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一種檢測鹽霉素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法

文檔序號:6111058閱讀:470來源:國知局
專利名稱:一種檢測鹽霉素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及一種檢測鹽霉素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術
鹽霉素(Salinomycin Sodium Premix)屬一種聚醚類獸用抗生素,對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和部分霉菌起抗菌作用,單獨使用對雞球蟲病能發(fā)揮良好的預防效果。但使用鹽霉素不可過量,過量使用將會在動物體內(nèi)大量蓄積,并會使所食用動物中毒死亡,通過食物鏈而危及人類健康。2002年12月我國農(nóng)業(yè)部公告第235號文規(guī)定鹽霉素在所食用動物的肌肉中最高殘留量為600μg/kg在皮膚、脂肪中的最高殘留量為1200μg/kg在肝中的最高殘留量為1800μg/kg。因此,檢測鹽霉素在動物性食品中的最高殘留量是非常重要。
目前,常用于鹽霉素殘留檢測的方法主要有微生物法和儀器分析法。微生物檢測法雖然經(jīng)濟、操作簡便,但在樣本中有其他微生物抑制劑存在時,其靈敏度和特異性受到限制;高效液相色譜分析法、氣譜、氣質聯(lián)機法等單純的儀器分析方法,雖然靈敏度高,但是樣本前處理及測定操作煩瑣,費用高,不適宜于大量樣本篩查,可以作為殘留的確證分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測鹽霉素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測鹽霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒,包括鹽霉素特異性抗體及包被原和酶標記物;所述包被原為鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體;所述酶標記物為酶標抗抗體或酶標鹽霉素半抗原;當所述包被原為鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時,所述酶標記物為酶標抗抗體;當所述包被原為鹽霉素抗抗體時,所述酶標記物為酶標鹽霉素半抗原。
所述鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將鹽霉素半抗原和載體蛋白用混合酸酐法或活性酯法進行偶聯(lián)得到;所述鹽霉素半抗原是將鹽霉素和對氨基苯甲酸通過縮合反應得到的。
所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶,其中優(yōu)選堿性磷酸酯酶;堿性磷酸酯酶標記抗抗體可采用現(xiàn)有技術中的多種方法如戊二醛法或過碘酸鈉法將酶交聯(lián)在抗抗體上;堿性磷酸酯酶標記的鹽霉素半抗原可采用混合酸酐法將堿性磷酸酯酶與鹽霉素半抗原偶聯(lián)得到。所述鹽霉素半抗原是將鹽霉素和對氨基苯甲酸通過縮合反應得到的。
所述鹽霉素特異性抗體可為鹽霉素單克隆抗體或鹽霉素多克隆抗體;它們均是用鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的;多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體,所述鹽霉素單克隆抗體為鹽霉素鼠單克隆抗體,所述鹽霉素多克隆抗體優(yōu)選為鹽霉素兔多克隆抗體。所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體??贵w工作液所用的抗體稀釋液為是pH值8.2的0.05mol/L,含有5%甲醇的磷酸鹽緩沖液。
所述鹽霉素鼠單克隆抗體優(yōu)選為鹽霉素的單克隆雜交瘤細胞株A-2-3 CGMCCNo.1609分泌的抗體。
鹽霉素的單克隆雜交瘤細胞株A-2-3 CGMCC No.1609已于2006年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
以上抗體均可以用鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按常規(guī)方法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白等常用載體蛋白;所述鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將鹽霉素半抗原和載體蛋白用混合酸酐法進行偶聯(lián)得到;所述鹽霉素半抗原是將鹽霉素和對氨基苯甲酸通過縮合反應得到的。
為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查,所述試劑盒還包括鹽霉素標準品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液。
所述標準品溶液為六個濃度梯度含有鹽霉素藥物的溶液,所用的鹽霉素藥物稀釋液為含有5‰(質量濃度)N,N’-二甲基甲酰胺(DMF),1%小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液。
所述濃縮洗滌液為pH7.4,0.01mol/L的含有0.8%~1.2%吐溫20、1‰硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液。
所述當標記酶為辣根過氧化物酶時,顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成,顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲,顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺,終止液為1~2mol/L硫酸或鹽酸;當標記酶為堿性磷酸酯酶時,顯色劑為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液,終止液為氫氧化鈉緩沖液。
