPL，Gaithersburg,MD)顯色。通過(guò)添加IOOiiL/孔1.0M磷酸來(lái)停止反應(yīng)，使用平板讀數(shù)器在450nm測(cè)量吸光度。通過(guò)用1OmMDTT還原和通過(guò)添加25mM碘乙酰胺烷化，制備還原和烷化的CD20樣品。通過(guò)進(jìn)一步添加100mMDTT來(lái)停止反應(yīng)。在每個(gè)步驟之后，容許反應(yīng)在室溫下在pH8.0進(jìn)行30-60分鐘。對(duì)于還原和重新氧化，在涂板(plating)之前CD20樣品用10mMDTT還原，并且在抗體結(jié)合之前容許在不存在DTT的情況下在平板上重新氧化幾個(gè)小時(shí)。表面等離振子共振(SurfacePlasmonResonance)對(duì)分離的人類(lèi)CD20蛋白質(zhì)的rituximab親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)使用BIAcore-3000儀器(BIAcore，Inc.,Piscataway,NJ)來(lái)測(cè)定。CM5傳感器芯片根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)使用N-乙基-N'-(3-二曱基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺來(lái)活化，用于共價(jià)偶聯(lián)rituximab或rituximab-Fab。rituximab或rituximab-Fab在10mM醋酸鈉pH5.0中稀釋5-10倍到100嗎/mL的濃度，并注射到活化的芯片上。其余的活性偶聯(lián)位點(diǎn)用1M乙醇胺封閉。完整的rituximab以8000-12000RU沉積，rituximab-Fab以4000-7000RU沉積。為了動(dòng)力學(xué)測(cè)量，0.1%DDM,150mMNaCl和20mMHEPESpH7.2中的、起始濃度5jiM的人類(lèi)CD20的七個(gè)兩倍稀釋度(總共八個(gè)樣品)以30pL/分鐘的流速注射100秒。容許結(jié)合的蛋白質(zhì)解離720秒。在每次樣品測(cè)量的結(jié)束，通過(guò)注射20jiL10mMHC1再生傳感器表面。在根據(jù)參考流的信號(hào)校正傳感圖(sensogram)之后，使用簡(jiǎn)單的1:1模型用BIAevaluation3.0(BIAcore)計(jì)算動(dòng)力學(xué)。圓二色性(CD)通過(guò)相對(duì)于lOOmM磷酸鈉pH7.2及0.1%DDPC或0.1%DDM透析來(lái)制備CD20在0.1%DDPC或0.1%DDM中的洗滌劑溶液。使用AVIV202儀器在lmm石英杯中對(duì)2到5pM蛋白質(zhì)樣品收集圓二色性數(shù)據(jù)；在25。C以IO秒平均時(shí)間、2nm的增量對(duì)標(biāo)明的區(qū)域進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。除了含有|3-巰基乙醇的樣品外，在185到285nm范圍上標(biāo)繪數(shù)據(jù)。由于p-巰基乙醇影響較低波長(zhǎng)的數(shù)據(jù)收集，在200nm截?cái)噙@些數(shù)據(jù)。rihiximabIgG和Fab結(jié)合正常人類(lèi)B細(xì)胞的Scatchard分析使用放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)對(duì)rituximabIgG和rituximabFab片段結(jié)合B細(xì)胞測(cè)量平衡解離常數(shù)(Kd)。在結(jié)合分析緩沖液(含有0.5%牛血清清蛋白，25mMHEPESpH7.2和0.01%疊氮化鈉的DMEM培養(yǎng)基)進(jìn)行所有稀釋。將用Iodogen碘化的rituximab^I-IgG或用Iodogen碘化的125I-Fab或乳過(guò)氧化物酶的等份(0.05mL)分別以0.005或0.05nM的濃度分配到V形底96孔微量分析板的測(cè)試孔中。添加冷抗體的連續(xù)稀釋物(0.05mL)并混合。然后向孔中添加純化的人類(lèi)B細(xì)胞(0.05mL中125,000個(gè))。密封平板并在室溫下溫育24小時(shí)，然后在2,500rpm離心15分鐘。吸出上清液，洗滌細(xì)胞沉淀物并離心。再次吸出上清液，沉淀物溶于1NNaOH，并轉(zhuǎn)移到管中用于伽馬計(jì)凄U吏用如McPherson，1983，Comput.Programs.Biomed.，17:107-113中所述程序Ligand，如Mu脂netal.，1980，Anal.Biochem.，107:220-239所述，將數(shù)據(jù)用于Scatchard分析。通過(guò)根據(jù)廠家的方案使用RosetteSepTMB細(xì)胞富集混合物(StemcellTechnologies,Vancouver,Cananda)的負(fù)選擇，從lOOmL肝素化的正常人類(lèi)血'液分離正常人類(lèi)B纟田月包。在Ficoll-Paque(AmershamBiosciences,Peapack，NJ)上進(jìn)一步分離B細(xì)胞，然后分離并在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌。通過(guò)暴露于低滲溶液30秒裂解任何剩余的紅細(xì)胞。純化的B細(xì)胞然后調(diào)節(jié)到每毫升結(jié)合緩沖液中l(wèi)-2百萬(wàn)細(xì)胞的濃度。膜結(jié)合型人類(lèi)CD20在大腸桿菌中的表達(dá)人類(lèi)CD20的一級(jí)結(jié)構(gòu)如附圖1所示。CD20的建議的拓樸結(jié)構(gòu)是兩個(gè)末端都在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的四跨膜蛋白。CD20的兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)形在大小上顯著不同。螺旋一和螺旋二之間的第一個(gè)環(huán)形是極小的，看起來(lái)不太可能從膜上廣泛地伸出。這個(gè)環(huán)形的大小在MS4A家族的其他成員中是高度保守的(參見(jiàn)例如Ishibashietal.,2001，Gene,264:87-93和Liangetal.,2001,Genomics,72:119-127)。螺旋三和螺旋四之間的第二個(gè)環(huán)形長(zhǎng)約46個(gè)氨基酸，從殘基140的區(qū)域延伸到殘基185的區(qū)域，含有殘基167和183之間的一個(gè)可能的二硫鍵。這個(gè)環(huán)形的大小在MS4A家族的基因的氨基酸序列之間大大不同，然而大多數(shù)這些序列保留了形成細(xì)胞外二石危4定的能力(Ishibashietal.,2001，同上和Liangetal.,2001，同上)。在靜息B細(xì)胞的膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，CD20被磷酸化(Valentineetal.，1989,J.Biol.Chem.,264:11282-11287)。磷酸化響應(yīng)抗體交聯(lián)而提高(Tedderetal.,1988，J.Biol.Chem,，263:10009-10015)。在CD20上沒(méi)有鑒定出其他翻譯后修飾，人類(lèi)蛋白質(zhì)缺乏細(xì)胞外區(qū)域中的任何共有N-糖基化位點(diǎn)。為了確定CD20的結(jié)構(gòu)和二硫鍵形成在抗體結(jié)合中的潛在作用，His標(biāo)記人類(lèi)CD20蛋白質(zhì)如上所述在大腸桿菌中表達(dá)。通過(guò)將CD20的細(xì)胞表達(dá)定位到膜上，通過(guò)密度梯度離心和通過(guò)測(cè)試在天然洗滌劑中的蛋白質(zhì)溶解度來(lái)評(píng)估大腸桿菌中蛋白質(zhì)的天然表達(dá)的潛力。附圖2顯示了分離的CD20在蔗糖梯度中的位置。在小圖a的凝膠上方標(biāo)出了級(jí)分編號(hào)1-16。來(lái)自蔗糖梯度的級(jí)分的等份在SDS-PAGE凝膠上電泳。使用抗His標(biāo)簽抗體對(duì)凝膠進(jìn)行印跡和探查。級(jí)分來(lái)自最低的蔗糖密度(1)到最高的蔗糖密度(14)。如附圖2的小圖a所示，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中表達(dá)的總蛋白質(zhì)的大約一半位于密度低于1.28g/cm2(1.75M蔗糖)的蔗糖級(jí)分(12)中，而發(fā)現(xiàn)其余的蛋白質(zhì)在沉淀物中(級(jí)分16)。典型的可溶性蛋白質(zhì)具有1.33-1.42g/cm2的密度(Creighton,1993，ProteinsStructuresandMolecularProperties,第2片反,W.H.FreemanandCompany,NewYork,USA),其大于底層蔗糖的密度(1.28g/cm2，1.75M)。可溶性蛋白質(zhì)將在該梯度的底部發(fā)現(xiàn)，而膜結(jié)合型蛋白質(zhì)由于蛋白質(zhì)周?chē)嬖谥|(zhì)而漂浮至較低密度。附圖2的小圖a中示出的這些數(shù)據(jù)與人類(lèi)CD20定位于細(xì)菌細(xì)胞膜級(jí)分的情況一致，因?yàn)榇竽c桿菌膜據(jù)報(bào)道具有1.15-1.25g/cm2的密度(Ishidateetal.，1986，J.Biol.Chem.，261:428-443)。這些觀測(cè)結(jié)果也與描述其他真核膜蛋白以天然構(gòu)象在細(xì)菌細(xì)胞膜中表達(dá)的先前報(bào)道一致(Bertinetal.,1992，J.Biol.Chem.，267:8200-8206;Grisshammeretal.，1993,BiochemJ.,295(Pt2):571-576)。CD20的洗滌劑增溶通過(guò)使用如上所述的方法篩選一批非變性和變性洗滌劑來(lái)確定對(duì)于CD20增溶有用的洗滌劑。大腸桿菌細(xì)胞膜在洗滌劑提取后的沉淀物和上清液用抗His抗體^:查。附圖2小圖b顯示了這個(gè)篩選的結(jié)果。在人類(lèi)CD20的Western印跡中，來(lái)自不同洗滌劑的上清液標(biāo)以(S)，而沉淀物標(biāo)以(P)。(WC)表示全細(xì)胞提取物(對(duì)照)。用于從膜提取蛋白質(zhì)的各種洗滌劑是SDS(1)、n-十二烷基肌氨酸(2)、n-十二烷基-N,N-二曱胺-N-氧化物(LADO)(3)、n-十二烷基磷酸膽堿(DDPC)(4)、n-十二烷基-J3-D-麥芽糖苦(DDM)(5)、Triton-X100(6)和CHAPS(7)。如Western印跡所示，使用各種洗滌劑獲得了可溶性蛋白質(zhì)。CD20的實(shí)質(zhì)級(jí)分可溶于非變性?xún)尚噪x子洗滌劑十二烷基磷酸膽堿(DDPC)(4)。選擇這種洗滌劑用于CD20的提取和純化中的進(jìn)一步工作。His標(biāo)記人類(lèi)CD20用DDPC從大腸桿菌膜提取，通過(guò)如上所述的金屬螯合、大小排阻和陰離子交換層析來(lái)純化。從一克細(xì)菌細(xì)胞獲得大約10-20嗎純化的His標(biāo)記CD20蛋白質(zhì)。附圖3顯示了提取和純化的人類(lèi)His標(biāo)記人類(lèi)CD20、C2S突變體和鼠CD20的Comassie染色的SDS凝膠泳道。泳道1、2和3顯示了非還原的蛋白質(zhì)人類(lèi)CD20(泳道1)、C2S突變體(泳道2)和鼠CD20(泳道3)。泳道4含有分子量標(biāo)記物(Mark12,Invitrogen)。泳道5、6和7顯示了還原的蛋白質(zhì)人類(lèi)CD20(泳道5)、C2S突變體(泳道6)和鼠CD20(泳道7)。泳道8和IO顯示了鄰近分子量標(biāo)記物(泳道9)的非還原的(泳道8)和還原的(泳道IO)鼠CD20。每個(gè)泳道含有2嗎(微克)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記物的分子量是200、116、97、66、55、36、30、22、14和6kDa。純化的His標(biāo)記人類(lèi)CD20的代表性SDS-PAGE在附圖3中示出(泳道1和5)。蛋白質(zhì)在還原性條件下以大約38kDa的表觀分子量遷移，其與計(jì)算分子量35kDa合理的相符。率的適度改變。這在附圖3中清楚可見(jiàn)，其中還原的(泳道IO)和非還原的(泳道8)鼠CD20為了強(qiáng)調(diào)在鄰近泳道中運(yùn)行。這種變化表明，與還原的形式相比，非還原的CD20由于位于大的細(xì)胞外環(huán)形中的二辟i^建而以更緊密的、更快遷移的結(jié)構(gòu)存在。這個(gè)二硫鍵在添加還原劑時(shí)被消除。雖然洗滌劑十二烷基麥芽糖苷(DDM)和LADO僅僅展現(xiàn)了有限的溶解CD20的能力，仍用這些洗滌劑嘗試了大規(guī);漠的純化，來(lái)評(píng)定使用如上所述和附圖2的小圖b所示的條件的Western印跡是否確實(shí)精確地測(cè)定來(lái)自大腸桿菌的洗滌劑增溶作用。筒要地，大腸桿菌表達(dá)的His標(biāo)記人類(lèi)CD20的不溶級(jí)分用1%標(biāo)明的洗滌劑提取。將樣品離心，沉淀物和上清液懸浮在等體積的SDS緩沖液中。等體積的各種樣品在還原性條件下在SDS-PAGE上電泳。為了對(duì)比，將等體積的全細(xì)胞級(jí)分(WC)在裂解后不經(jīng)任何搡作懸浮在SDS緩沖液中。與用DDPC進(jìn)行的純化相比，使用DDM或LADO純化的蛋白質(zhì)純度顯著更低，并且該流程產(chǎn)生顯著更少的蛋白質(zhì)。然而，CD20可以在純化后成功地交換到非離子型洗滌劑中，表明DDPC不具有溶解CD20的獨(dú)特能力。鼠CD20的表達(dá)在與純化人類(lèi)CD20使用的條件相似的條件下表達(dá)和純化鼠CD20。這個(gè)純化的結(jié)果在附圖3中示出(泳道3和7)。鼠蛋白質(zhì)材料比人類(lèi)CD20表現(xiàn)顯著更好，顯示了在非還原性SDS凝膠上的聚集較少(比較泳道1和3，附圖3)并提供了更高的最終蛋白質(zhì)產(chǎn)量。對(duì)鼠和人類(lèi)CD20的一級(jí)序列的檢查顯示人類(lèi)序列中的半胱氨酸殘基111(附圖1)在鼠蛋白質(zhì)中被絲氨酸替代。這種替代暗示Cyslll不是CD20活性所必需的。此外，已經(jīng)顯示了半胱氨酸220不是CD20活性所必需的，因?yàn)楫?dāng)在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)與野生型蛋白質(zhì)相比，用丙氨酸替代Cys220產(chǎn)生了相似的表達(dá)和抗體依賴(lài)性脂質(zhì)f是締合(antibody-dependentlipidraftassociation)。參見(jiàn)例^口Polyaketal.，1998,J.Immunol.,161:3242-3248。表2人類(lèi)和鼠CD20hCD20hC2SmuCD20hCD20hC2SniuCD20hCD20hC2SmuCD20hCD20muCD20hC咖hC2ShCI)20hC2SmuCD20hC腦hC2SmuCl)2t)!0203040MHTRNSVNGTFPAEPMKGP1AMQSGPKPLFRRMSSLVGPMTTP1RNSVNGTFPAEPMKGP隨QSGPKPL服MSSLVGP------MSG麼AEPTKGPLAMQPAFKVNLK盯SSLVGP50607080TQSFFMRESKTLGAVQ1MMGLFHIALGGLLMIPAG1YAPITQSFFMRESK丁LGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPITQSFFMRESKALGAV^IMNGLFHITLGG1丄M1PTGVFAPI901001020CVTVWYPLWGG〗MYIISG-SLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNCVTVWYPLWGGIMYIISG-SL一AATEKNSRK§LVKGfCMIMNclsvwyplwgG諮ISGSLLAAAAEKTSRkLvkAKVIMS130140150160SLSLFAAISGMILS1MD1LN1K1SHFLKMES1NFIRAHTPS!