專利名稱：鐵氰化鉀－魯米諾化學(xué)發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)的是一種檢測(cè)方法，具體地說是一種甜葉菊糖苷的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
目前糖尿病患者逐漸增加，另外正常人過量攝取可吸收性糖也不利于身體健康，為此具有與蔗糖口感相近，同時(shí)為非吸收性糖的甜味劑開發(fā)利用是今后的發(fā)展方向。
在世界上許可添加的幾大類甜味劑中，一半來自化工合成，另一半來自于天然植物。隨著人們生活水平的不斷提高，越來越傾向于使用天然植物無能量甜味劑。
在天然植物無能量甜味劑中甜度比較高的有甜葉菊植物，其糖作為甜味劑應(yīng)用也是近十幾年的事。甜葉菊植物中有7種甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(Stevioside)和450倍的RA(Rebaudioside A，或稱為甜菊A3Stevioside A3)。由于其甜度高、無能量等特性而被廣泛地應(yīng)用于食品、保健品、藥品、化妝品、抗氧化食用商品、飼料添加劑等行業(yè)。
隨著甜菊糖應(yīng)用范圍不斷地?cái)U(kuò)大，快速檢測(cè)手段也越來越受重視。目前分析檢測(cè)方法有(1)分光光度計(jì)比色(黃海水，林靜1990；付寶忠，史立華1995；項(xiàng)秀珠，郭秀珠1996)、(2)薄層色譜(黃雨三2003)、(3)高壓液相色譜紫外檢測(cè)(黃曉蘭，倪爾葭1990；坂牧成恵等2004)、(4)毛細(xì)管電泳紫外檢測(cè)(邵寒娟，胡涌剛2001)等方法。薄層色譜法的化學(xué)試劑比較多，適合于小樣品的純化。高壓液相色譜法和毛細(xì)管電泳法儀器比較貴，同時(shí)要有該專業(yè)技術(shù)人員，一般甜葉菊糖苷加工廠不易實(shí)現(xiàn)。此外高壓液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等儀器不方便攜帶，在農(nóng)業(yè)甜葉菊的育種和栽培生產(chǎn)中的隨時(shí)監(jiān)控等實(shí)際應(yīng)用比較困難。這4種方法都適合于大學(xué)及研究所對(duì)甜葉菊糖苷的研究。
化學(xué)發(fā)光分析法由于其靈敏度高，線性范圍寬，儀器設(shè)備簡單，越來越受人們青睞。到目前為止(2006年4月28日黑龍江省科技情報(bào)局信息中心查新)，未見化學(xué)發(fā)光測(cè)定甜葉菊糖苷的報(bào)道。我們發(fā)表了“流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定甜葉菊糖苷”為題的文章，2005年刊載于“化學(xué)工程師”0423～25。在此基礎(chǔ)之上，我們對(duì)甜葉菊糖苷的定量測(cè)定又增加了Luminol進(jìn)行深入研究，結(jié)果表明在NaOH堿性介質(zhì)中，甜葉菊糖苷可以增敏Luminol-Fe(CN)63-體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光這一現(xiàn)象，為此提出一種測(cè)定甜葉菊糖苷的化學(xué)發(fā)光體系，即鐵氰化鉀-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系，并結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)，建立起了一種簡單、快速測(cè)定甜葉菊糖苷的新方法。該方法比發(fā)表過的文章內(nèi)容更加靈敏，而且有很好的選擇性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單，檢測(cè)成本低，適合于做常規(guī)性測(cè)定、易于被生產(chǎn)廠家所應(yīng)用的鐵氰化鉀-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的用NaOH溶液作為溶劑，配制不同濃度的Fe(CN)3-6；3-氨基苯二甲酰環(huán)肼(Luminol)用pH值為8.0-12.0的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制成溶液；稱取甜葉菊糖苷溶于無水乙醇，用水定容，配制成甜葉菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(10mg/mL)儲(chǔ)存于棕色容量瓶中；用分光光度計(jì)在190～1100nm下對(duì)甜葉菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描；調(diào)控MPI-B型測(cè)定儀器的載流在主動(dòng)泵分別將載流Luminol和甜葉菊糖苷溶液以45r/min的流速通過相應(yīng)的管道進(jìn)行三通混合，輸入分析系統(tǒng)；待基線平穩(wěn)后，副動(dòng)泵將Fe(CN)63-溶液以35r/min的流速通過十六通注射閥注入于載流中，與其混合；K3Fe(CN)6-Luminol為空白發(fā)光體系(I0)，樣品增強(qiáng)信號(hào)(IS)，取峰值(ΔI＝IS-I0)進(jìn)行定量，發(fā)光強(qiáng)度以計(jì)數(shù)表示。
