專利名稱：一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種保健食品或食品添加劑中有害物質的檢測方法，特別是涉及一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法。
背景技術：
桔霉素是紅曲發(fā)酵產品在發(fā)酵過程中產生的一種有害物質。由于在紅曲產品中含量很低，難以對其進行準確定量分析。目前，高效液相色譜法和薄層層析法是檢測桔霉素比較靈敏的方法。但是由于這些檢測方法中缺少對樣品中桔霉素有效的初步分離，不能有效排除紅曲發(fā)酵產品中的大量色素等物質的干擾，因此即便是采用這些方法，對于那些桔霉素含量較低的樣品，還是不能準確測定樣品中存在的桔霉素含量。我國是紅曲的故鄉(xiāng)，是生產紅曲發(fā)酵產品的大國。自從發(fā)現紅曲發(fā)酵產品中含有一種能夠抑制體內膽固醇合成的天然產物—洛伐他汀以后，很多發(fā)達國家想從我國進口紅曲發(fā)酵產品。但由于國內目前桔霉素定量分析方法存在上述缺陷，并且最低檢測限數值較高(50μg/L，見衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范2003年版》)，而這些國家要求產品中桔霉素的最大含量往往低于50μg/L。因此給國內紅曲發(fā)酵產品的出口帶來困難。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠靈敏檢測紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的方法。
為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法，它包括以下步驟(一)、樣品色價測定步驟；(二)、試樣前處理步驟，包括(1)樣品中桔霉素的提取步驟將試樣充分混合均勻，準確稱取0.1～5.0g，即按色價50相當1g樣品量再乘以5計算所稱樣品重量，放于50mL容量瓶中；按稱樣量1∶10(W/V)比例加入95％甲醇提取液，混合均勻，超聲提取40min，工作頻率可以為40KHz，靜置澄清，上清液移至圓底燒瓶中平；往沉淀中按大約1∶8(V/V)比例加入95％甲醇，超聲提取20min，靜置澄清后將上清液合并至圓底燒瓶中；沉淀同前法加入95％甲醇，再超聲提取20min，轉入離心管中，3500rp/min離心10分鐘，將上清液倒入圓底燒瓶中與前兩次提取液合并；將圓底燒瓶中所合并的提取液在室溫下，溫度可以為20-25℃，減壓濃縮，將全部濃縮液取至5mL刻度試管中，讀取體積備用；(2)粗分離所需吸附層析柱的制備步驟取適量中性吸附樹脂以甲醇洗滌3次，再用蒸餾水洗滌3次，裝入1×20cm的柱子，柱床高度為10-15cm；用兩個柱床體積的蒸餾水清洗平衡后備用；(3)樣品中桔霉素的粗分離步驟取1/5-1/2的樣品濃縮液，體積一般不要超過1mL，上柱，以70％甲醇洗脫，收集前20mL-25mL洗脫液，混合均勻后以0.45μm孔徑微孔濾膜過濾，濾液待進樣；(三)、液相色譜條件的確定步驟中，液相色譜條件為色譜柱C18柱 4.6×250mm 5μm柱溫28℃熒光檢測器λex＝331nm，λem＝500nm流動相乙腈∶水＝50∶50(可以磷酸調pH至2.5)流速1.0mL/min進樣量20μl；(四)、色譜分析步驟，包括
將處理好的試樣提取液20μl進樣，經熒光檢測器檢測得到色譜圖后，外標法以標準桔霉素保留時間定性，將試樣提取液中色譜峰面積與標準樣品色譜峰面積比較定量；(五)、標準溶液的配制與標準曲線的制備步驟，包括配制濃度為0.0002、0.001、0.004、0.04、0.1μg/mL桔霉素標準溶液，在下述色譜條件下進樣測定，以峰面積對濃度作標準曲線色譜柱C18柱 4.6×250mm 5μm柱溫28℃熒光檢測器λex＝331nm，λem＝500nm流動相乙腈∶水＝50∶50(可以磷酸調pH至2.5)流速1.0mL/min進樣量20μl；(六)、結果計算步驟，所用公式為X=h1×c×20×5h2×m×1000]]>式中X-試樣中桔霉素含量，μg/Kgh1-試樣中桔霉素色譜峰面積c-標準桔霉素溶液濃度，μg/mL20-洗脫體積，mL5-1/5取樣倍數1000-單位折算倍數(g至Kg)h2-標準桔霉素色譜峰面積m-試樣稱取量，g。