-S!,FAASGMfLSrMDlLN1JGSHfLKMSSLNFiRAHTPSLSLFAAISGIlLSiMDILNMTLSHFLKMRRLELIQTSKP70環(huán)19020《)Y願(yuàn)YNCEPANPSEKNSl)STQYCYStQSLFLGILSVML1FY腕YNCEPAN1'SEKNSPSTQYCYS!QSLFU3〖LSVMUFYVDTYDCEPSNSSEKNS1)STQYC卿QSVFLG〖LSAML1S210220230240AFFQELVIAGrVENEWKRTCSRPKS雨LLSAEEKKEQTIAFFQELVIAGIVENEWKRTiSRPKSNIVLLSAEEKKEQT1AFFQKLVTAGIVENEWKRMCTRSKSNVVLLSAGEKNEQT1250260270280EKEEVVGLTETSSQPKNEEDIE11P1QEEEEEETE丁附EDCEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEGTETNFPKMKEE亂SGVSSQPKN頂E1E11PV卿EEEEAmNFPhC1)20hC2SimiC腿290298EPPQDQESSP,)SSPEPPQDQESSPIENDSSPAPPQEQESLPVENEIAP(卿/dwa-iyC2S突變?yōu)榱嗽u(píng)定CD20的表達(dá)和抗體結(jié)合，殘基Cyslll和Cys220都突變成在這些位置的替代的絲氨酸，形成C2S突變體。如上文關(guān)于His標(biāo)記人類(lèi)CD20所述，表達(dá)和純化C2S突變體。C2S突變體展現(xiàn)了相對(duì)于天然蛋白質(zhì)改善的蛋白質(zhì)性質(zhì)，包括聚集降低和產(chǎn)量提高。附圖2的小圖c中顯示的是大腸桿菌細(xì)胞提取物的樣品，展現(xiàn)了His標(biāo)記人類(lèi)CD20和C2S突變型CD20的表達(dá)。泳道1和4含有對(duì)照空載體；泳道2和5含有人類(lèi)CD20;泳道3和6含有C2S突變型CD20。泳道1、2和3中的樣品在非還原性條件下運(yùn)行；泳道4、5和6中的樣品用100mMDTT還原。每個(gè)泳道含有通過(guò)光密度標(biāo)準(zhǔn)化的等體積的細(xì)胞。與天然人類(lèi)CD20(泳道2和5)相比，C2S突變體(泳道3和6)在大腸桿菌中以更高水平表達(dá)，并顯示了更低的二硫鍵依賴(lài)性聚集。C2S突變體的較低的聚集和高約兩倍的蛋白質(zhì)產(chǎn)量也在附圖3的小圖a中得到證明，其中含有C2S的泳道2和6與天然人類(lèi)CD20(泳道1和5)和鼠CD20(泳道3和7)進(jìn)行比較。所表達(dá)的rCD20結(jié)合Rituximab為了評(píng)定純化的重組CD20是否采取了天然構(gòu)象，分析純化的蛋白質(zhì)結(jié)合嵌合抗CD20抗體rituximab的能力。已知這個(gè)抗體結(jié)合在B細(xì)胞表面表達(dá)的人類(lèi)CD20的在結(jié)構(gòu)上受限制的細(xì)胞外環(huán)形(Polyaketal.，2002,Blood,99:3256-3262)。根據(jù)rituximab與純化的人類(lèi)CD20的結(jié)合開(kāi)發(fā)了EUSA測(cè)定法。結(jié)果在附圖4中示出，是顯示rituximab抗體對(duì)His標(biāo)記人類(lèi)CD20(實(shí)心正方形)、還原和烷化的hCD20(空心正方形)、還原和重新氧化的hCD20(實(shí)心圓圈)和PBS對(duì)照(空心圓圈)的二硫鍵依賴(lài)性結(jié)合的圖表。穿過(guò)rituximab結(jié)合點(diǎn)的曲線(xiàn)根據(jù)4參數(shù)擬合分析來(lái)確定。如附圖4所示，在這個(gè)分析中rituximab以納摩爾親和力結(jié)合His標(biāo)記人類(lèi)CD20。根據(jù)數(shù)據(jù)的4參數(shù)擬合確定了EQo為9.4nM。還原的rCD20未能在ELISA中結(jié)合RituximabRituximab結(jié)合被定位到CD20殘基K142和Y184之間的細(xì)胞外環(huán)形(Polyaketal.,2002，同上)。認(rèn)為這個(gè)區(qū)域中的兩個(gè)殘基C167和C183形成二硫鍵(Einfeldetal.，1988，EMBOJ.，7:711-717)。繼而認(rèn)為Rituximab結(jié)合決定性地取決于這個(gè)二硫鍵的存在。為了評(píng)估CD20中任何二硫鍵對(duì)于rituximab結(jié)合的重要性，將CD20還原和烷基化，分析rituximab結(jié)合。這個(gè)流程實(shí)質(zhì)性降低了rituximab結(jié)合CD20的能力。作為另外的對(duì)照，還原CD20,除去DTT，容許蛋白質(zhì)重新氧化。在這個(gè)流程中Rituximab結(jié)合部分地恢復(fù)，與CD20中二硫鍵的重新形成相一致，從而證明了抗體結(jié)合取決于二硫鍵形成。由于針對(duì)鼠CD20的細(xì)胞外區(qū)域的抗體當(dāng)前是得不到的，沒(méi)有可能對(duì)鼠CD20開(kāi)發(fā)類(lèi)似的測(cè)定法。rhCD20和C2S突變體的BIAcore分析為了評(píng)估rituximab對(duì)人類(lèi)CD20的結(jié)合獨(dú)立于這種效應(yīng)，進(jìn)4亍表面等離振子共振分析。這種技術(shù)具有提供動(dòng)力學(xué)結(jié)合信息和平衡結(jié)合常數(shù)的額外益處。在這些實(shí)驗(yàn)中，rituximab或rituximabFab沉積在BIAcore傳感器芯片上，使可溶性人類(lèi)CD20以各種濃度通過(guò)芯片。全長(zhǎng)rituximab以10,000RU沉積，標(biāo)明濃度的人類(lèi)CD20在150mMNaCl,20mMHEPSpH7.2和0.1%DDM中以20pL/分鐘的流速應(yīng)用于傳感器芯片。有趣地，雖然CD20可以在DDPC中得到分離，CD20與固定的rituximab的結(jié)合在存在這種洗滌劑時(shí)顯著地降低(數(shù)據(jù)未顯示)。因而，在存在DDM的情況下測(cè)定來(lái)自表面等離振子共振實(shí)驗(yàn)的親和力。這些實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)可以在附圖5中見(jiàn)到，為顯示rituximab和人類(lèi)His標(biāo)記CD20之間結(jié)合的BIAcore傳感圖。人類(lèi)CD20與固定化的rituximab的結(jié)合發(fā)生在0.04pM到5.0pM的CD20濃度范圍，包括5pM、2.5|jM、1.25jiM、0.63pM、0.31fiM、0.16pM、0.08pM和0.04pM。前4個(gè)才羊品的濃度在傳感圖上有標(biāo)記。顯示了非還原的CD20(實(shí)心正方形)、還原和烷基化的CD20(實(shí)心圓圈)、允許再氧化的還原的CD20(空心正方形)和對(duì)照PBS(空心圓圈)的rituximab結(jié)合。根據(jù)四參數(shù)擬合分析，確定了結(jié)合曲線(xiàn)。在各個(gè)濃度顯示了非協(xié)同模型(non-cooperativemodel)的計(jì)算理論擬合。在表3中，顯示了rituximabIgG或Fab與人類(lèi)CD20、C2S突變體和親和純化的C2S突變體的結(jié)合參數(shù)。數(shù)據(jù)代表了多個(gè)實(shí)驗(yàn)，并且擬合了單一結(jié)合位點(diǎn)模型。根據(jù)結(jié)合和解離速率計(jì)算Kd和Ka值。根據(jù)這個(gè)表格可以看出，His標(biāo)記人類(lèi)CD20和人類(lèi)CD20的C2S突變體都展現(xiàn)了與全長(zhǎng)rituximab抗體和Fab片段近似相同的結(jié)合特性。數(shù)據(jù)表明，CD20的Cys到Ser突變不改變抗體結(jié)合，例如不改變抗體結(jié)合所需的"天然"構(gòu)象。表3Rituximab全長(zhǎng)抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>RituximabFab<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>大腸桿菌中表達(dá)的hCD20處于"天然"構(gòu)象為了測(cè)定在我們的制備物中以抗體結(jié)合的正確構(gòu)象存在的CD20的百分比，我們?cè)趓ituximab親和柱上進(jìn)一步純化了人類(lèi)CD20的C2S突變體。雖然產(chǎn)量是低的，親和純化之前和之后的結(jié)合數(shù)據(jù)大體上是一致的，表明大部分純化的人類(lèi)CD20是處于能結(jié)合rituximab的構(gòu)象。在用固定的rituximab親和純化之后，展現(xiàn)了抗體結(jié)合上適度的改善。這種改善的親和力可能是由于CD20純度的改善或除去了沒(méi)有活性的CD20分子。觀察到CD20對(duì)全長(zhǎng)抗體的親和力相對(duì)于Fab有小的差異。這種輕微的差異可以由表面效應(yīng)來(lái)說(shuō)明，所述表面效應(yīng)是由于較小的Fab片段與傳感器芯片偶聯(lián)或由于在除去Fc區(qū)域后Fab結(jié)構(gòu)中的微小改變?？赡艿氖牵谙礈靹┠z團(tuán)中聚集的任何CD20可以對(duì)IgG和Fab二者的結(jié)合的親和力貢獻(xiàn)親合力效應(yīng)。雖然難以排除親合力效應(yīng)的影響，由于兩個(gè)理由，不認(rèn)為這些在這項(xiàng)分析中觀察到的結(jié)合中顯著起貢獻(xiàn)。首先，可溶性CD20對(duì)完整rituximabIgG或Fab片段的親和力顯示了低于兩倍的差異。即使Fab結(jié)合由于Fab片段對(duì)傳感器芯片的接近允許一些親合力效應(yīng)，不太可能的是Fab片段的隨機(jī)偶聯(lián)和取向?qū)⒃跍y(cè)量中容許這種緊密的一致性。此外，IgG數(shù)據(jù)和Fab數(shù)據(jù)都顯示了與對(duì)單價(jià)結(jié)合預(yù)測(cè)的理論擬合極好的一致性。對(duì)于IgGBIAcore實(shí)驗(yàn)，對(duì)理論單價(jià)結(jié)合的分歧應(yīng)當(dāng)特別明顯，:然而如附圖5所示，CD20結(jié)合rituximabIgG的理論單價(jià)擬合和實(shí)際實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)緊密一致。因而，不需要推定其他的結(jié)合模式來(lái)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。第二，如BIAcore所測(cè)定的rituximabIgG和Fab片段的親和力測(cè)量都與從結(jié)合正常人類(lèi)B細(xì)胞的Scatchard分析測(cè)定的rituximabFab片段的親和力測(cè)量緊密一致。通過(guò)與125I-IgG或125I-Fab竟?fàn)幬礃?biāo)記的rituximabIgG或Fab來(lái)測(cè)定rituximabIgG或Fab與正常人類(lèi)B細(xì)胞的結(jié)合。顯示的數(shù)據(jù)是來(lái)自?xún)蓚€(gè)供體的正常細(xì)胞的分析的平均值。rituximabIgG和Fab的結(jié)合實(shí)驗(yàn)的典型替換圖表在附圖7中示出。通過(guò)未標(biāo)記的rituximabIgG與"I-IgG對(duì)供體1(上部小圖)或未標(biāo)記的rituximabFab與125I-Fab對(duì)供體4(下部小圖)的竟?fàn)巵?lái)測(cè)定結(jié)合。每個(gè)測(cè)量對(duì)來(lái)自單個(gè)供體的細(xì)胞一式三1^分進(jìn)行。表4顯示了來(lái)自每個(gè)供體的受體的親和力和編號(hào)。在這個(gè)分析中天然CD20的EC是9,5nM。表4RituximabIgG<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>RituximabFab<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>數(shù)據(jù)表明三到四倍的小差異存在于BIAcore測(cè)定的rituximabFab對(duì)分離的人類(lèi)CD20的單價(jià)親和力與rituximabFab對(duì)分離的人類(lèi)B細(xì)胞上表達(dá)的CD20的單價(jià)親和力之間(BIAcore實(shí)驗(yàn)中190-280nM親和力對(duì)Scatchard分析中50-60nM親和力)。這種小差異可能代表分析方法中的內(nèi)在差異、蛋白質(zhì)環(huán)境中的物理差異、洗滌劑的存在或分離的材料中CD20結(jié)合配偶體的缺乏，以及其他原因。感興趣的是在rituximabIgG和Fab結(jié)合B細(xì)胞之間的大差異。這表明，親合力效應(yīng)在rituximab與B細(xì)胞的結(jié)合中起作用。如從rituximab對(duì)人類(lèi)CD20的Kd(84-170nM)預(yù)計(jì)的，結(jié)合和解離結(jié)合速率是相對(duì)快的，特別是與高親和力抗體例如親和力成熟的抗VEGF抗體相比(Chenetal.,1999,J.Mol.Biol.，293:865-881,其在25。C具有低于0.15nM的Kd,3,6xl04(]VrV1)的k。n和低于或等于0.05x104(s")的koff)。然而，由于通過(guò)BIAcore測(cè)定的rituximabIgG或rituximabFab片段對(duì)分離的CD20的親和力與通過(guò)Scatchard分析測(cè)定的rituximabFab對(duì)正常B細(xì)胞的親和力緊密一致，看來(lái)可能的是低的單價(jià)親和力值是現(xiàn)實(shí)的，并且不是由分離的hcd20制備物中存在的顯著量的錯(cuò)誤折疊或非天然構(gòu)象引起的。通過(guò)圓二色性分析二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)人類(lèi)C2S和鼠CD20的圓二色性光譜(CD)進(jìn)一步分析CD20的二級(jí)結(jié)構(gòu)。來(lái)自這個(gè)分析的樣本譜線(xiàn)在附圖6中示出。上部小圖顯示的是在存在0.1%DDPC的情況下(黑線(xiàn))；在存在0.1%DDPC和lOmMp-巰基乙醇的情況下(短劃線(xiàn))及在存在1%SDS、直到95°C的熱掃描之后(點(diǎn)線(xiàn))的人類(lèi)CD20突變體C2S的i普線(xiàn)。下部小圖顯示的是在存在0.1%DDPC(短劃線(xiàn))、0.1%十二烷基-麥芽糖苷(DDM)(點(diǎn)線(xiàn))的情況下；及在添加1%SDS和P-巰基乙醇的0.1%DDM中并在95。C加熱2分鐘之后(黑線(xiàn))的鼠CD20的譜線(xiàn)。數(shù)據(jù)表述為摩爾橢圓性。在CD20作為四跨膜蛋白的預(yù)測(cè)拓樸結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，CD20應(yīng)具有大約350/。的螺旋含量?？梢钥闯?