專利名稱：一種生物芯片及其制備方法以及應(yīng)用該芯片的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的生物芯片；還涉及制備這種生物芯片的方法；以及涉及應(yīng)用本發(fā)明生物芯片的試劑盒。
背景技術(shù)：
本發(fā)明術(shù)語“生物芯片”簡(jiǎn)稱為“芯片”，包括但不限于英語中的Biochip、Microarray、Bioarray，是指定性和/或定量分析中的一種檢測(cè)裝置，其反應(yīng)器中含探針分子，同樣品中的目標(biāo)分子發(fā)生特異反應(yīng)的結(jié)果，可以以可尋址的方式進(jìn)行識(shí)別。芯片的核心是其中的反應(yīng)器，反應(yīng)器的核心是其中的芯片片基和固定在芯片片基上的探針分子。芯片包括微流路芯片(相當(dāng)于英語中的Microchannel Biochip)和微陣列芯片(相當(dāng)于英語中的Biochip、Microarray、Bioarray)。本發(fā)明的芯片含有單反應(yīng)器或多反應(yīng)器。生物芯片由于其高通量和微型化特點(diǎn)，有著廣泛的應(yīng)用范圍，包括基因表達(dá)檢測(cè)、基因篩選、藥物篩選、疾病診斷治療、環(huán)境監(jiān)測(cè)和治理、司法鑒定等領(lǐng)域。靈敏度和特異性是生物芯片檢測(cè)的兩個(gè)主要質(zhì)量指標(biāo)，而載體、特別是活性載體是決定靈敏度和特異性的關(guān)鍵之一。
目前，已公開了一些包含納米結(jié)構(gòu)的生物芯片。例如，申請(qǐng)?zhí)枮閃O0183825、US20030207296、和CN96193700.9的專利申請(qǐng)。這些生物芯片中納米結(jié)構(gòu)的制備方法，要么是基于效率不高的非特異性吸附，要么是基于造價(jià)昂貴的亞微米須晶結(jié)構(gòu)。實(shí)際上，具體的納米載體與探針之間的結(jié)合方式，對(duì)活化納米結(jié)構(gòu)的基本性質(zhì)，有著特別重要的影響。因而，仍是包含納米結(jié)構(gòu)的生物芯片的重要研究內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的生物芯片，這種芯片中的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)具有更高的反應(yīng)效率，從而提高了現(xiàn)有芯片的檢測(cè)靈敏度、或/和降低探針分子耗量、或/和增加了對(duì)芯片的選擇性；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供制備這種生物芯片方法；本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供具有這種芯片結(jié)構(gòu)的生物芯片試劑盒。
本發(fā)明的目的是通過實(shí)施下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種生物芯片，至少包括片基和在片基上的一個(gè)以上的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)，該納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)含有活化納米結(jié)構(gòu)，并在活化納米結(jié)構(gòu)上固定有探針分子，其特征是a.在納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)中，所述活化納米結(jié)構(gòu)的分布密度大于1個(gè)活化納米結(jié)構(gòu)/μm2、優(yōu)選大于5個(gè)活化納米結(jié)構(gòu)/μm2；和b.所述活化納米結(jié)構(gòu)，含有納米結(jié)構(gòu)、共價(jià)鍵合在納米結(jié)構(gòu)上的偶聯(lián)基團(tuán)、共價(jià)鍵合在偶聯(lián)基團(tuán)上的活化基團(tuán)，且所述活化基團(tuán)選自a).-NH2；b).通式為-RNH2的基團(tuán)；和c).不含-NH2的有機(jī)基團(tuán)，其中(1).所述R為有機(jī)基團(tuán)；(2).在所述活化納米結(jié)構(gòu)中當(dāng)所述活化基團(tuán)選自-NH2或/和不含-NH2的有機(jī)基團(tuán)時(shí)，所述偶聯(lián)基團(tuán)在其表面上的平均分布密度大于1.85μmol/m2，或/和所述活化基團(tuán)在其表面上的平均分布密度大于1.85μmol/m2。
需要說明的是，本發(fā)明中所述活化基團(tuán)的平均分布密度的計(jì)算基于元素分析(Microanalysis)。元素分析也許不一定是最佳方法，但在其誤差范圍內(nèi)并不影響本發(fā)明的成立，既只有當(dāng)活化納米粒子表面固定的功能基團(tuán)、尤其是活化基團(tuán)數(shù)目達(dá)到一定值時(shí)，用其與探針分子一起制備的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)才具有特定的性質(zhì)，從而達(dá)到本發(fā)明的目的。專業(yè)人員應(yīng)當(dāng)知道，盡管利用其它分析方法可能得出不同的數(shù)值，但其原則仍在本發(fā)明的權(quán)利要求之內(nèi)。本發(fā)明的生物芯片有確定的技術(shù)特征(例如，活化納米粒子的組成)。本發(fā)明芯片的這些技術(shù)特征，是達(dá)到本發(fā)明目的所必須的。正如本發(fā)明實(shí)施例所述，同不具備這些技術(shù)特征的生物芯片相比，本發(fā)明的生物芯片可以有明顯較高的檢測(cè)靈敏度，或/和明顯較低的探針分子耗量，從而明顯增加可用芯片的選擇性。
本發(fā)明生物芯片，其特征是所述通式為-RNH2的基團(tuán)，包括氨基肼基團(tuán)。
本發(fā)明生物芯片，其特征是所述通式為-RNH2的基團(tuán)，包括氨基酸基團(tuán)。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是所述通式為-RNH2的基團(tuán)在活化納米結(jié)構(gòu)表面上的平均分布密度大于0.5μmol/m2。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是所述通式為-RNH2的基團(tuán)在活化納米結(jié)構(gòu)表面上的平均分布密度大于1.0μmol/m2。顯然，與簡(jiǎn)單氨基(-NH2)比較，通式為-RNH2的基團(tuán)中的-NH2不直接與所述偶聯(lián)基團(tuán)共價(jià)鍵合，除可能有不同的反應(yīng)方式外，至少具有更為有利的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)條件。在本發(fā)明實(shí)施例中，一項(xiàng)方案中所述氨基酸基團(tuán)為精氨酸基團(tuán)，另一項(xiàng)方案中為天冬酰氨基團(tuán)，另一項(xiàng)方案中為甘氨酸基團(tuán)。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是所述不含-NH2的有機(jī)基團(tuán)包括醛基。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是所述不含-NH2的有機(jī)基團(tuán)包括環(huán)氧基。