所述的一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法，其樣品色價測定步驟中司以按照GB4926-85標準測定樣品色價水平。
所述的一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法，其粗分離所需吸附層析柱的制備步驟中，所使用的中性吸附樹脂可以為HPD-100。
所述的一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法，其粗分離所需吸附層析柱的制備步驟中，所使用的中性吸附樹脂可以為HPD-300。
所述的一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法，其粗分離所需吸附層析柱的制備步驟中，所使用的中性吸附樹脂可以為HPD-600。
本發(fā)明的技術參數可以是準確度方法的回收率100±10％。
允許差平行樣測定相對誤差≤±10％。
在本發(fā)明中，如果樣品色價含量過高，經色價50相當1g樣品折算后取樣量小于20mg，可按計算量稱取該樣品，用小于1ml的95％甲醇溶解后直接加至吸附層系柱上洗脫，收集20mL洗脫液測定。
本發(fā)明的有益效果為1、提取溶劑為95％甲醇，溶劑簡單，毒性小，減壓濃縮時不用加溫，濃縮時間短，且不會影響桔霉素的穩(wěn)定性，提取濃縮步驟合理，因此前處理階段樣品中的桔霉素損失小。
2、采用超聲波振蕩提取，能夠充分將樣品中的桔霉素提取出來。
3、用吸附柱層析對提取后的樣品進行粗分離，使進入高效液相色譜儀的樣品中雜質大大減少，因而提高了高效液相色譜分析的靈敏性，使最低檢測線達到0.0002μg/mL。
4、為了在粗分離的柱層析中能夠最大量的將樣品中的色素等雜質吸附除去，根據樣品中色素含量(色價)來確定吸附層析的上樣量即根據樣品色價確定取樣量。
5、所采用的吸附劑對桔霉素基本上不吸附，因此在前處理階段桔霉素的回收率在90％以上，而由于高效液相色譜儀本身對桔霉素的損失很小，因此方法回收率可以達到100±10％。
6、采用了簡單而分離度良好的色譜條件，只用普通C18柱，流動相乙腈∶水＝50∶50(可以磷酸調pH至2.5)，桔霉素的保留時間約為16-18min，測定一次的實際所需時間最多需要40-50min。
下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。


圖1為桔霉素標準曲線圖(0.0002、0.001、0.004、0.04、0.1ug/ml)圖2為桔霉素標準品HPLC色普3為實施例1-XX紅曲米中桔霉素含量測定HPLC分離圖譜圖4為實施例2-XX紅曲色素中桔霉素含量測定HPLC分離圖譜具體實施方式
實施例1 XX紅曲米中桔霉素含量測定1實驗材料1.1樣品由XX生物工程有限公司生產的功能性紅曲米，為紅色粉末。約100克/袋，共1袋。陰涼避光保存。
1.2主要儀器電子天平、高效液相色譜儀、分光光度計、酸度計、超聲波清洗器、旋轉蒸發(fā)儀、超純水制備系統(tǒng)、真空泵、恒溫水浴鍋、1×20cm層析柱1.3參考標準物質桔霉素(標準品，批號115049034704019，美國Fluka)1.4試劑磷酸(分析純，北京化工廠，批號20040408)；乙腈(色譜純，美國Fisher，批號052064)；甲醇(分析純，北京化工廠，批號20051022)；大孔吸附樹脂(HPD-300，滄州保恩化工有限公司)；無水乙醇(分析純，北京化工廠，批號20050412)2分析步驟2.1樣品色價測定按照GB 4926-85測定樣品色價水平。
2.2試樣前處理將試樣充分混合均勻，準確稱取3.5g放于50mL容量瓶中。按稱樣量1∶10(W/V)比例加入95％甲醇提取液，混合均勻，超聲提取40min(工作頻率40KHz)，靜置澄清，上清液移至圓底燒瓶中。往沉淀中按1∶8(V/V)比例加入95％甲醇，超聲提取20min，靜置澄清后將上清液合并至圓底燒瓶中。沉淀同前法加入95％甲醇，再超聲提取20min，轉入離心管中，3500rp/min離心10分鐘，將上清液倒入圓底燒瓶中與前兩次提取液合并。將圓底燒瓶中所合并的提取液在室溫下(20-25℃)減壓濃縮，將全部濃縮液取至5mL刻度試管中，讀取體積備用。