，人類(lèi)CD20的C2S突變體(附圖6，上部小圖)和鼠CD20(附圖6,下部小圖)都展現(xiàn)了在222nmi普線(xiàn)區(qū)的顯著信號(hào)，這是具有顯著的a螺旋成分的蛋白質(zhì)預(yù)期的。添加還原劑不顯著地改變鼠(下部小圖，黑線(xiàn))或者人類(lèi)CD20的C2S突變體在存在DDPC(上部小圖，短劃線(xiàn))或SDS(上部小圖，細(xì)線(xiàn))的情況下的二級(jí)結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的，CD20的二級(jí)結(jié)構(gòu)似乎在洗滌劑和溫度廣泛變化下非常穩(wěn)定。在熱掃描或短暫加熱之后，在存在SDS情況下人類(lèi)CD20的C2S突變體(上部小圖，細(xì)線(xiàn))或在存在SDS和還原劑情況下鼠CD20(下部小圖，黑線(xiàn))的CD譜線(xiàn)與天然蛋白質(zhì)(參見(jiàn)附圖6)的譜線(xiàn)是幾乎相同的。數(shù)據(jù)表述為摩爾橢圓性。從25。C到95。C的溫度掃描表明，人類(lèi)CD20在95。C丟失了大約35%的222nm螺旋信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。雖然沒(méi)有協(xié)同的解折疊或協(xié)同的重折疊的證據(jù)，當(dāng)樣品回到較低溫度時(shí)，至少在短暫加熱之后，大部分這些信號(hào)得到恢復(fù)(附圖6)。在加熱和未加熱的人類(lèi)CD20樣品中的小差異可能表明有些結(jié)構(gòu)永久地喪失了，永久地變性的蛋白質(zhì)的量可能隨著對(duì)熱的更久暴露而提高。向鼠CD20添加還原劑不顯著地影響SDS中蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性(下部小圖，黑線(xiàn))。可能的是，位于CD20中預(yù)測(cè)具有a螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域以外的二硫鍵可能對(duì)CD20的總體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性貢獻(xiàn)很少。還可能的是由二硫鍵的還原引起的CD20結(jié)構(gòu)改變僅僅是CD觀察不到的。先前已經(jīng)注意到，如CD所測(cè)量的，卩2腎上腺素能受體的二硫鍵的還原也對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)具有有限的影響(Linetal,,1996，Biochemistry,35:14445-14441)。類(lèi)似地，在與此處使用的條件類(lèi)似的條件下，二酰甘油激酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)不受SDS的影響(Lauetal.,1997,Biochemistry,36:5884-5892)。實(shí)施例2:用phoA啟動(dòng)子表達(dá)MS4A蛋白質(zhì)四跨膜多肽的MS4A家族的其他成員以上文實(shí)施例1描述的方式在phoA啟動(dòng)子的控制下在大腸桿菌中表達(dá)。根據(jù)上文實(shí)施例1描述的方法在大腸桿菌中表達(dá)基因產(chǎn)物MS4A4A(SEQIDNO:10)、MS4A6A(SEQIDNO:12)和MS4A7(SEQIDNO:14)。根據(jù)使用抗His免疫印跡檢測(cè)到的，從細(xì)胞獲得高數(shù)量的蛋白質(zhì)。如圖8所示，檢測(cè)到的MS4A多肽在分子量上接近Liang和Tedder(2001,Genomics72:119-127)推定的預(yù)測(cè)分子量MS4A4AMS4A6AMS4A727kDa29kDa23kDa實(shí)施例3:phoA啟動(dòng)子的突變大腸桿菌啟動(dòng)子phoA被選擇用于表達(dá)復(fù)雜的跨膜蛋白質(zhì)，包括四跨膜蛋白質(zhì)的MS4A家族，例如CD20。如下文表5所示，phoA啟動(dòng)子包括典型的啟動(dòng)子元件，例如翻譯起始位點(diǎn)區(qū)g、-10TATA盒[TATAGT|和pho備GCTGTCATAAAGTTGTCAC(SEQIDNO:20)。'Li哺乳動(dòng)物多跨膜蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)一般認(rèn)為是有挑戰(zhàn)性的(參見(jiàn)例j口Grisshammer,R.,1998,In:IdentificationandExpressionofGProtein-CoupledReceptors,ppl33-150,Ed.K.R丄ynch,Wiley-LissInc.;Laageetal.，2001,Traffic2:99-104)。這些蛋白質(zhì)的一些即使在很低水平表達(dá)時(shí)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞也是非常有毒的，這對(duì)它們的生產(chǎn)和分離增加了進(jìn)一步的復(fù)雜度。簡(jiǎn)單的將這些蛋白質(zhì)的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到相關(guān)的表達(dá)菌抹中常常產(chǎn)生異常小或大小多變的菌落，表明即使在啟動(dòng)子關(guān)閉時(shí)對(duì)細(xì)胞也有毒性。這些蛋白生長(zhǎng)，產(chǎn)生在完全打開(kāi)啟動(dòng)子之前不良的細(xì)胞生理。最終結(jié)果常常是從一個(gè)實(shí)驗(yàn)到下一個(gè)實(shí)驗(yàn)的多變的表達(dá)，以及低的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。如下文所示，這種蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中的生產(chǎn)需要嚴(yán)密調(diào)控的啟動(dòng)子來(lái)限制細(xì)胞中基礎(chǔ)蛋白質(zhì)表達(dá)的程度。為了排除基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄，從大腸桿菌phoA啟動(dòng)子的基礎(chǔ)序列和調(diào)節(jié)元件創(chuàng)建兩個(gè)新的可控制啟動(dòng)子(Kikuchietal.,1981，Nucl.AcidsRes.9:5671-5678)。野生型phoA啟動(dòng)子通常由磷酸化形式的蛋白質(zhì)phoB與緊鄰-10或Pribnow盒上游的pho盒的結(jié)合來(lái)控制。結(jié)合引起RNA聚合酶也結(jié)合并啟動(dòng)從這個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。PhoB在細(xì)胞質(zhì)膜處響應(yīng)周質(zhì)和培養(yǎng)基中的低磷酸鹽濃度隨后被磷酸化(Wanner,1996,EscherichiacoliandSalmonella,Neidhardt(編)，p.1357-1381)。磷酸化的phoB響應(yīng)培養(yǎng)基中低水平磷酸鹽與啟動(dòng)子的結(jié)合表現(xiàn)了phoA啟動(dòng)子的正調(diào)節(jié)。在不存在磷酸化的phoB時(shí)，RNA聚合酶可仍然孩￡弱地結(jié)合phoA啟動(dòng)子，利用-10序列和有些弱的-35序列用于替代的接觸，引起低基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。為了抑制RNA聚合酶在不存在磷酸化的phoB時(shí)結(jié)合phoA啟動(dòng)子，將負(fù)調(diào)節(jié)元件，在此為lac操縱基因序列AATTGTGAGCGGATAACAA(SEQIDNO:18)(Gilbertetal.，1973,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3581-3584)插入到+1轉(zhuǎn)錄起始位置的上游，如表5所示。當(dāng)磷酸鹽以顯著的濃度在培養(yǎng)基中存在(或缺乏)時(shí)，這種增加降低了phoA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄(參見(jiàn)附圖9)。新創(chuàng)造的啟'動(dòng)子phac具有經(jīng)由正調(diào)控元件(phoB結(jié)合pho盒)和添加的負(fù)調(diào)控元件lac操縱基因的正和負(fù)調(diào)節(jié)。phac啟動(dòng)子必需由磷酸鹽饑4我誘導(dǎo)，以及通過(guò)添加誘導(dǎo)物例如異丙基p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)免除乳糖阻抑物控制。已經(jīng)報(bào)道了向其他啟動(dòng)子添加lac操縱基因控制序列(DeBoeretal.1983，Proc.Natl.Acad.Sci，USA,80:21-25;Yansuraetal.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:439-443),然而，在這些啟動(dòng)子中，lac操縱基因序列被用于替換難以搡作的負(fù)調(diào)控元件，或被添加到組成型啟動(dòng)子來(lái)提供新的控制。要控制的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的第二種可能的來(lái)源是來(lái)自用于驅(qū)動(dòng)目標(biāo)膜蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子上游的啟動(dòng)子。已經(jīng)繪制了這種啟動(dòng)子，例如，在質(zhì)粒pBR322上，最常用于大腸桿菌載體的構(gòu)建。phoA的上游啟動(dòng)子可能潛在地由于"通讀"引起基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。為了防止上游轉(zhuǎn)錄進(jìn)行通過(guò)phac啟動(dòng)子和有些膜蛋白的編碼序列，將轉(zhuǎn)錄終止子，在此為Xto轉(zhuǎn)錄終止子AACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATT(SEQIDNO:17)(Scholtisseketal.,1987,Nucl.AcidsRes.，15:3185)以正確的取向插入到pho盒的上游，在添力口的上游序歹'J:AGGCCTAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGTTAACCATGGA(SEQIDNO:19)之內(nèi)。新的啟動(dòng)子tphac以與phac啟動(dòng)子相同的方式誘導(dǎo)，例如，通過(guò)稀釋到磷酸鹽限制培養(yǎng)基中和通過(guò)添加IPTG(數(shù)據(jù)未顯示)。與phac相比，使用tphac時(shí)基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄得到進(jìn)一步降低。表5<image>imageseeoriginaldocumentpage65</image>實(shí)施例4:表達(dá)RAlc的phoAvs.phac為了測(cè)試phoA突變型啟動(dòng)子phac對(duì)復(fù)雜的跨膜多肽在細(xì)菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)和產(chǎn)量的影響，將具有用于有效的翻譯起始的N-末端前導(dǎo)區(qū)MKHQHQQ(SEQIDNO:7)和兩個(gè)C-末端標(biāo)簽Flag和6His的重組RAlc工程化到表達(dá)載體中，并可操作連接到phoA啟動(dòng)子(載體pEfRAlc)和phac啟動(dòng)子(載體pEfRAlcr)。RAlc是具有七個(gè)跨膜片段的跨膜多肽。轉(zhuǎn)化兩種質(zhì)粒都表達(dá)人類(lèi)RAlc(Kretschmeretal.,2001，Gene278.41-51)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌抹58F3(W3110-fhuAA(tonAA)phoAAE15lonAgalErpoHts(htpRts)AclpPlaclqAompTA(nmpc畫(huà)fepE)AslyD)中，將選才奪的轉(zhuǎn)化體挑取物接種到5mL補(bǔ)充有羧節(jié)青霉素(50嗎/mL)的LB培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)輪上在30。C下培養(yǎng)大約14-16小時(shí)。pEfRAlc(phoA啟動(dòng)子)的培養(yǎng)物的OD6oo是1.55,pEfRAlcr(phac啟動(dòng)子)的培養(yǎng)物的是3.57。從LB接種物收集1OD6(xrmL樣品。進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)。然后每個(gè)培養(yǎng)物稀釋(1:100)到具有50|^g/mL羧千青霉素的C.R.A.P.磷酸鹽限制培養(yǎng)基(Simmonsetal.,2002，J.Immunol.Methods263:133-147)中。所有培養(yǎng)物在大約200rpm速度的搖床上在具有500mL最終誘導(dǎo)體積的兩升有擋板燒瓶中在30。C培養(yǎng)。對(duì)于pEfRAlc培養(yǎng)物(phoA啟動(dòng)子)在接種到C.R.A.P.培養(yǎng)基中后10、12、14、16、18、22和24小時(shí)收集1OD6。。-mL樣品。對(duì)于表達(dá)pEfRAlcr(phac啟動(dòng)子)的培養(yǎng)物，在接種到C.R.A.P.培養(yǎng)基中后10和12小時(shí)添加lmMIPTG來(lái)釋放乳糖阻抑物控制。IPTG誘導(dǎo)時(shí)培養(yǎng)物的OD6。o分別是2.79和2.97。對(duì)于所有的IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，在IPTG添加之前和IPTG添加后每?jī)尚r(shí)直到第24小時(shí)，收集1OD6。o-mL樣品。為了Western印跡分析，1OD^-mL樣品的還原的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物如下制備(1)1OD6oo-mL樣品在微量離心管中離心。(2)每個(gè)沉淀物重懸浮在lOO[aLTE(10mMTrispH7.6、ImMEDTA)中。(3)為了還原二石克4建，向每個(gè)樣品添加lO(iL1M二碌^蘇4唐醇(SigmaD-5545)。(4)向每個(gè)樣品添加20^L20%SDS。渦旋震蕩樣品，在90。C加熱5分鐘，然后再次渦旋震蕩。在樣品冷卻到室溫之后，添加800pL丙酮來(lái)沉淀蛋白質(zhì)。渦旋震蕩樣品并在在室溫下放置15分鐘。在微量離心機(jī)中離心5分鐘之后，吸出每個(gè)樣品的上清液，將每個(gè)蛋白質(zhì)沉淀物重懸浮在lOpL1M二石危蘇糖醇加40)iLdH20和50|iL2XNOVEXSDS樣品緩沖液中。然后樣品在90。C加熱5分鐘，良好的渦旋震蕩，并容許冷卻到室溫。然后進(jìn)行最后的5分鐘離心，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈管中。在SDS樣品制備之后，將誘導(dǎo)前樣品的8pL接種物樣品加載到10孑L、1.0mmNOVEX16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE上，并在大約120伏特電泳約1.5小時(shí)。按相同方式制備在C.R.A.P.