專利名稱：用于將動物血中的白細胞分類的方法及試劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于將動物血中的白細胞分類的方法及試劑。
背景技術：
在狗或貓的疾病治療或診斷中，血液檢查是不可缺少的檢查。檢查白細胞可得到對白血病、感染癥或過敏疾病等的治療或診斷有用的信息，檢查血紅蛋白可得到對貧血癥等的治療或診斷有用的信息。
測定人的白細胞的方法已經被確立。在該方法中，向人的血樣加入溶血劑，溶解紅細胞，用血細胞計數裝置計數剩下的白細胞。通過研究溶血劑的成分，不僅能計數總白細胞數，還能夠將白細胞分類成多種的亞群(sub-populations)，計數特定的白細胞的亞群(例如參照美國專利第4346018號、美國專利第4485175號、美國專利第5116539號、日本專利第2654811號、日本專利第2778745號)。而且，從血樣準備多個的等分試樣，對各等分試樣分別加入不同的溶血劑，分別測定特定的白細胞的亞群，由所得到的結果也能夠將白細胞分類成5種亞群。
測定血紅蛋白時，作為國際標準法采用氰化高鐵血紅蛋白法?？墒牵杌哞F血紅蛋白法使用有毒的氰化物，因此廢液處理成為必要。于是，近年來也采用不使用氰化物的方法(例如SIS血紅蛋白法、高鐵血紅蛋白法等)測定(例如參照美國專利第5250437號、美國專利第5968832號)。
動物血用的血細胞計數裝置已經在市場銷售。在該血細胞計數裝置中，使用人血液用的試劑。根據測定的動物種類變更分析程序(例如參照美國專利第6391263號)。
需要說明的是，使用含有季銨鹽的人血液(human blood)用的溶血劑用電阻檢測法測定狗或貓的血樣的場合，白細胞的粒度分布為單峰，不能將白細胞分類為多種的亞群(例如參照國際公開WO2002/014861、J Anim Clin Med，10(3)129-134，2001)。這是因為狗或貓的白細胞與人的白細胞比，對季銨鹽脆弱而敏感的緣故。
對于此，以比人血液用季銨鹽低的濃度使用季銨鹽(也就是說，白細胞在所測定的溶液中的濃度是1.5g/L-4.5g/L)，測定白細胞的方法記載于國際公開WO2002/014861中。其中記載著根據這種方法能夠將狗或貓的血樣的白細胞分類成淋巴細胞、主要由單核細胞組成的“混合細胞群”及顆粒細胞這3種亞群。
可是，在國際公開WO2002/014861中記載的方法中，不能將嗜酸性細胞與其他的白細胞區(qū)別地分類成亞群。在白細胞的檢查中，嗜酸性細胞數在過敏疾病或寄生蟲癥的診斷中是有用的信息。特別是在寵物中，狗或貓的寄生蟲癥已廣為人知，并且，狗或貓的過敏疾病近年來激增。因此，為了對狗或貓診斷過敏疾病或寄生蟲癥，在血液檢查中將嗜酸性細胞與其他的白細胞區(qū)別相分類是重要的。
而且，本發(fā)明人等比較了用在國際公開WO2002/014861中記載的方法得到的結果和用目視法得到的結果，它們的相關性低。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供將狗或貓的血樣中所含的白細胞區(qū)分嗜酸性細胞和其他的白細胞并分類成3種群的方法及試劑。
本發(fā)明的第1觀點涉及用于將動物血中的白細胞分類的方法，該方法包括以下的工序·混合狗或貓的血樣和溶血劑制備測定用試樣的工序，在上述測定用試樣中，紅細胞溶解，白細胞收縮；·測定與測定用試樣中的白細胞大小相關的信息(data)的工序；·基于所測定的信息，將白細胞分類成含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群及含有嗜酸性細胞的第3群的工序。
本發(fā)明的第2觀點涉及一種試劑，該試劑用于將狗或貓的血樣中的白細胞分類成含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群及含有嗜酸性細胞的第3群，包含·用于溶解血樣中的紅細胞，并使白細胞收縮的季銨鹽、以及·用于溶解上述季銨鹽的水系溶劑(aqueou ssolvent)，上述季銨鹽的濃度滿足以下的條件(1)充分地溶解紅細胞；(2)使白細胞收縮而使白細胞能夠基于大小分類成第1群、第2群、第3群。


圖1表示在測定例1中使用溶血劑1測定人血樣而得的一例粒度分布。