所述濃縮復溶液可為含有5‰(質量濃度)N,N’-二甲基甲酰胺(DMF),1%小牛血清(BSA)的0.01mol/L~0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液。
所述包被緩沖液為pH9.6,0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液。
所述封閉液是含有3~10%馬血清、1%惰性蛋白的水溶液。
所用的包被鹽霉素抗原或抗抗體的載體物質可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等,載體的形式可以是試管、微量反應板凹孔、小珠、小圓片等。
本發(fā)明所提供的檢測鹽霉素的方法,包括以下步驟1)樣品前處理樣品前處理稱取2g動物組織勻漿物置離心管中,加入10ml體積比為4∶1的甲醇和5%生理鹽水的混合液,劇烈振蕩混勻;于15℃,5000g以上速度離心10min;將上清液移入另一離心管中,于15℃,3000g離心5min;取5ml上清液,加入10ml四氯化碳,振蕩混勻,5000g以上速度離心10min;將上層液移入另一管中用氮氣吹干,用1ml稀釋4倍的濃縮復溶液溶解干燥的殘留物,取水相進行分析。
2)利用上述檢測鹽霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣品。
3)檢測數(shù)據(jù)分析。
鹽霉素是小分子物質,只有免疫反應性,沒有免疫原性,不能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應答,必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。將鹽霉素和對氨基苯甲酸通過縮合反應合成鹽霉素半抗原,有助于制出針對鹽霉素抗原特異性較強的多克隆抗體。再將鹽霉素采用混合酸酐法與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原。半抗原與載體蛋白的結合比例過低或過高都對免疫不利,半抗原與OVA、RSA和KLH的結合摩爾比分別為11∶1、17∶1、17∶1。
本發(fā)明的試劑盒可定性、定量檢測動物組織樣品中鹽霉素的殘留量。本發(fā)明的檢測原理是當微孔條上預包被鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時,加入系列標準品或樣品溶液和鹽霉素抗體工作液后,樣本中殘留的鹽霉素和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗鹽霉素的抗體,加入酶標記物進行酶活性放大作用,顯色后終止;當微孔條上包被抗抗體時,加入鹽霉素抗體工作液后,再加入系列標準品或樣品溶液和酶標抗原,樣品殘留的鹽霉素和酶標抗原競爭抗鹽霉素抗體,顯色;顯色終止后用酶標儀測定每孔吸光度值(OD值),樣本吸光度值與其殘留物鹽霉素的含量呈負相關,與標準曲線比較即可得出相應殘留物鹽霉素的含量。也可根據(jù)酶標板上的樣品溶液顏色的深淺,與系列濃度的鹽霉素標準液顏色比較判斷樣品中鹽霉素的濃度范圍。
本發(fā)明的檢測鹽霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒對樣品的前處理要求低,樣品前處理過程簡單,能同時快速檢測大批樣品;主要試劑以工作液、濃縮液或凍干粉等形式提供,檢驗方法方便易行,經(jīng)過對試劑盒的精密度和準確度測試實驗表明,本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點,將在食品和飼料鹽霉素殘留量的檢測中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明的試劑盒結構簡單、使用方便、價格便宜、便于攜帶,可用于動物源性食品中鹽霉素的檢測;本發(fā)明的檢測鹽霉素的方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測。


圖1為以鹽霉素抗原為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒鹽霉素標準曲線2為以抗抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒鹽霉素標準曲線圖具體實施方式
下述實施例的方法如無特別說明,均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量,如無特別說明,均為質量百分含量。
實施例1、以鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備及其檢測方法以鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有鹽霉素與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標板;(2)堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠抗抗體工作液用抗體稀釋液將堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠抗抗體稀釋成蛋白濃度為0.1μg/L,12ml/瓶,1瓶。酶標記物稀釋液為pH值8.2,含有1.2μg/L抗體蛋白,含有5%甲醇的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液。
(3)鹽霉素標準品溶液用稀釋液將鹽霉素稀釋成系列標準品溶液6瓶,0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L,3ml/瓶。所用的鹽霉素藥物稀釋液為含有5‰(質量濃度)N,N’-二甲基甲酰胺(DMF),1%小牛血清(BSA),0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液。
