專利名稱：：內(nèi)質(zhì)蛋白片段及其衍生物作為結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌的生物標(biāo)記的用途；用于檢測的方法...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的檢測領(lǐng)域。技術(shù)背景結(jié)腸直腸癌是全世界第三高頻率診斷出的癌癥(9.4%)。在2003年，全世界診斷出近乎945000例新的結(jié)腸直腸癌病例，且約492000人死于此疾病。結(jié)腸直腸癌的發(fā)生在增加，而其死亡率在下降。結(jié)腸直腸癌的發(fā)生隨年齡增長,在40歲左右開始，并且其發(fā)生在男性中高于女性(每年每100000人中40.6為男性相對30.6為女性)(世界癌報道，2003，BW.Stewart和P.Kleihues編輯.IARCPress,Lyon)。在大多數(shù)患者中，結(jié)腸直腸癌的發(fā)展從惡化前的腺瘤到具有轉(zhuǎn)移傾向的侵入性惡性肺瘤按照多級進(jìn)程進(jìn)行。迄今為止，僅令人不愉快的結(jié)腸直腸篩選測試，例如結(jié)腸鏡檢查顯示能夠檢測早期結(jié)腸直腸癌及其先兆。然而，已觀察到扁平胂瘤病變和小于10毫米直徑的息肉樣損害具有高的假陰性率(KudoS.(1997)Gastrointest.Endosc.Clin.N.Am.7:87-98)。因此，期望有測試系統(tǒng)使能夠進(jìn)行結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的早期診斷以及在不同腫瘤階段之間的特異性辨別。這也^f吏能夠特異性的適應(yīng)治療。目前已知的篩選測試基于在血樣中對腫瘤標(biāo)記的檢測，其缺少需要的敏感性和特異性。例如，已經(jīng)使用血樣中CEA-(癌胚抗原)-水平來檢測結(jié)腸癌。然而，CEA水平并非在結(jié)腸癌中特異性升高，已經(jīng)顯示也發(fā)現(xiàn)在患有其他惡性疾病(例如，胃癌、胰腺瘤、乳腺瘤和肺癌)和具有多種非惡性情況(例如，酒精性肝病、炎性腸病、重度吸煙、慢性支氣管炎和胰腺炎)的患者中升高。(PosnerMR，MayerRJ:Theuseofserologictumormarkersingastrointestinalmalignancies.HematolOncolCNnNorthAm8:533,1994)。此外，CEA-水平在結(jié)腸腺瘤中并未升高。而且CEA-水平不適用于區(qū)分結(jié)腸直腸腺瘤與結(jié)腸直腸癌或不同的肺瘤階段。本發(fā)明的目標(biāo)是提供方法，使能夠早期檢測結(jié)腸腺瘤和/或結(jié)腸癌和/或能夠區(qū)分不同腫瘤階段。另外的目標(biāo)是提供生物標(biāo)記，可以將其用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌，和/或用于區(qū)分不同的腫瘤階段。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供檢測系統(tǒng)用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌，和/或用于區(qū)分不同的肺瘤階段，該系統(tǒng)是有效的且可以被廣泛應(yīng)用。此外，該測試系統(tǒng)應(yīng)該是容易操作的。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供篩選系統(tǒng)用于檢測化合物的效果，所述化合物對于由肺瘤的特定階段而決定的腺瘤和/或癌的治療是特異性的。在個體中的結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌和/或用于區(qū)分不同腫瘤階段的生物標(biāo)記來獲得解決。該檢測可以在體內(nèi)和體外進(jìn)行。依照優(yōu)選的實(shí)施方案，在體外進(jìn)行該檢測。還通過用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的方法解決這些目標(biāo)，其包括步驟為a)提供從個體中采集的分離的樣品材料，b)確定在所述分離的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，c)將確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。還通過用于區(qū)別結(jié)腸直腸腺瘤和結(jié)腸直腸癌，和/或用于區(qū)別另外的肺瘤狀態(tài)的方法解決本發(fā)明的目標(biāo)，其包括步驟為a)提供從個體中采集的分離的樣品材料，b)確定在所述分離的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，c)將確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。還通過用于監(jiān)測結(jié)腸直腸腺瘤和結(jié)腸直腸癌的發(fā)展和/或過程和/或治療的方法解決本發(fā)明的目標(biāo)，其包括步驟為a)提供從個體中采集的分離的樣品材料，b)確定在所述分離的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，c)將確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，控制手術(shù)或治療操作的效果以決定關(guān)于是否將結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌徹底除去。在另一實(shí)施方案中，通過用一種或多種化學(xué)物質(zhì)、抗體、蛋白質(zhì)、肽、小分子藥物、反義-RNA、放射，例如X-射線，或其組合來治療患者，控制對結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌患者的治療以控制治療的有效性。通過提供用于在個體樣品中檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌和/或用于區(qū)分不同腫瘤階段的測試系統(tǒng)解決本發(fā)明的目標(biāo)，其包括a)結(jié)合于內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的表位的抗體或受體，b)支持所述抗體或受體的固體支持物，c)用于檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的所述表位與所述抗體或受體的結(jié)合的試劑。還通過提供陣列來解決本發(fā)明的目標(biāo)，其包含用于在個體中檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌和/或用于區(qū)分不同腫瘤階段的檢測分子，其包括以下作為檢測分子a)固定于固體支持物的用于結(jié)合和檢測編碼內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的核酸探針，或b)固定于固體支持物的用于結(jié)合和檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的表位的抗體，或c)固定于固體支持物的用于結(jié)合和檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的表位的受體，其中，優(yōu)選將不同量的檢測分子固定于固體支持物上以增加定量的精確性。核酸探針是例如選自由單鏈或雙鏈DNA或RNA、適配體及其組合組成的組。適配體為單鏈寡核苷酸，其被假定為特異性的、序列依賴形狀的且以高度的特異性和親和力與蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合。使用SELEX過程鑒定適配體(TuerkC.和GoldL.(1990)Science249:505-510;EllingtonAD.和SzostakJW(1990)Nature346，818-822)。還通過用于確定化合物在治療結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌中和/或用于區(qū)分不同腫瘤階段中是否有效的方法來解決這些目標(biāo)，其包括步驟為a)用化合物治療結(jié)腸直腸腺瘤或結(jié)腸直腸癌患者，b)確定在所述患者的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，和c)將確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。優(yōu)選的實(shí)施方案在從屬權(quán)利要求中進(jìn)行詳細(xì)說明。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"樣品材料"也被稱為"樣品"。依照本發(fā)明，術(shù)語"生物標(biāo)記"意指蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或核酸，其指示結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的發(fā)生。這意味著使用"生物標(biāo)記"作為檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的方法。