培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的樣品(pEfRAlc)。對(duì)于在C.R.A.P.培養(yǎng)基中和用IPTG誘導(dǎo)的樣品(pEfRAlcr樣品)，將5.3^L加載到15孔凝膠上。產(chǎn)生的凝膠然后用于Western印跡分析。Western印跡分析SDS-PAGE凝膠在20mM磷酸鈉緩沖液pH6.5中電印跡到硝酸纖維素膜(NOVEX)上。然后在搖擺器上在室溫下使用1XNET(150mMNaCl、5mMEDTA、50mMTrispH7.4、0.05%TritonX畫(huà)100)+0.5%明膠的溶液封閉膜大約30分鐘到一小時(shí)。在封閉步驟之后，將膜置于1XNET+0.5。/。明膠+抗His抗體(來(lái)自RocheDiagnostics的抗his6過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的小鼠單克隆抗體)的溶液中用于抗HisWestern印跡分析。抗His抗體稀釋度是1:5000,膜置于抗體溶液中在室溫下?lián)u動(dòng)過(guò)夜。次日早晨，膜在IXNET中洗滌最少3x10分鐘，然后在TBS(20mMTrispH7.5、500mMNaCl)中1x15分鐘。使用AmershamPharmaciaBiotechECL檢測(cè)使抗His抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)，并將膜使X射線(xiàn)底片曝光。phac啟動(dòng)子的效果早在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟就被顯示。在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜之后比較pEfRAlc(phoA)和pEfRAlcr(phac)的轉(zhuǎn)化體。用pEfRAlcr(phac)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞顯著大于用pEfRAlc轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。附圖9顯示了采自平板并接種在LB/羧千青霉素中大約14-16小時(shí)的菌落樣品的抗HisWestern印跡分析。如印跡的中間泳道所示，從非"i秀導(dǎo)的phoA啟動(dòng)子(pEfRAlc)的RAlc表達(dá)表明了磷酸鹽沒(méi)有限制時(shí)phoA啟動(dòng)子的滲漏。相比之下，從嚴(yán)密調(diào)控的phac啟動(dòng)子(pEfRAlcr)看到?jīng)]有4企測(cè)出RAlc表達(dá)。多跨膜蛋白質(zhì)RA1c從phoA啟動(dòng)子的基礎(chǔ)水平表達(dá)對(duì)于細(xì)胞是有毒的，弓1起在LB中的不良生長(zhǎng)，產(chǎn)生總體上的低細(xì)胞密度。過(guò)夜LB接種物的OD600讀數(shù)從pEfRAlc的1.55提高到pEfRAlcr的3.57，表明使用phac啟動(dòng)子的細(xì)胞更健康。pEfRAlc(phoA啟動(dòng)子)的表達(dá)結(jié)果的時(shí)間過(guò)程在附圖10中示出。培養(yǎng)物中的磷酸鹽預(yù)計(jì)到約2.0OD6oo時(shí)耗盡。早在第10小時(shí)時(shí)檢測(cè)到表達(dá)，OD6。。讀數(shù)為1.73。誘導(dǎo)后第12到第14小時(shí)出現(xiàn)了大約2小時(shí)的非常窄的生產(chǎn)窗口，但是此后生產(chǎn)慢慢地消失。到誘導(dǎo)后第24小時(shí)，表達(dá)的蛋白質(zhì)的單體條帶完全地消失。此外，隨著單體條帶隨著時(shí)間消失，模糊區(qū)(smear)中的非可還原聚集物積累了。維持單體條帶中的蛋白質(zhì)最多時(shí)的最高細(xì)胞密度是第14小時(shí)的2.51OD60()(附圖10中的*)。最佳地，phac啟動(dòng)子應(yīng)^^皮完全地關(guān)閉直到在C.R.A.P.培養(yǎng)基中通過(guò)磷酸鹽耗盡誘導(dǎo)之時(shí)。IPTG誘導(dǎo)的phac啟動(dòng)子(pEfRAlCr)培養(yǎng)物產(chǎn)生的RAlc表達(dá)的時(shí)間過(guò)程在附圖11中示出。在IPTG添加后兩小時(shí)內(nèi)達(dá)到最大蛋白質(zhì)生產(chǎn)，觀察到單體條帶和模糊區(qū)的類(lèi)似表達(dá)模式。第12小時(shí)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物顯示了比第IO小時(shí)誘導(dǎo)的更好的表達(dá)，表明誘導(dǎo)時(shí)間的重要性。最重要地，phac啟動(dòng)子提供了保持細(xì)胞更健康的益處，從而通過(guò)保持啟動(dòng)子完全關(guān)閉直到需要，細(xì)胞可以生長(zhǎng)到更高密度。在誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞經(jīng)歷壓力(stress)并停止生長(zhǎng)，最終細(xì)胞密度降低。添加IPTG前的12小時(shí)培養(yǎng)物已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)RAlc,推測(cè)是由于作為磷酸鹽耗盡的結(jié)果的phac啟動(dòng)子的部分誘導(dǎo)。如果晚于第12小時(shí)添加IPTG，則phac啟動(dòng)子可能變得不太有用。因而，在這些培養(yǎng)條件之下，在第12小時(shí)添加IPTG看來(lái)是利用phac啟動(dòng)子的最晚的時(shí)點(diǎn)。在IPTG誘導(dǎo)(第12小時(shí))之后兩小時(shí)在14小時(shí)，達(dá)到最大的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。使用phac啟動(dòng)子在第14小時(shí)OD6。o是2.97,大于phoA啟動(dòng)子獲得的2.51。phoA啟動(dòng)子和phac啟動(dòng)子的RAlc總體表達(dá)的比較在附圖12中示出。phoA和phac啟動(dòng)子產(chǎn)生的最好的表達(dá)呈現(xiàn)在相同的印跡上來(lái)進(jìn)行直接比較。明顯的是，phac啟動(dòng)子在第12小時(shí)的兩小時(shí)RAlc誘導(dǎo)(右側(cè)泳道)產(chǎn)生了比phoA啟動(dòng)子在第14小時(shí)的最高表達(dá)(左側(cè)泳道)更高的蛋白質(zhì)表達(dá)和更高的細(xì)胞密度。實(shí)施例5:phoAvs.phac表達(dá)人類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體73(GPR73)為了進(jìn)一步分析phoA突變型啟動(dòng)子phac對(duì)EG-VEGF受體(GPR73)的表達(dá)和產(chǎn)量的影響，使用質(zhì)粒pST239.EGVEGFrl.Flag.H8.1270(phoA啟動(dòng)子)和pRIFHr(phac啟動(dòng)子)進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)。兩個(gè)質(zhì)粒都表達(dá)人類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體73蛋白質(zhì)(hGPR73)(Linetal.,2002，J.Biol.Chem.277:19276-19280)，具有用于有效翻譯起始的N-末端前導(dǎo)序歹'KMKHQHQQ，SEQIDNO:7)和兩個(gè)C-末端標(biāo)簽，F(xiàn)lag和8xHis。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌抹58F3(W3110-fhuAA(tonAA)phoAAE15lonAgalErpoHts(htpRts)AclpPlaclqAompTA(nmpc-fepE)AslyD)中。將選擇的轉(zhuǎn)化體挑取物接種到5mL補(bǔ)充有羧千青霉素(50pg/mL)的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)輪上在30°C培養(yǎng)大約14-16小時(shí)。含有phoA啟動(dòng)子的pST239,EGVEGFrl.Flag.H8.1270的過(guò)夜培養(yǎng)物的光密度(OD6。。)是0.84，而含有phac啟動(dòng)子的pRIFHr的培養(yǎng)物是3.19。從過(guò)夜LB接種物收集1OD6()()-mL樣品。然后每個(gè)培養(yǎng)物稀釋(1:100)到具有50嗎/mL羧卡青霉素的C.R.A.R磷酸鹽限制培養(yǎng)基(Simmonsetal.，2002，J.Immunol.Methods,263:133-147)中。所有培養(yǎng)物在大約200rpm速度的搖床上在具有500mL最終誘導(dǎo)體積的兩升有擋板燒瓶中在25。C培養(yǎng)。對(duì)于pST239.EGVEGFrl.Flag.H8.1270(phoA)培養(yǎng)物，在接種到C.R.A.P.培養(yǎng)基中后14、15、16、17和24小時(shí)，收集1OD6oo-mL樣品。對(duì)于表達(dá)pRlFHr(phac)的培養(yǎng)物，在接種到C.R.A.P.培養(yǎng)基中后14和15小時(shí)添加lmMIPTG。IPTG誘導(dǎo)時(shí)培養(yǎng)物的OD6o。分別是2.37(14小時(shí))和3.21(15小時(shí))。對(duì)于第14小時(shí)的誘導(dǎo)，在添加IPTG前、IPTG添加后兩、三和十.小時(shí)收集1OD6oo-mL樣品。對(duì)于第15小時(shí)的誘導(dǎo)，在IPTG添加前、IPTG添加后兩小時(shí)和九小時(shí)收集1OD6(xrmL樣品。如上文實(shí)施例4關(guān)于RAlc所描述的，制備1OD6oo-mL樣品的還原的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。在SDS樣品制備之后，所有樣品的8pL還原的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物加載到10孔、1.0mmNOVEX制造的16。/oTris-甘氨酸SDS-PAGE上,并在大約120伏特電泳約1.5小時(shí)。如上文實(shí)施例3關(guān)于RAlc所描述的，產(chǎn)生的凝力交然后用于Western印跡分析。來(lái)自phoA啟動(dòng)子和來(lái)自phac啟動(dòng)子的GPR73表達(dá)的抗HisWestern印跡結(jié)果在附圖13中示出。在誘導(dǎo)前從phoA啟動(dòng)子(pST239.EGVEGFrl.Flag.H8.1270)表達(dá)了人類(lèi)GPR73(中間泳道)，表明當(dāng)磷酸鹽不構(gòu)成限制時(shí)phoA啟動(dòng)子的滲漏。相比之下，從嚴(yán)密調(diào)控的phac啟動(dòng)子沒(méi)有檢測(cè)到hGPR73表達(dá)(右側(cè)泳道)。如實(shí)施例3中的RAlc表達(dá)所注意到的，多跨膜蛋白質(zhì)從phoA啟動(dòng)子的基礎(chǔ)水平表達(dá)對(duì)于細(xì)胞是有毒的，引起在LB中的不良生長(zhǎng)，產(chǎn)生總體上的低細(xì)胞密度。過(guò)夜LB接種物的OD600讀數(shù)從pST239.EGVEGFrl.Flag.H8.1270(phoA啟動(dòng)子)的0.84提高到pRlFHr(phac啟動(dòng)子)的3.19，表明更健康的細(xì)胞和含有phac啟動(dòng)子的細(xì)胞的生長(zhǎng)。phoA啟動(dòng)子的GPR73表達(dá)結(jié)果的時(shí)間過(guò)程在附圖14中示出。第15小時(shí)檢測(cè)到表達(dá)及二聚體條帶的存在，OD,讀數(shù)為3.14,到第24小時(shí)蛋白質(zhì)完全消失。相比之下，通過(guò)提高的OD6oo讀數(shù)注意到細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)。這種持續(xù)生長(zhǎng)是使用phoA啟動(dòng)子表達(dá)有些多跨膜蛋白時(shí)觀察到的多變結(jié)果的實(shí)例，表明有些細(xì)胞通過(guò)某種方法下調(diào)表達(dá)。不考慮這些，GPR73的表達(dá)模式類(lèi)似于RAlc的實(shí)施例3中或其他多跨膜蛋白質(zhì)所見(jiàn)的。表達(dá)在第16小時(shí)達(dá)到"^值，相應(yīng)的OD60()是3.46。最佳地，phac啟動(dòng)子應(yīng)^f皮完全地關(guān)閉直到在C.R.A.P.培養(yǎng)基中通過(guò)磷酸鹽耗盡誘導(dǎo)之時(shí)。IPTG誘導(dǎo)的GPR73表達(dá)在附圖15中示出。沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)時(shí)沒(méi)有看到可檢測(cè)的hGPR73表達(dá)，表明phac啟動(dòng)子的嚴(yán)密性。在添加IPTG后兩小時(shí)內(nèi)達(dá)到最大蛋白質(zhì)生產(chǎn)。早期出現(xiàn)的單體和二聚體條帶觀察到相似的表達(dá)模式，而模糊區(qū)在誘導(dǎo)中稍后出現(xiàn)。在誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞經(jīng)歷壓力并停止生長(zhǎng)，最終細(xì)胞密度降低。第15小時(shí)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物顯示了比第14小時(shí)誘導(dǎo)的更好的表達(dá)。在第17小時(shí)即IPTG誘導(dǎo)(第15小時(shí))后兩小時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)量，OD6oo是2.41。在附圖16中比較了使用phoA和phac啟動(dòng)子的hGPR73的總體表達(dá)。產(chǎn)自每個(gè)啟動(dòng)子的最好的表達(dá)呈現(xiàn)在同一印跡上用于直接比較。當(dāng)與phac啟動(dòng)子(右側(cè)泳道)相比時(shí)，使用phoA啟動(dòng)子(中間泳道)沒(méi)有看到可4企測(cè)的hGPR73表達(dá)，只是有更長(zhǎng)的膠片曝光。明顯的是，使用phac啟動(dòng)子在第15小時(shí)的hGPRJ3兩小時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生了高得多的蛋白質(zhì)表達(dá)。使用phoA啟動(dòng)子的表達(dá)結(jié)果也傾向于多變，而使用phac啟動(dòng)子的表達(dá)結(jié)果是相對(duì)恒定的。實(shí)施例6:用于膜蛋白MS4A4A的phoAvs.tphac為了分析突變型phoA啟動(dòng)子tphac對(duì)MS4A家族多肽的表達(dá)和產(chǎn)量的影響，使用具有phoA啟動(dòng)子的pMS4A4A.8His.32和具有tphac啟動(dòng)子的pMS4A4ArT進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)。兩個(gè)質(zhì)粒都表達(dá)人免疫球蛋白E受體樣蛋白(hIGERB)(固S4A4A)(Liangetal.，2001,Genomics72:119-127)，具有用于有效翻譯起始的N-末端前導(dǎo)區(qū)MKHQHQQ,和C-末端8x-his標(biāo)簽。