圖2表示在測定例1中使用溶血劑1測定狗血樣而得的粒度分布。
圖3表示在測定例1中使用溶血劑1測定貓血樣而得的粒度分布。
圖4表示在測定例2中使用溶血劑2測定狗血樣而得的粒度分布。
圖5表示在測定例2中使用溶血劑3測定狗血樣而得的粒度分布。
圖6表示在測定例2中使用溶血劑4測定狗血樣而得的粒度分布。
圖7表示在測定例2中使用溶血劑5測定狗血樣而得的粒度分布。
圖8表示在測定例2中使用溶血劑6測定狗血樣而得的粒度分布。
圖9表示在測定例2中使用溶血劑5測定貓血樣而得的粒度分布。
圖10表示在測定例2中使用溶血劑6測定貓血樣而得的粒度分布。
圖11表示在測定例3中使用溶血劑7測定狗血樣而得的一例粒度分布。
圖12表示在測定例3中使用溶血劑7測定狗血樣(狗1)而得的粒度分布。
圖13表示在測定例3中使用溶血劑7測定狗血樣(狗2)而得的粒度分布。
圖14表示在測定例3中，關于狗血樣，使用溶血劑7得到的小型白細胞比率(SCR)和采用目視法得到的淋巴細胞比率的相關性。
圖15表示在測定例3中，關于狗血樣，使用溶血劑7得到的小型白細胞數(SCC)和采用目視法得到的淋巴細胞數的相關性。
圖16表示在測定例3中，關于狗血樣，使用溶血劑7得到的中型白細胞比率(MCR)和采用目視法得到的中性粒細胞比率的相關性。
圖17表示在測定例3中，關于狗血樣，使用溶血劑7得到的中型白細胞比率(MCR)和采用目視法得到的中性粒細胞比率+單核細胞比率的相關性。
圖18表示在測定例3中，關于狗血樣，使用溶血劑7得到的中型白細胞數(MCC)和采用目視法得到的中性粒細胞數+單核細胞數的相關性。
圖19表示在測定例3中，關于狗血樣，使用溶血劑7得到的大型白細胞比率(LCR)和采用目視法得到的嗜酸性細胞比率的相關性。
圖20表示在測定例3中，關于狗血樣，使用溶血劑7得到的大型白細胞比率(LCR)和采用目視法得到的嗜酸性細胞比率+單核細胞比率的相關性。
圖21表示在測定例3中，關于狗血樣，使用溶血劑7得到的大型白細胞數(LCC)和采用目視法得到的嗜酸性細胞數的相關性。
圖22表示在測定例3中，使用溶血劑7測定貓血樣得到的一例粒度分布。
圖23表示在測定例3中，使用溶血劑7測定貓血樣(貓1)得到的粒度分布。
圖24表示在測定例3中，使用溶血劑7測定貓血樣(貓2)得到的粒度分布。
圖25表示在測定例3中，關于貓血樣，使用溶血劑7得到的小型白細胞比率(SCR)和采用目視法得到的淋巴細胞比率的相關性。
圖26表示在測定例3中，關于貓血樣，使用溶血劑7得到的小型白細胞數(SCC)和采用目視法得到的淋巴細胞數的相關性。
圖27表示在測定例3中，關于貓血樣，使用溶血劑7得到的中型白細胞比率(MCR)和采用目視法得到的中性粒細胞比率的相關性。
圖28表示在測定例3中，關于貓血樣，使用溶血劑7得到的中型白細胞比率(MCR)和采用目視法得到的中性粒細胞比率+單核細胞比率的相關性。
圖29表示在測定例3中，關于貓血樣，使用溶血劑7得到的中型白細胞數(MCC)和采用目視法得到的中性粒細胞數+單核細胞數的相關性。
圖30表示在測定例3中，關于貓血樣，使用溶血劑7得到的大型白細胞比率(LCR)和采用目視法得到的嗜酸性細胞比率的相關性。
圖31表示在測定例3中，關于貓血樣，使用溶血劑7得到的大型白細胞比率(LCR)和采用目視法得到的嗜酸性細胞比率+單核細胞比率的相關性。
圖32表示在測定例3中，關于貓血樣，使用溶血劑7得到的大型白細胞數(LCC)和采用目視法得到的嗜酸性細胞數的相關性。
具體實施例方式
首先本發(fā)明人等使用人血液用的溶血劑，測定人、狗和貓的血樣，比較了白細胞的分類結果。
實施例1本發(fā)明人基于美國專利第5968832號的記載，制備了能將人的白細胞分類成淋巴細胞、中性粒細胞、其他的白細胞這3種亞群的溶血劑(溶血劑1)。溶血劑1的組成如下。
溶血劑1月桂基三甲基氯化銨 7.9g/l(30mM)硬脂基三甲基氯化銨 0.84g/l(30mM)氯化鈉 4.13g琥珀酸 3.0gEDTA-2K 2.5g