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是所述不含-NH2的有機(jī)基團(tuán)包括羧基、或-SH、等等。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是a).所述片基包括納米結(jié)構(gòu)片基，其中所述納米結(jié)構(gòu)片基含有納米結(jié)構(gòu)區(qū)，并在該結(jié)構(gòu)區(qū)有納米凸體，并且納米凸體的分布密度大于1個(gè)納米凸體/μm2，優(yōu)選納米凸體的分布密度大于5個(gè)納米凸體/μm2；和b).所述活化納米結(jié)構(gòu)包括活化納米凸體，其中所述活化納米凸體含有所述納米凸體、共價(jià)鍵合在納米凸體上的所述偶聯(lián)基團(tuán)、共價(jià)鍵合在偶聯(lián)基團(tuán)上的所述活化基團(tuán)。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是a).所述片基包括非納米結(jié)構(gòu)片基；和b).所述活化納米結(jié)構(gòu)包括活化納米粒子，其中所述活化納米粒子含有納米粒子、共價(jià)鍵合在納米粒子上的所述偶聯(lián)基團(tuán)、共價(jià)鍵合在偶聯(lián)基團(tuán)上的所述活化基團(tuán)。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是a).所述片基包括納米結(jié)構(gòu)片基，其中所述納米結(jié)構(gòu)片基含有納米結(jié)構(gòu)區(qū)，并在該結(jié)構(gòu)區(qū)有納米凸體，并且納米凸體的分布密度大于1個(gè)納米凸體/μm2、優(yōu)選納米凸體的分布密度大于5個(gè)納米凸體/μm2；和b).所述活化納米結(jié)構(gòu)包括活化納米粒子，其中所述活化納米粒子含有納米粒子、共價(jià)鍵合在納米粒子上的所述偶聯(lián)基團(tuán)、共價(jià)鍵合在偶聯(lián)基團(tuán)上的所述活化基團(tuán)。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是所述生物芯片包括流動(dòng)式生物芯片。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是所述生物芯片還含有非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是其中所述納米粒子包括無機(jī)納米粒子。在本發(fā)明芯片的一項(xiàng)方案中所述無機(jī)納米粒子包括無機(jī)氧化物納米粒子。所述無機(jī)納米粒子包括非磁性無機(jī)納米粒子和磁性無機(jī)納米粒子(例如氧化鐵納米粒子)，所述非磁性無機(jī)納米粒子包括非磁性金屬納米粒子(例如金納米粒子)和非磁性非金屬納米粒子(例如，氧化硅納米粒子、氧化鈦納米粒子、氧化鋁納米粒子)。在本發(fā)明實(shí)施例中，一項(xiàng)方案中所述無機(jī)氧化物納米粒子包括氧化硅納米粒子，另一項(xiàng)方案中所述無機(jī)氧化物納米粒子包括氧化鋁納米粒子，另一項(xiàng)方案中所述無機(jī)氧化物納米粒子包括氧化鈦納米粒子。本發(fā)明芯片的一項(xiàng)方案中，所述納米粒子粒徑為1-500nm、優(yōu)選1-100nm、更優(yōu)選1-50nm。
本發(fā)明芯片的一項(xiàng)方案中所述偶聯(lián)基團(tuán)包括有機(jī)硅偶聯(lián)劑提供的偶聯(lián)基團(tuán)。在本發(fā)明實(shí)施例中，本發(fā)明方法的一項(xiàng)方案中所述有機(jī)硅偶聯(lián)劑包括3-氨丙基三甲氧基硅烷，另一項(xiàng)方案中所述有機(jī)硅偶聯(lián)劑包括氨丙基三乙氧基硅烷，另一項(xiàng)方案中所述有機(jī)硅偶聯(lián)劑包括3-異氰酸酯丙基三乙氧基硅烷。
本發(fā)明的生物芯片，其特征是其中所述活化納米粒子與片基上共價(jià)鍵合有相同的所述活化基團(tuán)。從而使生物芯片上有盡可能少的活化基團(tuán)，有利于提高生物芯片的反應(yīng)特異性。
本發(fā)明芯片的一項(xiàng)方案中，納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)內(nèi)有多重探針分子或/和多重活化納米粒子，例如配基2-活化納米粒子2-配基2-配基1-活化納米粒子1-配基1-片基。
上述生物芯片的制備方法，至少含以下步驟第一步，提供所述納米結(jié)構(gòu)、偶聯(lián)基團(tuán)和活化基團(tuán)，并制備所述活化納米結(jié)構(gòu)；第二步，提供所述探針分子和在第一步中制備出來活化納米結(jié)構(gòu)，并制備所述納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)。
本發(fā)明的生物芯片的制備方法，其特征在于所述制備出的活化納米結(jié)構(gòu)，包括所述活化納米凸體。
本發(fā)明的生物芯片的制備方法，其特征在于所述制備出的活化納米結(jié)構(gòu)，包括活化納米粒子，并至少含有以下步驟第一步，提供所述探針分子和所制備出的活化納米粒子，并制備含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物；第二步，提供所述片基和第一步中所制備出的含探針分子/活化納米粒子的制備物，并制備所述納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)。
本發(fā)明的生物芯片的制備方法，其特征在于其中在所述含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物中，未固定探針分子的含量小于探針分子總量的50％。一般而言，所述制備物含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物、未結(jié)合在納米粒子上的探針分子(未固定探針分子)、和未結(jié)合探針分子的納米粒子。既使純化，也只是使某一組分比例盡可能大(或小)。在本發(fā)明實(shí)施例中，本發(fā)明方法的一項(xiàng)方案中所含未固定探針分子的含量小于探針分子總量的30％，在一項(xiàng)方案中甚至小于20％，在一項(xiàng)方案中甚至小于5％。
本發(fā)明的生物芯片的制備方法，其特征在于其中所述含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物中，非親和納米粒子的含量小于納米粒子總量的50％。在本發(fā)明實(shí)施例中，本發(fā)明方法的一項(xiàng)方案中非親和納米粒子的含量小于納米粒子總量的30％，在一項(xiàng)方案中甚至小于20％。
本發(fā)明的生物芯片的制備方法，其特征在于所述制備出的活化納米粒子，含有納米粒子、共價(jià)鍵合在納米粒子上的所述偶聯(lián)基團(tuán)、共價(jià)鍵合在偶聯(lián)基團(tuán)上的所述活化基團(tuán)。
本發(fā)明的生物芯片的制備方法，其特征在于所述制備出的含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物，其中未固定探針分子的含量小于探針分子總量的50％。
本發(fā)明的生物芯片的制備方法，其特征在于所述制備出的含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物，其中非親和納米粒子的含量小于納米粒子總量的50％。