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌材、58F3(W3110-fhuAA(tonAA)phoAAE15lonAgalErpoHts(htpRts)AclpPlaclqAompTA(nmpc-fepE)AslyD)中，將選擇的轉(zhuǎn)化體挑取物接種到5mL補(bǔ)充有羧千青霉素(50ng/mL)的LB培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)輪上在30。C培養(yǎng)大約14-16小時(shí)。使用pMS4A4A.8His.32(phoA)的培養(yǎng)物的OD固是2.4,使用pMS4A4ArT(tphac)的培養(yǎng)物是2.5。從過(guò)夜LB接種物采集1OD60()-mL樣品。然后每個(gè)培養(yǎng)物稀釋(1:100)到具有50嗎/mL羧千青霉素的C.R.A.P.磷酸鹽限制培養(yǎng)基(Simmonsetal.，2002，同上)中。所有培養(yǎng)物在大約200rpm速度的搖床上在具在500mL最終誘導(dǎo)體積的兩升有擋板燒瓶中在3(TC培養(yǎng)。對(duì)于pMS4A4A.8His.32培養(yǎng)物(phoA)在接種到C,R.A.P.培養(yǎng)基中后10、U、12、14和15小時(shí)，收集1OD6。o-mL樣品。對(duì)于表達(dá)pMS4A4ArT(tphac)的培養(yǎng)物，在接種到C.R.A.P.培養(yǎng)基中后10和10.5小時(shí)添加lmMIPTG。IPTG誘導(dǎo)時(shí)培養(yǎng)物的0D6。。分別是2.1和2.6。對(duì)于第10小時(shí)添加IPTG的pMS4A4ArT培養(yǎng)物，在IPTG添加前、IPTG添加后一、二、四和五小時(shí)收集1OD6。o-mL樣品。對(duì)于第10.5小時(shí)添加IPTG的pMS4A4ArT培養(yǎng)物，在IPTG添加前、IPTG添加后一'卜時(shí)和四小時(shí)收集1OD600-mE樣品。如實(shí)施例4描述，制備1OD6o。-mL樣品的還原的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。在SDS樣品制備之后，8pLpMS4A4A.8His.32(phoA)和pMS4A4ArT(tphac)樣品加載到10孔、1.OmmNOVEX制造的16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE上，并在大約120伏特電泳約1.5小時(shí)。在C.R.A.P培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的樣品加載到15孔凝月交上。如實(shí)施例3所述，產(chǎn)生的凝膠然后用于Western印跡分析。顯示在液體LB培養(yǎng)基中pMS4A4A.8His.32(phoA)和pMS4A4ArT(tphac)載體的MS4A4A表達(dá)的抗HisWestern印跡結(jié)果在附圖17中示出。在沒(méi)有誘導(dǎo)的情況下從phoA啟動(dòng)子(pMS4A4A.8His.32)表達(dá)出人免疫球蛋白E受體樣蛋白(hIGERB)，表明當(dāng)磷酸鹽不構(gòu)成限制時(shí)phoA啟動(dòng)子的滲漏。相比之下，使用嚴(yán)密調(diào)控的tphac啟動(dòng)子在hMS4A4A誘導(dǎo)之前沒(méi)有檢測(cè)到蛋白質(zhì)表達(dá)。過(guò)夜LB接種物的OD麵讀數(shù)從pMS4A4A.8His.32(phoA)的2.4稍微提高到pMS4A4ArT(tphac)的2.5。phoA啟動(dòng)子的MS4A4A表達(dá)結(jié)果的時(shí)間過(guò)程在附圖18中示出。在第11小時(shí)時(shí)檢測(cè)到表達(dá)，OD,讀數(shù)為2.24。蛋白質(zhì)是隨著時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定的；然而，蛋白質(zhì)表達(dá)不隨著時(shí)間提高。在第11小時(shí)的一小時(shí)內(nèi)達(dá)到最大產(chǎn)量。此后細(xì)胞密度降低。來(lái)自pMS4A4ArT(tphac)培養(yǎng)物的IPTG誘導(dǎo)的MS々A々A表達(dá)的結(jié)果在附圖19中示出。在沒(méi)有添加IPTG的情況下沒(méi)有看到可檢測(cè)的hIGERB蛋白質(zhì)表達(dá)，表明tphac啟動(dòng)子的嚴(yán)密性。在IPTG誘導(dǎo)后一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)表達(dá)。在OD6。。為2.1的第10小時(shí)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物顯示了比在OD,為2.6的第10.5小時(shí)誘導(dǎo)的稍好的表達(dá)。在IPTG誘導(dǎo)后兩小時(shí)即第12小時(shí)(IPTG在第10小時(shí)添加)達(dá)到最大產(chǎn)量，OD6。o是2.36。在附圖20中比較了phoA啟動(dòng)子和tphac啟動(dòng)子的hMS4A4總體表達(dá)。phoA和tphac啟動(dòng)子產(chǎn)生的最好的表達(dá)呈現(xiàn)在相同的印跡上來(lái)進(jìn)行直接比較。IPTG誘導(dǎo)的pMS4A4ArT(IPTG在第10小時(shí)添加)的第12小時(shí)樣品樣品的顯著改善。tphac驅(qū)動(dòng)的培養(yǎng)物的OD60()是2.19,而phoA啟動(dòng)子的峰值表達(dá)的OD6oo是2.24。實(shí)施例7:使用trpLE前導(dǎo)區(qū)提高CD20表達(dá)trpLE序列已經(jīng)被使用多年，作為N-末端融合配偶體來(lái)表達(dá)難以積累的凈爭(zhēng)另寸成問(wèn)題的蛋白質(zhì)(參見(jiàn)例^口Yansura,1990，MethodsinEnzymology，Vol.185:161-166，AcademicPressInc.,SanDiego，CA)。trpLE蛋白質(zhì)一4殳表現(xiàn)出一端的trp前導(dǎo)區(qū)及tipE基因的遠(yuǎn)端部分的按讀碼框的刪除。已經(jīng)報(bào)道了兩個(gè)版本，AtrpLE1417和AtrpLE1413(參見(jiàn)例如Bertrandetal.,1976,J.Mol.Biol.103:319-337和Miozzarietal.,1978，J,Bacteriol.133:1457-1466)。AtrpLE1413已經(jīng)被用于構(gòu)建載體，用于幾種人類(lèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,888,808)。然而，用相似的載體pHS94表達(dá)跨膜蛋白乙型肝炎表面抗原的努力被報(bào)告為否定的結(jié)果(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No:4,S03，164和4,741,901)。與trpLE融合的蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)一般歸因于強(qiáng)trp啟動(dòng)子，包括trp前導(dǎo)區(qū)的前幾個(gè)密碼子的強(qiáng)翻譯起始區(qū)，和異源蛋白質(zhì)變?yōu)榈鞍姿夥€(wěn)定的折射體的結(jié)果推動(dòng)。為了確定trpLE前導(dǎo)區(qū)是否可以推動(dòng)多跨膜蛋白質(zhì)成為折射體和/或以其它方式提高異源多跨膜蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和產(chǎn)量，使用兩個(gè)版本的trpLE序列前導(dǎo)區(qū)，稱(chēng)為L(zhǎng)E(SEQIDNO:25)和sLE(SEQIDNO:26)制造了幾種構(gòu)建體。這些構(gòu)建體包含更嚴(yán)密調(diào)控的phoA啟動(dòng)子和phac/tphac啟動(dòng)子，如以上實(shí)施例描述的。兩個(gè)前導(dǎo)區(qū)中4交長(zhǎng)的一個(gè)，LE，含有大腸桿菌trpE蛋白的前九個(gè)氨基酸((M)KAIFVLKGS，SEQIDNO:27),例如在表達(dá)載體pNCV(AtrpLE1413)中描述了(Maniatisetal.，In:MolecularCloning:ALaboratoryManual,p426,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1982.)，繼之以trpE多肽的氨基酸339-408(SEQIDNO:25)，如附圖22所示。較小的trpLE序列前導(dǎo)區(qū)(sLE)含有trp前導(dǎo)區(qū)的相同的前九個(gè)氨基酸，繼之以來(lái)自trpE多肽的不連續(xù)氨基酸的序列(SEQIDNO:26)，也在附圖22中示出。這兩個(gè)trpLE前導(dǎo)區(qū)對(duì)于膜插入而言表現(xiàn)類(lèi)似，而較長(zhǎng)的LE前導(dǎo)區(qū)的表達(dá)水平高出約兩倍。LECD20的克隆和表達(dá)Cyslll和Cys220各自^L替換為絲氨酸，以及Cys81替換為丙氨酸的突變型CD20使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Ausubeletal.編，2003，CurrentProtocolsinMolecularBiology,4Vols.,JohnWiley&Sons)亞克隆到含有(3畫(huà)內(nèi)酰胺酶基因和三個(gè)稀有大腸桿菌密碼子的tRNA基因(argU、glyT和pro2)的pBR322衍生質(zhì)粒中。在N-末端添加79個(gè)氨基酸的trpLE間隔區(qū)序列(SEQIDNO:25)和GS接頭序列。凝血酶裂解識(shí)別位點(diǎn)添加在CD20的第九個(gè)氨基酸之后來(lái)裂解trpLE前導(dǎo)區(qū)，以及在CD20的第236個(gè)氨基酸之后來(lái)裂解細(xì)胞內(nèi)親水性的尾部。為了編碼在C-末端的標(biāo)簽序列，添加8xHis(SEQIDNO:8)來(lái)幫助所表達(dá)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和純化。產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱(chēng)為pLEfGKiSArT?；蜣D(zhuǎn)錄處于phoA啟動(dòng)子的控制下，通過(guò)限制磷酸鹽來(lái)誘導(dǎo)大腸桿菌菌抹58F3中的表達(dá)，如以上的實(shí)施例4所述的。飽和的LB羧芐青霉素培養(yǎng)基稀釋到C.R.A.P.磷酸鹽限制培養(yǎng)基(Simmonsetal.,2002，J.Immunol.Methods,263:133-147)中。然后培養(yǎng)物在30。C培養(yǎng)24小時(shí)。為了表達(dá)分析，1OD6Q(rmL樣品的還原的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物如下制備(1)1OD鋼-mL才羊品在孩i量離心管中離心。(2)每個(gè)沉淀物重懸浮在70pLTE(10mMTrispH7.6、ImMEDTA)中。(3)為了還原二石克鍵，向每個(gè)樣品添加10nL1M二石危蘇糖醇(SigmaD-5545)。(4)向每個(gè)樣品添加20piL20%SDS。渦旋震蕩樣品，在90。C加熱5分鐘，然后再次渦旋震蕩。在樣品冷卻到室溫之后，添加100|iL2XNOVEXSDS樣品緩沖液。然后樣品在90。C加熱5分鐘，良好的渦旋震蕩，并容許冷卻到室溫。然后進(jìn)行最后的5分鐘離心，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈管中。在SDS樣品制備之后，16|iL誘導(dǎo)樣品加載到10孑L、1.0mmNOVEX16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE上，并在大約120伏特電泳約1.5小時(shí)。產(chǎn)生的凝膠用添加10%乙酸的Coomassie藍(lán)染色。為了Western印跡分析，加載l]iL全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，產(chǎn)生的凝膠在lXTris-甘氨酸緩沖液(Invitrogen,CA)、0.01%SDS、5%曱醇中電印跡到硝酸纖維素膜(NOVEX)上。然后在搖擺器上在室溫下j吏用1XNET(150mMNaCl、5mMEDTA、50mMTrispH7.4、0.05%TritonX-100)和0.5%明膠的溶液封閉膜大約30分鐘到一小時(shí)。在封閉步驟之后，將膜置于1XNET、0.5%明膠、含抗His抗體(來(lái)自RocheDiagnostics的抗his6過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的小鼠單克隆抗體)的溶液中用于抗HisWestern印跡分析?？笻is抗體稀釋度是1:5,000，膜在IXNET中洗滌最少3x10分鐘，然后在TBS(20mMTrispH7.5、500mMNaCl)中1x15分鐘。使用AmershamPharmaciaBiotechECL檢測(cè)使抗His抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)，并將膜使X射線(xiàn)底片曝光。附圖23顯示了LE.CD20的構(gòu)建體圖，和由LE.CD20產(chǎn)生的CD20表達(dá)，與如實(shí)施例1所描述的、來(lái)自沒(méi)有trpLE前導(dǎo)區(qū)的phoA啟動(dòng)子、但在具有前導(dǎo)序列MKHQHQQ(SEQIDNO:7)的phoA啟動(dòng)子的控制下的表達(dá)相比較。使用trpLE,CD20蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)和生產(chǎn)被大大地增強(qiáng)到在Coomassie藍(lán)染色凝膠上可檢測(cè)的水平。Western印跡分析顯示了使用trpLE前導(dǎo)區(qū)比沒(méi)有trpLE前導(dǎo)區(qū)好出大約10倍的CD20表達(dá)產(chǎn)量(數(shù)據(jù)未顯示)。估計(jì)的表達(dá)水平是每1升培養(yǎng)物約30毫克trpLE融合的CD20。LECD20膜蛋白提取為了分析trpLE融合CD20的溶解度，使用Polytron(Brinkmann，Westbury,NY)在每lg糊狀物10mL天然裂解緩沖液(20mMTrispH7.5、300mMNaCl)中重懸浮細(xì)胞沉淀物，使用微流化儀(MicrofluidicsCorp，Newton,MA)通過(guò)細(xì)胞破壞來(lái)裂解，使用超速離心轉(zhuǎn)子TLA-100.3(Beckman，F(xiàn)ullerton,CA)在391,000xg離心1小時(shí)。從含有膜蛋白和不溶性蛋白質(zhì)的沉淀物(沉淀物1)分離含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液(上清液1)。沉淀物1然后使用Polytron在含非變性中性洗滌劑1%Fos-Choline12的天然裂解緩沖液中重懸浮，在4。C提取過(guò)夜。第二天，再次超速離心樣品，含有膠團(tuán)形式的膜結(jié)合蛋白質(zhì)的上清液(上清液2)從不溶蛋白(沉淀物2)分離。