取HPD-300吸附樹脂以甲醇洗滌2-3次，再用蒸餾水洗滌2-3次，裝入1×20cm的柱子，柱床高度為10cm。用兩個柱床體積的蒸餾水清洗平衡后備用。
取1/5的樣品濃縮液上柱，以70％甲醇洗脫，收集前20mL洗脫液，混合均勻后以0.45μm孔徑微孔濾膜過濾，濾液待進樣。
2.3液相色譜條件色譜柱C18柱 4.6×250mm 5μm柱溫28℃熒光檢測器λex＝331nm，λem＝500nm
流動相乙腈∶水＝50∶50(以磷酸調pH至2.5)流速1.0mL/min進樣量20μl2.4色譜分析處理好的試樣提取液20μl進樣，經熒光檢測器檢測得到色譜圖后，外標法以標準桔霉素保留時間定性，將試樣提取液中色譜峰面積與標準樣品色譜峰面積比較定量。見圖3。
2.5標準溶液制備準確量取桔霉素標準儲備液0.1mL，以70％甲醇定容100mL。此溶液濃度為0.004μg/mL，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2.6計算X=h1×c×20×5h2×m×1000]]>式中X-試樣中桔霉素含量，μg/Kgh1-試樣中桔霉素色譜峰面積c-標準桔霉素溶液濃度，g/mL20-洗脫體積，mL5-1/5取樣倍數1000-單位折算倍數(g至Kg)h2-標準桔霉素色譜峰面積m-試樣稱取量，g3實驗結果功能性紅曲米中桔霉素的含量測定實驗結果(X±SD)


實施例3 XX紅曲色素中桔青霉素含量測定1實驗材料1.1樣品由XX研究所提供的xx紅曲色素，為紅色粉末。約50克/袋，共1袋。陰涼避光保存。
1.2主要儀器電子天平、高效液相色譜儀、分光光度計、酸度計、超聲波清洗器、旋轉蒸發(fā)儀、超純水制備系統(tǒng)、真空泵、恒溫水浴鍋、1×20cm層析柱1.3參考標準物質桔霉素(標準品，批號1150490 34704019，美國Fluka)1.4試劑磷酸(分析純，北京化工廠，批號20040408)；乙腈(色譜純，美國Fisher，批號052064)；甲醇(分析純，北京化工廠，批號20051022)；大孔吸附樹脂(HPD-300，滄州保恩化工有限公司)；無水乙醇(分析純，北京化工廠，批號20050412)2.分析步驟2.1樣品色價測定按照GB 4926-85測定樣品色價水平。
2.2試樣前處理稱取該樣品5.0mg，用1ml的95％甲醇溶解后備用。
取HPD-600吸附樹脂以甲醇洗滌2-3次，再用蒸餾水洗滌2-3次，裝入1×20cm的柱子，柱床高度為10cm。用兩個柱床體積的蒸餾水清洗平衡后備用。
將溶解好的樣品溶液上柱，以70％甲醇洗脫，收集前20mL洗脫液，混合均勻后以0.45μm孔徑微孔濾膜過濾，濾液待進樣。
2.3液相色譜條件色譜柱C18柱 4.6×250mm 5μm柱溫28℃熒光檢測器λex＝331nm，λem＝500nm流動相乙腈∶水＝50∶50(以磷酸調pH至2.5)流速1.0mL/min進樣量20μl2.4色譜分析處理好的試樣提取液20μl進樣，經熒光檢測器檢測得到色譜圖后，外標法以標準桔霉素保留時間定性，將試樣提取液中色譜峰面積與標準樣品色譜峰面積比較定量。見圖4。
2.5標準溶液制備準確量取桔霉素標準儲備液0.1mL，以70％甲醇定容100mL。此溶液濃度為0.004μg/mL，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2.6計算X=h1×c×20h2×m×1000]]>式中X-試樣中桔霉素含量，μg/Kgh1-試樣中桔霉素色譜峰面積c-標準桔霉素溶液濃度，μg/mL20-洗脫體積，mL1000-單位折算倍數(g至Kg)h2-標準桔霉素色譜峰面積m-試樣稱取量，g
3.實驗結果xx紅曲色素中桔霉素的含量測定實驗結果(x±SD)

權利要求
