專利名稱：環(huán)保無氰型溶血劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種全自動血細胞分析儀用的溶血劑。
背景技術：
血液細胞分析技術從上世紀七、八十年代至本世紀初已得到迅速應用和普及。血細胞分析儀按白細胞的異質性分為二分群、三分群和五分群分析儀。白細胞的自動分類和血紅蛋白儀器測定靠溶血劑按一定組份及其配伍來實現(xiàn)。溶血劑的分析原理是按“國際血液標準化委員會”(ICSH)推行的氰化高鐵血紅蛋白法而設計的標準方法。由于標準的氰化高鐵血紅蛋白法溶血劑中含有氰化物，對人員(尤其是操作人員)、儀器及環(huán)境均夠成污染，排出的廢液需特殊處理。在醫(yī)院日常工作中，因血液分析工作量大，大多醫(yī)療機構難以達到劇毒藥品的管理要求。發(fā)明一種理化及生物學指標與氰化高鐵血紅蛋白法相同的無氰、環(huán)保型溶血劑，并應用于臨床血液細胞分析工作變得十分必要。CN1069576A公開了一種溶血劑的配置方法，它是先配緩沖液，在一量筒中，稱磷酸二氫鉀4.6克，加蒸餾水500毫升，pH值5.5，取30毫升備用。在另一量筒中，稱磷酸氫二鈉9.5克，加蒸餾水1000毫升，溶解后，取出30毫升不用，pH值控制在8.5，將兩個量筒溶液混合，pH值8.5，稱十六烷基三甲基溴化銨7.5克、乙二胺四乙酸二鈉20克、草酸銨20克將上述緩沖液加至1000毫升，加熱溶解后再加冰乙酸25毫升，用過濾紙過濾，濾液pH值5.5至5.8之間。此溶血劑的配制方法較復雜。CN1308235A公開了一種血液分析用無毒溶血劑，是在1升重蒸餾水溶劑中，分別加入有機季胺鹽4-120g、羥胺鹽1-40g及弱堿性緩沖劑10-100g，組成pH值為7-10的混合液，此技術未在實際中得到應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術之不足，提供一種環(huán)保無氰型溶血劑，它適合多種三分群血液分析儀使用，其性能等同和優(yōu)于氰化高鐵血紅蛋白法溶血劑，相對于無氰溶血劑其性能得以改善，而且對儀器無損傷，對人體、環(huán)境無任何毒害，排出廢液不需無害化處理，能在臨床廣泛應用。
為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下一種環(huán)保無氰型溶血劑，其技術方案是所述的溶血劑是由緩沖液和貯存液混合制成溶血劑的應用液，其中，緩沖液組分為磷酸氫二鈉、檸檬酸、水，各組分的配比為磷酸氫二鈉13.00～17.00g/L，檸檬酸2.00～5.00g/L，水為余量；貯存液組分為十二烷基三甲基氯化銨、磷酸氫二鈉、檸檬酸、水，各組分的配比為十二烷基三甲基氯化銨90.00～110.00g/L，磷酸氫二鈉13.00～17.00g/L，檸檬酸2.00～5.00g/L，水為余量；溶血劑的應用液中貯存液的體積占18～60％。
上述技術方案中，所述的緩沖液各組分的配比最好為磷酸氫二鈉15.63g/L，檸檬酸3.78g/L，水為余量。貯存液各組分的配比最好為十二烷基三甲基氯化銨100.00g/L，磷酸氫二鈉15.63g/L，檸檬酸3.78g/L，水為余量。
對于PocH-100i型血液分析儀，溶血劑的應用液中貯存液的體積占18％。
對于CA-800型血液分析儀，溶血劑的應用液中貯存液的體積占30％。
當然，對于其它某一型號血液分析儀，溶血劑的應用液中貯存液的體積占60％。