本發(fā)明還可以包括這樣一些特征1、所述的Fe(CN)63-的濃度為1mol/L～1×10-6mol/L；2、所述的NaOH溶液的濃度為1mol/L～0.01mol/L；3、所述的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液的pH值為8.0～10.0；4、甜葉菊糖苷在0.05～10mg/mL的濃度范圍內(nèi)與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，其回歸方程為ΔI＝360.8×(mg/mL)+286.3，r2＝0.9941。
本發(fā)明采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法，操作簡單，檢測(cè)成本低，適合于做常規(guī)性測(cè)定易于被生產(chǎn)廠家所應(yīng)用。本發(fā)明所使用的儀器是MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光測(cè)試分析系統(tǒng)。它是具有獨(dú)特電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)功能的“毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀”，由中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)所與西安瑞邁電子科技有限公司合作研制成功，并通過鑒定。有關(guān)專家認(rèn)為，這種具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的儀器，創(chuàng)新性顯著，設(shè)計(jì)制作新穎，達(dá)到國際領(lǐng)先水平。該電化學(xué)分析儀器可用于藥物、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)及核酸等的檢測(cè)分析，并可適用于蛋白質(zhì)與藥物、核酸相互作用的研究，在生化、醫(yī)藥、臨床，免疫等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。它與相關(guān)領(lǐng)域通常應(yīng)用的進(jìn)口“毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光分析儀”相比，大大降低了成本。因此由該儀器進(jìn)行分析、測(cè)定建立起來的技術(shù)平臺(tái)也將具有我國獨(dú)立自主的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。該方法具有國際先進(jìn)水平。
本發(fā)明將物理學(xué)的流動(dòng)注射和化學(xué)的化學(xué)發(fā)光相結(jié)合，利用化學(xué)物質(zhì)在氧化還原反應(yīng)過程中有熒光或磷光，對(duì)該部分光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，再進(jìn)一步信號(hào)放大，依據(jù)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到定量分析的目的。
本發(fā)明的方法應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，可以應(yīng)用于1)工業(yè)甜葉菊糖苷的提取、純化等工業(yè)化生產(chǎn)的隨時(shí)監(jiān)控；2)農(nóng)業(yè)在甜葉菊栽培和育種的種植中，甜葉菊糖苷含量質(zhì)量監(jiān)控；3)原料收購收購甜葉菊葉片(或莖稈)時(shí)，其中的甜葉菊糖苷含量測(cè)定；4)相關(guān)終端產(chǎn)品在食品、保健品、藥品、化妝品、添加甜葉菊糖苷的抗氧化商品以及飼料添加劑中，甜葉菊糖苷被濃縮之后用該方法測(cè)定等。
五

圖1是兩種主要的甜葉菊糖苷分子結(jié)構(gòu)，R為H時(shí)是st；R為葡萄糖時(shí)是RA。
具體實(shí)施例方式1儀器設(shè)備1.1MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)(西安瑞邁電子有限公司)。整個(gè)分析過程中采樣、注樣、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集及處理，均由Windows XP系統(tǒng)下MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)軟件完成。
1.2UV-1600紫外可見分光光度計(jì)北京瑞利分析儀器公司。
2材料與試劑2.1材料新鮮甜葉菊葉片，本實(shí)驗(yàn)室栽培；甜葉菊糖苷，哈爾濱市綠葉科技有限公司。
2.2試劑(1)用0.1mol/L NaOH作為溶劑，配制不同濃度的Fe(CN)3-6。3-氨基苯二甲酰環(huán)肼(Luminol)為Sigma公司產(chǎn)品(用pH值為9.2的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制)。(2)甜葉菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(10mg/mL)稱取甜葉菊糖苷溶于無水乙醇，用水定容，儲(chǔ)存于棕色容量瓶中備用。其余試劑均為分析純，水為二次去離子水。
3操作方法3.1定性分析用分光光度計(jì)在190～1100nm下對(duì)甜葉菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描。