1.一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法，它包括以下步驟(一)、樣品色價測定步驟；(二)、試樣前處理步驟，包括(1)樣品中桔霉素的提取步驟將試樣充分混合均勻，準確稱取0.1～5.0g，即按色價50相當1g樣品量再乘以5計算所稱樣品重量，放于50mL容量瓶中；按稱樣量1∶10(W/V)比例加入95％甲醇提取液，混合均勻，超聲提取40min，靜置澄清，上清液移至圓底燒瓶中平；往沉淀中按大約1∶8(V/V)比例加入95％甲醇，超聲提取20min，靜置澄清后將上清液合并至圓底燒瓶中；沉淀同前法加入95％甲醇，再超聲提取20min，轉入離心管中，3500rp/min離心10分鐘，將上清液倒入圓底燒瓶中與前兩次提取液合并；將圓底燒瓶中所合并的提取液在室溫下減壓濃縮，將全部濃縮液取至5mL刻度試管中，讀取體積備用；(2)粗分離所需吸附層析柱的制備步驟取適量中性吸附樹脂以甲醇洗滌3次，再用蒸餾水洗滌3次，裝入1×20cm的柱子，柱床高度為10-15cm；用兩個柱床體積的蒸餾水清洗平衡后備用；(3)樣品中桔霉素的粗分離步驟取1/5-1/2的樣品濃縮液上柱，以70％甲醇洗脫，收集前20mL-25mL洗脫液，混合均勻后以0.45μm孔徑微孔濾膜過濾，濾液待進樣；(三)、液相色譜條件的確定步驟中，液相色譜條件為色譜柱C18柱4.6×250mm 5μm柱溫28℃熒光檢測器λex＝331nm，λem＝500nm流動相乙腈∶水＝50∶50流速1.0mL/min進樣量20μl；(四)、色譜分析步驟，包括將處理好的試樣提取液20μl進樣，經熒光檢測器檢測得到色譜圖后，外標法以標準桔霉素保留時間定性，將試樣提取液中色譜峰面積與標準樣品色譜峰面積比較定量；(五)、標準溶液的配制與標準曲線的制備步驟，包括配制濃度為0.0002、0.001、0.004、0.04、0.1μg/mL桔霉素標準溶液，在下述色譜條件下進樣測定，以峰面積對濃度作標準曲線色譜柱C18柱4.6×250mm 5μm柱溫28℃熒光檢測器λex＝331nm，λem＝500nm流動相乙腈∶水＝50∶50流速1.0mL/min進樣量20μl；(六)、結果計算步驟，所用公式為X=h1×c×20×5h2×m×1000]]>式中X-試樣中桔霉素含量，μg/Kgh1-試樣中桔霉素色譜峰面積c-標準桔霉素溶液濃度，μg/mL20-洗脫體積，mL5-1/5取樣倍數1000-單位折算倍數(g至Kg)h2-標準桔霉素色譜峰面積m-試樣稱取量，g。
2.根據權利要求1所述的一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法，其樣品色價測定步驟中按照GB4926-85標準測定樣品色價水平。
3.根據權利要求1所述的一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法，其粗分離所需吸附層析柱的制備步驟中，所使用的中性吸附樹脂為HPD-100。
4.根據權利要求1所述的一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法，其粗分離所需吸附層析柱的制備步驟中，所使用的中性吸附樹脂為HPD-300。
5.根據權利要求1所述的一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法，其粗分離所需吸附層析柱的制備步驟中，所使用的中性吸附樹脂為HPD-600。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種紅曲發(fā)酵產品中桔霉素含量的檢測方法。它包括以下步驟(一)樣品色價測定步驟；(二)試樣前處理步驟，包括(1)樣品中桔霉素的提取步驟試樣稱??；加入甲醇提取液；混勻超聲提取，離心提?。皇覝叵聹p壓濃縮；(2)粗分離所需吸附層析柱的制備步驟包括以甲醇洗滌后的中性吸附樹脂裝柱；(3)樣品中桔霉素的粗分離步驟；(三)液相色譜條件的確定步驟；(四)色譜分析步驟；(五)標準溶液的配制與標準曲線的制備步驟；(六)結果計算步驟。本發(fā)明具有提取溶劑簡單、毒性小、桔霉素的穩(wěn)定性高、樣品中的桔霉素提取充分、液相色譜分析的靈敏性高、測定時間短等特點。
文檔編號G01N30/86GK1808117SQ200610000038
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月5日 優(yōu)先權日2006年1月5日
發(fā)明者文鏡, 常平 申請人:北京聯(lián)合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心