氫氧化鈉1.55g精制水 1LpH5.3使用溶血劑1采用自動血細胞計數裝置pocH·100iV(Sysmex株式會社)測定了人、狗和貓的血樣。在該裝置中，用稀釋液pocH·packD(Sysmex株式會社)稀釋血樣，制備成500倍稀釋試樣。對于2容量的稀釋試樣添加1容量的溶血劑1，制備測定用試樣。從添加溶血劑13秒后開始用6秒鐘用電阻式的檢測部計數白細胞。在本實驗例中，測定的信號從檢測部通過RS·232C電纜被傳遞到個人計算機中，從取得的信號解析計數值和粒度分布。
另外，關于測定中使用的血樣，制作涂抹標本，進行May-Grünwald-Giemsa染色，采用目視法將白細胞分類、計數。
圖1是測定人血樣得到的粒度分布。圖2是測定狗血樣而得的粒度分布。圖3是測定貓血樣而得的粒度分布。與粒度分布上的各亞群和白細胞的各亞群的對應，通過比較采用目視法分類的數據、和采用使用了上述溶血劑的方法測定的數據就能夠確認。
在圖1的粒度分布中，與美國專利第5968832一樣地從最左開始出現了溶血了的紅細胞群、含有淋巴細胞的群、含有中性粒細胞的群、含有其他的白細胞的群。另一方面，在圖2和圖3的粒度分布中從最左開始出現了溶血了的紅細胞群、含有白細胞的群。由圖1-3知道，溶血劑1能將人的白細胞分類成3種亞群，但不能將狗或貓的白細胞分類成亞群。由此知道，即使將人用的溶血劑用于狗或貓的白細胞分類，與人的情況同樣，對狗或貓的白細胞分類是困難的。
另外，在圖1中，嗜酸性細胞未被分類成與其他白細胞區(qū)別的獨立的亞群。可是，如上述，在寵物、尤其是狗或貓的血液檢查中，將嗜酸性細胞與其他白細胞區(qū)別地分類在診斷過敏疾病或寄生蟲癥上是非常重要的。
從以上的情況看，本發(fā)明人等關于用于對狗或貓的白細胞分類的溶血劑，特別地研討了能夠將嗜酸性細胞分類成為與其他白細胞區(qū)別的獨立的亞群的溶血劑。在進行研討的基礎上，本發(fā)明人等著眼于溶血劑所含的季銨鹽。其結果發(fā)現了能夠將狗或貓的白細胞分類成含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群、含有嗜酸性細胞的第3群這3種亞群的溶血劑。
該溶血劑含有季銨鹽及水系溶劑。上述季銨鹽溶解血樣中的紅細胞，并使白細胞收縮。上述水系溶劑溶解上述季銨鹽。
上述季銨鹽的濃度是滿足以下條件范圍的濃度(1)充分地溶解紅細胞的濃度；(2)使白細胞收縮從而使得白細胞能夠基于大小分類成含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群及含有嗜酸性細胞的第3群這3種亞群。
具體講，作為季銨鹽的濃度，為了充分地溶解紅細胞，優(yōu)選為大于等于1.5mM。另外，為了將白細胞如上述那樣地分類，優(yōu)選為小于等于20mM，更優(yōu)選為小于等于14.5mM。
作為季銨鹽，例如使用具有碳數10-20的烷基的烷基三甲基銨鹽。優(yōu)選是具有碳數12-18的烷基的烷基三甲基銨鹽。作為烷基可舉出十烷基、月桂基、肉豆蔻基、鯨蠟基、硬脂基等。
烷基三甲基銨鹽有隨著烷基的碳數變大，溶解紅細胞的力和使白細胞收縮的力(以后將之略記為溶血力)變大的傾向。另外，烷基三甲基銨鹽有隨著烷基的碳數變大，霧點變低的傾向。因此，當使用一種烷基三甲基銨鹽時，有可能引起紅細胞的溶血不良、或相反連白細胞也過度地收縮。另外有可能發(fā)生沉淀等。于是，為了對白細胞的亞群更明了地分類，優(yōu)選組合多種的烷基三甲基銨鹽，來控制溶血劑整體的溶血力。作為該組合，優(yōu)選組合烷基的碳數小的烷基三甲基銨鹽(第1種烷基三甲基銨鹽)和烷基的碳數大的烷基三甲基銨鹽(第2種烷基三甲基銨鹽)。具體講，作為第1種烷基三甲基銨鹽，可舉出十烷基三甲基銨鹽或月桂基三甲基銨鹽，作為第2種烷基三甲基銨鹽，舉出鯨蠟基三甲基銨鹽和硬脂基三甲基銨鹽。作為更優(yōu)選的組合，可舉出第1種烷基三甲基銨鹽是月桂基三甲基銨鹽、第2種烷基三甲基銨鹽是硬脂基三甲基銨鹽的組合。
另外，組合的場合，優(yōu)選第2種烷基三甲基銨鹽的濃度比第1種烷基三甲基銨鹽的濃度低。具體講，月桂基三甲基銨鹽的濃度優(yōu)選是小于等于20mM，更優(yōu)選是8-20mM。硬脂基三甲基銨鹽的濃度優(yōu)選是小于等于2mM，更優(yōu)選是0.4-2mM，最優(yōu)選是1-2mM。