術(shù)語"個體"意指哺乳動物。優(yōu)選的，哺乳動物是人，例如患者。術(shù)語"健康個體"意指未患有結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的個體。即術(shù)語"健康個體"僅關(guān)于結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的病理狀態(tài)方面，且不排除患有結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌之外的其他疾病的個體。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"不同腫瘤階段的區(qū)分"意指區(qū)分結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌，和/或區(qū)分不同的肺瘤階段，例如TNMI、II、III和IV。術(shù)語"其衍生物"意指描述在DNA、mRNA或蛋白質(zhì)水平的任何修飾，包括例如截短的基因、所述基因的片段、突變的基因、或修飾的基因，或其各自的基因產(chǎn)物。術(shù)語"其衍生物"包括核酸序列，例如DNA、RNA、mRNA或蛋白質(zhì)序列或肽序列。衍生物可以是修飾，其為在基因中的缺失、取代或插入的結(jié)果。該基因修飾可以是天然發(fā)生的基因可變性的結(jié)果。術(shù)語"天然發(fā)生的基因可變性"意指非基因工程結(jié)果的修飾。衍生物可以是在體內(nèi)的基因或基因產(chǎn)物的加工結(jié)果和/或降解產(chǎn)物。在蛋白質(zhì)水平的修飾可以出于體內(nèi)的酶修飾或化學(xué)修飾。例如，該修飾可以是糖基化或磷酸化或法尼基化。在本發(fā)明中使用的術(shù)語"內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物"也包括突變的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或修飾的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或修飾的內(nèi)質(zhì)蛋白的片段。"內(nèi)質(zhì)蛋白片段，，的修飾可以由于酶修飾或化學(xué)修飾。術(shù)語"腫瘤"和"癌"被可互換的使用并且具有相同的含義。在一個實(shí)施方案中，內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物為包含內(nèi)質(zhì)蛋白的N-末端片段或C-末端片段的蛋白質(zhì)。術(shù)語N-末端片段或C-末端片段不被理解為這些序列包含內(nèi)質(zhì)蛋白的完整的N-末端或C-末端，而是該片段從內(nèi)質(zhì)蛋白的N-末端或C-末端區(qū)域產(chǎn)生。該片段也可以從內(nèi)質(zhì)蛋白的蛋白質(zhì)序列的中間部分產(chǎn)生。內(nèi)質(zhì)蛋白(SEQIDNO.l)的片段的序列長度必須是充分長從而對于內(nèi)質(zhì)蛋白特異性的。已經(jīng)顯示內(nèi)質(zhì)蛋白的片段包含內(nèi)質(zhì)蛋白序列(SEQIDNO.l)的至少7個連續(xù)的氨基酸，優(yōu)選至少8個連續(xù)的氨基酸，其對內(nèi)質(zhì)蛋白是高度特異性的。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，該片段包含內(nèi)質(zhì)蛋白(SEQIDNO.l)的至少9個連續(xù)的氨基酸。全長內(nèi)質(zhì)蛋白(SEQIDNO.1)(其也被稱為grp94)的特異性切割，產(chǎn)生約10-14kDa和80kDa的兩個片段。假定該內(nèi)質(zhì)蛋白-切割是由(需)鉤蛋白酶引起(圖4)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，內(nèi)質(zhì)蛋白片段包含具有分子量約為80kDa的C-末端片段或具有分子量約為10-14kDa的N-末端片段。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，具有分子量約為10-14kDa或約為80kDa的片段由(需)鈣蛋白酶切割引起。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，內(nèi)質(zhì)蛋白片段包含序列SEQ-ID-NO.l的部分。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，內(nèi)質(zhì)蛋白片段包含N-末端片段。優(yōu)選該片段包含肽序列SEQID-NO.2和/或肽序列SEQ-IDNO.3。依照本發(fā)明的另一實(shí)施方案，該片段包含肽序列SEQ-IDN0.4。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，內(nèi)質(zhì)蛋白片段具有10至14kDa，更優(yōu)選103kDa的分子量。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，內(nèi)質(zhì)蛋白片段是肽或蛋白質(zhì)，其為或包括氨基酸序列，所述序列與SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4(圖l)具有至少80%，優(yōu)選至少卯％,更優(yōu)選至少95%的序列同一性，且其能夠特異性檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌。依照本發(fā)明的另一實(shí)施方案，內(nèi)質(zhì)蛋白片段具有的氨基酸序列與基于SEQIDNO.1的序列片段有至少80%，優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%的序列同一性。葡萄糖相關(guān)蛋白(grp)是在脅迫誘導(dǎo)后合成的一組高度保守的蛋白質(zhì)。Grp作為分子監(jiān)控蛋白類起作用，幫助轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊和加工其各自的耙標(biāo)蛋白質(zhì)。免疫組織化學(xué)染色檢測grp94主要在細(xì)胞質(zhì)。Grp94也被稱為內(nèi)質(zhì)蛋白。Grp94(內(nèi)質(zhì)蛋白)呈現(xiàn)腔蛋白質(zhì)和整合蛋白質(zhì)的雙重性質(zhì)，說明其以兩種不同的形式在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在。術(shù)語"表位"意指蛋白質(zhì)或肽的任何結(jié)構(gòu)元素或蛋白質(zhì)性質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其使能夠特異性結(jié)合抗體、抗體片段、蛋白質(zhì)或肽結(jié)構(gòu)或受體。使用已經(jīng)從人體分離的樣品材料，例如體液或組織樣品執(zhí)行本發(fā)明的方法。優(yōu)選樣品材料是組織樣品。接著可以分級和/或純化樣品材料。例如，可能將待檢測的樣品材料貯存于冷凍庫和在融化各個樣品材料的適當(dāng)?shù)臅r間點(diǎn)執(zhí)行本發(fā)明的方法。已經(jīng)由本發(fā)明人令人驚訝的發(fā)現(xiàn)可以使用內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物作為生物標(biāo)志，優(yōu)選作為早期生物標(biāo)志用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌。發(fā)明人目前驚訝的發(fā)現(xiàn)在樣品材料，例如組織樣品或體液中的內(nèi)質(zhì)蛋白片段的蛋白質(zhì)水平或其衍生物在患有結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌的個體中升高。此外，發(fā)明人已經(jīng)驚訝的發(fā)現(xiàn)可以使用在組織樣品或體液中內(nèi)質(zhì)蛋白片段的蛋白質(zhì)水平或其衍生物區(qū)分健康人與患有結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌的患者，以及區(qū)分結(jié)腸直腸腺瘤與結(jié)腸直腸癌。另外，可以使用內(nèi)質(zhì)蛋白片段的水平區(qū)分不同的腫瘤階段，例如TNMI、n、ni和/或iv。內(nèi)質(zhì)蛋白片段是特異性的生物標(biāo)志，可以使用其區(qū)分結(jié)腸直腸腺瘤和結(jié)腸直腸癌和/或不同的腫瘤階段。不同的腫瘤階段可以是例如TNMI、II、in和/或iv。內(nèi)質(zhì)蛋白片段是選擇性和特異性的標(biāo)志，可以使用其確認(rèn)由組織病理學(xué)獲得的診斷。然而，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在例如組織或生物液，例如血清或血漿的樣品材料中完整內(nèi)質(zhì)蛋白的升高的水平是對結(jié)腸直腸腺瘤特異性的。因此，完整內(nèi)質(zhì)蛋白的升高的水平也是結(jié)腸直腸腺瘤的指示。