專利名稱：一種檢測(cè)泰樂菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)泰樂菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
泰樂菌素(Halofuginone)商品名叫速丹(Stenorol)，為氫溴酸泰樂菌素0.6％預(yù)混劑，是常山堿甲、乙、丙三種的混合物，對(duì)瘧疾和球蟲均有特效，且與其它抗球蟲藥無(wú)交叉耐藥性，因此常被添加于飼料中以控制球蟲引起的動(dòng)物疾病，是目前飼料中廣泛應(yīng)用的藥物添加劑。但泰樂菌素對(duì)水生動(dòng)物(如魚、蝦)有很強(qiáng)的毒性，且可以通過食物鏈危害人類。人如果食用泰樂菌素殘留濃度很高的禽肉組織，會(huì)出現(xiàn)身體不適等中毒現(xiàn)象。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定了泰樂菌素在雞肝組織中的最高殘留限量為130μg/kg。
目前，常用于泰樂菌素殘留檢測(cè)的方法主要有微生物法和儀器分析法。微生物檢測(cè)法雖然經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便，但在樣本中有其他微生物抑制劑存在時(shí)，其靈敏度和特異性受到限制；高效液相色譜分析法、氣譜、氣質(zhì)聯(lián)機(jī)法等單純的儀器分析方法，雖然靈敏度高，但是樣本前處理及測(cè)定操作煩瑣，費(fèi)用高，不適宜于大量樣本篩查，可以作為殘留的確證分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)泰樂菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)泰樂菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括泰樂菌素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)泰樂菌素半抗原；當(dāng)所述包被原為泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)泰樂菌素半抗原。
所述泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將泰樂菌素半抗原和載體蛋白用混合酸酐法或活性酯法進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述泰樂菌素半抗原是將泰樂菌素和對(duì)氨基苯甲酸通過縮合反應(yīng)得到的。
所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選堿性磷酸酯酶；堿性磷酸酯酶標(biāo)記抗抗體可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法如戊二醛法或過碘酸鈉法將酶交聯(lián)在抗抗體上；堿性磷酸酯酶標(biāo)記的泰樂菌素半抗原可采用活性酯法將堿性磷酸酯酶與泰樂菌素半抗原偶聯(lián)得到。所述泰樂菌素半抗原是將泰樂菌素和對(duì)氨基苯甲酸通過縮合反應(yīng)得到的。
所述泰樂菌素特異性抗體可為泰樂菌素單克隆抗體或泰樂菌素多克隆抗體；它們均是用泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述泰樂菌素單克隆抗體為泰樂菌素鼠單克隆抗體，所述泰樂菌素多克隆抗體優(yōu)選為泰樂菌素兔多克隆抗體。所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體，優(yōu)選為羊抗兔抗抗體。
所述泰樂菌素單克隆抗體優(yōu)選為泰樂菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-4 CGMCCNo.1614分泌的抗體。
泰樂菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-4 CGMCC No.1614已于2006年2月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)。
以上抗體均可以用泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按常規(guī)方法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白等常用載體蛋白；所述泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將泰樂菌素半抗原和載體蛋白用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述泰樂菌素半抗原是將泰樂菌素和對(duì)氨基苯甲酸通過縮合反應(yīng)得到的。
為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。
所述濃縮洗滌液為pH7.4，0.01～0.05mol/L的含有0.8％～1.2％吐溫80，1‰(質(zhì)量濃度)的疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；當(dāng)酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶時(shí)，所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；當(dāng)酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶是堿性磷酸酯酶時(shí)，所述顯色劑為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。
所述濃縮復(fù)溶液為含有5‰(質(zhì)量濃度)N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)，1％卵清蛋白(OVA)的磷酸鹽緩沖液。
所述終止液為1～2mol/L的硫酸、鹽酸或氫氧化鈉緩沖液。
所述泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液為含有泰樂菌素藥物六個(gè)濃度梯度的溶液，用含有5‰(質(zhì)量濃度)N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)，1％卵清蛋白(OVA)的磷酸鹽緩沖液稀釋。
制備酶標(biāo)板所需試劑為包被緩沖液為pH 8.0，0.1mol/L的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液；封閉液是含有3～10％的馬血清、1％酪蛋白的磷酸鹽緩沖溶液；
泰樂菌素特異性抗體可以抗體工作液形式存在，所用的稀釋抗體的溶液可為pH值8.2的0.1mol/L，含有3％的牛血清，20％甲醇的磷酸鹽緩沖液。
酶標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；所述酶標(biāo)記物工作液所用的稀釋溶液可為含有0.1‰(質(zhì)量濃度)甘油、1％的硫柳汞防腐劑的溶液。
所用的包被泰樂菌素抗原或抗抗體的載體的物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等，載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)泰樂菌素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當(dāng)樣品為動(dòng)物組織時(shí)，用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，稱取3g±0.1g樣本，加入10ml乙腈—水溶液(84∶16，V∶V)，混勻，渦動(dòng)10分鐘后于振蕩器上振蕩10分鐘，3000g以上，15℃，離心10分鐘，取上清液4ml，加入蒸餾水3ml，再加入2mol/L NaOH 100μl，混合后立刻加入三氯甲烷5ml萃取，于振蕩器上振蕩10min，3000g以上，15℃，離心10-15分鐘，去除上層相，取下層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，?ml稀釋3倍的上述濃縮復(fù)溶液(用去離子水稀釋)溶解干燥后的殘留物。