作為第2種烷基三甲基銨鹽，可代替硬脂基三甲基銨鹽而使用鯨蠟基三甲基銨鹽。烷基三甲基銨鹽隨著烷基的碳數變大，溶血力變大，因此與硬脂基三甲基銨鹽比，鯨蠟基三甲基銨鹽的溶血力小。由此看來，使用鯨蠟基三甲基銨鹽的場合的濃度優(yōu)選是小于等于3mM，更優(yōu)選是1.5-3mM。
也可以在上述的組合中進一步組合少量的肉豆蔻基三甲基銨鹽。據此即使對于各種各樣的檢體作為溶血劑也能發(fā)揮更穩(wěn)定的溶血力。肉豆蔻基三甲基銨鹽的濃度優(yōu)選0.5-1.3mM，更優(yōu)選0.6-0.8mM。
另外，也可以在溶血劑中添加少量的烷基二甲基乙基銨鹽。據此能夠更有效地使溶血了的紅細胞收縮。作為烷基二甲基乙基銨鹽，例如舉出鯨蠟基二甲基乙基銨鹽，其濃度優(yōu)選0.4-1.1mM，更優(yōu)選0.5-0.8mM。
而且，當向溶血劑中添加HLB(油水分配系數，Hydrophilic-Lipophilic-Balance)17-20的非離子性表面活性劑時，對使溶解的紅細胞收縮，將收縮的白細胞穩(wěn)定化，得到精度高的粒度分布是有效的。作為非離子性表面活性劑的例子，舉出聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯二十二烷基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚或聚氧乙烯辛基苯基醚，聚氧乙烯鏈的數量優(yōu)選20以上100以下。非離子性表面活性劑的優(yōu)選濃度是0.05-0.5w/v％，更優(yōu)選是0.1-0.2w/v％。
另外，作為血紅蛋白穩(wěn)定劑，也可以將5-30mM的亞硝酸鹽或硝酸鹽、或者5-50mM的具有碳數1-8的烷基的烷基三甲基銨鹽或四烷基銨鹽添加到溶血劑中。作為烷基，可舉出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基及辛基。作為烷基三甲基銨鹽或四烷基銨鹽的例子，可舉出乙基三甲基銨鹽、辛基三甲基銨鹽、四乙基銨鹽、四丁基銨鹽等。
作為溶解上述季銨鹽的水系溶劑，可舉出水或緩沖液。
優(yōu)選溶血劑的滲透壓保持在200mmol/kg-350mmol/kg。滲透壓能夠用氯化鈉或氯化鉀之類的堿金屬鹽調整。
另外，優(yōu)選溶血劑的pH維持在4-9。pH的調整可使用公知的緩沖劑。
通過使用上述的溶血劑，能夠分類、計數狗或貓的白細胞。在該方法中，首先混合狗或貓的血樣和溶血劑，制備測定用試樣。在該工序中，試樣中的紅細胞溶解。另一方面，白細胞收縮并殘留。紅細胞的溶解和白細胞的收縮，能夠通過調整在使用的溶血劑中含有的季銨鹽的種類和濃度而同時發(fā)生，還能夠錯開時間使得使紅細胞溶解之后白細胞收縮從而分別地發(fā)生。呈不清楚白細胞如何收縮，但大體認為，通過血樣和溶血劑的混合，試樣中的白細胞的細胞膜受到損傷，導致細胞質流出，裸核化等，從而最終白細胞發(fā)生收縮。由于收縮了的白細胞的大小，每個亞群都不同，因此基于其大小能夠將白細胞分類成亞群計數。具體講，通過使用使白細胞收縮而使得收縮后的大小根據淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞、嗜酸性細胞而不同的溶血劑，最終能將白細胞分類成含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群及含有嗜酸性細胞的第3群這3種亞群。予以說明的是，也可以用稀釋液稀釋血樣，并向該稀釋血樣中添加溶血劑，使之反應規(guī)定的時間(例如11秒-15秒)，從而制備測定用試樣。作為稀釋液，可使用生理鹽水或pH4-9、滲透壓200mmol/kg-350mmol/kg的緩沖液。
如此制備測定用試樣后，接著測定與測定用試樣中的白細胞大小(size)相關(correlate)的信息(data)。然后，基于所測定的信息，將白細胞分類成含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群及含有嗜酸性細胞的第3群。例如，在測定時利用電阻法的場合，作為與白細胞大小相關的信息，可舉出電阻。具體講，首先將所制備的測定用試樣送至測定裝置的電阻式檢測部。在電阻法中，檢測部上設有細孔，在細孔的兩側設置著電極。當在該電極間施加直流電流，在細孔中通過血細胞時，電阻與血細胞的容積成比例地變化。檢測該電阻的變化作為脈沖信號，計數所規(guī)定的脈沖高以上的信號作為白細胞。另外，將脈沖高轉換成容積，通過計數檢測了各自的脈沖高的頻度能夠作成粒度分布。在所作成的粒度分布中出現了含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群及含有嗜酸性細胞的第3群。