由此考慮，以上或以下給出的全部說明分別應(yīng)用于完整的內(nèi)質(zhì)蛋白。然而，發(fā)明人還驚訝的發(fā)現(xiàn)，在樣品材料，例如組織或體液中內(nèi)質(zhì)蛋白片段的升高的水平是結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌的更加特異和敏感的生物標(biāo)士依照本發(fā)明，樣品材料可以是組織、細(xì)胞或體液。樣品材料可以是體液，例如血液、血漿、血清、骨髓、糞便、滑液、淋巴液、腦脊髓液、唾液、尿液、母乳、精液、滲出液及其混合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過色"i普法分離體液。優(yōu)選的，在執(zhí)行本發(fā)明的方法之前已經(jīng)分離體液。本發(fā)明的方法優(yōu)選通過實(shí)驗室技術(shù)人員在體外進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，測量在血漿、血清或尿液中的內(nèi)質(zhì)蛋白片段的水平。可以通過從要醫(yī)學(xué)檢查的個體采集血液和從凝塊的血液分離上清容易的獲得血清。隨著結(jié)腸直腸腺瘤形成的進(jìn)程，內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平升高。結(jié)腸直腸腺瘤是可以變成惡性的良性瘤。當(dāng)從良性結(jié)腸直腸腺瘤發(fā)展為結(jié)腸直腸癌時，在體液中，優(yōu)選血清中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平進(jìn)一步增加。在結(jié)腸直腸腺瘤轉(zhuǎn)化為結(jié)腸直腸癌之后，患病個體的病理情況可以通過形成轉(zhuǎn)移而進(jìn)一步惡化。內(nèi)質(zhì)蛋白片段的更高水平與結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌和/或轉(zhuǎn)移的發(fā)生相關(guān)。本發(fā)明提供早期的生物標(biāo)志，其使能夠檢測在早期和/或仍然為良性期和/或腫瘤早期檢測腫瘤性疾病。早期檢測使醫(yī)生能夠及時移除結(jié)腸直腸腺瘤和大大增加個體存活的機(jī)會。此外，本發(fā)明使能夠在延長的時間，例如數(shù)年，監(jiān)測在體液中，例如血清中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平。長期監(jiān)測使能夠區(qū)分在結(jié)腸直腸腺瘤和結(jié)腸直腸癌之間的不同。可以常規(guī)的檢查體液中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，例如，一年一次或兩次。如果檢測到內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物水平的增加，這可能指示結(jié)腸直腸腺瘤。然后，內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的進(jìn)一步增加可能指示向惡性結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移。此外，可以監(jiān)控疾病和/或治療的過程。如果內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平進(jìn)一步增加，例如在移除結(jié)腸直腸腺瘤之后，這可以是病理情況惡化的指示。這意味著，內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平是檢測和監(jiān)測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的有價值的臨床參數(shù)。在結(jié)腸直腸腺瘤發(fā)生之后，體液中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物水平增加。因此，內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平是使能夠進(jìn)行早期診斷的重要臨床參數(shù)，并且因而能夠?qū)膊∵M(jìn)行早期治療。此外，可以使用內(nèi)質(zhì)蛋白片段的水平檢查手術(shù)和/或其他治療的有效性。用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌和/或用于區(qū)分不同腫瘤階段的本發(fā)明的方法包括步驟為提供從個體提取的分離的樣品材料，接著確定在分離的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，和最后將內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的確定的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。在一個實(shí)施方案中，另外檢測從個體采集的分離的樣品材料中的一種或多種生物標(biāo)志，并且與一個或多個參考值進(jìn)行比較?？梢园凑赵诙鄠€健康個體或患有結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌個體中分離的樣品中確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的平均水平計算參考值。這一參考值可以是從健康人建立，被認(rèn)為覆蓋正常范圍，或從患有結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌患者建立，被認(rèn)為是升高的范圍。通常，作為參考值的范圍給出參考值。因此，在本發(fā)明中使用的術(shù)語參考值和參考值的范圍被定義為具有相同的含義。接著，在參考值范圍內(nèi)的特定值可能指示結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的健康情況或病理情況?？梢酝ㄟ^采集健康個體和患有結(jié)腸腺瘤和/或結(jié)腸癌的個體的統(tǒng)計相關(guān)數(shù)目的組織樣品或體液樣品，例如血清樣品，如對任何其他醫(yī)學(xué)參數(shù)范圍，例如血糖所做的來建立參考值的范圍。也可以從結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸腫瘤患者的健康組織獲得對于健康狀況的參考值。優(yōu)選的，計算兩種參考值，其被指定為陰性對照和陽性對照1。從健康個體或結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸腫瘤患者的健康組織計算陰性對照的參考值，并且從患有結(jié)腸直腸腺瘤或結(jié)腸直腸癌的個體計算陽性對照。更優(yōu)選的，計算三種參考值，其被指定為陰性對照和陽性對照1以及陽性對照2。陽性對照1可以從患有結(jié)腸直腸癌的個體計算，且陽性對照2可以從結(jié)腸直腸腺瘤計算。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，參考值可以是個體參考值，計算為在長期從個體采集的多個分離樣品中確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的平均水平。當(dāng)在延長的期間，例如數(shù)月或數(shù)年監(jiān)測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平時，可能建立個體平均水平。當(dāng)測量血糖時，可以(例如從相同的血清樣品)測量內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，并且可以用于建立個體校準(zhǔn)曲線使能夠特定的檢測任何個體的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物水平的增加。也可以如所述用于內(nèi)質(zhì)蛋白的相同方式計算更多生物標(biāo)記的參考值。內(nèi)質(zhì)蛋白片段的平均水平或更多的生物標(biāo)記可以是平均值或中間水平。另一方面，本發(fā)明還提供了用于在個體的分離的樣品材料中檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的測試系統(tǒng)。該測試系統(tǒng)是基于抗體或受體對特異結(jié)合的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的表位或合適的結(jié)構(gòu)元件的特異性。受體可以是能夠特異結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的任何結(jié)構(gòu)。該受體可以是，例如，抗體片段，例如Fab或F(ab，)2片段或能夠特異結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白或其衍生物的任何其他蛋白質(zhì)或肽結(jié)構(gòu)。該受體也可以是特異結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的適配體。