2)利用上述檢測(cè)泰樂菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)樣品。
本發(fā)明的試劑盒可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物源食品樣品中動(dòng)物組織(肌肉、肝臟)中的泰樂菌素含量。本發(fā)明的方法中，當(dāng)微孔條上預(yù)包被泰樂菌素半抗原和載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，加入樣品溶液和泰樂菌素抗體，樣品中殘留的泰樂菌素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗泰樂菌素抗體，加入酶標(biāo)抗抗體進(jìn)行酶放大作用后，顯色；當(dāng)微孔條上預(yù)包被抗抗體時(shí)，加入泰樂菌素抗體后再加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液及酶標(biāo)記泰樂菌素抗原，樣本中殘留物泰樂菌素將和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗泰樂菌素抗體，顯色；顯色終止后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)，樣本吸光度值與其所含殘留物泰樂菌素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中殘留的泰樂菌素藥物含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的泰樂菌素藥物的標(biāo)準(zhǔn)液顏色的比較可判斷樣品中泰樂菌素的濃度范圍。在洗滌液中加入一定量吐溫80和疊氮化鈉的作用在于緩沖液中吐溫80會(huì)減少抗體的非特異性吸附，還能對(duì)蛋白起到一定的保護(hù)作用，加入疊氮化鈉后，則疊氮鈉在溶液中抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)溶液的穩(wěn)定性其到一個(gè)保護(hù)作用。
泰樂菌素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明將泰樂菌素和對(duì)氨基苯甲酸通過縮合反應(yīng)合成泰樂菌素半抗原，給泰樂菌素接出了一個(gè)含苯環(huán)的間隔臂，這樣突出了泰樂菌素的特征結(jié)構(gòu)，同時(shí)也增加了半抗原的免疫源性和特異性。再將泰樂菌素采用混合酸酐法與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原。本發(fā)明的檢測(cè)泰樂菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過低或過高都對(duì)免疫不利，半抗原與OVA、RSA和MSA的結(jié)合摩爾比分別為12∶1、17∶1和17∶1。主要試劑以工作液、濃縮液或凍干粉等形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，經(jīng)過對(duì)試劑盒的精密度和準(zhǔn)確度測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，將在食品和飼料泰樂菌素殘留量的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、便于攜帶，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控及大量的樣本篩查。本發(fā)明的檢測(cè)泰樂菌素的方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測(cè)。本發(fā)明簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的步驟，縮短了檢測(cè)的時(shí)間，具有可觀的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1為以泰樂菌素抗原為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線2為以抗抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例的方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、以泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備及其檢測(cè)方法以泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有泰樂菌素與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液用酶標(biāo)抗體稀釋液將堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體稀釋成蛋白濃度為0.1～1μg/L。上述堿性磷酸酯酶標(biāo)記抗抗體，所述酶標(biāo)抗體稀釋液為含有0.1‰(質(zhì)量濃度)甘油、1％的硫柳汞防腐劑的溶液。12ml/瓶，1瓶。
(3)泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液泰樂菌素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，0μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L，121.5μg/L，1～3ml/瓶。所用的泰樂菌素藥物稀釋液為含有5‰(質(zhì)量濃度)N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)，1％卵清蛋白(OVA)的磷酸鹽緩沖液。
(4)顯色劑為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。均為8ml/瓶。
(5)泰樂菌素鼠單克隆抗體工作液用抗體稀釋液將泰樂菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-4 CGMCC No.1614分泌的單克隆抗體稀釋成蛋白濃度為0.02μg/ml，12ml/瓶，1瓶。稀釋抗體的溶液為pH值8.2的0.1mol/L，含有3％的牛血清，20％甲醇的磷酸鹽緩沖液。
(6)濃縮洗滌液pH 7.4、0.01-0.05mol/L的含有1.0％吐溫80，1‰(質(zhì)量濃度)的疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液，40ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液2mol/L氫氧化鈉，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液0.02mol/L含有5‰(質(zhì)量濃度)N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)，1％卵清蛋白(OVA)的磷酸鹽緩沖液，20ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的4倍。
制備酶標(biāo)板所需試劑(1)包被緩沖液pH值為8.0，0.1mol/L的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液。
(2)封閉液含有3～10％的馬血清、1％酪蛋白的磷酸鹽緩沖溶液。
其中，泰樂菌素與載體蛋白偶聯(lián)物、泰樂菌素特異性抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體的制備方法如下一、酶標(biāo)板的制備1、泰樂菌素半抗原的合成方法泰樂菌素半抗原的制備將泰樂菌素和對(duì)氨基苯甲酸通過縮合反應(yīng)合成泰樂菌素半抗原，給泰樂菌素接出了一個(gè)含苯環(huán)的間隔臂，這樣突出了泰樂菌素的特征結(jié)構(gòu)，同時(shí)也增加了半抗原的免疫源性和特異性。