(4)顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液,8ml/瓶,1瓶。
(5)鹽霉素鼠單克隆抗體工作液用抗體稀釋液將鹽霉素的單克隆雜交瘤細胞株A-2-3 CGMCC No.1609分泌的抗體稀釋為蛋白濃度0.1μg/L,12ml/瓶,1瓶??贵w稀釋液是pH值8.2,含有1.2μg/L抗體蛋白,含有5%甲醇的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液。
(6)濃縮洗滌液含0.9%吐溫、1‰(質量濃度)硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.01M,pH值7.4),50ml/瓶,1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液2mol/L氫氧化鈉溶液,8ml/瓶,1瓶。
(8)濃縮復溶液含有5‰N,N’-二甲基甲酰胺(DMF),1%小牛血清(BSA)的0.01~0.05mol/L磷酸鹽緩沖液,400ml/瓶,1瓶。為正常使用濃度的5倍。
(9)包被緩沖液pH 9.6,0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液。
(10)封閉液5%馬血清、1%惰性蛋白的水溶液。
其中,包被鹽霉素與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標板、鹽霉素特異性抗體、堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠抗抗體的制備方法如下一、酶標板的制備1、鹽霉素半抗原的合成方法半抗原的合成將鹽霉素和對氨基苯甲酸通過縮合反應合成鹽霉素半抗原。具體步驟為將鹽霉素和對氨基苯甲酸按1∶1比例混合攪拌反應,室溫下反應過夜。
2、包被原采用混合酸酐法將鹽霉素半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原。
包被原的具體制備方法如下(1)取鹽霉素半抗原2g溶于30ml,50%的N,N’-二甲基甲酰胺溶液中;(2)取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無水二噁烷中加到半抗原溶液中室溫攪拌反應4小時;(3)取卵清22g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中;(4)將卵清蛋白滴加到半抗原中4℃攪拌過夜;(5)將反應完的人工抗原對0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天,每天換液3~4次。
3、酶標板的制備用包被緩沖液將鹽霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋成0.06μg/ml,每孔加入100μl,37℃溫育2h,傾去包被液,用稀釋19倍的濃縮洗滌液洗滌2次,每次30s,拍干,然后在每孔中加入150μl封閉液,37℃溫育1-2h,傾去孔內(nèi)液體,干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、鹽霉素鼠單克隆抗體的制備1、免疫原的合成將鹽霉素和對氨基苯甲酸通過縮合反應合成鹽霉素半抗原。再采用混合酸酐法將鹽霉素半抗原與血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)得到免疫原。合成的免疫原采用免疫電泳測定其純度為97.3%。
免疫原合成的具體步驟(1)取鹽霉素半抗原2g溶于30ml,50%的N,N’-二甲基甲酰胺溶液中;(2)再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無水二噁烷中加到半抗原溶液中室溫攪拌反應4小時;(3)取血藍蛋白(KLH)32g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中;(4)再將血藍蛋白滴加到半抗原中4℃攪拌過夜;(5)將反應完的人工抗原對0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天,每天換液3~4次。
2、鹽霉素鼠單克隆抗體的制備動物免疫程序 采用Balb/c小鼠作為免疫動物,以鹽霉素半抗原與血藍蛋白偶聯(lián)物為免疫原,免疫劑量為100μg/只,首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑,頸背部皮下多點注射,間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化,加強免疫一次,四免后腹腔加強免疫一次,3天后取脾細胞。
細胞融合與克隆化 取免疫BALB/c小鼠脾細胞,按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合,采用間接競爭ELISA測定細胞上清液,篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化,直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株—鹽霉素的單克隆雜交瘤細胞株A-2-3 CGMCC No.1609。
細胞凍存和復蘇 取處于對數(shù)生長期的鹽霉素的單克隆雜交瘤細胞株A-2-3CGMCC No.1609用凍存液制成5×106個/ml的細胞懸液,分裝于凍存管,在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管,立即放入37℃水浴中速融,離心去除凍存液后,移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化 采用體內(nèi)誘生法,將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只,7~14天后腹腔注射雜交瘤細胞5×106個/只,7~10天后采集腹水。經(jīng)辛酸—飽和硫酸銨法進行腹水純化,小瓶分裝,-20℃保存。
三、酶標抗體的制備抗抗體的制備以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫,得到羊抗鼠抗抗體。