抗體、抗體片段或受體結(jié)合于固體支持物，例如塑料表面或珠子，使能夠結(jié)合和檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物。例如，可以使用常規(guī)的微量滴定板作為塑料表面。例如，通過使用以可檢測的基團(tuán)標(biāo)記的第二抗體可以有效進(jìn)行內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的結(jié)合的檢測。可檢測的基團(tuán)可以是，例如，放射性的同位素或酶，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶(其可以通過加入合適的底物產(chǎn)生，例如顏色或焚光信號)。測試系統(tǒng)可以是免疫測定，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或放射免疫測定(RIA)或發(fā)光免疫測定(LIA)。然而，可以使用任何使用抗體或抗體片段的任何其他免疫測試，例如蛋白質(zhì)印跡法或免疫沉淀法。本發(fā)明還提供包含用于在個體中檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的檢測分子的陣列，其中檢測分子可以是固定于固體支持物的核酸探針，其被用于結(jié)合和檢測編碼內(nèi)質(zhì)蛋白片段、突變、變體或其衍生物的mRNA,或固定于固體支持物的抗體，其被用于結(jié)合和檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的表位，或固定于固體支持物的受體，其被用于結(jié)合和檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的表位。優(yōu)選的，該陣列還包括用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和結(jié)腸直腸癌的生物標(biāo)記的更多的檢測分子。優(yōu)選的，核酸探針包含選自對應(yīng)于SEQ-ID-NO,2和/或SEQ-ID-N0.3或SEQ-ID-N0.4的核酸序列組成的組的核酸序列。備選的，本發(fā)明還包括包含固定于固體支持物的患者樣品的反陣列(inversearray)，其可以通過以上定義的檢測分子一皮檢測。優(yōu)選的，該陣列包含固定在固體表面可識別位置上的檢測分子。在本發(fā)明中使用的術(shù)語"陣列"指分類(grouping)或排列，而不需要是規(guī)則的排列。陣列優(yōu)選的包括至少2個，更優(yōu)選5個，最優(yōu)選10個不同組的檢測分子。優(yōu)選的，本發(fā)明的陣列包括至少50組檢測分子，更優(yōu)選至少100組檢測分子。依照本發(fā)明的另一實(shí)施方案，本發(fā)明的陣列包含至少500組檢測分子。檢測分子可以是，例如如上所述的核酸探針或抗體或受體。核酸探針可以是任何天然產(chǎn)生的或合成的寡核苷酸、適配體以及cDNA、cRNA等等。所述陣列可以在根據(jù)本發(fā)明的測試系統(tǒng)中使用。在本發(fā)明中使用的術(shù)語"陣列，，同時涉及大陣列(macroairay)和微陣列(microarray)。依照本發(fā)明的另一實(shí)施方案，通過質(zhì)譜法確定內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平。質(zhì)鐠法使能夠經(jīng)由其分子量特定的檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物和非常容易的定量內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的量?？梢允褂迷谫|(zhì)i瞽法領(lǐng)域已知技術(shù)中的任何合適的電離法來電離內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物分子、片段、突變、變體或其衍生物。電離法包括電子撞擊(EI)、化學(xué)電離(CI)、場電離(FDI)、電噴射離子化(ESI)、激光解析電離(LDI)、矩陣輔助的激光解析電離(MALDI)和表面增強(qiáng)的激光解析電離(SELDI)?？梢允褂迷谫|(zhì)鐠法領(lǐng)域已知技術(shù)中的任何合適的檢測方法來確定內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的分子量。檢測方法包括四級質(zhì)語法(QMS)、傅立葉變換質(zhì)譜法(FT-MS)和飛行時間質(zhì)鐠法(TOF-MS)。優(yōu)選的，該質(zhì)i脊法是表面增強(qiáng)的激光解析電離-飛行時間-質(zhì)鐠法(SELDI-TOF-MS)。在執(zhí)行SELDI-TOF-MS之前，在分離的樣品中的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物優(yōu)選固定于芯片或具有活性表面的固體支持物上。活性表面優(yōu)選包括被固定的針對內(nèi)質(zhì)蛋白或其衍生物的抗體，例如兔多克隆抗體。在內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物與抗體結(jié)合之后，在SELDI-TOF質(zhì)i普儀進(jìn)行飛行時間分析，其傳遞強(qiáng)信號用于確定內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平。此外，質(zhì)譜法使能夠同時檢測與結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的檢測有關(guān)聯(lián)的其他蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過另外的檢測一個或多個更多的生物標(biāo)記來增強(qiáng)對結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌檢測的敏感度和/或特異性。優(yōu)選的，通過檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段及其衍生物以及oc-防衛(wèi)素1、2或3或其衍生物的組合增加根據(jù)本發(fā)明的方法、陣列、測試系統(tǒng)和用途的敏感度和特異性。在本發(fā)明中使用的術(shù)語"a-防衛(wèi)素l、2或3或其衍生物"也包括截短的a-防衛(wèi)素1、2或3，a-防衛(wèi)素1、2或3的片段，突變的a-防衛(wèi)素1、2或3，或修飾的a-防衛(wèi)素l、2或3。"a-防衛(wèi)素l、2或3"的修飾可以由于酶或化學(xué)的修飾，a-防衛(wèi)素1、2和3也被分別稱為人中性粒細(xì)胞肽類(HNP)1、2和3。三種肽具有質(zhì)量/電荷比率(m/z)為3445±10、3374±10和3489±10。HNPl-3肽是肽的防衛(wèi)素家族部分，其為免疫系統(tǒng)的基本成分并且具有殺死/滅活廣泛病原體的能力。還已知防衛(wèi)素也作為先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)物起作用。先前的研究顯示HNP1-3在腫瘤中的表達(dá)主要來自腫瘤入侵嗜酸細(xì)胞和中性白細(xì)胞。然而，其也由癌細(xì)胞產(chǎn)生(例如，膀胱癌細(xì)胞)。(AlbrethsenJ，BogeboR,GammeltoftS，OlsenJ，WintherB，RaskovH.Upregulatedexpressionofhumanneutrophilpeptides1,2和3(HNP1-3)incoloncancerserumandtumours:abiomarkerstudy.BMCCancer.2005，5:8.)在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以通過將內(nèi)質(zhì)蛋白片段的檢測與一種或多種其他的生物標(biāo)志組合以增強(qiáng)對結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的檢測和/或?qū)Σ煌[瘤階段區(qū)分的敏感度和/或特異性，所述生物標(biāo)志選自由a-防衛(wèi)素l、2或3、運(yùn)曱狀腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA19-9、CA15-3、CA-125、Kras、卩-聯(lián)蛋白(p-Catenin)、Her-2/neu、C-反應(yīng)蛋白血漿及其衍生物；和在E-鈣祐著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因的突變；和MHL1或MSH2的微衛(wèi)星不穩(wěn)性；以及SNP(單核苷酸多態(tài)性)及其組合組成的組。結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌的另一生物標(biāo)志可以包括蛋白質(zhì)或多肽，其具有分子量為4，838士25Da，優(yōu)選4,838±10Da。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，同時使用內(nèi)質(zhì)蛋白片段和具有分子量為4，838+25Da,優(yōu)選為4,838±10Da的蛋白質(zhì)和多肽來檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌。在一個實(shí)施方案中，將內(nèi)質(zhì)蛋白或其衍生物的片段與C3a或其衍生物和/或運(yùn)甲狀腺素蛋白或其衍生物組合用作生物標(biāo)志來檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或癌和/或來區(qū)分不同的腫瘤階段。在本發(fā)明中使用的術(shù)語"運(yùn)甲狀腺素蛋白"或其衍生物也包括截短的運(yùn)甲狀腺素蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白的片段、突變的運(yùn)甲狀腺素蛋白或修飾的運(yùn)甲狀腺素蛋白。"運(yùn)甲狀腺素蛋白，，的修飾可以出于酶或化學(xué)修飾。而且，術(shù)語"運(yùn)曱狀腺素蛋白"也被用于指定運(yùn)甲狀腺素蛋白的單體或多聚體形式。例如，術(shù)語"運(yùn)甲狀腺素蛋白"特別覆蓋單體蛋白質(zhì)鏈，其通常是同源四聚體蛋白質(zhì)運(yùn)甲狀腺素蛋白的部分。運(yùn)甲狀腺素蛋白也被命名為前白蛋白。運(yùn)曱狀腺素蛋白是分子量為約54000Da的四聚體蛋白質(zhì)，其主要在肝臟中合成。運(yùn)曱狀腺素蛋白通常為同源四聚體，包含四個蛋白質(zhì)鏈，各自具有約14000Da的分子量。發(fā)明人已經(jīng)使用質(zhì)鐠法檢測到運(yùn)甲狀腺素蛋白的多種變體，尤其是具有分子量13776Da、13884Da或14103Da。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的情況下，在體液例如血清中特別是具有分子量為13776Da和13884Da的運(yùn)曱狀腺素蛋白的分子變體的水平降低。在本發(fā)明中使用的術(shù)語"C3a或其衍生物"還包括截短的C3a、C3a的片段、突變的C3a、修飾的C3a或前體C3(圖2，SEQIDN0.5)或C3的片段。在一個實(shí)施方案中，衍生物具有或包含蛋白質(zhì)序列，該序列與序列SEQ-ID-NO.6(圖3A,SEQIDNO.6)具有至少80%,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少98%的同一性。"C3a"的修飾可以由于酶或化學(xué)修飾。具體的，術(shù)語C3a或其衍生物特別包括截短的C3a蛋白質(zhì)，其優(yōu)選具有分子量在8950士25Da的范圍；更優(yōu)選在8950士20Da的范圍。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短的C3a蛋白質(zhì)具有8939Da的分子量。優(yōu)選的，該C3a蛋白質(zhì)沒有C-末端的精氨酸且任選的分子量在8950±20Da的范圍。在一個實(shí)施方案中，C3a衍生物是C3a-desArg(圖3B,SEQIDNO.7)。在一個實(shí)施方案中，通過肥大細(xì)胞-類胰凝乳蛋白酶切割C3a獲得C3a衍生物。在另一實(shí)施方案中，通過C3-轉(zhuǎn)化酶切割C3獲得C3a。本發(fā)明也包括上述實(shí)施方案的組合。C3a屬于過敏毒素類。C3a、C4a和C5a是補(bǔ)體系統(tǒng)的絲氨酸蛋白酶的蛋白水解產(chǎn)物。C3a(SEQ-ID-N0.6)在補(bǔ)體激活過程中衍生自血液補(bǔ)體系統(tǒng)的第三元件(C3)(SEQ-ID-N0.5)。C3a是具有局部效應(yīng)的激素。在C3a中約40%的氨基酸殘基涉及螺旋構(gòu)象。血清過敏毒素參與多種細(xì)胞免疫應(yīng)答，還是有力的促炎物質(zhì)。C3a對血管壁、平滑肌收縮和血管通透性的增加產(chǎn)生有力的效應(yīng)。在C3a的C-末端精氨酸是其生物活性的重要基礎(chǔ)。過敏毒素由羧肽酶N(過敏毒素滅活劑)調(diào)節(jié)，其在數(shù)秒內(nèi)移除羧端精氨酸。這一機(jī)制將完整的過敏毒素轉(zhuǎn)化為低活性的C3a-desArg形式(SEQIDN0.7)。這^f吏結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的檢測具有增加的敏感度和/或特異性，和/或區(qū)分不同的腫瘤階段。此外，由于這些方法不象結(jié)腸鏡檢查一樣令人不適，本發(fā)明的方法將被患者更好的接受。依據(jù)本發(fā)明，用本發(fā)明的方法篩選從個體分離的樣品材料，其可以為組織樣品或生物液，例如血漿或血清。可以例如通過釆集血液或通過活組織檢查獲得樣品材料。敏感度和特異性被定義如下敏感度是相對于全部患者數(shù)(100%)檢測到的真正陽性患者的數(shù)值(%)?；颊呖梢允腔加薪Y(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的個體。特異性是相對應(yīng)全部健康個體數(shù)(100%)檢測到的真正陰性個體的數(shù)值(％)。可以通過下列公式可選擇的定義敏感度和特異性診斷<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>TP:真正陽性(檢測陽性，診斷正確)；FP:假陽性(檢測陽性，診斷不正確)；TN:真正陰性(檢測陰性，"珍斷正確)；FN:假陰性(檢測陰性，診斷不正確)；通過以下公式計算敏感度TP/(TP+FN)且通過以下7>式計算特異性TN/(TN+FP)對多個分離的樣品計算選自TP、FP、TN、FN的各個分析組的結(jié)果，所述樣品選自健康個體、結(jié)腸直腸腺瘤患者和/或結(jié)腸直腸癌患者組成的組。TP、FP、TN、FN涉及分別與真正陽性、假陽性、真正陰性、假陰性狀態(tài)相關(guān)的個體的數(shù)量?？梢詫⒈景l(fā)明的方法與其他用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的診斷方法組合執(zhí)行以增加整體敏感度和/或特異性。內(nèi)質(zhì)蛋白片段的檢測允許非常早期的檢測結(jié)腸直腸腺瘤和因而能夠用作非常早期的生物標(biāo)記。此外，內(nèi)質(zhì)蛋白片段的檢測使能夠區(qū)分不同的腫瘤階段。優(yōu)選的，執(zhí)行本發(fā)明的方法作為早期檢測和/或監(jiān)測方法。如果本發(fā)明方法的結(jié)果指示在體液樣品中發(fā)生結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸腺瘤，可以進(jìn)行進(jìn)一步的檢查，例如結(jié)腸鏡檢查。如果通過組織化學(xué)用組織樣品獲得的結(jié)果指示發(fā)生結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸腺瘤，應(yīng)該分析內(nèi)質(zhì)蛋白片段的水平任選的與另一生物標(biāo)志組合，以區(qū)分不同的腫瘤階段。本發(fā)明還提供用于區(qū)分化合物在治療結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌中是否有效的方法。此外，本發(fā)明提供方法用于選擇治療特殊胂瘤階段的特殊化合物。優(yōu)選的，用于確定化合物在治療結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌和/或用于治療特殊腫瘤階段中是否有效的方法包括步驟為a)用化合物治療結(jié)腸直腸腺瘤或結(jié)腸直腸癌患者b)確定在所述患者的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平C)將確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。在本申請中使用的術(shù)語"患者"包括人以及非人，例如動物。優(yōu)選動物選自嚙齒類(例如小鼠、大鼠、倉鼠)和其他動物(例如荷蘭豬、兔、野兔、狗和豬)組成的組。可以使用這些動物特異性的誘導(dǎo)某疾病狀態(tài)，例如結(jié)腸直腸腺瘤和結(jié)腸直腸癌用于研究?？梢岳缤ㄟ^用放射性或化學(xué)的物質(zhì)處理動物起作用來誘導(dǎo)所述疾病狀態(tài)，所述物質(zhì)已知誘導(dǎo)結(jié)腸直腸癌或結(jié)腸直腸腺瘤疾病狀態(tài)。也可能使用病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)誘導(dǎo)疾病狀態(tài)。也可能使用基因修飾的動物，其中一個或多個特定的基因功能已經(jīng)被改變，或敲除動物，例如其中特定基因功能已經(jīng)被缺失的敲除小鼠。用于治療結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的化合物可以是一種或多種化學(xué)物質(zhì)、抗體、蛋白質(zhì)、肽、小分子藥物或反義mRNA。備選的，可以單獨(dú)使用放射代替一種或多種化合物或與一種或多種化合物組合。通過上述檢測技術(shù)可以確定在所述患者的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平。給出下列圖和實(shí)施例僅意在說明。本發(fā)明不應(yīng)被解釋為局限于以下實(shí)施例。圖1在圖1A中顯示內(nèi)質(zhì)蛋白的蛋白質(zhì)序列(SEQ-IDNO.l)，和在圖1B中顯示三個肽序列，其為N-末端內(nèi)質(zhì)蛋白片段的各個部分(SEQIDNO.2、3和4)。