2、包被原的制備是將泰樂菌素半抗原與甲狀腺蛋白采用混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)偶聯(lián)得到。
3、酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將泰樂菌素與甲狀腺蛋白偶聯(lián)物稀釋成0.06μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，并4℃環(huán)境過夜，傾去包被液，用洗滌液(濃縮洗滌液用去離子水稀釋20倍)洗滌2次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、泰樂菌素鼠單克隆抗體的制備1、免疫原的制備是將泰樂菌素半抗原與卵清蛋白采用混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)偶聯(lián)得到。通常免疫原的純度要求較高，免疫原的純度越高，制備的抗體特異性越強(qiáng)，至少要達(dá)到90％以上，上述合成的免疫原采用免疫電泳測(cè)定其純度為93.2％。
2、泰樂菌素鼠單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以泰樂菌素與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為100μg/只，首免時(shí)將免疫原與等量的福氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量福氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株—泰樂菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-4 CGMCC No.1614。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的泰樂菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-4CGMCC No.1614用凍存液制成5×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7～14天后腹腔注射泰樂菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-4CGMCC No.1614 5×106個(gè)/只，7～10天后采集腹水。經(jīng)辛酸—飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
四、酶標(biāo)抗體的制備抗抗體的制備采用無(wú)病原體山羊做為免疫動(dòng)物，將鼠源性抗體按照免疫劑量為150～300μg/只進(jìn)行免疫，首免時(shí)將免疫原與等量的福氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量福氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的羊抗鼠抗抗體。
酶標(biāo)記抗抗體的制備將抗抗體與堿性磷酸酯酶進(jìn)行偶聯(lián)，采用的方法優(yōu)選戊二醛法，用堿性磷酸酯酶以2∶1的比例與抗抗體偶聯(lián)時(shí)，約有60％～70％的酶與8％的抗抗體偶聯(lián)，酶標(biāo)記物的產(chǎn)量比使用辣根過氧化物酶高。
酶標(biāo)羊抗鼠抗抗體具體步驟如下1)稱取堿性磷酸酯酶25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1min，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以聚己二醇濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
3)取羊抗鼠抗抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
4)用1M pH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3h。
5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2h。
6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1h。
7)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液中。
8)將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
利用該試劑盒檢測(cè)樣品中殘留的泰樂菌素的方法如下一、樣品前處理肌肉、肝臟用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，稱取3g±0.1g樣本于50ml離心管中，加入10ml 乙腈—水溶液(84∶16，V∶V)，渦動(dòng)1min后于振蕩器上振蕩5min。3000g以上，15℃，離心10min。取上清液4ml，加入蒸餾水3ml，再加入2M NaOH 100μl，混合后立刻加入三氯甲烷5ml萃取，于振蕩器上振蕩10min，3000g以上，15℃，離心10min。去除上層相，取下層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈伞Ｓ?ml稀釋3倍的濃縮復(fù)溶液(濃縮復(fù)溶液用去離子水稀釋3倍)溶解干燥后的殘留物。即可進(jìn)行分析。
二、檢測(cè)方法向包被有泰樂菌素與甲狀腺蛋白偶聯(lián)物的96孔酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μl，加入泰樂菌素鼠單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液(濃縮洗滌液用去離子水稀釋19倍)，30秒后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次。每孔加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體工作液100μl用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。底物顯色液4-硝基酚磷酸鹽緩沖液100μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min。每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)為400nm)測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。
三、結(jié)果分析所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以泰樂菌素濃度的自然對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中泰樂菌素的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液中泰樂菌素的濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。整個(gè)檢測(cè)過程只需1.5小時(shí)就可以完成，最低檢測(cè)限為1.5μg/L。
實(shí)施例2、以抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法以泰樂菌素抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有泰樂菌素抗抗體的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記的泰樂菌素半抗原工作液用酶標(biāo)半抗原稀釋液將堿性磷酸酯酶標(biāo)記的泰樂菌素半抗原稀釋成蛋白濃度為0.1～1μg/L。所述酶標(biāo)半抗原稀釋液為含有50％甘油、1％的硫柳汞防腐劑的溶液。12ml/瓶，1瓶。