本發(fā)明的生物芯片試劑盒，其特征在于在試劑盒內(nèi)設(shè)置有本發(fā)明的生物芯片。
本發(fā)明的生物芯片試劑盒，其特征在于在試劑盒中還設(shè)置有標(biāo)記系統(tǒng)，且所述標(biāo)記系統(tǒng)如此配置使得在進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)時(shí)，其標(biāo)記物的標(biāo)記探針分子濃度小于5ug/ml。另一項(xiàng)方案中，標(biāo)記探針分子濃度小于2ug/ml。另一項(xiàng)方案中，標(biāo)記探針分子濃度小于0.5ug/ml。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由于本發(fā)明芯片有新的組成，尤其是芯片上活性納米結(jié)構(gòu)的新組成，所以使本發(fā)明生物芯片上的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)有更高的反應(yīng)效率，從而提高了檢測(cè)靈敏度、或/和降低探針分子耗量、或/和增加芯片選擇性。本發(fā)明芯片的新組成是指在其納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)中，所述活化納米結(jié)構(gòu)的分布密度大于1個(gè)活化納米結(jié)構(gòu)/μm2、優(yōu)選大于5個(gè)活化納米結(jié)構(gòu)/μm2；而所述活化納米的特性。
具體實(shí)施例方式
術(shù)語定義本發(fā)明中，術(shù)語“探針分子”是指用以固定在反應(yīng)器內(nèi)、通過相互作用(包括親和作用)捕獲目標(biāo)物的物質(zhì)。探針分子包括多肽或/和與多肽相互作用的藥物。公知的可與目標(biāo)多肽作用的探針分子很多，例如離子交換劑、藥物、多肽、多糖、維生素、抗生素、功能有機(jī)物、抗原、以及病毒、細(xì)胞或它們的組成。探針分子也包括核酸或/和與核酸相互作用的藥物。
本發(fā)明中，術(shù)語“探針點(diǎn)”是指固定有探針分子的區(qū)域；術(shù)語“非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)”是指基本不含有納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)；術(shù)語“納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)”是指明顯含有納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)，其中至少部分探針分子固定在納米結(jié)構(gòu)上；術(shù)語“含納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的生物芯片”是指至少含有一個(gè)納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的生物芯片。
本發(fā)明術(shù)語“標(biāo)記探針分子”是指包含于標(biāo)記物中、通過其與目標(biāo)物相互作用(包括親和作用)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物標(biāo)記的物質(zhì)，包括配基(相當(dāng)于英語中的Ligand)，例如抗原、抗體、配體、配體指數(shù)增強(qiáng)系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選的適配分子、配基、多肽、多糖、共酶、輔因子、抗生素、類固醇、病毒、細(xì)胞等。
本發(fā)明術(shù)語“多肽”相當(dāng)于英語中的“polypeptide”，包括天然或合成蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片斷、合成肽、等等，免疫檢測(cè)中通常的目標(biāo)物和檢測(cè)中通用的配基、例如抗原、抗體、等等都屬于多肽。
本發(fā)明術(shù)語“探針分子/納米粒子復(fù)合物”是指固定有探針分子的納米粒子。探針分子在納米粒子上的固定有很多方式，本發(fā)明的方法中制備的探針分子/納米粒子復(fù)合物中的一種固定方式例子為共價(jià)健合。需要注意的是，芯片制備中的含探針分子/納米粒子復(fù)合物的制備物，一般為含探針分子/納米粒子復(fù)合物的混合物(簡(jiǎn)稱探針分子/納米粒子混合物)，因其還含或多或少未固定至納米粒子的探針分子、和或多或少基本上未固定有探針分子的納米粒子。
本發(fā)明術(shù)語“納米粒子”是指在三維空間中至少有一維小于1000nm的固相載體粒子；術(shù)語“活化納米粒子”，是指活化基團(tuán)與納米粒子通過共價(jià)結(jié)合形成的復(fù)合物。
本發(fā)明術(shù)語“生物芯片片基”，簡(jiǎn)稱片基，是指用以在其上形成探針點(diǎn)的固相載體。本發(fā)明的固相載體包括常規(guī)載體和納米結(jié)構(gòu)載體，其中所述常規(guī)載體為表面基本上無納米結(jié)構(gòu)的固相載體，所述納米結(jié)構(gòu)載體為表面上有納米結(jié)構(gòu)的固相載體。片基上通常有可與探針分子反應(yīng)的活性基團(tuán)。
本發(fā)明中，術(shù)語“納米凸體”是指至少一維具有尺寸1-1000nm的僅有一個(gè)頂部的凸體，例如一個(gè)固定于芯片片基、或其它結(jié)構(gòu)上的納米粒子。術(shù)語“納米結(jié)構(gòu)”是指由納米凸體為結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，例如由納米凸體形成的樹枝狀、深丘狀、網(wǎng)狀、或其它幾何形貌，或其間納米凸體的相互關(guān)系。
本發(fā)明術(shù)語“基片”是指以片基為基礎(chǔ)的、結(jié)合有無其它結(jié)構(gòu)(例如隔離結(jié)構(gòu))的用以在固定配基后形成芯片的產(chǎn)品?；峡梢杂幸粋€(gè)或多個(gè)片基池。單片基池基片上通常沒有隔離結(jié)構(gòu)，此時(shí)基片既是片基(例如市售的氨基玻片)。多片基池基片上有隔離結(jié)構(gòu)，此時(shí)基片包括片基和隔離結(jié)構(gòu)。片基池在固定上配基后形成反應(yīng)器，多片基池片基形成多反應(yīng)器芯片。片基是用以固定配基及其它助劑(假如有的話)的片基，其表面化學(xué)性質(zhì)和光學(xué)性質(zhì)是影響芯片性能及成本的重要因素。
本發(fā)明術(shù)語“片基池”是指片基與其隔離結(jié)構(gòu)形成的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明術(shù)語“標(biāo)記物質(zhì)”是指用以形成或參與形成檢出信號(hào)的物質(zhì)，例如羅丹明、CY3、CY5等。
本發(fā)明術(shù)語“納米結(jié)構(gòu)”是指具有納米尺寸且反應(yīng)出部分或全部納米效應(yīng)(例如表面效應(yīng)、尺寸效應(yīng)等)的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明術(shù)語“凸出距離”是指上述凸體沿其頂部至其底部的距離。