沉淀物和上清重懸浮在還原性SDS加載緩沖液中到相等體積，通過(guò)SDS-PAGE和用夢(mèng)束才艮過(guò)氧化物酶偶耳關(guān)的抗His抗體(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)探查硝酸纖維素膜上的免疫印跡來(lái)分析。獲得的結(jié)果展現(xiàn)來(lái)自膜的幾乎完全的trpLE.CD20提取，如Coomassie藍(lán)染色的凝膠和免疫印跡所示(附圖24)。LECD20密度梯度離心通過(guò)在離心管中疊放用150mMNaCl和20mMHEPESpH7.2緩沖的1.9M和1.4M蔗糖溶液，產(chǎn)生不連續(xù)的蔗糖梯度。表達(dá)LECD20蛋白質(zhì)的細(xì)胞在天然裂解緩沖液中裂解。通過(guò)使用超速離心轉(zhuǎn)子TLA100.3(Beckman,Fullerton,CA)在391，000xg(85Krpm)超速離心1小時(shí)來(lái)分離膜和不溶級(jí)分。丟棄上清液，沉淀物重懸浮在1.9M蔗糖溶液中。100pL重懸浮物的等分量再次與0.9mL1.9M哀糖溶液混合。然后將這種混合物置于離心管的底部，lmL1.4M蔗糖溶液疊放在上。樣品放入SWTi55轉(zhuǎn)子，在128,356xg(32.5Krpm)旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。小心地從管頂部取出200|iiL等分量的分級(jí)樣品，通過(guò)SDS-PAGE分析每個(gè)級(jí)分(IO份頂部，l份底部)，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素，并用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗His抗體探查。Western印跡分析表明，trpLE融合CD20多肽在1.4M和1.9M蔗糖溶液的界面處的膜層中發(fā)現(xiàn)(級(jí)分5和6),大部分多肽在級(jí)分5中(數(shù)據(jù)未顯示)，表明大部分trpLE融合CD20多肽看起來(lái)插入在大腸桿菌膜中。LECD20凝血酶裂解具有l(wèi)mM氯化4丐的凝血酶以1:1000稀釋度添加到來(lái)自溶解性分析的l%Fos-Choline12可溶膜提取物中，在室溫下放置過(guò)夜。還原的SDS制備的樣品通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分析。Coomassie藍(lán)染色的凝膠顯示了工程化在融合蛋白上的兩個(gè)凝血酶裂解位點(diǎn)的良好裂解，產(chǎn)生了三個(gè)蛋白質(zhì)條帶，包括截短的CD20跨膜結(jié)構(gòu)域(26kDa)、trpLE(llkDa)和CD20的親水性C-末端尾部(8kDa)(數(shù)據(jù)未顯示)。來(lái)自三個(gè)條帶的每一個(gè)的肽的N-末端被測(cè)序來(lái)確認(rèn)身傷乂identity)。實(shí)施例8:使用trpLE前導(dǎo)區(qū)提高RAlc表達(dá)LERAlc的克隆和表達(dá)使用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，將編碼RAlc的DNA亞克隆到含有P-內(nèi)酰胺酶基因和三個(gè)稀有大腸桿菌密碼子的tRNA基因(argU、glyT和pro2)的pBR322衍生質(zhì)粒中。trpLE前導(dǎo)區(qū)及其后面的flag標(biāo)簽(DYKDDDDK,SEQIDNO:32)和凝血酶識(shí)別位點(diǎn)(thrX)(LVPRGS，SEQIDNO:31)添加在RAlc的N-末端，以分別確保高效的翻譯起始、檢測(cè)和裂解。十個(gè)組氨酸殘基被添加在C-末端來(lái)幫助所表達(dá)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和純化。產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱(chēng)為pLEfRAlCnFcHrT?；蜣D(zhuǎn)錄處于tphac啟動(dòng)子的控制下，通過(guò)在約2到3OD6。。的細(xì)胞密度下限制磷酸鹽和添加ImMIPTG來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)，如以上的實(shí)施例所描述的。飽和的LB羧節(jié)青霉素培養(yǎng)基稀釋到C.R.A.P.磷酸鹽限制培養(yǎng)基(Simmonsetal.，2002，J.Immunol.Methods,263:133-147)中。在IPTG添加后在30。C培養(yǎng)培養(yǎng)物6小時(shí)。為了表達(dá)分析，1OD6o。-mL樣品的還原的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物如之前實(shí)施例7所描述的制備。在SDS樣品制備之后，5pL誘導(dǎo)樣品加載到10孔、1.0mmNOVEX16。/。Tris-甘氨酸SDS-PAGE上，并在大約120伏特電泳約1.5小時(shí)。為了Western印跡分析，產(chǎn)生的凝膠在IXTris-甘氨酸緩沖液(Invitrogen，CA)、0.01%SDS、5%曱醇中電印跡到硝酸纖維素膜(NOVEX)上。然后在搖擺器上在室溫下使用IXNET(150mMNaCl、5mMEDTA、50mMTrispH7.4、0.05%TritonX-100)和0.5%明膠的溶液封閉膜大約30分鐘到一'J、時(shí)。在封閉步驟之后，將膜置于1XNET、0.5%明膠、和抗His抗體(來(lái)自RocheDiagnostics的抗his6過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的小鼠單克隆抗體)的溶液中用于抗HisWestern印跡分析?？笻is抗體稀釋度是1:5,000，膜在IXNET中洗滌最少3xl0分鐘，然后在TBS(20mMTrispH7.5、500mMNaCl)中1x15分鐘。使用AmershamPharmaciaBiotechECL才企測(cè)4吏抗His抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)，并將膜使X射線(xiàn)底片曝光。附圖25顯示了LE.RAlc(47.6kDa)的構(gòu)建體圖，并比較了LE.RAlc產(chǎn)生的RAlc表達(dá)與缺乏trpLE前導(dǎo)區(qū)、含有前導(dǎo)序列MKHQHQQ(SEQIDNO:7)的構(gòu)建體表達(dá)的RAlc,兩者都處在如實(shí)施例4所描述的tphac啟動(dòng)子的控制下。使用抗His抗體的Western印跡表明了含有LE前導(dǎo)序列的LE.RAlc相對(duì)沒(méi)有trpLE前導(dǎo)區(qū)的RAlc的大大改善的表達(dá)水平(參見(jiàn)附圖25)。RAlc膜蛋白提取為了分析trpLE融合RAlc的溶解度，使用Polytron(Brinkmann，Westbury，NY)在每lg糊狀物lOmL天然裂解緩沖液(20mMTrispH7.5,300mMNaCl)中重懸浮細(xì)胞沉淀物，使用樣i流化儀(MicrofluidicsCorp,Newton,MA)通過(guò)細(xì)胞破壞來(lái)裂解，使用超速離心轉(zhuǎn)子TLA-100.3(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)在391'000xg離心1小時(shí)。從含有膜蛋白和不溶性蛋白質(zhì)的沉淀物(沉淀物1)分離含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液(上清液1)。沉淀物1然后使用Polytron在含非變性洗滌劑1%Fos-Choline12的天然裂解緩沖液中重懸浮，在4。C提取過(guò)夜。第二天，再次超速離心樣品，含有膠團(tuán)形式的膜結(jié)合蛋白質(zhì)的上清液(上清液2)從不溶蛋白(沉淀物2)分離。沉淀物和上清液重懸浮在還原性SDS加載緩沖液中到相等體積，通過(guò)SDS-PAGE和用辣才艮過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗His抗體(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)探查硝酸纖維素膜上的免疫印跡來(lái)分析。如附圖26所示，在Coomassie藍(lán)染色的凝膠和免疫印跡中都觀察到來(lái)自膜的幾乎完全的LE.RAlc提取。RAlc蛋白質(zhì)的產(chǎn)量足以在1%Fos-Choline12提取之后的Coomassie藍(lán)染色的凝膠中觀察。LERAlc密度梯度離心使用如上文實(shí)施例7中針對(duì)CD20所述的方法對(duì)LERAlc進(jìn)行密度梯度離心。簡(jiǎn)要地，通過(guò)如上所述疊放1.9M和1.4M蔗糖溶液來(lái)產(chǎn)生不連續(xù)的蔗糖梯度。按照與實(shí)施例7所描述的相同方式，Western印跡分析的結(jié)果表明所述大部分LE.RAlc多肽看起來(lái)插入在大腸桿菌膜中(數(shù)據(jù)未顯示)。RAlc蛋白質(zhì)分離為了分離LE.RAlc蛋白質(zhì)，上述溶解度分析中的1%Fos-Choline12可溶膜提取物加載到Ni-NTAPhyTip柱(Phynexus，SanJose,CA)上，用天然裂解緩沖液中的50mM咪唑和0.5%Fos-Choline12洗滌，用天然裂解緩沖液中的250mM咪唑和0.75%Fos-Choline12洗脫。洗脫級(jí)分重懸浮在還原性SDS加載緩沖液中，并通過(guò)SDS-PAGE分析。SDS-PAGE凝膠顯示了47.6kDa分子量的純化的LE.RAlc(數(shù)據(jù)未顯示)。已知的是，G蛋白偶聯(lián)受體多聚化，例如二聚，甚至在存在還原劑和SDS的情況下(Bouvier,2001,NatureReviewsNeuroscience,2:274-286)。在凝膠中所見(jiàn)的上部條帶看來(lái)是RAlc的這種二聚體和寡聚體，通過(guò)分子量來(lái)判斷(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)N-末端蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)序確認(rèn)純化的蛋白質(zhì)為L(zhǎng)E.RAlc。根據(jù)Coomassie藍(lán)染色后蛋白質(zhì)條帶強(qiáng)度的計(jì)算，從1升搖瓶培養(yǎng)物的全細(xì)胞提取物中可以分離大約10毫克trpLERAlc。LERAlc凝血酶裂解為了分離RAlc多肽，將具有l(wèi)mM氯化鈣的凝血酶以1:1000稀釋度添加到純化的RAlc洗脫液，并在室溫下放置過(guò)夜來(lái)發(fā)揮凝血酶的酶活性。將樣品還原、制備，并通過(guò)SDS-PAGE分析。產(chǎn)生的Coomassie藍(lán)染色的凝膠顯示了融合蛋白在插入的凝血酶裂解位點(diǎn)處的良好裂解，產(chǎn)生了兩個(gè)蛋白質(zhì)條帶，包括截短的RAlc融合物(37kDa)和具有flag標(biāo)簽的trpLE(10.6kDa)(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)N-末端測(cè)序確認(rèn)了裂解的多肽條帶的身份。實(shí)施例9:使用trpLE前導(dǎo)區(qū)提高的GPR73表達(dá)LE人類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體73(hGPR73)的克隆和表達(dá)編碼人類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體73(GPR73)的DNA使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Ausubeletal.編，2003，CurrentProtocolsinMolecularBiology,4Vols.,JohnWiley&Sons)亞克隆到含有(3-內(nèi)酰胺酶基因和三個(gè)稀有大腸桿菌密碼子的tRNA基因(argU、glyT和pro2)的pBR322衍生質(zhì)粒中。如附圖25所示，trpLE前導(dǎo)區(qū)及其后面的flag標(biāo)簽(DYKDDDDK，SEQIDNO:32)和凝血酶識(shí)別位點(diǎn)(thrX)(LVPRGS,SEQIDNO:31)添加在GPR73的N-末端，以分別確保高效的翻譯起始、檢測(cè)和裂解。8xHis標(biāo)簽(SEQIDNO:8)添加到C-末端來(lái)幫助所表達(dá)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和純化。產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱(chēng)為pLEfRlnFcHrT。如上文實(shí)施例8所述，基因轉(zhuǎn)錄處于tphac啟動(dòng)子的控制下，通過(guò)在約2到3OD6(K)的細(xì)胞密度下限制磷酸鹽和添加ImMIPTG來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)。飽和的LB羧千青霉素培養(yǎng)基稀釋到C.R.A.P.磷酸鹽限制培養(yǎng)基(Simmonsetah，2002,J,Immunol.Methods,263:133-147)中。在IPTG添加后在30。C培養(yǎng)培養(yǎng)物6小時(shí)。為了表達(dá)分析，1OD6CQ-mL樣品的還原的全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物如之前實(shí)施例7所描述的制備。5pLSDS誘導(dǎo)樣品加載到10孔、1.0mmNOVEX16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE上，并在大約120伏特電泳約1.5小時(shí)。為了Western印跡分析，產(chǎn)生的凝膠在IXTransfer緩沖液(Invitrogen,CA)、0.01%SDS、5%曱醇中電印跡到硝酸纖維素膜(NOVEX)上。然后在搖擺器上在室溫下使用1XNET(150mMNaCl、5mMEDTA、50mMTrispH7.4、0.05%TritonX-100)和0.5%明膠的溶液封閉膜大約30分鐘到一小時(shí)。在封閉步驟之后，將膜置于IXNET、0.5%明膠、和抗His抗體(來(lái)自RocheDiagnostics的抗his6過(guò)氧化物酶偶4關(guān)的小鼠單克隆抗體)的溶液中用于抗HisWestern印跡分析。抗His抗體稀釋度是1:5,000，膜在IXNET中洗滌最少3x10分鐘，然后在TBS(20mMTrispH7.5、500mMNaCl)中1x15分鐘。使用AmershamPharmaciaBiotechECL檢測(cè)使抗His抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)，并將膜對(duì)X射線(xiàn)底片曝光。附圖25顯示了構(gòu)建體圖表和與沒(méi)有trpLE前導(dǎo)區(qū)的GPR73相比較的表達(dá)結(jié)果。Western印跡顯示了相對(duì)沒(méi)有trpLE前導(dǎo)區(qū)的LE.GPR73大大改善的LE.GPR73表達(dá)和產(chǎn)量水平。LE人類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體73膜蛋白提取為了分析trpLE融合GPR73的溶解度，如上文實(shí)施例7和8中對(duì)于LE.CD20和LE.RAlc蛋白質(zhì)的類(lèi)似分析所描述的從細(xì)胞膜提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行分析。從含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液(上清液1)分離膜蛋白(沉淀物1)。