另外，在測定時也能利用光學的方法。該場合下，作為與白細胞大小相關的信息，可舉出前方散射光。具體講，首先將所制備的測定用試樣送至測定裝置的檢測部。在光學的方法中，當對檢測部照射光，血細胞在檢測部通過時，檢測與血細胞大小相應的前方散射光。然后，基于該前方散射光的強度作成粒度分布，從而能夠將白細胞分類成含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群及含有嗜酸性細胞的第3群。
予以說明，在粒度分布上出現的各亞群、和白細胞的各亞群的對應，測定從血樣只分離了各亞群的試樣(例如淋巴細胞分離試樣)，能夠從粒度分布上的出現位置確認。另外，制作血樣的涂抹標本，通過比較用目視法對白細胞分類的數據和采用使用上述溶血劑的方法測定的數據，能夠確認粒度分布上的各亞群和白細胞的各亞群的對應。而且，可以在兩者數據之差最小的位置設定用于區(qū)分粒度分布上的各亞群的閾值。另外，閾值，能夠可變地設定以使得對各檢體檢出粒度分布的谷，將谷的位置作為閾值。
能夠采用使用上述溶血劑的白細胞分類方法，可將狗或貓的白細胞基于大小分類成小型白細胞、中型白細胞、大型白細胞。小型白細胞包含淋巴細胞，中型白細胞包含中性粒細胞和單核細胞，大型白細胞包含嗜酸性細胞。由于嗜堿性細胞在血中的出現頻度非常低，因此難以特定屬于哪個群，但大致推定為屬于中型白細胞。
血紅蛋白濃度通過檢測上述制備的測定用試樣的555nm附近的吸光度就能夠測定。
以下示出使用上述溶血劑測定狗或貓的血樣的測定例。
實施例2制備對于溶血劑1的組成，季銨鹽濃度或組合各異的溶血劑2-6，使用各溶血劑測定狗或貓的白細胞。使用的季銨鹽如下。
烷基三甲基銨鹽·十烷基三甲基溴化銨(DTAB)烷基的碳數是10·月桂基三甲基氯化銨(LTAC)烷基的碳數是12·肉豆蔻基三甲基溴化銨(MTAB)烷基的碳數是14·硬脂基三甲基氯化銨(STAC)烷基的碳數是18烷基二甲基乙基銨鹽·鯨蠟基二甲基乙基溴化銨(CDMBB)烷基的碳數是16溶血劑2-6中的季銨鹽濃度及組合見表1。
表1

使用表1記載的溶血劑2-6，用自動血細胞計數裝置pocH·100iV(Sysmex株式會社)測定了狗的血樣。測定方法與例1同樣。
另外，與例1同樣地對于測定使用的血樣制作涂抹標本，進行May-Grünwald-Giemsa染色，通過目視將白細胞分類、計數。
圖4是使用溶血劑2測定狗血樣而得的粒度分布。
圖5是使用溶血劑3測定狗血樣而得的粒度分布。
圖6是使用溶血劑4測定狗血樣而得的粒度分布。
圖7是使用溶血劑5測定狗血樣而得的粒度分布。
圖8是使用溶血劑6測定狗血樣而得的粒度分布。
在圖4-8的粒度分布中均出現了3種白細胞亞群(X、Y、Z)。與采用目視法分類的數據比較，結果知道圖中的X群是含有淋巴細胞的群，圖中的Y群是含有中性粒細胞和單核細胞的群，圖中的Z群是含有嗜酸性細胞的群。另外，比較了粒度分布上的各亞群的數據和利用目視法得到的各亞群的數據，結果尤其在圖7和圖8中得到高的相關性。
由以上情況知道，使用溶血劑2-6，能夠將狗的白細胞分類成含有淋巴細胞的群、含有中性粒細胞和單核細胞的群及含有嗜酸性細胞的群這3種亞群。另外知道，使用溶血劑5和溶血劑6，能夠以更高的精度將白細胞分類。
其次，使用溶血劑5和溶血劑6，采用與狗血樣同樣的方法測定了貓血樣。圖9是使用溶血劑5測定貓血樣而得的粒度分布。圖10是使用溶血劑6測定貓血樣而得的粒度分布。
在圖9和圖10的粒度分布中均出現了3種白細胞亞群(X、Y、Z)。與采用目視法分類的數據比較，結果知道圖中的X群是含有淋巴細胞的群，圖中的Y群是含有中性粒細胞和單核細胞的群，圖中的Z群是含有嗜酸性細胞的群。
由以上情況知道，與狗的情況同樣，使用溶血劑5和溶血劑6，能夠將貓的白細胞分類成含有淋巴細胞的群、含有中性粒細胞和單核細胞的群及含有嗜酸性細胞的群這3種亞群。