本發(fā)明術(shù)語“凸出半距處橫斷面”是指上述凸體在其凸出距離一半處垂直于這一距離的面。
本發(fā)明術(shù)語“反應(yīng)器”是指探針與目標(biāo)物的反應(yīng)的場(chǎng)所及與之連通的全部結(jié)構(gòu)組成的整體。反應(yīng)器包括邊界或隔離結(jié)構(gòu)、片基、固定在片基上的探針、及相連通的其它相關(guān)結(jié)構(gòu)(例如流路、進(jìn)液結(jié)構(gòu)、出液結(jié)構(gòu)、固定化標(biāo)記物、等等)。此外，本發(fā)明中按照芯片上反應(yīng)器的數(shù)目n，芯片被定義為單反應(yīng)器芯片(n＝1)和多反應(yīng)器芯片(n等于或大于2)；按照檢測(cè)過程中所加入的液相介質(zhì)能否在反應(yīng)器中定向流動(dòng)，反應(yīng)器被定義為流動(dòng)反應(yīng)器和非流動(dòng)反應(yīng)器，且將以流動(dòng)反應(yīng)器和非流動(dòng)反應(yīng)器為特征的芯片分別定義為流動(dòng)芯片和非流動(dòng)芯片以下將通過實(shí)施例更為詳細(xì)地說明本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1活化納米粒子的制備方法本實(shí)施例中，活化納米粒子制備方法一般包括1).提供納米粒子、偶聯(lián)劑和活化劑本實(shí)施例中，所用納米粒子如表1所示。
表1

本發(fā)明中，偶聯(lián)劑為含偶聯(lián)基團(tuán)的試劑。本實(shí)施例中，所用偶聯(lián)劑選自有機(jī)硅偶聯(lián)劑(表2)。有機(jī)硅偶聯(lián)劑包括硅烷偶聯(lián)劑，其通式為YSiX。其中SiX為硅氧烷基，在本實(shí)施例中，用以同無機(jī)物表面進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)；Y為有機(jī)官能團(tuán)，具有反應(yīng)活性。在本實(shí)施例中，Y包括通式為Y’R’的基團(tuán)。其中Y’用作活性基團(tuán)(例如-NH2活性基團(tuán))或進(jìn)一步固定活性基團(tuán)；R’為有機(jī)官能團(tuán)與硅氧烷基之間的“臂”。
表2

2).進(jìn)行納米粒子、偶聯(lián)基團(tuán)和活化基團(tuán)間的共價(jià)鍵合反應(yīng)本實(shí)施例中，納米粒子、偶聯(lián)基團(tuán)和活化基團(tuán)間的共價(jià)鍵合反應(yīng)一般包括(1).去離子處理本實(shí)施例中，先制備納米粒子懸浮液，其中納米粒子濃度(w/v)在5-30％之間。如果必要，選用已知的離子交換層析方法，將納米粒子懸浮液中的陰、陽離子分別去除。然后，對(duì)懸浮液進(jìn)行離心(2-8℃，20000g)并獲得納米粒子沉積物。
(2).在納米粒子表面共價(jià)鍵合偶聯(lián)劑將上述納米粒子沉積物制成納米粒子懸浮液，并與偶聯(lián)劑溶液混合、反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)公知的反應(yīng)控制條件(例如反應(yīng)物濃度，反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，等等)可以控制反應(yīng)。本實(shí)施例中共價(jià)鍵合反應(yīng)時(shí)，納米粒子的濃度(w/v)在5％至5‰之間調(diào)節(jié)；偶聯(lián)劑濃度(v/v)在1％至5％之間調(diào)節(jié)；反應(yīng)介質(zhì)為含水的甲醇；反應(yīng)溫度在室溫至反應(yīng)介質(zhì)沸點(diǎn)以下5℃之間調(diào)節(jié)；反應(yīng)時(shí)間在0.5至2小時(shí)之間調(diào)節(jié)。本專業(yè)的技術(shù)人員通過調(diào)節(jié)這些參數(shù)可獲得所需的優(yōu)化條件。要強(qiáng)調(diào)的是，偶聯(lián)劑與納米粒子間的鍵合反應(yīng)是能否獲得本發(fā)明的生物芯片的關(guān)鍵步驟之一。
反應(yīng)完成后，對(duì)懸浮液進(jìn)行多次離心(2-8℃，20000g)以去除未固定在納米粒子上的反應(yīng)物和反應(yīng)介質(zhì)，然后獲得以DMF為分散介質(zhì)的納米粒子懸浮液。
本實(shí)施例中，通過調(diào)節(jié)偶聯(lián)反應(yīng)參數(shù)獲得不同的結(jié)合有偶聯(lián)基團(tuán)的納米粒子。一些納米粒子在元素分析中的氮含量在0.25-0.65N％之間變動(dòng)，理論上相當(dāng)于1g納米粒子上固定的偶聯(lián)基團(tuán)在179-464umol之間變動(dòng)，或1m2納米粒子表面上固定的偶聯(lián)基團(tuán)在1.3-3.4umol之間變動(dòng)。本實(shí)施例中，只有當(dāng)偶聯(lián)基團(tuán)含量超過一個(gè)最低含量時(shí)，納米粒子才能滿足本發(fā)明的方法的要求，被選作進(jìn)一步制備本發(fā)明的活化納米粒子。具體而言，這個(gè)最低含量是指元素分析中的氮含量大于0.35N％、優(yōu)選大于0.5N％(或1g納米粒子上固定的偶聯(lián)基團(tuán)大于250umol、優(yōu)選大于357umol，或1m2納米粒子表面上固定的偶聯(lián)基團(tuán)大于1.85umol、優(yōu)選大于2.64umol)。此外，偶聯(lián)基團(tuán)的含量也可用元素分析中的碳含量表征，但本質(zhì)上是一樣的。
(3).將活化基團(tuán)共價(jià)鍵合至偶聯(lián)基團(tuán)上本實(shí)施例中，對(duì)于以氨基之外的其它基團(tuán)為活化基團(tuán)的活化納米粒子，其制備還包括將活化基團(tuán)共價(jià)鍵合至偶聯(lián)基團(tuán)上將納米粒子懸浮液與活化劑溶液(例如以DMF為溶劑)混合、反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)公知的反應(yīng)控制條件(例如反應(yīng)物濃度，反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，等等)可以控制反應(yīng)。本專業(yè)的技術(shù)人員通過調(diào)節(jié)這些參數(shù)可獲得所需的優(yōu)化條件。此一鍵合反應(yīng)也是能否獲得本發(fā)明生物芯片的關(guān)鍵步驟之一。
反應(yīng)完成后，對(duì)懸浮液進(jìn)行多次離心(2-8℃，20000g)以去除未固定在納米粒子上的反應(yīng)物和反應(yīng)介質(zhì)，然后獲得納米粒子的懸浮液。若活化劑含保護(hù)基團(tuán)(例如Fmoc)，還要脫去這些保護(hù)基團(tuán)。脫保護(hù)方法選自已知的肽合成中的脫保護(hù)方法。
本發(fā)明的方法的另一方案，是先將活化劑(例如氨基肼)與偶聯(lián)劑(例如3-異氰酸酯丙基三乙氧基硅烷)反應(yīng)，使活化基團(tuán)共價(jià)鍵合至偶聯(lián)基團(tuán)上，再將此一鍵合有活化基團(tuán)的偶聯(lián)基團(tuán)共價(jià)鍵合至無機(jī)物納米粒子表面上。制備鍵合有活化基團(tuán)的偶聯(lián)基團(tuán)的方法是公知方法。
更具體的制備方法由以下實(shí)施例補(bǔ)充。