然后用Fos-Choline12提取沉淀物1,從不溶性蛋白質(zhì)(沉淀物2)分離膠團(tuán)(上清液2)中的膜蛋白。沉淀物和上清液重懸浮在還原性SDS加載緩沖液中到相等體積，通過(guò)SDS-PAGE和用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗His抗體(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)探查硝酸纖維素膜上的免疫印跡來(lái)分析。如附圖27的免疫印跡中所示，觀察到從大腸桿菌細(xì)胞膜的幾乎完全的GPR73蛋白質(zhì)4是取。LE人類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體73密度梯度離心如以上實(shí)施例7和8所描述的，通過(guò)在離心管中疊放用150mMNaCl和20mMHEPESpH7.2緩沖的1.9M和1.4M蔗糖溶液，產(chǎn)生不連續(xù)的蔗糖梯度，用來(lái)分離大腸桿菌膜級(jí)分。表達(dá)LE.GPR73蛋白質(zhì)的細(xì)胞在天然裂解緩沖液中裂解。通過(guò)使用超速離心轉(zhuǎn)子TLA100.3(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)在391,000xg超速離心1小時(shí)來(lái)分離膜和不溶級(jí)分。丟棄上清液，沉淀物重懸浮在1.9M蔗糖溶液中。100(iL重懸浮物的等分量再次與0.9mL1.9M蔗糖溶液混合。然后將這種混合物置于離心管的底部，lmL1.4M蔗糖溶液疊放在上。樣品放入SW55轉(zhuǎn)子，在128,356xg旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。小心地從管頂部取出200nL等分量的分級(jí)樣品，通過(guò)SDS-PAGE分析級(jí)分，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素，并用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗His抗體探查。結(jié)果表明，大多數(shù)trpLE融合GPR73蛋白看起來(lái)插入在大腸桿菌膜中(數(shù)據(jù)未顯示)。LE人類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體73蛋白質(zhì)分離為了分離LE.GPR73蛋白質(zhì)，上述溶解度分析中的1%Fos-Choline12可溶膜提取物的一部分加載到Ni-NTAPhyTip柱(Phynexus，CA)上，用天然裂解緩沖液中的50mM咪唑和0.5%Fos-Choline12洗滌，用天然裂解緩沖液中的250mM咪峻和0.75%Fos-Choline12洗脫。洗脫級(jí)分的樣品重懸浮在還原性SDS加載緩沖液中，并通過(guò)SDS-PAGE分析。產(chǎn)生的凝月交顯示在其56.5kDa分子量處的純化的GPR73蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)N-末端測(cè)序確認(rèn)了純化的蛋白質(zhì)的身份。蛋白質(zhì)產(chǎn)量計(jì)算表明，從l升搖瓶培養(yǎng)物的全細(xì)胞提取物可以分離大約2到3毫克的trpLEGPR73。LE人類(lèi)G蛋白偶聯(lián)受體73凝血酶裂解GPR73蛋白在插入的凝血酶裂解位點(diǎn)處從融合蛋白切出。將具有l(wèi)mM氯化鈣的凝血酶以1:1000稀釋度添加到純化的GPR73洗脫液，并在室溫下放置過(guò)夜來(lái)進(jìn)行酶裂解。裂解后的蛋白質(zhì)的樣品用SDS還原并通過(guò)SDS-PAGE分析。Coomassie藍(lán)染色的凝膠顯示了融合蛋白在插入位點(diǎn)處的良好裂解，產(chǎn)生了兩個(gè)蛋白質(zhì)條帶，包括裂解的GPR73(45.9kDa)和具有flag標(biāo)簽的trpLE(10.6kDa)(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)N-末端測(cè)序確認(rèn)了裂解的蛋白質(zhì)的身份。實(shí)施例10:膜蛋白的純化LE和sLE標(biāo)記人類(lèi)CD20的純化為了分離如上文實(shí)施例7、8和9中所述在大腸^f干菌中產(chǎn)生的LE和sLE蛋白，通過(guò)使用Polytron(Brinkmann,Westbury,NY)在1:10wt/vo1裂解緩沖液(20mMTrispH7.5、300mMNaCl和lmMEDTA)中重懸浮全細(xì)胞來(lái)制備膜級(jí)分。然后細(xì)胞使用微流化儀(MicrofluidicsCorp，Newton，MA)通過(guò)細(xì)胞破壞來(lái)裂解，混合物在12，000xg離心1小時(shí)。然后使用Polytron將細(xì)胞沉淀物(Pl)重懸浮在有或沒(méi)有(3-巰基乙醇、沒(méi)有EDTA的裂解緩沖液中。十二烷基磷酸膽堿(DDPC，F(xiàn)os-Choline12)添加到1%的濃度，使樣品通過(guò)微流化儀一到三次。然后在125,000xg離心溶液約45分鐘到1小時(shí)。上清液加載到在緩沖液(20mMTrispH7.5、250-300mMNaCl和5mMDDPC或0.1%n-十二烷基-N,N-二甲胺-N-氧化物(LDAO))中預(yù)先平4軒的Ni-NTASuperflow(QiagenInc.,Valencia,CA)柱上。柱用10個(gè)柱體積的含50rnM咪唑的相同緩沖液洗滌，用含250到300mM咪唑的相同緩沖液洗脫。直到柱加載的所有純化步驟在4。C進(jìn)行。存在還原劑的情況下純化的蛋白質(zhì)僅作為單體從膜中分離(數(shù)據(jù)未顯示)。不存在還原劑的情況下分離的蛋白質(zhì)以單體和二硫鍵連接的二聚體形式存在。為了將二聚體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成單體形式，通過(guò)添加(3-巰基乙醇或DTT來(lái)還原CD20。通過(guò)相對(duì)于含有20mMTrispH8.0、300mMNaCl以及洗滌劑、不存在還原劑的緩沖液的多輪透析來(lái)除去還原劑，或通過(guò)添加氧化的還原劑，例如氧化的DTT或氧化的谷胱甘肽來(lái)中和還原劑。His標(biāo)簽和LE或sLE前導(dǎo)區(qū)通過(guò)與牛凝血酶溫育從蛋白質(zhì)上切除。為了從任何剩余的二聚體、前導(dǎo)區(qū)(LE或sLE)和His標(biāo)簽中分離單體CD20，裂解后的蛋白質(zhì)加載到在20mMTrispH7.5、300mMNaCl和5mMDDPC或0.1%n-十二烷基-N，N-二曱胺-N-氧化物(LDAO)中預(yù)平衡的Superdex200柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)上。收集來(lái)自大小排阻4主的級(jí)分，通過(guò)凝膠層析來(lái)分析以顯示純化的蛋白質(zhì)的位置。純化的蛋白質(zhì)被用于如下所述的結(jié)合分析。ELISA活性分析表達(dá)的CD20蛋白質(zhì)的功能完整性通過(guò)有和沒(méi)有LE及sLE序列而表達(dá)的人類(lèi)CD20多肽結(jié)合抗體rhuximab的能力來(lái)評(píng)定。Rituximab僅識(shí)別人類(lèi)CD20的折疊構(gòu)象，其中已經(jīng)形成半胱氨酸殘基167和183之間的天然二硫鍵。結(jié)合rituxmab的人類(lèi)CD20的ELISA分析被用于分析CD20的天然折疊。純化的CD20蛋白質(zhì)通過(guò)ELISA來(lái)分析。使用100jnLl叱/mL溶于PBS的CD20,將96孔板于4°C包被過(guò)夜，所述PBS含有稀釋到低于其臨界膠團(tuán)濃度的增溶洗滌劑。然后用含有0.05%Tween-20的PBS(PBST)洗滌平板三次，在室溫下用200pL含0.5%BSA的PBST(封閉和分析緩沖液)封閉45分鐘。平板用PBST再洗滌三次，用一抗探查。15(VL60嗎/mL溶于分析緩沖液的rituximab添加到合適的孔中，在隨后的孔中通過(guò)從前一孔采集50^L并與lOOpL分析緩沖液在下一個(gè)和隨后的孔中混合，來(lái)進(jìn)行三倍連續(xù)稀釋?zhuān)酱蠹s2ng/mL的終濃度。在室溫下溫育90分鐘之后，平板用PBST洗滌，用100pL在分析緩沖液中1:2000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗人F(ab')2(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc，WestGrove,PA)檢測(cè)結(jié)合的rituximab,用PBST洗滌六次，用100pL/孔根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)混合的TMBMicrowell過(guò)氧化物酶D底物系統(tǒng)(KPL,Gaithersburg，MD)顯色。通過(guò)添加100jiL/孔l.OM磷酸來(lái)停止反應(yīng)，使用平板讀數(shù)器在450nm測(cè)量吸光度。附圖28顯示了結(jié)合分析的結(jié)果，比較沒(méi)有LE或sLE序列而表達(dá)的人類(lèi)CD20與有LE或sLE前導(dǎo)區(qū)而表達(dá)的和在各種條件下分離的人類(lèi)CD20與rituximab結(jié)合的反應(yīng)。每種表達(dá)的人類(lèi)LE.CD20和sLE.CD20多肽顯示了與構(gòu)象特異性抗體rituximab的結(jié)合，類(lèi)似于對(duì)照的人類(lèi)CD20的結(jié)合。權(quán)利要求1.一種表達(dá)構(gòu)建體，用于單或多跨膜多肽在宿主細(xì)胞中增強(qiáng)的表達(dá)，包含以下可操作連接的元件a.編碼單或多跨膜多肽的多核苷酸；b.在宿主細(xì)胞中有效的并具有低基礎(chǔ)活性的嚴(yán)密調(diào)控的啟動(dòng)子；c.增強(qiáng)對(duì)啟動(dòng)子的調(diào)控的至少一個(gè)正調(diào)節(jié)調(diào)控元件和至少一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)調(diào)控元件；d.包含翻譯起始增強(qiáng)子的前導(dǎo)序列。2.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述前導(dǎo)序列進(jìn)一步包含翻譯延伸間隔區(qū)序列。3.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子，和/或一個(gè)或多個(gè)親和純化標(biāo)簽。4.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，所述啟動(dòng)子是phoA、phac或tphac啟動(dòng)子。5.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，所述啟動(dòng)子是T7、meffi或XPL啟動(dòng)子。6.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，所述啟動(dòng)子是被工程化以含有至少一個(gè)異源調(diào)控元件來(lái)降低基礎(chǔ)活性的(3-內(nèi)酰胺酶、乳糖或色氨酸啟動(dòng)子。7.權(quán)利要求l的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述負(fù)調(diào)控元件是lac操縱基因、trp操縱基因或九操縱基因，其中所述正調(diào)控元件是pho盒、MaITDNA結(jié)合位點(diǎn)或AraCDNA結(jié)合位點(diǎn)。8.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄終止子是人序列AACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATT(SEQIDNO:17)或His操縱子終止子。9.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述翻譯起始序列包含高度表達(dá)的多肽的約前6個(gè)到約前12個(gè)密碼子。10.權(quán)利要求l的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述翻譯起始序列包含(3-半乳糖苷酶、蛋白A、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的約前6個(gè)到約前12個(gè)密碼子。11.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述翻譯起始序列包含選自由ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCAT(SEQIDNO:34)、CACCAACACCAACAA(SEQIDNO:28)構(gòu)成的組的核苦酸序列。12.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述前導(dǎo)序列進(jìn)一步包含延伸間隔區(qū)序列，所述延伸間隔區(qū)序列包含高度表達(dá)的細(xì)菌基因的超過(guò)約50個(gè)氨基酸和^^于約120個(gè)氨基酸的至少一部分。13.權(quán)利要求2的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述翻譯延伸間隔區(qū)序列編碼已知在宿主細(xì)胞中高度表達(dá)的基因的至少一部分。14.權(quán)利要求2的表達(dá)構(gòu)建體，用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，其中所述翻譯延伸間隔區(qū)序列包含良好表達(dá)的細(xì)菌基因的約50到約120個(gè)氨基酸。15.權(quán)利要求2的表達(dá)構(gòu)建體，用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，其中所述翻譯延伸間隔區(qū)序列包含trp操縱子的E基因的約50到約120個(gè)氨基酸。16.權(quán)利要求2的表達(dá)構(gòu)建體，用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，其中所述翻譯延伸間隔區(qū)序列包含SEQIDNO:29或30的序列。17.權(quán)利要求l的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述多肽含有l(wèi)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或24個(gè)3爭(zhēng)膜區(qū)i或。18.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述多肽是具有四個(gè)跨膜區(qū)域的MS4A基因家族的成員。19.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述多肽是CD20或C2S-CD20或包含CyslllSer、Cys220Ser和Cys81Ala突變的突變型CD20。20.權(quán)利要求l的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。21.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述多肽是GPR73或RAlc。22.