酶標抗抗體制備將羊抗鼠抗抗體與堿性磷酸酯酶進行偶聯(lián),采用的方法優(yōu)選戊二醛法,用堿性磷酸酯酶以2∶1的比例與抗抗體偶聯(lián)時,約有60%~70%的酶與8%的抗抗體偶聯(lián),酶標記物的產(chǎn)量比使用辣根過氧化物酶高。
堿性磷酸酯酶標記羊抗鼠抗抗體具體步驟如下1)稱取堿性磷酸酯酶25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室溫靜置過夜。
2)反應后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1min,收集棕色流出液。如體積大于5ml,則以聚己二醇濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中,緩慢攪拌。
3)取羊抗鼠抗抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。
4)用1M pH9.5碳酸緩沖液0.25ml,繼續(xù)攪拌3h。
5)加0.2M賴氨酸0.25ml,混勻后,置室溫2h。
6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,置4℃1h。
7)3000rpm離心半小時,棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液中。
8)將上述溶液裝入透析袋中,用0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析,去除銨離子后用萘氏試劑檢測,10000rpm離心30min去除沉淀,上清液即為酶結合物,分裝后,冰凍保存。
利用該試劑盒檢測樣品中殘留的鹽霉素的方法如下一、樣品前處理肌肉、肝臟取肌肉、肝臟樣品用勻漿機10000r/min勻漿1min,稱取2±0.05g勻漿物置離心管中,加入10ml甲醇-5%生理鹽水溶液(甲醇∶生理鹽水=4∶1(體積比))混合,劇烈振蕩10min。于15℃,5000g以上速度離心10min。上清液移入另一離心管中再次離心15℃,3000g,5min。取5ml上清液,加入10ml四氯化碳,混合振蕩10min,5000g以上速度離心10min。將上層液移另一管中用氮氣吹干(或雞心瓶中,50℃減壓蒸干),用1ml稀釋4倍的濃縮復溶液溶解干燥的殘留物。取水相進行分析。
二、檢測方法向鹽霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物包被的96孔酶標板微孔中加系列標準品溶液或樣品溶液50μl,再加入鹽霉素鼠單克隆抗體工作液50μl,用蓋板膜封板,37℃恒溫箱中反應30min。倒出孔中液體,每孔加入250μl稀釋19倍的濃縮洗滌液(含0.8%~1.2%吐溫,1‰硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.01M PH7.4)),30秒后倒出孔中液體,如此重復操作共洗板5次,用吸水紙拍干。每孔加入堿性磷酸酯酶標記羊抗鼠抗抗體工作液100μl用蓋板膜封板,37℃恒溫箱中反應30min。倒出孔中液體,重復洗滌步驟。加入底物顯色液100μl,輕輕振蕩混勻,37℃恒溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液(1mol/L氫氧化鈉)50μl,輕輕振蕩混勻,用酶標儀測定每孔吸光度值(OD值)。
三、結果分析所獲得的每個濃度標準品溶液或樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個標準(0標準)的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。
公式中B為標準品溶液或樣本溶液的平均吸光度值,B0為0μg/L標準品溶液的平均吸光度值。以鹽霉素濃度的自然對數(shù)值為X軸,百分吸光度值為Y軸,繪制標準曲線圖,如圖1所示。相對應每一個樣品中鹽霉素的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法,計算出樣本溶液中鹽霉素的濃度。利用計算機專業(yè)軟件,更便于大量樣品的快速分析。整個檢測過程只需1.4小時就可以完成,最低檢測限為1.0μg/L。
實施例2、以羊抗兔抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法以羊抗兔抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有鹽霉素抗抗體的酶標板;(2)堿性磷酸酯酶標記的鹽霉素半抗原工作液用雙蒸水將堿性磷酸酯酶標記的鹽霉素半抗原稀釋為0.1mol/L,12ml/瓶,1瓶。
鹽霉素標準品溶液用稀釋液將鹽霉素稀釋成系列標準品溶液6瓶,0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L,3ml/瓶。所用的鹽霉素藥物稀釋液為含有5‰N,N’-二甲基甲酰胺(DMF),1%小牛血清(BSA)0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液(4)顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液,8ml/瓶,1瓶。
(5)鹽霉素兔多克隆抗體工作液用抗體稀釋液將鹽霉素兔多克隆抗體稀釋為蛋白濃度0.1μg/L,12ml/瓶,1瓶??贵w稀釋液是含有pH值8.2的0.05mol/L,1.2μg/L抗體蛋白,含有5%甲醇的磷酸鹽緩沖液。
(6)濃縮洗滌液含0.9%吐溫、1‰硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.01MpH7.4),50ml/瓶,1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液2mol/L氫氧化鈉緩沖液,8ml/瓶,1瓶。
(8)濃縮復溶液含有5‰N,N’-二甲基甲酰胺(DMF),1%小牛血清(BSA)的0.01~0.05mol/L磷酸鹽緩沖液,400ml/瓶,1瓶。為正常使用濃度的5倍。