實施例3使用添加了非離子性表面活性劑的以下組成的溶血劑7，測定了狗和貓的血樣。在溶血劑7中含有作為非離子性表面活性劑的エマルジツト9(第一工業(yè)制藥(株))。エマルジツト9是聚氧乙烯壬基苯基醚型的非離子性表面活性劑，相當于HLB(Hydrophilic-Lipophilic-Balance)17-20的非離子性表面活性劑。
溶血劑7陽離子·AB 2.16g(日本油脂(株)，含有硬脂基三甲基氯化銨23％)月桂基三甲基氯化銨 2.39g鯨蠟基二甲基乙基溴化銨 0.2g肉豆蔻基三甲基溴化銨 0.2gエマルジツト9 1.0g(第一工業(yè)制藥(株)，聚氧乙烯壬基苯基醚)氯化鈉 4.13g琥珀酸 3.0gEDTA·2K·2H2O2.5g氫氧化鈉 1.55g亞硝酸鈉 0.69g精制水 1LpH5.3、滲透壓280mmol/kg在上述的溶血劑7中含有作為季銨鹽的1.43mM的硬脂基三甲基氯化銨、9mM的月桂基三甲基氯化銨、0.53mM的鯨蠟基二甲基乙基溴化銨及0.6mM的肉豆蔻基三甲基溴化銨。使用溶血劑7用自動血細胞計數裝置pocH·100iV(Sysmex株式會社)測定狗血樣111個檢體、貓血樣37個檢體。測定方法與實施例1同樣。另外，與實施例1同樣地將測定使用的血樣制成涂抹標本，進行May-Grünwald-Giemsa染色，通過目視將白細胞分類、計數。
<狗血樣的場合>
圖11表示測定狗血樣的場合的一例粒度分布。在圖11中，最左邊的群是溶血了的紅細胞的群。接著，從尺寸小的一方開始依次是第1群(小型白細胞)、第2群(中型白細胞)、第3群(大型白細胞)。
各群的閾值根據所得到的粒度分布的狀態(tài)而有若干不同，但溶血了的紅細胞群與第1群的閾值在48f1附近，第1群與第2群的閾值在90f1附近，第2群與第3群的閾值在162f1附近，上限值設定在300f1。
圖12和圖13是測定的狗檢體之中2個檢體(狗1和狗2)的粒度分布。任何粒度分布都與圖11同樣，在最左邊出現溶血了的紅細胞群，接著從尺寸小的一方開始依次出現了第1群(小型白細胞)、第2群(中型白細胞)、第3群(大型白細胞)。
然后，比較了在圖12和圖13的粒度分布中出現的小型白細胞、中型白細胞、大型白細胞的數據與采用目視法對白細胞分類、計數得到的數據。表2表示出其結果。
表2

在表2中，SCR(％)、MCR(％)、LCR(％)是基于在圖12和圖13的粒度分布中出現的小型白細胞、中型白細胞、大型白細胞的數據算出的值。SCR(％)是小型白細胞數對于總白細胞數的比率(small cellratio；SCR)。MCR(％)是中型白細胞數對于總白細胞數的比率(Middlecell ratio；MCR)。LCR(％)是大型白細胞數對于總白細胞數的比率(large cell ratio；LCR)。另一方面，淋巴細胞比率(％)、中性粒細胞比率(％)、單核細胞比率(％)及嗜酸性細胞比率(％)是基于采用目視法對白細胞分類、計數得到的數據算出的值。淋巴細胞比率(％)是淋巴細胞數對于總白細胞數的比率。中性粒細胞比率(％)是中性粒細胞數對于總白細胞數的比率。單核細胞比率(％)是單核細胞數對于總白細胞數的比率。嗜酸性細胞比率(％)是嗜酸性細胞數對于總白細胞數的比率。
由表2知道，SCR值與淋巴細胞比率的值近似。同樣地知道，MCR值與單核細胞比率(％)和中性粒細胞比率(％)的合計值近似。而且知道，LCR值與嗜酸性細胞比率的值近似。
在此，對于狗血樣(111個檢體)調查了SCR和利用目視法得到的淋巴細胞比率的相關性，結果兩者的相關性良好(圖14)。因此知道，小型白細胞群含有淋巴細胞。另外，小型白細胞數(SCC；small cellcount)與采用目視法得到的淋巴細胞數的相關性也良好(圖15)。
其次，調查了MCR與采用目視法得到的中性粒細胞比率的相關性(圖16)。另外，調查了MCR與采用目視法得到的中性粒細胞比率+單核細胞比率的相關性(圖17)。與圖16比，圖17的相關性良好。另外，中型白細胞數(MCC；middle cell count)與采用目視法得到的中性粒細胞數+單核細胞數的相關性也良好(圖18)。