本發(fā)明的溶血劑在制備時，在一量筒中，將磷酸氫二鈉、檸檬酸按上述配比混合于一起，加一定量(一定體積)的水制成緩沖液，備用。再用該緩沖液間接制成貯存液，方法是在另一量筒中加入上述配比的十二烷基三甲基氯化銨，加上述一定量(一定體積)的緩沖液即制得貯存液，備用。當然，也可以直接制得貯存液，方法是在另一量筒中將磷酸氫二鈉、檸檬酸、十二烷基三甲基氯化銨按上述配比混合于一起，加一定量(一定體積)的水制成貯存液，備用。由于十二烷基三甲基氯化銨的含量為100.00g/L，因此貯存液中十二烷基三甲基氯化銨的濃度大約為10％。進行血細胞分析時，取一定量(一定體積)的貯存液，在其內加入一定量(一定體積)的緩沖液，混合均勻，用直徑為0.45Lμm的微孔濾膜(醋酸纖維膜)過濾，可過濾2～3次，制成溶血劑的應用液，溶血劑的應用液中貯存液的體積占18～60％。溶血劑的應用液可按500～1000ml/瓶作為應用溶血劑。對于不同的血液分析儀，緩沖液和貯存液混合時的配比不同，如取150ml貯存液加緩沖液至500ml所制成的溶血劑的應用液，為CA-800型血液分析儀用的溶血劑。再如，取90ml貯存液加緩沖液至500ml所制成的溶血劑的應用液，為PocH-100i型血液分析儀用的溶血劑。
本發(fā)明的溶血劑可用于BC-2000、BC-2200、BC-2800、BC-3000型；丹能EXCELL-18、丹能EXCELL-22、丹能EXCELL-1020型；ABX micro-60型；MEK-6318K、MEK-6108K型；CA-800型；Sysmex KX-21型；PocH-100i型；CELL-DYN型；AC-900、AC920；AC-970型等多種三分群血液分析儀。還可作為溶血劑做五分群血液分析儀的基礎試劑。
本發(fā)明的溶血劑，經(jīng)北京、天津、華北地區(qū)多家三甲醫(yī)院對比，其線性范圍、重復性、穩(wěn)定性達到原配套試劑指標，有些項目優(yōu)于原配套試劑指標。結果如下1.材料與方法1.1儀器 Sysmex KX-21型三分群血液分析儀；PocH-100i型三分群血液分析儀；CA-800型三分群血液分析儀；BC-2000型三分群血液分析儀；ABX micro-60型三分群血液分析儀；MEK-6318K三分群血液分析儀；Sysmex SE-9000型五分群血液分析儀。
1.2溶血劑1.2.1含氰溶血劑(溶血劑I)，山東蘭橋公司生產(chǎn)。
1.2.2無氰溶血劑(溶血劑II)，上海希森美康公司生產(chǎn)。
1.2.3本發(fā)明溶血劑(溶血劑III)。
1.3方法1.3.1血紅蛋白最大吸收峰取稀釋液10ml、全血20μl三份，加到溶血劑I、II、III各1ml中，室溫60秒溶血后，用法國光柵分光光度計連續(xù)比色，讀取吸光度值，以稀釋液調零?？梢姡N溶血劑均在波長420nm和540nm處吸收峰最大?；旌弦褐檬覝?0～180min后，其測定值無明顯變化。
1.3.2用溶血劑I和溶血劑III在CA-800型血液分析儀分別測定同一份健康人全血20次。統(tǒng)計兩種溶血劑的HGB、WBC及分類記數(shù)結果。
1.3.3用溶血劑II和溶血劑III在PocH-100i型血液分析儀分別測定同一份健康人全20次。統(tǒng)計兩種溶血劑的HGB、WBC及分類記數(shù)結果。
1.3.4用溶血劑II和溶血劑III在Sysmex KX-21型血液分析儀分別測定同一份健康人全血20次。統(tǒng)計兩種溶血劑的HGB、WBC及分類記數(shù)結果。
1.3.5用溶血劑II和溶血劑III在Sysmex SE-9000型血液分析儀分別測定同一份健康人全血20次。統(tǒng)計兩種溶血劑的HGB、WBC及分類記數(shù)結果。
1.3.6取病理性WBC高值、低值標本(白血病患者)各1份；病理性血紅蛋白高值、低值標本(血液病患者)各1份。分別用上述兩兩溶血劑組合、在7種機型上重復測定20次。統(tǒng)計3種溶血劑的HGB、WBC結果。
1.3.7用1.3.2～6的溶血劑組合分別在BC-2000、ABX micro-60、MEK-6318型三分群血液分析儀進行測定。統(tǒng)計3種溶血劑的HGB、WBC及分類記數(shù)結果。
2.結果2.1同一份健康人全血用溶血劑I、II、III在7種機型三分群血液分析儀上所測定HGB(血紅蛋白)、WBC(白血球)、LYM(淋巴細胞)％、MID(單核細胞)％、GRAN(粒細胞)％結果的變異系數(shù)見表1。