實(shí)施例1.1含氨基活化基團(tuán)的活化納米粒子的制備方法本實(shí)施例中，對(duì)于以氨基(-NH2)為活化基團(tuán)的活化納米粒子，在使用3-氨丙基三甲氧基硅烷或氨丙基三乙氧基硅烷時(shí)，偶聯(lián)基團(tuán)與活化基團(tuán)同時(shí)固定在納米粒子上，偶聯(lián)基團(tuán)與活化基團(tuán)在納米粒子上的分布密度相同。本實(shí)施例中，只有當(dāng)氨基密度超過一個(gè)最低含量時(shí)，納米粒子才能滿足本發(fā)明的方法的要求，被選作活化納米粒子。具體而言，這個(gè)最低含量是指元素分析中的氮含量大于0.38N％、優(yōu)選大于0.5N％(或1g納米粒子上固定的偶聯(lián)基團(tuán)大于270umol、優(yōu)選大于357umol，或1m2納米粒子表面上固定的偶聯(lián)基團(tuán)大于2.0umol、優(yōu)選大于2.6umol)。
實(shí)施例1.2含-RNH2活化基團(tuán)的活化納米粒子的制備方法本發(fā)明中，活化劑為含活化基團(tuán)的試劑，活化基團(tuán)為用以特征性地固定探針分子的基團(tuán)，盡管其它基團(tuán)(例如偶聯(lián)基團(tuán))上也可能固定探針分子。本實(shí)施例中，所用活化劑如表3所示。此外，應(yīng)用其它含-RNH2活化基團(tuán)的活化劑，例如氨基酸衍生物、聚氨基酸(例如聚耐氨酸)、聚氨基衍生物，也可利用本實(shí)施例的方法制作本發(fā)明的活化納米粒子。
表3

本實(shí)施例中，通過調(diào)節(jié)活化反應(yīng)參數(shù)獲得不同的結(jié)合有活化基團(tuán)的活化納米粒子。一些活化納米粒子在元素分析中的氮含量在0.58-1.50N％之間變動(dòng)。減去結(jié)合有偶聯(lián)基團(tuán)的納米粒子的元素分析氮含量后，與活化基團(tuán)有關(guān)的氮含量在0.10-0.85N％之間變動(dòng)，理論上相當(dāng)于1g納米粒子上固定的活化基團(tuán)在35-245umol之間變動(dòng)，或1m2納米粒子表面上固定的活化基團(tuán)在0.26-1.8umol之間變動(dòng)。本實(shí)施例中，只有當(dāng)活化基團(tuán)含量超過一個(gè)最低含量時(shí)，納米粒子才能滿足本發(fā)明的方法的要求，被選作進(jìn)一步制備本發(fā)明生物芯片的活化納米粒子。具體而言，這個(gè)最低含量是指，與活化基團(tuán)有關(guān)的元素分析氮含量大于0.20N％、優(yōu)選大于0.40N％(或1g納米粒子上固定的活性基團(tuán)大于70umol、優(yōu)選大于140umol，或1m2納米粒子表面上固定的活化基團(tuán)大于0.5umol、優(yōu)選大于1umol)。此外，活化基團(tuán)的含量也可用元素分析中的碳含量表征，但本質(zhì)上是一樣的。所含活化基團(tuán)量小于此一最低含量的納米粒子，被稱作非活化納米粒子，用以與活化納米粒子進(jìn)行比較研究。本實(shí)施例中，非活化納米粒子包括未活化納米粒子(共價(jià)鍵合活化基團(tuán)量為0)和弱活化納米粒子(1m2納米粒子表面上固定的活化基團(tuán)小于0.5umol)。
表4列出了實(shí)施例1.1中制備的部份活化納米粒子的組成。
表4


*偶聯(lián)后元素分析中的N百分比**與活化基團(tuán)有關(guān)的元素分析氮含量(N％)＝活化納米粒子元素分析中的N百分比-未活化前含偶聯(lián)基團(tuán)的納米粒子的元素分析中的N百分比實(shí)施例1.3活化基團(tuán)含有不含-NH2的有機(jī)基團(tuán)的活化納米粒子的制備方法本實(shí)施例中，本實(shí)施例中，所用活化劑分別為戍二醛和1，4-丁二醇二縮水甘油醚。本實(shí)施例的方法，也適于其它含有不含-NH2的活化基團(tuán)(例如羰基、巰基、等等)的活化劑。
納米粒子上固定的偶聯(lián)劑中含氨基時(shí)，納米粒子與1，4-丁二醇二縮水甘油醚反應(yīng)，在偶聯(lián)基團(tuán)上共價(jià)鍵合帶有碳原子鏈的環(huán)氧基；納米粒子與戍二醛反應(yīng)，在偶聯(lián)基團(tuán)上共價(jià)鍵合醛基。
本實(shí)施例中，只有用所固定的偶聯(lián)劑中氨基含量大于1.85umol/1m2納米粒子表面、優(yōu)選大于2.6umol/1m2納米粒子的納米粒子，結(jié)合活化基團(tuán)制成的制備物，才被選作活化納米粒子。
實(shí)施例2探針分子/活化納米粒子混合物的制備本發(fā)明中，探針分子/活化納米粒子混合物，是指含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物。其制備方法一般包括1).提供探針分子和本發(fā)明的活化納米粒子本實(shí)施例中，所用活化納米粒子選自實(shí)施例1制備的合乎要求的活化納米粒子；所用探針分子如表5所示。
表5


*制作方法參考Tranchand-Bunel，D.，Auriault，C.，Diesis，E.，Gras-Masse，H.(1998)Detection of human antibodies using“convergent”combinatorialpeptide libraries or“mixotopes”designed form a nonvariable antigenApplication to the EBV viral capsid antigen p18，J.Peptide Res.52，1998，495-508。
本實(shí)施例所用探針分子包括多肽(例如合成肽EBV VCA-P18)、抗原(例如HCV、HIV和Syphilis抗原)、及抗體(例如HBs抗體)。本實(shí)施例的方法也適于其它探針分子，例如藥物、多糖、維生素、抗生素、功能有機(jī)物、單鏈或多鏈DNA、RNA、以及病毒、細(xì)胞或它們的組成。
2).制備探針分子/活化納米粒子復(fù)合物本發(fā)明中，術(shù)語“探針分子/活化納米粒子復(fù)合物”是指探針分子結(jié)合在活化納米粒子上形成的復(fù)合物。優(yōu)選的結(jié)合方式之一為，在高鹽(例如0.5MNaCl)溶液中不解離的結(jié)合方式，例如共價(jià)鍵合。
制備方法為通過離心分離獲得活化納米粒子沉積物，再將其均勻分布在緩沖液中制成活化納米粒子均勻分布的懸浮液，并與探針分子溶液混合、反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)公知的反應(yīng)控制條件(例如反應(yīng)物濃度，反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，等等)可以控制反應(yīng)。本實(shí)施例中反應(yīng)時(shí)納米粒子的濃度(w/v)在5％至5‰之間調(diào)節(jié)，探針分子濃度在0.1mg/ml至1mg/ml之間調(diào)節(jié)；反應(yīng)介質(zhì)為緩沖液(PBS或pH9.3的0.1M碳酸鹽緩沖液)；反應(yīng)溫度在室溫至40℃之間調(diào)節(jié)；反應(yīng)時(shí)間在0.5至24小時(shí)之間調(diào)節(jié)。本專業(yè)的技術(shù)人員通過調(diào)節(jié)這些參數(shù)可獲得所需的優(yōu)化條件。要強(qiáng)調(diào)的是，活化納米粒子和探針分子之間的反應(yīng)，也是能否獲得本發(fā)明生物芯片的關(guān)鍵步驟之一。