(9)包被緩沖液pH 9.6,0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液。
(10)封閉液5%馬血清、1%惰性蛋白的水溶液。
其中,包被羊抗兔抗抗體的酶標板、鹽霉素特異性抗體、堿性磷酸酯酶標記的鹽霉素半抗原的制備方法如下一、酶標板的制備1、羊抗兔抗抗體包被原的制備以兔源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫,得到羊抗兔抗抗體。
2、包被有羊抗兔抗抗體的酶標板制備方法酶標板的材料為聚氯乙稀,用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成0.5μg/ml,酶標板每孔加入100μl,37℃溫育2h,傾去包被液,用稀釋19倍的濃縮洗滌液洗滌2次,每次30s,拍干,然后在每孔中加入150μl封閉液,37℃溫育1-2h,傾去孔內(nèi)液體,干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、鹽霉素兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物,以鹽霉素半抗原與血藍蛋白偶聯(lián)物為免疫原,免疫劑量為1mg/kg,首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑,頸背部皮下多點注射,間隔3~4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化,加強免疫一次,共免疫5次,最后一次不加佐劑。最后一次免疫7~10d后采血,測定血清抗體效價,心臟采血,經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的兔多克隆抗體。
三、酶標記鹽霉素抗原的制備將鹽霉素和對氨基苯甲酸通過縮合反應合成鹽霉素半抗原,將鹽霉素半抗原與堿性磷酸酯酶采用混合酸酐法進行偶聯(lián)得到酶標記鹽霉素抗原。
酶標記鹽霉素抗原的具體制備方法如下取鹽霉素半抗原2g溶于30ml,50%的N,N’-二甲基甲酰胺溶液中,再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無水二噁烷中加到半抗原溶液中室溫攪拌反應4小時,取堿性磷酸酯酶32g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中,再將堿性磷酸酯酶滴加到半抗原中4℃攪拌過夜。將反應完的人工抗原對0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天,每天換液3~4次。
利用該試劑盒檢測樣品中殘留的鹽霉素的方法如下樣品前處理的具體步驟同實施例1中的樣品前處理步驟。
檢測方法向包被有羊抗兔抗抗體的96孔酶標板微孔中加入鹽霉素多克隆抗體工作液100μl,37℃恒溫箱中反應30min,每孔加入250μl稀釋19倍的濃縮洗滌液(含0.8%~1.2%吐溫,1‰硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.01M,PH值7.4)),30秒后倒出孔中液體,如此重復操作共洗板5次,用吸水紙拍干。每孔加入系列標準品溶液或樣品溶液和堿性磷酸酯酶標記的鹽霉素工作液各50μl,用蓋板膜封板,37℃恒溫箱中反應30min。倒出孔中液體,每孔加入250μl濃縮洗滌液(含0.8%~1.2%吐溫,1‰硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.01M,PH值7.4)),30秒后倒出孔中液體,如此重復操作共洗板5次,用吸水紙拍干。加入底物顯色液4-硝基酚磷酸鹽緩沖液100μl,輕輕振蕩混勻,37℃恒溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液(2mol/L氫氧化鈉)50μl,輕輕振蕩混勻,用酶標儀測定每孔吸光度值(OD值)。
結果分析的方法同實施例1中的結果分析方法,該試劑盒的標準曲線圖,如圖2所示。結果分析表明,制備的試劑盒整個檢測過程只需1.4小時就可以完成,最低檢測限為1.0μg/L。
實施例3、試劑盒精密度、準確度和保存期試驗1、試劑盒精密度試驗
(1)標準品精密度試驗從三批試劑盒中每批抽取10個試劑盒,從每個試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個微孔,測定9μg/L標準品溶液的吸光度值(OD值),計算變異系數(shù)。結果如表1所示,表明變異系數(shù)范圍在4.8%-16.2%之間,符合精密度小于或等于20%的規(guī)定。
表1標準精密度試驗

(2)樣本可重復性試驗每個樣本按10μg/kg濃度添加鹽霉素標準品,分別取三個不同批次的試劑盒各三個,每個濃度重復5次,分別計算變異系數(shù)。測定結果如表3、表4所示,結果表明雞肉樣本變異系數(shù)均低于20%,雞肝樣本的變異系數(shù)均低于25%。
表2雞肉樣品可重復性試驗

表3雞肝樣品可重復性試驗


結果表明雞肉樣品的變異系數(shù)均小于20%,雞肝樣品的變異系數(shù)均小于20%。
2、試劑盒的準確度測定取兩個濃度的鹽霉素標準品溶液分別為5μg/kg(L)和10μg/kg(L),分別用試劑盒按照實施例1或實施例2的方法檢測鹽霉素,每個濃度做4個平行,分別計算準確度。試劑盒準確度檢測結果如表4所示,結果表明雞肉添加的準確度在62.4%~80.3%之間,雞肝添加準確度在71.6%~89.8%之間。
表4準確度測定試驗

3、試劑盒保存期試驗將試劑盒分別保存在2-8℃,6個月后,測定試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50%抑制濃度、鹽霉素添加實際測定值,結果表明試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50%抑制濃度均在正常范圍之內(nèi)??紤]在運輸和使用過程中,會有非正常保存條件出現(xiàn),將上述試劑盒在37℃保存的條件下放置6天,進行加速老化實驗,結果表明試劑盒各項指標完全符合要求??紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生,將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天,測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個月以上。