圖2顯示C3蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.5)。圖3在圖3A中顯示C3a蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.6)，和在圖3B中顯示C3a-desArg蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.7)。圖4顯示由(需)鈣蛋白酶對內(nèi)質(zhì)蛋白的推定的切割位點(diǎn)，其產(chǎn)生約80kDa和約14kDa的片段。圖5顯示來自正常結(jié)腸、腺瘤和腫瘤組織的裂解物的SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)鐠。在從健康到腺瘤到癌患者的組織中，plO,3(內(nèi)質(zhì)蛋白的N-末端部分，10300Da)的強(qiáng)度顯著增加。圖6顯示通過SELDI-TOF-MS對內(nèi)質(zhì)蛋白片段p10.3的分析。對來自結(jié)腸癌的30個樣品和來自腺瘤組織的29個樣品以及相應(yīng)的正常健康結(jié)腸組織進(jìn)行分析。在腺瘤組(A)和或癌組(T)中內(nèi)質(zhì)蛋白片段p10.3的平均濃度顯著高于在健康組(N)中的濃度。圖7顯示通過SELDI-TOF-MS檢測在不同癌類型中的p10.3。與不同的結(jié)腸癌階段相比，在胃、食道、肺、前列腺和乳腺癌的分析的樣品中，p10.3的表達(dá)水平顯著更低。在SAX蛋白質(zhì)芯片⑧陣列分析裂解物。在正常和腫瘤組織之間pl(U表達(dá)水平的差異是統(tǒng)計顯著性的。N-正常組織，T=癌組織。圖8顯示來自正常結(jié)腸、腺瘤和癌組織的裂解物的SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜。在來自結(jié)腸直腸腺瘤到癌患者的組織中，p3489(oc-防衛(wèi)素家族成員，p3.4)的峰強(qiáng)度顯著增加。N-正常組織，A-腺瘤組織，T-癌組織。圖9顯示來自正常結(jié)腸、腺瘤和癌組織的裂解物的SELDITOFMS蛋白質(zhì)i普。與健康對照和結(jié)腸直腸癌組織相比，在來自結(jié)腸直腸腺瘤患者的組織中，p4838(p4.8)的峰強(qiáng)度顯著上升。N-正常組織，A-腺瘤組織，T-癌組織。圖10顯示兩種標(biāo)記的組合(p10.3和p4.8或p10.3和p3.4)在異源患者群中提高對腺瘤和癌組織的敏感度和特異性。A)如果基于p10.3和p4.8的組合，獲得對癌組織的敏感度為90%(對腺瘤為79%)且特異性為90%。B)使用pl(U和a-防衛(wèi)素家族成員p3.4的組合，相應(yīng)數(shù)值為對于癌樣品為70%(對于腺瘤為82%)，具有卯％的特異性。N-正常結(jié)腸粘膜，T-癌組織，A=腺瘤組織。在字母前的數(shù)值指定分離的個體的數(shù)值。另一數(shù)值指截斷值(Cut-offvalue)。實(shí)施例除非另外聲明，按照分析系統(tǒng)的制造商操作手冊執(zhí)行全部方法。實(shí)施例1:樣品制備組織樣品對來自腺瘤和結(jié)腸直腸癌患者(TNMIII期)的肺瘤組織以及相匹配的來自各個患者的正常結(jié)腸組織進(jìn)行分析?；颊邔惱碇笇?dǎo)和患者的保密性有嚴(yán)格的保證，并且全部患者簽字同意參與此研究。所有患者擁有相當(dāng)?shù)男g(shù)前準(zhǔn)備，例如禁食時間和在外科手術(shù)時的藥物處理。組織提取物的制備來自新鮮冷凍的腫瘤和正常組織的冷凍切片(5jim)用蘇木精/曙紅染色來對照腫瘤/基質(zhì)的組織病理學(xué)和量。用超過50%的腫瘤內(nèi)容物或腺瘤內(nèi)容物封閉組織，并且將正常組織切為切片(8x20jim)和立即轉(zhuǎn)移至500plDulbeccos磷酸鹽緩沖液鹽水緩沖液(137mMNaCl、2.7mMKCl、6.5mMNa2HP04.12H20、1.5mMKH2P04，pH7.4)。將這些切片于4。C以13200rpm離心10分鐘。沉淀用150jil裂解緩沖液(20mMTris、50mMNaCl、0.5%吐溫pH7.2、0.1%complete(Roche,Mannheim,德國))在水上提取10分鐘。在劇烈渦旋之后，以13200rpm離心裂解物10分鐘。通過BCA測定(BCA測定，Pierce,Rockford，IL，美國)來測量上清液的蛋白質(zhì)濃度并且用裂解緩沖液調(diào)整每個樣品濃度至5ng/50jtl。實(shí)施例2Ciphergen蛋白質(zhì)芯片@陣列制備。在強(qiáng)陰離子交換器陣列(SAX;CiphergenBiosystems,Femont,CA,美國)分析蛋白質(zhì)裂解物。SAX蛋白質(zhì)陣列(強(qiáng)陰離子交換器)是在生物處理器(CiphergenBiosystems,Inc)中處理。芯片用結(jié)合緩沖液(O.lMTris/HCl，pH7.5)平衡2x5分鐘并且接著在每個點(diǎn)用50nl蛋白質(zhì)裂解液孵育。45分鐘之后，移去未結(jié)合的材料并且用緩沖液洗芯片3次和用水洗2次。干燥之后，加入2份應(yīng)用芥子酸(2applicationsofsinapinicacid)(1.0fil)并且用Ciphergen蛋白質(zhì)芯片讀取4義(模型pbsii)分析芯片。為了最小化數(shù)據(jù)變異性，在兩天內(nèi)使用隨機(jī)分布在芯片上的來自全部患者組的樣品進(jìn)行測量。作為標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)準(zhǔn)對照，對于全部測量平行使用來自一名癌患者的一份組織提取物。SELDI-TOF-MS分析。通過使用195個激光點(diǎn)的平均值以激光強(qiáng)度為180來產(chǎn)生蛋白質(zhì)質(zhì)譜。以敏感度為6運(yùn)行檢測器。為了數(shù)據(jù)采集，檢測大小范圍在2000和40000Da之間。激光聚焦在10000Da。使用蛋白質(zhì)芯片數(shù)據(jù)分析程序(版本3.1，CiphergenBiosystems)和使用生物標(biāo)記Wizard程序(版本3.1，CiphergenBiosystems)分析數(shù)據(jù)。將峰強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化為總的離子流。實(shí)施例3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計評估對于三個患者組，通過C&RT(CART)算法基于決策樹分析(Brdman,L，F(xiàn)riedman,J.H.，Olshen，R.A.，&Stone,C.J.(1984)分類和退化樹.Monterey,CA:Wadsworth&Brooks/ColeAdvancedBooks&Software)來計算截斷值。計算截斷值以選擇和說明在不同分析組之間的極限值。用來自統(tǒng)計軟件7^司(STATSOFTINC)的STATISTICA軟件Vs7.1進(jìn)行評估，用Data-Miner模數(shù)子程序標(biāo)準(zhǔn)分類樹(CAndRT)(統(tǒng)計軟件公司(2005)STATISTICA(數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng))，版本7.1.www.statsoft.com.)進(jìn)行決策樹分析。基于平均值和標(biāo)準(zhǔn)差評估統(tǒng)計數(shù)據(jù)。此外，圖6、8和9顯示平均值士0.95的置信區(qū)間，說明找到希望患者組的真實(shí)平均值具有95%可能性在此置信區(qū)間內(nèi)。通過T-檢驗(表l)進(jìn)行統(tǒng)計評估。該檢測被認(rèn)為具有p-水平〈0.05的顯著性。whiskers盒圖顯示標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)施例4根據(jù)實(shí)施例1和2制備和分析來自一例腺瘤和一例結(jié)腸直腸癌患者(TNMII期)的腫瘤組織以及正常結(jié)腸組織的蛋白質(zhì)樣品。圖5顯示裂解物的SELDI-TOF蛋白質(zhì)譜，所述裂解物來自正常結(jié)腸、腺瘤和腫瘤組織。在從健康到癌患者的組織中p10.3的強(qiáng)度顯著增加。圖6顯示在正常、腺瘤和結(jié)腸癌組織中pl(U(內(nèi)質(zhì)蛋白片段)的平均強(qiáng)度。根據(jù)實(shí)施例1到3分析30例結(jié)腸癌和29例腺瘤組織樣品以及相應(yīng)的正常結(jié)腸組織。在正常和結(jié)腸肺瘤組織中以及在正常和腺瘤組織中p10.3的平均強(qiáng)度的差異是統(tǒng)計顯著的。對于腫瘤樣品的區(qū)分，獲得的特異性為97%和敏感度為93%。腺瘤樣品的特異性為卯％，具有86%的敏感度。圖8顯示在相同患者群中鑒定的oc-防衛(wèi)素家族成員之一(峰3489)的平均強(qiáng)度。與正常結(jié)腸組織水平相比，在腺瘤和結(jié)腸癌組織中的平均強(qiáng)度顯著升高。對腺瘤樣品的區(qū)分獲得的敏感度為52%和特異性為90%。區(qū)分腫瘤才羊品的各自的值為90%和89.6%。圖9顯示在腺瘤組樣品中峰4838的特異性升高的水平。