表1 三種溶血劑測定5項血細胞參數(shù)的變異系數(shù)(CV％)

從表1可見，三種溶血劑在7種機型同一份正常人標本重復測定20次，血紅蛋白的變異系數(shù)＜3％；白細胞計數(shù)的變異系數(shù)＜5.3％。溶血劑III的多項指標優(yōu)于前兩者。
2.2病理性高、低值白細胞和血紅蛋白在7種機型測定結果的變異系數(shù)見表2。
三種溶血劑測定病理性高、低值血紅蛋白表2 及白細胞結果的變異系數(shù)(CV％)

從表2可見，病理性高、低值白細胞和血紅蛋白測定結果的變異系數(shù)大于正常人測定結果的變異系數(shù)，血紅蛋白＜6％；白細胞計數(shù)的變異系數(shù)＜24％。這與白細胞和血紅蛋白的異質性有關。
2.3溶血劑III測定血紅蛋白和白細胞計數(shù)的線性范圍HGB11.2～282.2g/L(CA-800型；Sysmex KX-21型血液分析儀)。
WBC0.61～78.82×109/L(CA-800型；Sysmex KX-21型血液分析儀)。
3.討論 溶血劑的主要成分是第四級季氨鹽類化合物，就針對血液紅細胞和白細胞而言，要求該類化合物溶血完全、迅速釋放出血紅蛋白，并能迅速與之結合，形成穩(wěn)定化合物。對白細胞能迅速脫去細胞質，而保持白細胞形態(tài)的完整性，并按細胞核的異質性進行分類。要求溶血劑能在最適pH值、離子強度、滲透壓等環(huán)境下，儀器產(chǎn)生最佳脈沖信號。由于阻抗法三分群血液分析儀各生產(chǎn)廠家給定參數(shù)不盡相同，有的甚至為達到知識產(chǎn)權的保護作用，嚴格設定自己參數(shù)以達到保護目的。因此，研究一類首先無毒、環(huán)保無氰型的溶血劑；又能同時適用于多種常用三分群血液分析儀的溶血劑非常必要。本發(fā)明溶血劑經(jīng)5年多臨床探索，各項指標均達上述要求，且多數(shù)指標優(yōu)于有氰溶血劑和個別原廠生產(chǎn)溶血劑。
本發(fā)明在原有滴加型無氰溶血素(CN1116606C)的基礎上，廣泛比較分析了不同種類分析儀的特點，篩選出眾多試劑，進行多種配伍，研究出了一類適合多種三分群血液分析儀的環(huán)保型溶血劑；并可做為五分群血液分析儀基礎試劑。其性能等同和優(yōu)于氰化高鐵血紅蛋白法溶血劑，其性能也優(yōu)于其它無氰溶血劑。本發(fā)明的溶血劑對儀器無損傷，對人體、環(huán)境無任何毒害，排出廢液不需無害化處理，適于臨床廣泛應用，且其制備方法簡單、易行。再者，上述十二烷基三甲基氯化銨是抑菌或殺菌能力很強的陽離子表面活性劑，故其貯存液或應用液放置時間越長使用效果越好(一般可放置三年到五年)。
具體實施例方式
實施例1本發(fā)明的溶血劑是由緩沖液和貯存液混合制成溶血劑的應用液。其中，緩沖液組分為磷酸氫二鈉、檸檬酸、水(去離子水或蒸餾水)，各組分的配比為磷酸氫二鈉156.30g(或者130.00g或者170.00g)，檸檬酸37.80g(或者20.00g或者50.00g)，水為11～15L(準備量)。在一量筒中，將磷酸氫二鈉、檸檬酸按上述配比混合于一起，加水至10L制成緩沖液，備用。再用該緩沖液間接制成貯存液，方法是在另一量筒中加入500.00g(或者450.00g或者550.00g)十二烷基三甲基氯化銨，加5L上述緩沖液即制得貯存液，備用。進行血細胞分析時，取一定量(一定體積)的貯存液，在其內加入一定量(一定體積)的緩沖液，混合均勻，用直徑為0.45μm的微孔濾膜(醋酸纖維膜)過濾，可過濾2～3次，制成溶血劑的應用液，溶血劑的應用液中貯存液的體積占18～60％。溶血劑的應用液可按500～1000ml/瓶作為應用溶血劑。對于不同的血液分析儀，緩沖液和貯存液混合時的配比不同，如取150ml貯存液加緩沖液至500ml所制成的溶血劑的應用液，為CA-800型血液分析儀用的溶血劑，使用時，將該溶血劑放入CA-800型血液分析儀的溶血劑盛裝位置，連接管路即可應用。再如，取90ml貯存液加緩沖液至500ml所制成的溶血劑的應用液，為PocH-100i型血液分析儀用的溶血劑。