其次，調查了LCR與采用目視法得到的嗜酸性細胞比率的相關性(圖19)。另外，調查了LCR與采用目視法得到的嗜酸性細胞比率+單核細胞比率的相關性(圖20)。與圖20比，圖19的相關性良好。另外，大型白細胞數(LCC；large cell count)與采用目視法得到的嗜酸性細胞數的相關性也良好(圖21)。
予以說明，在本實施例中，用目視法未看見出現嗜堿性細胞的檢體。
由此可知，中型白細胞群含有中性粒細胞和單核細胞，大型白細胞群含有嗜酸性細胞。
<貓血樣的場合>
圖22表示測定貓血樣的場合的一例粒度分布。在圖22中，最左邊的群是溶血了的紅細胞群。接著，從尺寸小的一方開始依次是第1群(小型白細胞)、第2群(中型白細胞)、第3群(大型白細胞)。
各群的閾值根據所得到的粒度分布的狀態(tài)而有若干不同，但溶血了的紅細胞群與第1群的閾值在48f1附近，第1群與第2群的閾值在96f1附近，第2群與第3群的閾值在174f1附近，上限值設定在300f1。
圖23和圖24是測定的貓檢體之中2個檢體(貓1和貓2)的粒度分布。任何粒度分布都與圖22同樣，在最左邊出現溶血了的紅細胞群，接著從尺寸小的一方開始依次出現了第1群(小型白細胞)、第2群(中型白細胞)、第3群(大型白細胞)。
然后，比較了在圖23和圖24的粒度分布中出現的小型白細胞、中型白細胞、大型白細胞的數據與采用目視法對白細胞分類、計數得到的數據結果。表3表示出其結果。
表3

在表3中，SCR(％)、MCR(％)、LCR(％)是基于在圖23和圖24的粒度分布中出現的小型白細胞、中型白細胞、大型白細胞的數據算出的值。SCR(％)是小型白細胞數對于總白細胞數的比率(small cellratio；SCR)。MCR(％)是中型白細胞數對于總白細胞數的比率(Middlecell ratio；MCR)。LCR(％)是大型白細胞數對于總白細胞數的比率(large cell ratio；LCR)。另一方面，淋巴細胞比率(％)、中性粒細胞比率(％)、單核細胞比率(％)及嗜酸性細胞比率(％)是基于采用目視法對白細胞分類、計數得到的數據算出的值。淋巴細胞比率(％)是淋巴細胞數對于總白細胞數的比率。中性粒細胞比率(％)是中性粒細胞數對于總白細胞數的比率。單核細胞比率(％)是單核細胞數對于總白細胞數的比率。嗜酸性細胞比率(％)是嗜酸性細胞數對于總白細胞數的比率。
由表3知道，SCR值與淋巴細胞比率的值近似。同樣地知道，MCR值與單核細胞比率(％)和中性粒細胞比率(％)的合計值近似。而且知道，LCR值與嗜酸性細胞比率的值近似。
在此，對于貓血樣(37個檢體)調查了SCR和利用目視法得到的淋巴細胞比率的相關性，結果兩者的相關性良好(圖25)。因此知道，小型白細胞群含有淋巴細胞。另外，小型白細胞數(SCC)與采用目視法得到的淋巴細胞數的相關性也良好(圖26)。
其次，調查了MCR與采用目視法得到的中性粒細胞比率的相關性(圖27)。另外，調查了MCR與采用目視法得到的中性粒細胞比率+單核細胞比率的相關性(圖28)。與圖27比，圖28的相關性良好。另外，中型白細胞數(MCC)與采用目視法得到的中性粒細胞數+單核細胞數的相關性也良好(圖29)。
其次，調查了LCR與采用目視法得到的嗜酸性細胞比率的相關性(圖30)。另外，調查了LCR與采用目視法得到的嗜酸性細胞比率+單核細胞比率的相關性(圖31)。與圖31比，圖30的相關性良好。另外，大型白細胞數(LCC)與采用目視法得到的嗜酸性細胞數的相關性也良好(圖32)。
予以說明，在本實施例中，用目視法未看見出現嗜堿性細胞的檢體。
由此可知，中型白細胞群含有中性粒細胞和單核細胞，大型白細胞群含有嗜酸性細胞。
<血紅蛋白濃度>
關于狗血樣和貓血樣，使用溶血劑7和現有制品ストマトライザ·WH(Sysmex株式會社)，用pocH·100iV進行血紅蛋白濃度測定并比較，結果相關性良好。由此證實了用溶血劑7能測定血紅蛋白濃度。
根據上述的對狗和貓的白細胞分類的方法和試劑，得到比過去詳細、準確的血液檢查的結果，因此對于包括寄生蟲癥和過敏疾病在內的狗和貓的疾病，能進行更合適的診斷或治療監(jiān)控。
權利要求