腺瘤樣品可以區(qū)別于肺瘤和正?；颊邩悠?，具有76%的敏感度和100%的特異性。表1總結(jié)了在患者組中峰10324、4838和防衛(wèi)素家族成員峰3375、3445和3489的檢測的峰強(qiáng)度。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>n:患者數(shù)N:正常組織A:腺癌組織T:癌組織在表I中的全部數(shù)據(jù)通過SELDl-TOF-MS獲得實(shí)施例5在不同組織中p10.3的表達(dá)為了鑒定p10.3作為結(jié)腸特異性生物標(biāo)記，根據(jù)實(shí)施例1和2制備不同肺瘤組織的細(xì)胞提取物并且通過質(zhì)鐠法進(jìn)行分析，所述不同肺瘤組織為乳腺、胃、食道、肺和前列腺。如在圖7和表2中所示，可以在結(jié)腸直腸癌(I期和III期)中發(fā)現(xiàn)p10.3的最高強(qiáng)度。但是，在食道、肺和前列腺癌以及正常組織中，內(nèi)質(zhì)蛋白片段以較低水平表達(dá)。表2:在不同癌類型中p10.3的強(qiáng)度。裂解物在SAX蛋白質(zhì)芯片⑧陣列上進(jìn)行分析。組織類型口10.3的強(qiáng)度乳腺正常l豫腫瘤0.672肺正常1.431腫瘤.卯7胃正常1.849腫瘤1.629食道正常0.506腫瘤0.944前列腺正常0.933腫瘤0.852結(jié)腸(I期)正常0,948腫瘤2.830結(jié)腸(III期)正常1.035腫瘤3,283從圖7可見，內(nèi)質(zhì)蛋白片段，特別是具有表觀分子量為10300Da的蛋白質(zhì)片段(pl0.3)，是對于結(jié)腸癌高度特異性的。與乳腺、肺、胃、食道或前列腺的腫瘤相反，在健康和疾病患者之間p10.3的水平有顯著不同。而且，p10.3的水平隨著癌階段(I期相對III期)而增加。實(shí)施例6如實(shí)施例1至3所述，分離和分析30例結(jié)腸癌和29例腺瘤組織樣品以及相應(yīng)的正常結(jié)腸組織，除了第二標(biāo)記是4吏用分子量為4838Da(p4.8)或分子量為3489Da(p3.4)的蛋白質(zhì)與內(nèi)質(zhì)蛋白片段峰組合。與第二標(biāo)記蛋白質(zhì)，例如4838Da(p4.8)或3489Da(p3.4)組合，實(shí)現(xiàn)同時從腺瘤和/或癌組織分離正常組織。使用pl0,3作為第一標(biāo)記和p4.8作為第二標(biāo)記，29個正常組織樣品中的26個(特異性卯％)，29個腺瘤樣品中的23個(敏感度79%),以及30個癌樣品中的r7個(敏感度90%)被正確分離(圖IOA)。與峰3489組合，實(shí)現(xiàn)90%的特異性和對于腺瘤樣品82%的敏感度且對于腫瘤樣品為70%(圖IOB)。結(jié)果如在圖6所示，在三組之間的內(nèi)質(zhì)蛋白片段的量顯著不同(N-正常；A-腺瘤；T-癌)。從健康個體到結(jié)腸直腸腺瘤患者到結(jié)腸直腸癌患者，內(nèi)質(zhì)蛋白片段水平增加。這些數(shù)據(jù)顯示，內(nèi)質(zhì)蛋白片段(任選的與其他生物標(biāo)記組合，例如具有分子量為4838Da(p4.8)或為3489Da(p3.4)的蛋白質(zhì))是用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的極好生物標(biāo)記。與已知的生物標(biāo)記CEA和CA19-9相比，區(qū)分健康個體和腺瘤患者是可能的。此外，可能區(qū)分腺瘤患者和結(jié)腸直腸癌患者。內(nèi)質(zhì)蛋白片段測試具有高的敏感度和特異性，并且使能夠進(jìn)行腺瘤的早期特異性檢測以及區(qū)分不同的腫瘤階段。權(quán)利要求1.用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的方法，其包括步驟為a)提供從個體采集的分離的樣品材料，b)確定在所述分離的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，c)將確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。2.用于區(qū)分結(jié)腸直腸腺瘤和結(jié)腸直腸癌或更多的腫瘤狀態(tài)的方法，其包括步驟為a)提供從個體采集的分離的樣品材料，b)確定在所述分離的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，c)將確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。3.用于監(jiān)測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的發(fā)展和/或過程和/或治療的方法，和/或用于區(qū)分不同肺瘤階段的方法，其包括步驟為a)提供從個體釆集的分離的樣品材料，b)確定在所述分離的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，c)將內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項的方法，其中在從結(jié)腸直腸腺瘤或結(jié)腸直腸癌患者采集的所述樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平相對于健康個體的樣品材料升高。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項的方法，其中在第一個樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物水平的第一次增加指示結(jié)腸直腸腺瘤，和其中在第二個樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物水平的第二次增加指示結(jié)腸直腸癌，條件是所述第二次增加強(qiáng)于所述第一次增加，所述第二個樣品材料在晚于所述笫一個樣品材料的時間點(diǎn)從所述個體分離。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項的方法，其中在步驟(b)中在所述分離的樣品材料中確定用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的一個或多個更多的生物標(biāo)記，和其中在步驟(C)中將確定的所述生物標(biāo)記的水平與各自的一個或多個參考值進(jìn)行比較。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6的任一項的方法，其中所述用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的更多的生物標(biāo)記選自以下組成的組具有分子量為4838±25Da的蛋白質(zhì)，oc-防衛(wèi)素l、2或3、運(yùn)甲狀腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA19-9、CA15-3、CA-125、Kras、p曙聯(lián)蛋白、Her-2/neu、C-反應(yīng)蛋白血漿及其衍生物；和在E曙鉤殺著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突變；和MHL1或MSH2的孩t衛(wèi)星不穩(wěn)性；以及SNP及其組合。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項的方法，其中內(nèi)質(zhì)蛋白片段和/或其衍生物的參考值和任選的更多生物標(biāo)記和/或其衍生物的參考值被計算為在各個個體組的多個分離的樣品中內(nèi)質(zhì)蛋白片段和/或其衍生物的平均水平以及任選的更多生物標(biāo)記和/或其衍生物的平均水平，其中個體組是健康個體、結(jié)腸直腸腺瘤患者和/或結(jié)腸直腸癌患者。9.根據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項的方法，其中參考值是個體參考值，其被計算為在一段時間內(nèi)從所述個體采集的多個分離的樣品材料中確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段和任選的更多生物標(biāo)記和/或其衍生物的平均水平。10.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的方法，其中分離的樣品材料是體液或組織，并且其中體液是任選的選自血液、血漿、血清、骨髓、糞便、滑液、淋巴液、腦脊液、唾液、尿液、母乳、精液、滲出液及其混合物組成的組。11.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的方法，其中是在DNA、mRNA和/或蛋白質(zhì)水平確定在所述樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段和/或其衍生物和任選的更多的生物標(biāo)記的水平。12.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的方法，其中通過核酸雜交技術(shù)、免疫學(xué)方法或蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和/或質(zhì)語法確定在所述樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段和/或其衍生物以及任選的更多生物標(biāo)記的水平。