實施例2本發(fā)明的溶血劑是由緩沖液和貯存液混合制成溶血劑的應用液。其中，緩沖液組分為磷酸氫二鈉、檸檬酸、水(去離子水或蒸餾水)，各組分的配比為磷酸氫二鈉156.30g(或者130.00g或者170.00g)，檸檬酸37.80g(或者20.00g或者50.00g)，水為11～15L(準備量)。在一量筒中，將磷酸氫二鈉、檸檬酸按上述配比混合于一起，加水至10L制成緩沖液，備用?？梢灾苯又频觅A存液，例如制得10L貯存液，方法是在另一量筒中，將磷酸氫二鈉156.30g(或者130.00g或者170.00g)、檸檬酸37.80g(或者20.00g或者50.00g)、十二烷基三甲基氯化銨1000.00g(或者900.00g或者1100.00g)混合于一起，加水(去離子水或蒸餾水)至10L制成貯存液，備用。進行血細胞分析時，取一定量(一定體積)的貯存液，在其內加入一定量(一定體積)的緩沖液，混合均勻，用直徑為0.45μm的微孔濾膜(醋酸纖維膜)過濾，可過濾2～3次，制成溶血劑的應用液，溶血劑的應用液中貯存液的體積占18～60％。溶血劑的應用液可按500ml/瓶作為應用溶血劑。對于不同的血液分析儀，緩沖液和貯存液混合時的配比不同，如取300ml貯存液加緩沖液至500ml制成溶血劑的應用液。再如，取250ml貯存液加緩沖液至500ml制成溶血劑的應用液。
權利要求
1.一種環(huán)保無氰型溶血劑，其特征在于所述的溶血劑是由緩沖液和貯存液混合制成溶血劑的應用液，其中，緩沖液組分為磷酸氫二鈉、檸檬酸、水，各組分的配比為磷酸氫二鈉13.00～17.00g/L，檸檬酸2.00～5.00g/L，水為余量；貯存液組分為十二烷基三甲基氯化銨、磷酸氫二鈉、檸檬酸、水，各組分的配比為十二烷基三甲基氯化銨90.00～110.00g/L，磷酸氫二鈉13.00～17.00g/L，檸檬酸2.00～5.00g/L，水為余量；溶血劑的應用液中貯存液的體積占18～60％。
2.根據(jù)權利要求1所述的溶血劑，其特征在于上述緩沖液各組分的配比為磷酸氫二鈉15.63g/L，檸檬酸3.78g/L，水為余量；貯存液各組分的配比為十二烷基三甲基氯化銨100.00g/L，磷酸氫二鈉15.63g/L，檸檬酸3.78g/L，水為余量。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的溶血劑，其特征在于溶血劑的應用液中貯存液的體積占18％。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的溶血劑，其特征在于溶血劑的應用液中貯存液的體積占30％。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的溶血劑，其特征在于溶血劑的應用液中貯存液的體積占60％。
全文摘要
一種環(huán)保無氰型溶血劑，是由緩沖液和貯存液混合制成溶血劑的應用液。其中，緩沖液各組分的配比為磷酸氫二鈉13.00～17.00g/L，檸檬酸2.00～5.00g/L，水為余量；貯存液各組分的配比為十二烷基三甲基氯化銨90.00～110.00g/L，磷酸氫二鈉13.00～17.00g/L，檸檬酸2.00～5.00g/L，水為余量；溶血劑的應用液中貯存液的體積占18～60％。本發(fā)明適合多種三分群血液分析儀使用，并可做為五分群血液分析儀基礎試劑，其性能等同和優(yōu)于氰化高鐵血紅蛋白法溶血劑，相對于無氰溶血劑其性能得以改善，而且對儀器無損傷，對人體、環(huán)境無任何毒害，排出廢液不需無害化處理，能在臨床廣泛應用。
文檔編號G01N33/52GK1866011SQ20061001272
公開日2006年11月22日 申請日期2006年5月18日 優(yōu)先權日2006年5月18日
發(fā)明者劉愛兵, 張繼深 申請人:劉愛兵, 張繼深