反應(yīng)完成后，對(duì)懸浮液進(jìn)行離心(2-8℃，20000g)，取上清液測(cè)定探針分子濃變，以測(cè)定未固定在納米粒子上的探針分子量。其中，上清液蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定使用常規(guī)測(cè)定方法。如有必要，也可再離心(2-8℃，20000g)，以減少探針分子/活化納米粒子混合物中未固定探針分子。本發(fā)明中，術(shù)語“未固定探針分子”是指探針分子/活化納米粒子混合物中未固定在納米粒子上的探針分子。
探針分子/活化納米粒子混合物中，也可能含非親和納米粒子。本發(fā)明中，術(shù)語“非親和納米粒子”是指未固定有探針分子的納米粒子，或雖固定有探針分子但其含量太少、以至并無無探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的明顯反應(yīng)性的納米粒子。本實(shí)施例中，探針分子/活化納米粒子混合物中無親和的納米粒子的比例通過公知的親和層析法來測(cè)定。例如，在HBS Ab、蛋白質(zhì)G或蛋白質(zhì)A作為探針分子的情況下，分別用HBS Ag和人IgG作配基固定至活化層析膠上，再比較親和層析上清液和探針分子/活化納米粒子混合物懸浮液中納米粒子的量(通過離心分離比較沉淀量)，可得此一比例。親和層析膠的制備方法及親和層析的進(jìn)行方法為常規(guī)方法。
如有必要，還可用生物芯片片基常規(guī)鈍化處理方法對(duì)混合物中活化納米粒子表面進(jìn)行鈍化處理。
本實(shí)施例中，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)參數(shù)獲得不同的探針分子/活化納米粒子混合物。利用實(shí)施例1制備的活化納米粒子，在優(yōu)化條件下制備的探針分子/活化納米粒子混合物中，自由探針分子的含量小于50％，非親和納米粒子的含量小于50％。然而，利用弱活化納米粒子或非活化納米粒子在相同條件下的制備中，自由探針分子的含量可以大于50％，非親和納米粒子的含量可以大于50％。從而，本發(fā)明的活化納米粒子的使用改變了探針分子/納米粒子混合物的組成，從而改變了芯片上納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的組成，也就是改變了芯片的組成。下面我們將看到，這是有實(shí)際意義的。
本實(shí)施例中，只有當(dāng)探針分子/活化納米粒子混合物的組成超過一個(gè)最低標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，其才能滿足本發(fā)明的方法的要求，被選作進(jìn)一步制備本發(fā)明生物芯片的探針分子/活化納米粒子混合物。具體而言，這個(gè)最低標(biāo)準(zhǔn)是指，所述混合物中自由探針分子的含量小于探針分子總量的50％，或/和所述混合物中無親和的納米粒子的比例小于50％。低于這個(gè)最低標(biāo)準(zhǔn)的制備物(例如以非活化納米粒子制備的探針分子/非活化納米粒子混合物)，被用以與本發(fā)明的探針分子/活化納米粒子混合物進(jìn)行比較研究。
更具體的制備方法由以下實(shí)施例補(bǔ)充。
實(shí)施例2.1探針分子/活化納米粒子混合物的制備方法(活化納米粒子含-RNH2活化基團(tuán))本實(shí)施例中，所用活化納米粒子含-RNH2活化基團(tuán)，其選自實(shí)例例1.2制備的活化納米粒子。
本實(shí)施例中一些探針分子/活化納米粒子混合物中，自由探針分子的含量小于50％，某些甚至小于20％，個(gè)別甚至小于5％；一些探針分子/活化納米粒子混合物中，無親和的納米粒子的比例小于50％，某些甚至小于20％。
表6列出了實(shí)施例2.1中制備的部份探針分子/活化納米粒子混合物的組成。
表6


*參考表4**(離心上清液中探針分子含量/探針分子總加入量)×100％***(親和層析透過液的離心沉淀量/探針分子/活化納米粒子混合物的等體積液的離心沉淀量)×100％實(shí)施例2.2探針分子/活化納米粒子混合物的制備方法(活化納米粒子含-NH2活化基團(tuán))本實(shí)施例中，所用活化納米粒子含-NH2活化基團(tuán)，其選自實(shí)例例1.1制備的活化納米粒子。
實(shí)施例2.3探針分子/活化納米粒子混合物的制備方法(活化納米粒子含有不含NH2的活化基團(tuán))本實(shí)施例中，所用活化納米粒子含有不含NH2的活化基團(tuán)，其選自實(shí)例例1.3制備的活化納米粒子。
本實(shí)施例中，在優(yōu)化條件下制備的探針分子/活化納米粒子混合物中，自由探針分子的含量小于50％，非親和納米粒子的含量小于50％。然而，利用弱活化納米粒子或非活化納米粒子在相同條件下的制備中，自由探針分子的含量可以大于50％，非親和納米粒子的含量可以大于50％。從而，本發(fā)明的活化納米粒子的使用改變了探針分子/納米粒子混合物的組成，從而改變了芯片上納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的組成，也就是改變了芯片的組成。下面我們將看到，這是有實(shí)際意義的。
實(shí)施例3.生物芯片的制備方法(1)本實(shí)施例中，所用片基為非納米結(jié)構(gòu)片基，所用活化納米結(jié)構(gòu)為選自實(shí)施1制備的活化納米粒子。其制備方法一般包括1).提供生物芯片片基和本發(fā)明的探針分子/活化納米粒子混合物本實(shí)施例中，所用探針分子/活化納米粒子混合物，選自實(shí)施2制備的合乎要求的探針分子/活化納米粒子混合物；所用芯片片基包括載玻片衍生物，如下表7所示。
表7

*制作方法參考Melnyk O等，Peptide arrays for highiy sensitive and specialantibody-binding fluorescence arrays，Bioconjug Chem.13713-20.2002。
**制作方法簡(jiǎn)述1).使載玻片表面上的羥基與3-氨丙基三甲氧基硅烷反應(yīng)；2).將含保護(hù)基團(tuán)Fmoc的精氨酸或天冬酰氨與固定在載玻片表面上的氨基接觸并進(jìn)行反應(yīng)；3).脫去固定化精氨酸或天冬酰氨中的保護(hù)基團(tuán)Fmoc。
本實(shí)施例的制備方法同樣適于由以下材料或其衍生物制成的芯片片基硅片、硅膠、陶瓷、金屬氧化物、金屬、其它聚合物材料及它們的復(fù)合物。同理，本實(shí)施例所用芯片片基還可以是含納米結(jié)構(gòu)的片基。
2.制備生物芯片本實(shí)施例中制備生物芯片的方法包括使探針分子/活化納米粒子復(fù)合物與芯片片基反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)公知的反應(yīng)控制條件(例如反應(yīng)物濃度，反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，等等)可以控制反應(yīng)。本專業(yè)的技術(shù)人員通過調(diào)節(jié)這些參數(shù)可獲得所需的優(yōu)化條件。