13.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項的方法，其中將該方法與用于結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的其他診斷方法組合執(zhí)行以增加敏感度和/或特異性。14.內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物作為生物標(biāo)記的用途，所述用途用于在個體中或在個體的分離的樣品中檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌和/或區(qū)分不同的腫瘤階段。15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其用于在個體的分離的樣品中對結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的早期檢測和/或區(qū)分不同的腫瘤階段。16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的任一項的用途，其與結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的一個或多個更多的生物標(biāo)記組合以增加敏感度和/或特異性。17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中所述至少一個更多的生物標(biāo)記選自以下組成的組具有分子量為4838士25Da的蛋白質(zhì)，a-防衛(wèi)素l、2或3、運(yùn)曱狀腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA19-9、CA15-3、CA-125、Kras、p隱聯(lián)蛋白、Her-2/neu、C-反應(yīng)蛋白血漿及其衍生物；和在E隱鈣縣著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因的突變；和MHL1或MSH2的微衛(wèi)星不穩(wěn)性；以及SNP及其組合。18.用于在個體分離的樣品材料中檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌和/或區(qū)分不同的肺瘤階段的檢測系統(tǒng)，其包括a)結(jié)合至內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的表位的抗體或受體，b)支持所述抗體或受體的固體支持物，c)用于檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的所述表位與所述抗體或受體的結(jié)合的試劑。19.依照權(quán)利要求18的測試系統(tǒng)，其中所述測試系統(tǒng)包括一個或多個抗體或受體，其凈皮用于結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的一個或多個更多的生物標(biāo)記的檢測。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的測試系統(tǒng)，其中所述至少一個更多的生物標(biāo)記選自以下組成的組具有表觀分子量為4838±25Da的蛋白質(zhì)，a-防衛(wèi)素l、2或3、運(yùn)曱狀腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA19-9、CA15-3、CA畫125、Kras、卩-聯(lián)蛋白、Her訓(xùn)2/neu、C-反應(yīng)蛋白血漿及其衍生物；和在E-鉤翻著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因的突變；和MHL1或MSH2的微衛(wèi)星不穩(wěn)性；以及SNP及其組合。21.包含檢測分子的陣列，用于在個體中檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌和/或區(qū)分不同的胂瘤階段，其包含以下作為檢測分子a)固定于固體支持物的核酸4果針，其被用于結(jié)合和檢測編碼內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的mRNA，或b)固定于固體支持物的抗體，其被用于結(jié)合和檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的表位，或c)固定于固體支持物的受體，其被用于結(jié)合和檢測內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的表位，其中優(yōu)選將不同量的檢測分子固定于固體支持物以增加定量的精確度。22.依據(jù)權(quán)利要求21的陣列，其中所述測試系統(tǒng)包含一個或多個抗體或受體用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的一個或多個更多的生物標(biāo)志o23.根據(jù)權(quán)利要求22的陣列，其中所述至少一個更多的生物標(biāo)記選自以下組成的纟且具有表觀分子量為4838±25Da的蛋白質(zhì)，ot-防衛(wèi)素l、2或3、運(yùn)甲狀腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA19-9、CA15-3、CA-125、Kras、卩-聯(lián)蛋白、Her-2/腦、C-反應(yīng)蛋白血漿及其衍生物；和在E-鉀祐著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMSl、PMS2、MSH6基因的突變；和MHL1或MSH2的微衛(wèi)星不穩(wěn)性；以及SNP及其組合。24.用于確定化合物在治療結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌和/或特異性的腫瘤階段是否有效的方法，其包括步驟為a)用化合物治療結(jié)腸直腸腺瘤或結(jié)腸直腸癌患者，b)確定在所述患者的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，和c)將確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在步驟(b)中在所述分離的樣品材料中確定用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌和/或用于區(qū)分不同的腫瘤階段的一個或多個更多的生物標(biāo)記，和其中在步驟(c)中將確定的所述生物標(biāo)記的水平與一個或多個分別的參考值進(jìn)行比較。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述至少一個更多的生物標(biāo)記選自以下組成的組具有分子量為4838±25Da的蛋白質(zhì)，a-防衛(wèi)素l、2或3、運(yùn)曱狀腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA19-9、CA15-3、CA-125、Kras、p畫聯(lián)蛋白、Her-2/neu、C-反應(yīng)蛋白血漿及其衍生物；和在E國4丐黏著蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因的突變；和MHL1或MSH2的孩i衛(wèi)星不穩(wěn)性；以及SNP及其組合。全文摘要本發(fā)明涉及用于檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的方法，其包括步驟為a)提供從個體采集的分離的樣品材料，b)確定在所述分離的樣品材料中內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平，c)將確定的內(nèi)質(zhì)蛋白片段或其衍生物的水平與一個或多個參考值進(jìn)行比較。本發(fā)明還涉及用于區(qū)分結(jié)腸直腸腺瘤和結(jié)腸直腸癌的方法，并且涉及用于監(jiān)測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的發(fā)展和/或過程的方法，和/或用于治療結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的方法。而且，本發(fā)明涉及在這些方法中使用的測試系統(tǒng)和陣列。此外，本發(fā)明涉及內(nèi)質(zhì)蛋白片段用作在個體中檢測結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的生物標(biāo)記的用途。更多的，本發(fā)明涉及用于確定化合物在治療結(jié)腸直腸腺瘤和/或結(jié)腸直腸癌的有效性的方法。文檔編號G01N33/574GK101238373SQ200580051331公開日2008年8月6日申請日期2005年8月19日優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日發(fā)明者A-K·芬茨,H·尤爾,K·戴維申請人:因迪維姆德有限公司