3.2MPI-B型的載流調(diào)控在主動(dòng)泵分別將載流Luminol和甜葉菊糖苷溶液以45r/min的流速通過相應(yīng)的管道進(jìn)行三通混合，輸入分析系統(tǒng)。待基線平穩(wěn)后，副動(dòng)泵將Fe(CN)63-溶液以35r/min的流速通過十六通注射閥(注樣時(shí)間10秒)注入于載流中，與其混合。K3Fe(CN)6-Luminol為空白發(fā)光體系(I0)，樣品增強(qiáng)信號(hào)(IS)，取峰值(ΔI＝IS-I0)進(jìn)行定量，發(fā)光強(qiáng)度以計(jì)數(shù)表示。
4結(jié)果與分析4.1氧化劑的選擇在酸性介質(zhì)(1mol/L H2SO4)中KMnO4和堿性介質(zhì)(0.4mol/L NaOH)中Fe(CN)63-、H2O2分別做氧化劑進(jìn)行直接氧化甜葉菊糖苷的化學(xué)發(fā)光研究。結(jié)果表明，僅有KMnO4和Fe(CN)3-6做氧化劑時(shí)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，而Fe(CN)63-在該體系中表現(xiàn)出最好的發(fā)光特性。本文選擇堿性的Fe(CN)63-作為氧化劑來測(cè)定甜葉菊糖苷。
4.2Fe(CN)63-濃度影響Fe(CN)63-的用量對(duì)該體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有很大的影響。本文在固定了甜葉菊糖苷和堿的濃度下，詳細(xì)考察了不同濃度的Fe(CN)63-(0～1×10-3mol/L)對(duì)該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)Fe(CN)63-的濃度為5×10-4mol/L時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度最大。
4.3NaOH濃度的影響Fe(CN)63-只有在堿性介質(zhì)中，才能氧化甜葉菊糖苷產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。試驗(yàn)表明，NaOH的最佳濃度為0.1mol/L。
4.4Luminol濃度及pH值的影響固定其它試驗(yàn)條件，隨Luminol濃度的升高，ΔI增加越大，反應(yīng)越靈敏。從靈敏度及節(jié)省溶劑角度考慮，選用0.03mmol/l的Luminol溶液。
Luminol的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)需要在堿性介質(zhì)中進(jìn)行，介質(zhì)的pH值會(huì)影響化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。本文選用Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液為Luminol的介質(zhì)，考察了緩沖溶液pH值在8.0-12.0范圍內(nèi)對(duì)ΔI的影響，結(jié)果表明，當(dāng)緩沖液pH值為9.2時(shí)，ΔI達(dá)到最大，由于實(shí)驗(yàn)中K3Fe(CN)6用0.1mol/LNaOH溶液配制，實(shí)際經(jīng)管道混合后檢測(cè)流出廢液的pH值為9.8。
4.5表面活性劑的影響表面活性劑對(duì)許多化學(xué)發(fā)光體系有影響(Alwarthan 1996)，能顯著地改變化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。研究了1種非離子型表面活性劑(Tween80)，1種陽離子型表面活性劑(碘化四甲胺)，1種陰離子表面活性劑(十二烷基磺酸鈉SDS)，對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系的影響。結(jié)果表明，這些表面活性劑對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系均不產(chǎn)生顯著的影響。
4.6流速的影響在流動(dòng)注射分析中，流速是影響分析特性的一個(gè)很重要的因素。在該化學(xué)發(fā)光流動(dòng)體系中，流速太慢會(huì)導(dǎo)致最大發(fā)光在流通池之前；流速太快會(huì)導(dǎo)致最大發(fā)光在流通池之后。主動(dòng)泵和副動(dòng)泵的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)為0～99，對(duì)它們的轉(zhuǎn)數(shù)進(jìn)行了組合設(shè)定，發(fā)現(xiàn)該體系的最佳轉(zhuǎn)數(shù)分別為45r/min和35r/min。此時(shí)，最大發(fā)光在流通池中，恰好能被光電倍增管完全檢測(cè)。
4.7該化學(xué)發(fā)光體系的特性分析在上述選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，甜葉菊糖苷在0.05～10mg/mL的濃度范圍內(nèi)與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，其回歸方程為ΔI＝360.8×(mg/mL)+286.3，r2＝0.9941，檢出限為0.05mg/mL。對(duì)5mg/mL甜葉菊糖苷溶液連續(xù)測(cè)定，每次得5個(gè)峰值，重復(fù)7次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.7％，回收率為98％～108％。