1).點(diǎn)樣將探針分子/活化納米粒子混合物制成懸浮液，其中納米粒子濃度在1％至萬分之一之間選擇(優(yōu)選五百分之一至萬分之一)，所含探針分子的濃度在0.1-2.0mg/ml之間選擇(優(yōu)選0.1-0.3mg/ml)。再按常規(guī)的點(diǎn)樣方法將懸浮液加至芯片片基，形成探針點(diǎn)。每種探針分子/活化納米粒子混合物點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)。在一些情況下，除上述探針點(diǎn)外，還將探針分子溶液(探針分子濃度在0.5-2.0mg/ml之間選擇)按常規(guī)的點(diǎn)樣方法加至芯片片基，形成非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)。每種探針分子/活化納米粒子混合物和探針分子點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)。所有探針點(diǎn)在芯片片基上形成M×N探針陣列。其中M大于1，N大于1。所用點(diǎn)樣儀為DY-2003生物芯片點(diǎn)樣儀(中國科學(xué)院電工研究所制備)。
2).孵化點(diǎn)樣后，在一定溫度(4-37℃內(nèi)選擇)下和一定時(shí)間(1-24小時(shí))內(nèi)進(jìn)行片基上的固定化反應(yīng)。
3).鈍化孵化后，使芯片在一定溫度(4-37℃內(nèi)選擇)下和一定時(shí)間(1-15小時(shí))內(nèi)與一定濃度(1-30mg/ml)的鈍化劑(小牛血清或牛奶或其它已知鈍化劑)反應(yīng)，以減小芯片上的非特異吸附活性。納米結(jié)構(gòu)本實(shí)施中，生物芯片上探針點(diǎn)中的納米凸體及其高度、半高處的最小尺寸及其分布密度的測(cè)定，均利用SPA-300HV型掃描探針顯微鏡(DFM)和電子掃描顯微鏡進(jìn)行。
本實(shí)施例中，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)參數(shù)獲得不同的生物芯片，其上有不同的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)。一些生物芯片中探針點(diǎn)上的納米凸體分布密度大于1個(gè)/μm2，某些生物芯片中探針點(diǎn)上的納米凸體分布密度大于5個(gè)/μm2，某些生物芯片中探針點(diǎn)上的納米凸體分布密度甚至大于10個(gè)/μm2。本實(shí)施例中，只有當(dāng)探針點(diǎn)上的納米凸體分布密度超過一個(gè)最低標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，其才能達(dá)到本發(fā)明的目的，被選作本發(fā)明生物芯片。具體而言，這個(gè)最低標(biāo)準(zhǔn)是指，所述的生物芯片上含納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)，其中所述納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)包含凸出高度大于3nm、且凸出半高處至少一維尺寸在1-500nm、優(yōu)選1-100nm之間的納米凸體，且所述納米凸體在所述納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)中的分布密度大于1個(gè)/μm2。低于這個(gè)最低標(biāo)準(zhǔn)的制備物(例如以探針分子/活化納米粒子混合物制備的、納米凸體分布密度大于1個(gè)/μm2的生物芯片)，被用以與本發(fā)明的生物芯片進(jìn)行比較研究。
本實(shí)施例的方法當(dāng)然也適于各種芯片，例如單反應(yīng)池芯片、多反應(yīng)池芯片、流動(dòng)芯片、非流動(dòng)芯片、等等。
本實(shí)施例制備的非流動(dòng)生物芯片，為多反應(yīng)池非流動(dòng)芯片，制備方法參考我們的另一專利申請(qǐng)《反應(yīng)器高度最小化的高集成度分析芯片及其應(yīng)用》(PCT申請(qǐng)?zhí)朇N20040169)中的實(shí)施例1。簡(jiǎn)言之用高疏水有機(jī)硅涂料(成都晨光化工研究院)涂在芯片片基上反應(yīng)器邊界位置上，按供貨方的使用說明在室溫干燥后固化，形成高度25-115μm、寬度2.0-2.5mm的高疏水凸體。高疏水凸體包圍的表面可以取3mm×3mm矩形。在基片此一表面上，橫向共有12個(gè)片基池，縱向有4個(gè)片基池，共有48個(gè)片基池。然后，對(duì)片基池進(jìn)行上述“點(diǎn)樣”操作和其它操作，制得非流動(dòng)芯片(例如表6中的芯片D1-D11)。
本實(shí)施例制備的流動(dòng)生物芯片，芯片上探針分子與檢測(cè)樣品中的反應(yīng)，包括檢測(cè)樣品在流動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行的反應(yīng)。流動(dòng)生物芯片的例子，有我們的另一專利申請(qǐng)《反應(yīng)器高度最小化的高集成度分析芯片及其應(yīng)用》(PCT申請(qǐng)?zhí)朇N20040169)中的實(shí)施例9或10。本實(shí)施例流動(dòng)生物芯片的制備方法，參考其制備方法。簡(jiǎn)言之對(duì)片基上預(yù)留固定探針的4個(gè)區(qū)域(每個(gè)區(qū)域?qū)?mm，長15mm)進(jìn)行上述“點(diǎn)樣”、“孵化”和“鈍化”操作。本實(shí)施例中的頂面元件為可重復(fù)使用的、有進(jìn)出液口、進(jìn)出液管的、和與4個(gè)區(qū)域相適應(yīng)的不銹鋼板。其與片基接觸的面上有密封結(jié)構(gòu)。其密封結(jié)構(gòu)為與片基上4區(qū)域之外的區(qū)域?qū)?yīng)的彈性材料層(自干硅橡膠溶液，成都晨光化工研究院)(層厚小于0.5mm)。其每一對(duì)進(jìn)出液口與底面元件上的每一個(gè)反應(yīng)池的進(jìn)出液區(qū)相對(duì)應(yīng)。使用機(jī)械卡具壓力將頂面元件與片基之間形成密封連結(jié)，從而制得非流動(dòng)芯片(例如表6中的芯片D12-D14)。
更具體的制備方法由以下實(shí)施例補(bǔ)充。
實(shí)施例3.1.生物芯片的制備方法(活化納米粒子含-RNH2活化基團(tuán))本實(shí)施例中，所用活化納米粒子含-RNH2活化基團(tuán)；所用探針分子/活化納米粒子混合物，選自實(shí)施2.1制備的合乎要求的探針分子/活化納米粒子混合物。
表8列出了實(shí)施例5中制備的部份本發(fā)明的生物芯片的組成。
表8


*參考表7**探針分子/活化納米粒子混合物，參考表6***納米凸體密度(個(gè)納米凸體/μm2)****b4EBV-VCA-P18抗原；b5HCV AG；b6HIV AG；b7梅毒抗原實(shí)施例3.2.生物芯片的制備方法(活化納米粒子含-NH2活化基團(tuán))本實(shí)施例中，所用活化納米粒子含-NH2活化基團(tuán)；所用探針分子/活化納米粒子混合物，選自實(shí)施2.2制備的合乎要求的探針分子/活化納米粒子混合物。
實(shí)施例3.3.生物芯片的制備方法(活化納米粒子含有不含胺基的活化基團(tuán))本實(shí)施例中，所用活化納米粒子含有不含胺基的活化基團(tuán)；所用探針分子/活化納米粒子混合物，選自實(shí)施2.3制備的合乎要求的探針分子/活化納米粒子混合物。
實(shí)施例4.生物芯片的制備方法(2)本實(shí)施例中，所用片基為納米結(jié)構(gòu)片基，所用活化納米結(jié)構(gòu)為納米結(jié)構(gòu)片基上的活化凸體。其制備方法一般包括
1).提供納米結(jié)構(gòu)片基本實(shí)施例所用納米結(jié)構(gòu)片基為納米結(jié)構(gòu)玻片，其制備方法參考我們的另一項(xiàng)專利申請(qǐng)PCT CN2004000437。簡(jiǎn)言之將載玻片放入優(yōu)化濃度的、選自于表4的納米粒子的懸浮液中浸泡2小時(shí)以上，然后洗滌烘干。