權利要求
1.一種檢測鹽霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒,包括鹽霉素特異性抗體及包被原和酶標記物;所述包被原為鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體;所述酶標記物為酶標抗抗體或酶標鹽霉素半抗原;當所述包被原為鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時,所述酶標記物為酶標抗抗體;當所述包被原抗抗體時,所述酶標記物為酶標鹽霉素半抗原;所述鹽霉素半抗原是將鹽霉素和對氨基苯甲酸通過縮合反應得到的。
2.根據(jù)權利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于所述試劑盒還包括鹽霉素標準溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復溶液。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于所述鹽霉素特異性抗體為鹽霉素單克隆抗體或鹽霉素多克隆抗體;它們均是用鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的;所述鹽霉素半抗原是將鹽霉素和對氨基苯甲酸通過縮合反應得到的;所述載體蛋白為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶,其中優(yōu)選為堿性磷酸酯酶。
5.根據(jù)權利要求3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體;所述鹽霉素單克隆抗體為鹽霉素的單克隆雜交瘤細胞株A-2-3 CGMCCNo.1609分泌的抗體。
6.根據(jù)權利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于所述濃縮洗滌液為pH值7.4,0.01mol/L的含有0.8%~1.2%吐溫20、0.1%硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質量百分含量。
7.根據(jù)權利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于當標記酶為辣根過氧化物酶時,所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成,顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲,顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺,終止液為1~2mol/L硫酸、鹽酸溶液;當標記酶為堿性磷酸酯酶時,顯色劑為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液,終止液為1~2mol/L氫氧化鈉溶液。
8.根據(jù)權利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于所述濃縮復溶液為含有0.5%N,N’-二甲基甲酰胺,1%小牛血清的0.01~0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液;所述百分含量為質量百分含量。
9.根據(jù)權利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于所述包被緩沖液為pH值9.6,0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液;所述封閉液是含有3~10%馬血清、1%惰性蛋白的水溶液;所述百分含量為質量百分含量。
10.一種檢測鹽霉素的方法,包括以下步驟1)樣品前處理稱取2g動物組織勻漿物置離心管中,加入10ml體積比為4∶1的甲醇和5%生理鹽水的混合液,混勻;于15℃,5000g以上速度離心10min;將上清液于15℃,3000g離心5min;取5ml上清液,加入10ml四氯化碳,振蕩混勻,5000g以上速度離心10min;將上層液用氮氣吹干,用1ml稀釋4倍的權利要求8所述的濃縮復溶液溶解干燥的殘留物,取水相進行分析;2)利用權利要求1-9中任一所述的檢測鹽霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測鹽霉素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。該檢測鹽霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒,包括鹽霉素特異性抗體及包被原和酶標記物;所述包被原為鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體;所述酶標記物為酶標抗抗體或酶標鹽霉素半抗原;當所述包被原為鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時,所述酶標記物為酶標抗抗體;當所述包被原為抗抗體時,所述酶標記物為酶標鹽霉素半抗原。本發(fā)明的方法操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查的檢測如動物肝臟、肌肉等鹽霉素藥物殘留量。
文檔編號G01N33/535GK1811441SQ20061000728
公開日2006年8月2日 申請日期2006年2月17日 優(yōu)先權日2006年2月17日
發(fā)明者沈建忠, 何方洋, 萬宇平, 史為民, 馮才偉, 江海洋, 吳小平, 汪善良 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學
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