(3)泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液泰樂菌素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，0μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L，121.5μg/L，1～3ml/瓶。所用的泰樂菌素藥物稀釋液為含有5‰(質(zhì)量濃度)N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)，1％卵清蛋白(OVA)的磷酸鹽緩沖液。
(4)顯色劑為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。均為8ml/瓶。
(5)泰樂菌素兔多克隆抗體工作液用抗體稀釋液將泰樂菌素兔多克隆抗體稀釋成蛋白濃度為0.05μg/ml，12ml/瓶，1瓶。稀釋抗體的溶液為pH值8.2的0.1mol/L，含有3％的牛血清，20％甲醇的磷酸鹽緩沖液。
(6)濃縮洗滌液pH 7.4、0.01-0.05mol/L，含有1.0％吐溫80，1‰的疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液，40ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液2mol/L氫氧化鈉，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液0.02mol/L含有5‰N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)，1％卵清蛋白(OVA)的磷酸鹽緩沖液，20ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的4倍。
制備酶標(biāo)板所需試劑(1)包被緩沖液pH值為8.0，0.1mol/L的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液。
(2)封閉液含有3～10％的馬血清、1％酪蛋白的磷酸鹽緩沖溶液。
其中，抗抗體包被原、泰樂菌素特異性抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的泰樂菌素半抗原的制備方法如下一、酶標(biāo)板的制備1、包被原的制備采用無(wú)病原體山羊做為免疫動(dòng)物，將兔源抗體按照免疫劑量為150～300μg/只進(jìn)行免疫，首免時(shí)將免疫原與等量的福氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量福氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的羊抗兔抗抗體。
2、包被有羊抗兔抗抗體的酶標(biāo)板制備方法用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成0.06μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，并4℃環(huán)境過夜，傾去包被液，用洗滌液(濃縮洗滌液用去離子水稀釋19倍)洗滌2次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、泰樂菌素兔多克隆抗體的制備方法免疫原的制備是將泰樂菌素半抗原與卵清蛋白采用混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)偶聯(lián)得到。
通常免疫原的純度要求較高，免疫原的純度越高，制備的抗體特異性越強(qiáng)，至少要達(dá)到90％以上，上述合成的免疫原采用免疫電泳測(cè)定其純度為93.2％。
泰樂菌素兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以泰樂菌素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的福氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量福氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。
三、酶標(biāo)半抗原的制備堿性磷酸酯酶標(biāo)記半抗原泰樂菌素半抗原的制備同實(shí)施例1中的泰樂菌素半抗原制備方法。再將泰樂菌素半抗原與堿性磷酸酯酶采用活性酯法進(jìn)行偶聯(lián)得到酶標(biāo)記泰樂菌素抗原。
利用該試劑盒檢測(cè)樣品中殘留的泰樂菌素的方法如下樣品前處理的具體步驟同實(shí)施例1中的樣品前處理步驟檢測(cè)方法向包被有抗抗體的96孔酶標(biāo)板微孔中加泰樂菌素兔多克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液(濃縮洗滌液用去離子水稀釋19倍)，30秒后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次。每孔加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μl，再加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記的泰樂菌素半抗原工作液100μl用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。底物顯色液(4-硝基酚磷酸鹽緩沖液)100μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15min。每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)為400nm)測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。
結(jié)果分析的方法同實(shí)施例1中的結(jié)果分析方法，該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖2所示。結(jié)果分析表明，制備的試劑盒整個(gè)檢測(cè)過程只需1.5小時(shí)就可以完成，最低檢測(cè)限為1.5μg/L。
實(shí)施例3、試劑盒精密度、準(zhǔn)確度和保存期試驗(yàn)1、試劑盒精密度試驗(yàn)(1)標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備的試劑盒分別取三批進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，每批試劑盒抽取10個(gè)試劑盒，再?gòu)拿總€(gè)試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定13.5μg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值(OD值)，計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)施例1中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在4.2％-10.2％之間。
表1實(shí)施例1的試劑盒標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)施例2中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在3.7％～8.6％之間。
表2.實(shí)施例2的試劑盒標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)

(2)樣本可重復(fù)性試驗(yàn)分別取雞的肌肉、雞的肝臟作為樣本，在每個(gè)樣本中，添加50μg/kg濃度的泰樂霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別取實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備的三個(gè)不同批次的試劑盒各三個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)施例1中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表3、表4所示，結(jié)果表明肌肉樣本變異系數(shù)均低于20％，肝臟樣本的變異系數(shù)均低于16％。