權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼細(xì)菌細(xì)胞的稀有密碼子的一個(gè)或多個(gè)tRNA基因。23.用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)跨膜多肽的表達(dá)系統(tǒng)，包含權(quán)利要求1的表達(dá)構(gòu)建體。24.生產(chǎn)跨膜多核苷酸的方法，所述方法包括a)將權(quán)利要求l的表達(dá)構(gòu)建體插入細(xì)菌細(xì)胞；和b)在正和負(fù)調(diào)控元件的控制下誘導(dǎo)啟動(dòng)子的表達(dá)。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含phoA、phac或tphac啟動(dòng)子和至少一個(gè)異源的負(fù)和/或正調(diào)控元件。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述正調(diào)控元件包含pho盒，其中所述負(fù)調(diào)控元件包含操縱基因/阻抑物系統(tǒng)的細(xì)菌操縱基因。27.權(quán)利要求25的方法，其中所述正調(diào)控元件是pho盒，所述負(fù)調(diào)控元件包含lac操縱基因。28.權(quán)利要求24的方法，進(jìn)一步包括在非離子或兩性離子洗滌劑中溶解表達(dá)的多肽。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述洗滌劑包括2^6巧61^@3-08、3-10、3-12、3-16、ASB-14、ASB-16或ASBC80。30.權(quán)利要求28的方法，其中所述洗滌劑包括磷酸膽堿的衍生物。31.權(quán)利要求28的方法，其中所述洗滌劑包括十二烷基磷酸膽堿(DDPC)、十二烷基麥芽糖香(DDM)、癸基麥芽糖苷(DM)、正-十二烷基-N，N-二曱胺-N-氧化物(LADO)或正-癸基-N,N-二曱胺-N-氧化物。32.權(quán)利要求28的方法，其中所述洗滌劑包括NP40。33.從細(xì)菌細(xì)胞分離所表達(dá)的含有至少4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的跨膜多肽的方法，所述方法包括a.分離表達(dá)所述多肽的裂解的細(xì)菌細(xì)胞的可溶和不溶級(jí)分；和b.將所述不溶級(jí)分懸浮在非離子或兩性離子洗滌劑中來(lái)溶解，從而從所述細(xì)胞分離所述多肽。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述洗滌劑包括兩性離子洗滌劑。35.權(quán)利要求33的方法，其中所述洗滌劑包括磷酸膽堿衍生物。36.權(quán)利要求33的方法，其中所述洗滌劑包括DDPC、DHPC、DLPC、MPC、IX)PC或IXPG。37.權(quán)利要求33的方法,其中所述洗滌劑包括zwittergent3-08、3-10、3-12、3-16、ASB-14、ASB-16或ASB-80。38.權(quán)利要求33的方法，其中所述多肽包括CD20、高親和力IgE受體(3鏈(FcsRI卩)、HTm4、MS4A4A、MS4A6、MS4A7、GPR73或RAlc。39.權(quán)利要求33的方法，其中所述多肽是通過(guò)蔗糖密度梯度離心分離的。40.權(quán)利要求24的方法產(chǎn)生的多肽，其中所述多肽以良好的產(chǎn)量并且以天然的構(gòu)象產(chǎn)生。41.從權(quán)利要求1的載體表達(dá)的多肽。42.—種多肽，包含與SEQIDNO:1具有至少80。/。同一性的氨基酸序列，其中殘基Cyslll、Cys220或兩者被取代。43.權(quán)利要求42的多肽，其中Cyslll、Cys220或兩者被絲氨酸取代。44.權(quán)利要求42的多肽，具有SEQIDNO:6的序列。45.編碼權(quán)利要求42、43或44的多肽的多核苷酸序列。46.具有天然構(gòu)象的分離的、可溶的、重組CD20多肽。47.生產(chǎn)結(jié)合跨膜多肽的抗體的方法，包括a)用權(quán)利要求40或41的多肽接種宿主動(dòng)物；和b)從所述宿主動(dòng)物收獲結(jié)合權(quán)利要求40或41的多肽的抗體。48.生產(chǎn)抗CD20抗體的方法，包括a)用權(quán)利要求42、43或44的多肽接種宿主動(dòng)物；和b)從所述宿主動(dòng)物收獲結(jié)合B細(xì)胞上表達(dá)的CD20的抗體。49.權(quán)利要求48的方法，進(jìn)一步包括步驟c)在收獲的抗體中選擇結(jié)合CD20的高親和力抗體。50.包含一個(gè)或多個(gè)負(fù)調(diào)控元件的突變的p/7a4啟動(dòng)子。51.權(quán)利要求50的突變的//zo4啟動(dòng)子，其中所述負(fù)調(diào)控元件包括/"c操縱基因。52.權(quán)利要求50的突變的啟動(dòng)子，進(jìn)一步包括安置的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子以防止上游啟動(dòng)子的通讀。53.包含SEQIDNO:15(p/ac)或SEQIDNO:160一ac)的突變型p/w」啟動(dòng)子。54.權(quán)利要求24的方法，其中所述多肽包括CD20、高親和力IgE受體(3鏈(FcsRI卩)、HTm4、MS4A4A、MS4A6、MS4A7、GPR73或RAlc。55.權(quán)利要求24的方法，其中所述多核苷酸位于載體中，所述載體包含細(xì)菌細(xì)胞的稀有密碼子的一個(gè)或多個(gè)tRNA基因。56.權(quán)利要求55的方法，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，所述稀有密碼子的tRNA基因包括一個(gè)或多個(gè)wgt/、g&r和；ra2。57.權(quán)利要求24的方法，其中所述表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步包括位于所述跨膜多肽的第一個(gè)氨基酸上游的編碼有效翻譯起始增強(qiáng)子序列的前導(dǎo)序列。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述前導(dǎo)序列編碼氨基酸序列MKHQHQQ(SEQIDNO:7)。59.權(quán)利要求58的方法，其中編碼所述前導(dǎo)序列的多核香酸包含ATGAAACACCAACACCAACAA(SEQIDNO:25)。60.權(quán)利要求57的方法，其中所述多核苷酸進(jìn)一步包含表達(dá)標(biāo)簽。61.權(quán)利要求60的方法，其中所述表達(dá)標(biāo)簽包括聚His標(biāo)簽或HisGln標(biāo)簽。62.權(quán)利要求25的方法，其中所述啟動(dòng)子是p/zo4啟動(dòng)子或其變體，其中表達(dá)通過(guò)暴露于磷酸鹽限制培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)。63.權(quán)利要求24的方法，其中所述多核苷酸編碼具有至少80%相同于SEQIDNO:1的氨基酸序列的CD20。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述多核苷酸編碼突變的CD20,其包含與SEQIDNO:1相比在殘基Cyslll、Cys220、或這兩處的氨基酸耳又代。65.權(quán)利要求64的方法，其中所述多核苷酸編碼突變的CD20，其中所述取代包含與SEQIDNO:1相比的CyslllSer、Cys220Ser、或這兩者。66.權(quán)利要求64的方法，其中所述多核苷酸編碼SEQIDNO:6的氨基酸序列。67.權(quán)利要求24的方法，其中所述表達(dá)構(gòu)建體編碼CD20的片段，其包含SEQIDNO:1的殘基Kl16到N214。68.權(quán)利要求25的方法，其中所述啟動(dòng)子包括被突變以含有異源負(fù)調(diào)控元件的p/zoJ啟動(dòng)子。69.權(quán)利要求68的方法，其中所述突變的；/z"啟動(dòng)子進(jìn)一步包含被安置以防止上游啟動(dòng)子的通讀的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。70.權(quán)利要求24的方法，其中所述正調(diào)控元件包含結(jié)合p/zoB的//70盒或其變體、MalTDNA結(jié)合位點(diǎn)或AraCDNA結(jié)合位點(diǎn)。71.權(quán)利要求24的方法，其中所述啟動(dòng)子被突變以含有被安置以防止上游啟動(dòng)子的通讀的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。72.權(quán)利要求24的方法，其中所述啟動(dòng)子包含SEQIDNO:15(p/wc)或SEQIDNO:16OZwc)的序列。73.權(quán)利要求24的方法，其中所述多肽包含MSA4家族成員。74.權(quán)利要求73的方法，其中所述多肽包括MS4A4A、MS4A6A、MS4A7、CD20或C2S。75.權(quán)利要求24的方法，其中所述多肽包括GPR73。76.^l利要求24的方法，其中所述多肽包括RAlc。77.權(quán)利要求34的方法，其中所述多肽包括具有至少80%相同于SEQIDNO:1的序列的氨基酸序列的CD20。78.^L利要求34的方法，其中所述多肽包含具有與SEQIDNO:1相比在Cyslll和Cys220的一處或多處取代的突變的CD20。79.權(quán)利要求34的方法，其中所述取代包括CyslllSer、Cys220Ser或這兩者。80.權(quán)利要求34的方法，其中所述多肽包含SEQIDNO:6的序列。81.權(quán)利要求23或權(quán)利要求34的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞包括革蘭氏陰性細(xì)菌。82.權(quán)利要求24或34的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞包括埃希氏菌屬(^foc/zer/c/z/a)、沙門(mén)氏菌屬(Sa/wo"e〃a)、志賀氏菌屬(幼/ge〃a)、沙雷氏菌屬0Seraf/a)、克雷伯氏菌屬(尺/eZw'e〃a)或腸桿菌屬(五wterakcfer)細(xì)胞。83.權(quán)利要求34的方法，進(jìn)一步包括通過(guò)層析、凝膠過(guò)濾或沉淀來(lái)純化溶解的多肽。84.權(quán)利要求83的方法，其中所述層析包括柱層析、親和層析、金屬螯合層析、HPLC、陽(yáng)離子交換層析或?qū)游鼍劢埂?5.權(quán)利要求l的表達(dá)構(gòu)建體，進(jìn)一步包括大腸桿菌tRNA基因wgtAg&r和86.權(quán)利要求3的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)標(biāo)簽包括聚His標(biāo)簽或HisGln標(biāo)簽。87.權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其中所述//zoX啟動(dòng)子被突變以包含負(fù)調(diào)節(jié)元件、轉(zhuǎn)錄終止子增強(qiáng)子、或這兩者。88.權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其中所述p/zo4啟動(dòng)子包含SEQIDNO:15(p/2ac)或SEQIDNO:16(p/zac)的序列。89.權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其中所述多肽包括CD20、高親和力IgE受體卩鏈(FcsRl卩)、HTm4、MS4A4A、MS4A6、MS4A7、GPR73或RAlc。90.權(quán)利要求l的載體，其中所述多肽包含具有與SEQIDNO:1的CD20序列至少80。/。同一性的氨基酸序列。91.權(quán)利要求1的載體，其中所述多肽包含與SEQIDNO:1的氨基Sl/f列相比具有在Cyslll和Cys220的一處或多處的取代的突變型CD20。92.權(quán)利要求l的載體，其中所述取代包括CyslllSer、Cys220Ser或這兩者。93.權(quán)利要求l的載體，其中所述多肽包含SEQIDNO:6的序列。94.包含權(quán)利要求1的表達(dá)載體的細(xì)菌細(xì)胞。95.檢測(cè)抗體與含有至少4個(gè)跨膜片段的跨膜多肽的結(jié)合的方法，包括a)分析抗體與權(quán)利要求40或41的多肽的結(jié)合；和b)將多肽的結(jié)合與跨膜多肽結(jié)合抗體的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)。96.檢測(cè)配體與CD20的結(jié)合的方法，包括a)分析配體與權(quán)利要求42、43或44的多肽的結(jié)合；和b)將多肽的結(jié)合與CD20結(jié)合配體的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)。97.權(quán)利要求96的方法，其中所述配體包括抗體或抗體片段。98.權(quán)利要求95或96的方法，其中所述分析包括ELISA分析。99.權(quán)利要求95或96的方法，其中所述多肽在離子型洗滌劑中從細(xì)胞提取，其中所述離子型洗滌劑在所述分析前交換非離子或兩性離子洗滌劑。100.權(quán)利要求99的方法，其中所述非離子或兩性離子洗滌劑包括DDM、DM、LADO或DDPC。101.權(quán)利要求95或96的方法，其中所述配體包括親和成熟的抗體。102.包含固定的權(quán)利要求40或41的多肽的測(cè)定表面。103.權(quán)利要求102的測(cè)定表面，包括固定的權(quán)利要求42、43或44的多肽。104.權(quán)利要求102或103的測(cè)定表面，其中所述表面包括微量滴定板、層析樹(shù)脂、生物傳感器芯片或流化的分析卡。105.在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)跨膜多肽的方法，所述方法包括在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)編碼所述跨膜多肽的多核苷酸，其中所述表達(dá)處在根據(jù)權(quán)利要求50、51、52或53的啟動(dòng)子的控制下。106.權(quán)利要求105的方法，其中所述啟動(dòng)子被活化以低于3小時(shí)的持續(xù)時(shí)間表達(dá)所述多肽。107.權(quán)利要求105的方法，其中所述啟動(dòng)子被活化以低于2小時(shí)的持續(xù)時(shí)間表達(dá)所述多肽。108.權(quán)利要求105的方法，其中所述啟動(dòng)子被活化以在1到2小時(shí)范圍內(nèi)的持續(xù)時(shí)間表達(dá)所述多肽。全文摘要以高產(chǎn)量、具有天然構(gòu)象和/或以可溶形式生產(chǎn)跨膜多肽的方法，包括在非離子或兩性離子洗滌劑中溶解，以及使用啟動(dòng)子和表達(dá)載體用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)高產(chǎn)量的跨膜多肽。突變的啟動(dòng)子提供了在細(xì)菌細(xì)胞宿主中跨膜多肽的嚴(yán)密調(diào)控。文檔編號(hào)G01N33/68GK101128586SQ200580048588公開(kāi)日2008年2月20日申請(qǐng)日期2005年12月22日優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日發(fā)明者丹尼爾·G·揚(yáng)蘇拉,詹姆斯·A·厄恩斯特,金胡善申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司