1.一種用于將動物血中的白細胞分類的方法，包括以下的工序·混合狗或貓的血樣和溶血劑制備測定用試樣的工序，其中在上述測定用試樣中，紅細胞溶解，白細胞收縮；·測定與測定用試樣中的白細胞大小相關的信息的工序；·基于所測定的信息，將白細胞分類成含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群及含有嗜酸性細胞的第3群的工序。
2.根據權利要求1所述的白細胞的分類方法，其中，采用電阻法測定電阻作為與測定用試樣中的白細胞大小相關的信息。
3.根據權利要求1所述的白細胞的分類方法，其中，在制備上述測定用試樣的工序中，白細胞收縮并使得收縮后的大小從小的一方開始依次為淋巴細胞、中性粒細胞及單核細胞、嗜酸性細胞。
4.根據權利要求1所述的白細胞的分類方法，其中，上述群從與白細胞大小相關的信息的小的一方開始依次是第1群、第2群、第3群。
5.根據權利要求1所述的白細胞的分類方法，其中，上述溶血劑含有季銨鹽，上述季銨鹽的濃度是滿足以下條件的濃度(1)充分地溶解紅細胞；(2)使白細胞收縮并使得能夠基于大小將白細胞分類成上述第1群、上述第2群、上述第3群。
6.根據權利要求5所述的白細胞的分類方法，其中，上述季銨鹽的濃度是1.5mM-20mM。
7.根據權利要求5所述的白細胞的分類方法，其中，上述季銨鹽是具有碳數10-20的烷基的烷基三甲基銨鹽。
8.根據權利要求7所述的白細胞的分類方法，其中，上述烷基三甲基銨鹽至少含有第1種烷基三甲基銨鹽和第2種烷基三甲基銨鹽，上述第1種烷基三甲基銨鹽選自月桂基三甲基銨鹽，上述第2種烷基三甲基銨鹽選自硬脂基三甲基銨鹽和鯨蠟基三甲基銨鹽。
9.根據權利要求8所述的白細胞的分類方法，其中，上述月桂基三甲基銨鹽的濃度是8-20mM，上述硬脂基三甲基銨鹽的濃度是0.4-2mM，上述鯨蠟基三甲基銨鹽的濃度是1.5-3mM。
10.根據權利要求8所述的白細胞的分類方法，其中，上述溶血劑還進一步含有肉豆蔻基三甲基銨鹽。
11.根據權利要求8所述的白細胞的分類方法，其中，上述溶血劑還進一步含有烷基二甲基乙基銨鹽。
12.根據權利要求5所述的白細胞的分類方法，其中，上述溶血劑還進一步含有HLB 17-20的非離子性表面活性劑。
13.根據權利要求1所述的白細胞的分類方法，其中，上述溶血劑的pH是4-9。
14.一種試劑，用于將狗或貓的血樣中的白細胞分類成含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群及含有嗜酸性細胞的第3群的試劑，含有溶解血樣中的紅細胞、使白細胞收縮的季銨鹽；和溶解上述季銨鹽的水系溶劑，上述季銨鹽的濃度滿足以下條件(3)充分地溶解紅細胞；(4)使白細胞收縮并使得能夠基于大小將白細胞分類成第1群、第2群、第3群。
15.根據權利要求14所述的試劑，其中，上述季銨鹽的濃度是1.5mM-20mM。
16.根據權利要求14所述的試劑，其中，上述季銨鹽是具有碳數10-20的烷基的烷基三甲基銨鹽。
17.根據權利要求16所述的試劑，其中，上述烷基三甲基銨鹽至少含有第1種烷基三甲基銨鹽和第2種烷基三甲基銨鹽，上述第1種烷基三甲基銨鹽選自月桂基三甲基銨鹽，上述第2種烷基三甲基銨鹽選自硬脂基三甲基銨鹽和鯨蠟基三甲基銨鹽。
18.根據權利要求17所述的試劑，其中，上述月桂基三甲基銨鹽的濃度是8-20mM，上述硬脂基三甲基銨鹽的濃度是0.4-2mM，上述鯨蠟基三甲基銨鹽的濃度是1.5-3mM。
19.根據權利要求14所述的試劑，其中，還進一步含有HLB 17-20的非離子性表面活性劑。
20.根據權利要求14所述的試劑，其中，上述水系溶劑是將pH維持在4-9的緩沖液。
全文摘要
提供將動物血中的白細胞的亞群更準確地分類的方法及試劑。(1)混合含有動物血的血樣和溶血劑，溶解上述血樣中的紅細胞，同時使白細胞收縮，制備測定用試樣；(2)用電阻法測定上述測定用試樣中的白細胞大小；(3)將上述白細胞基于其大小分類成含有淋巴細胞的第1群、含有中性粒細胞和單核細胞的第2群及含有嗜酸性細胞的第3群。
文檔編號G01N27/02GK1811417SQ20061000604
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月24日 優(yōu)先權日2005年1月24日
發(fā)明者松本英彬, 白石順一, 平山英樹 申請人:希森美康株式會社