表3肌肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


表4肝臟樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)施例2中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表5、表6所示，結(jié)果表明肌肉樣本變異系數(shù)均低于20％，肝臟樣本的變異系數(shù)均低于20％。
表5肌肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表6肝臟樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

2、試劑盒的準(zhǔn)確度測(cè)定雞的肌肉樣本和肝臟樣本分別按20μg/kg濃度、按50μg/kg濃度添加泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品，分別利用實(shí)施例1或?qū)嵤├?的試劑盒按照實(shí)施例1或?qū)嵤├?的方法檢測(cè)泰樂菌素，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度。實(shí)施例1的試劑盒測(cè)定結(jié)果如表7所示，結(jié)果表明肌肉添加的準(zhǔn)確度在61.5％～91.5％之間，肝臟添加準(zhǔn)確度在72.6％～95.5％之間。
表7.實(shí)施例1的試劑盒準(zhǔn)確度

實(shí)施例2的試劑盒測(cè)定結(jié)果如表8所示，結(jié)果表明肌肉添加的準(zhǔn)確度在65.2％～95.6％之間，肝臟添加準(zhǔn)確度在64.3％～95.7％之間。
表8.實(shí)施例2的試劑盒準(zhǔn)確度

3、試劑盒保存期試驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒分別保存在2-8℃，6個(gè)月后，測(cè)定試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、泰樂菌素添加實(shí)際測(cè)定值，結(jié)果表明實(shí)施例1的試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度，實(shí)施例2的試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度，均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將上述試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)泰樂菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括泰樂菌素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)泰樂菌素半抗原；當(dāng)所述包被原為泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)泰樂菌素半抗原；所述泰樂菌素半抗原是將泰樂菌素和對(duì)氨基苯甲酸通過縮合反應(yīng)得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液、包被緩沖液和封閉液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述泰樂菌素特異性抗體為泰樂菌素單克隆抗體或泰樂菌素多克隆抗體；它們均是用泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述泰樂菌素半抗原是將泰樂菌素和對(duì)氨基苯甲酸通過縮合反應(yīng)得到的；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體；所述泰樂菌素單克隆抗體為泰樂菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-4CGMCC No.1614分泌的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為pH7.4、0.01-0.05mol/L的含有0.8％～1.2％吐溫80，0.1％的疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于當(dāng)酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶時(shí)，所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；當(dāng)酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶是堿性磷酸酯酶時(shí)，所述顯色劑為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮復(fù)溶液為0.02mol/L含有0.5％N，N′-二甲基甲酰胺，1％卵清蛋白的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述包被緩沖液為pH值為8.0，0.1mol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；所述封閉液是含有3～10％的馬血清、1％酪蛋白的溶液；所述終止液為1～2mol/L的硫酸、鹽酸或氫氧化鈉緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
10.一種檢測(cè)泰樂菌素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當(dāng)樣品為動(dòng)物組織時(shí)，稱取3g動(dòng)物組織勻漿物樣本，加入10ml體積比為84∶16乙腈和水溶液渦動(dòng)1min后于振蕩器上振蕩5min，混勻，3000g以上，15℃，離心后取上清液4ml，加入蒸餾水3ml，再加入2mol/L NaOH 100μl，混合后立刻加入三氯甲烷5ml萃取，于振蕩器上振蕩10min，3000g以上，15℃離心10-15分鐘，去除上層相，取下層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?，?ml稀釋3倍的權(quán)利要求8所述濃縮復(fù)溶液溶解干燥后的殘留物；2)利用權(quán)利要求1-9中任一所述的檢測(cè)泰樂菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)泰樂菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。該檢測(cè)泰樂菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括泰樂菌素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)泰樂菌素半抗原；當(dāng)所述包被原為泰樂菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)泰樂菌素半抗原；本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本篩查的檢測(cè)動(dòng)物組織(肌肉、肝臟)等樣品中泰樂菌素藥物殘留量。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1811442SQ20061000728
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月17日
發(fā)明者沈建忠, 何方洋, 萬(wàn)宇平, 史為民, 馮才偉, 張素霞, 吳小平, 汪善良 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)