4.8標(biāo)準(zhǔn)溶液甜葉菊糖苷的掃描甜葉菊糖苷在全波長(190～1100nm)掃描的研究結(jié)果表明，223nm、231nm的紫外有最大吸收峰。哈爾濱市綠葉科技有限公司生產(chǎn)的甜葉菊糖苷和本實(shí)驗(yàn)室栽培的甜葉菊葉片提取物都有相同的紫外最大吸收峰。坂牧成恵等(2004)利用高壓液相色譜紫外檢測(cè)法，在210nm波長下檢測(cè)出了St和RA[食品衛(wèi)生志(日文)，45(2)81～86]。
4.9干擾實(shí)驗(yàn)甜葉菊糖苷來源于葉片，在提取過程中共存其他組分，它們可能對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定甜葉菊糖苷有一定的影響。為此，研究了1000倍的Na+、Cl-、K+、Br-、CO32-、SO42-和NO3-；100倍的淀粉、糊精以及無水乙醇等分別對(duì)1mg/mL的甜葉菊糖苷進(jìn)行干擾測(cè)定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，它們不干擾測(cè)定，因此可以用無水乙醇或水溶解甜葉菊糖苷。100倍蔗糖、葡萄糖、麥芽糖對(duì)測(cè)定無干擾。
4.10該化學(xué)發(fā)光方法測(cè)定葉片中的甜葉菊糖苷含量該方法已經(jīng)成功地用于甜葉菊葉片中糖苷含量的測(cè)定。取本實(shí)驗(yàn)室栽培的甜葉菊葉片，105℃下干燥30min后80℃下干燥5h，稱重研細(xì)，用無水乙醇提取、振蕩過夜。次日10000rpm離心10min，取出上清用無水乙醇定溶到100mL。用該化學(xué)發(fā)光方法在線性范圍內(nèi)測(cè)定，重復(fù)三次。測(cè)定結(jié)果表明，干葉片中甜葉菊糖苷含量為9.28％。
權(quán)利要求
1.一種鐵氰化鉀-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法，其特征是(1)用NaOH溶液作為溶劑，配制不同濃度的Fe(CN)3-6；(2)3-氨基苯二甲酰環(huán)肼(Luminol)用pH值為8.0-12.0的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制成溶液；(3)稱取標(biāo)準(zhǔn)甜葉菊糖苷溶于無水乙醇，用水定容，配制成甜葉菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(10mg/mL)儲(chǔ)存于棕色容量瓶中；(4)用分光光度計(jì)在190～1100nm下對(duì)甜葉菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描；(5)MPI-B型測(cè)定儀器的載流調(diào)控在主動(dòng)泵分別將載流Luminol和甜葉菊糖苷溶液以45r/min的流速通過相應(yīng)的管道進(jìn)行三通混合，輸入分析系統(tǒng)；待基線平穩(wěn)后，副動(dòng)泵將Fe(CN)63-溶液以35r/min的流速通過十六通注射閥注入于載流中，與其混合；K3Fe(CN)6-Luminol為空白發(fā)光體系(I0)，樣品增強(qiáng)信號(hào)(IS)，取峰值(ΔI＝IS-I0)進(jìn)行定量，發(fā)光強(qiáng)度以計(jì)數(shù)表示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵氰化鉀-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法，其特征是所述的Fe(CN)63-的濃度為1mol/L～1×10-6mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鐵氰化鉀-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法，其特征是所述的NaOH溶液的濃度為1mol/L～0.01mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鐵氰化鉀-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法，其特征是所述的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液的pH值為8.0～10.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鐵氰化鉀-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法，其特征是甜葉菊糖苷在0.05～10mg/mL的濃度范圍內(nèi)與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，其回歸方程為ΔI＝360.8x(mg/mL)+286.3，r2＝0.9941。
全文摘要
本發(fā)明提供了鐵氰化鉀－魯米諾化學(xué)發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法。配制不同濃度的Fe(CN)
文檔編號(hào)G01N21/76GK1877309SQ20061001027
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日
發(fā)明者郝再彬, 楊丹, 蒼晶, 王貴民, 一井真比古 申請(qǐng)人:郝再彬