本實(shí)施中，納米凸體及其高度、半高處的最小尺寸及其分布密度的測(cè)定，利用SPA-300HV型掃描探針顯微鏡(DFM)及分析軟件進(jìn)行。只有那些納米凸體(高度大于3nm、且凸出半高處至少一維尺寸在1-500nm)分布密度大于5個(gè)/μm2的制備物被選作納米結(jié)構(gòu)片基，來制備本實(shí)施例的生物芯片。
特別要強(qiáng)調(diào)的是，含其它納米結(jié)構(gòu)、特別是納米凸體的芯片片基，也可以用作本實(shí)施例的納米結(jié)構(gòu)片基。這些納米凸體的例子，包括定向排列的、不連續(xù)的亞微米須晶結(jié)構(gòu)(參考中國專利申請(qǐng)?zhí)?6193700.9)，納米管道、等等。
2).制備活化納米結(jié)構(gòu)本實(shí)施例中，偶聯(lián)劑與實(shí)施例1中的偶聯(lián)劑相同；活化劑與實(shí)施例1中的活化劑相同。
活化方法一般包括(1).清洗芯片片基(2).在納米凸體表面共價(jià)鍵合偶聯(lián)劑將上述片基與偶聯(lián)劑溶液混合、反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)公知的反應(yīng)控制條件(例如反應(yīng)物濃度，反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，等等)可以控制反應(yīng)。本實(shí)施例中，偶聯(lián)劑濃度(v/v)在1％至5％之間調(diào)節(jié)；反應(yīng)介質(zhì)為含水的甲醇；反應(yīng)溫度在室溫至反應(yīng)介質(zhì)沸點(diǎn)以下5℃之間調(diào)節(jié)；反應(yīng)時(shí)間在0.5至5小時(shí)之間調(diào)節(jié)。本專業(yè)的技術(shù)人員通過調(diào)節(jié)這些參數(shù)可獲得所需的優(yōu)化條件。要強(qiáng)調(diào)的是，偶聯(lián)劑與片基上納米凸體間的鍵合反應(yīng)是能否獲得本發(fā)明的生物芯片的活性納米結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵步驟之一。
反應(yīng)完成后，先后用甲醇和無離子蒸餾水清洗，高溫干燥后備用。
(3).將活化基團(tuán)共價(jià)鍵合至偶聯(lián)基團(tuán)上將(2)的制備物與活化劑溶液(以DMF為溶劑)混合、反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)公知的反應(yīng)控制條件(例如反應(yīng)物濃度，反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，等等)可以控制反應(yīng)。本專業(yè)的技術(shù)人員通過調(diào)節(jié)這些參數(shù)可獲得所需的優(yōu)化條件。此一鍵合反應(yīng)也是能否獲得本發(fā)明生物芯片的活性納米結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵步驟之一。
若活化劑含保護(hù)基團(tuán)，還要脫去這些保護(hù)基團(tuán)。脫保護(hù)方法選自已知的肽合成中的脫保護(hù)方法。
表9列出了本實(shí)施例中制備的部份活化納米結(jié)構(gòu)片基的組成。
表9

3).制備生物芯片本實(shí)施例中，所用探針分子選自表5；所用片基選自上述制備。
本實(shí)施例中，制備生物芯片(包括非流動(dòng)生物芯片和流動(dòng)生物芯片)的方法，與實(shí)施例3中“制備生物芯片”的方法相同，只不過在其使用非納米結(jié)構(gòu)片基的地方，本實(shí)施例使用活化納米結(jié)構(gòu)片基；而在其使用含探針分子/納米粒子復(fù)合物的制備的地方，本實(shí)施例使用探針分子。
實(shí)施例5.生物芯片的制備方法(3)本實(shí)施例中，所用片基為納米結(jié)構(gòu)片基，所用活化納米結(jié)構(gòu)為實(shí)施例1制備的合乎要求的活化納米粒子。其制備方法一般包括1).提供納米結(jié)構(gòu)片基本實(shí)施例所用納米結(jié)構(gòu)片基與實(shí)施例4中所用納米結(jié)構(gòu)片基相同。
2).制備活化納米結(jié)構(gòu)片基本實(shí)施例所用活化納米結(jié)構(gòu)片基選自實(shí)施例4所制備的活化納米結(jié)構(gòu)片基。
3).制備生物芯片本實(shí)施例中，所用探針分子/活化納米粒子混合物選自表6；所用活化納米結(jié)構(gòu)片基選自上述制備(表9)。
本實(shí)施例中，制備生物芯片(包括非流動(dòng)生物芯片和流動(dòng)生物芯片)的方法，與實(shí)施例3中“制備生物芯片”的方法相同，只不過在其使用非納米結(jié)構(gòu)片基的地方，本實(shí)施例使用活化納米結(jié)構(gòu)片基。
實(shí)施例6生物芯片試劑盒的制備本實(shí)施例中，生物芯片試劑盒包含生物芯片和生物芯片標(biāo)記系統(tǒng)，其制備一般地包括1).制備生物芯片制備本發(fā)明的生物芯片試劑盒時(shí)，本實(shí)施例中所用生物芯片選自上述實(shí)施例制備的本發(fā)明的生物芯片。
2).制備生物芯片標(biāo)記系統(tǒng)本實(shí)施例中，標(biāo)記系統(tǒng)為標(biāo)記物，其包含標(biāo)記探針分子和與之結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)。本實(shí)施例中，所用標(biāo)記探針分子為羊抗人二抗(北京天壇生物制品股份有限公司)和標(biāo)記用HBS Ab(北京大學(xué)人民醫(yī)院肝病研究所)；所用標(biāo)記物質(zhì)為羅丹明(Molecular probes公司)。
本實(shí)施例中，標(biāo)記物制備方法為公知的羅丹明標(biāo)記物的制備方法。如有必要純化，將混合產(chǎn)物滴入裝有凝膠的旋轉(zhuǎn)管，在4000r/min條件下離心，取收集管液體。
3).為生物芯片配置標(biāo)記系統(tǒng)本實(shí)施例中，制備本發(fā)明的生物芯片試劑盒時(shí)，為本發(fā)明的生物芯片配置的標(biāo)記系統(tǒng)要使得在進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)時(shí)有確定的標(biāo)記物濃度(以標(biāo)記探針分子濃度表示)。在本實(shí)施例制備的本發(fā)明的生物芯片試劑盒中，標(biāo)記物這樣配置，使得在進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)時(shí)標(biāo)記探針分子濃度在20ug/ml至0.05ug/ml之間選擇。
表10列出了本實(shí)施例制備的部份生物芯片試劑盒的組成。
表10

*參考表8**標(biāo)記時(shí)標(biāo)記探針分子濃度實(shí)施例7本發(fā)明的生物芯片的比較研究及應(yīng)用(1)本實(shí)施例中，用來研究的本發(fā)明的生物芯片選自實(shí)施例3.1制備的生物芯片。比較研究的一般方法為1).提供樣品在本實(shí)施例中，樣品分別為HCV抗體陽性血清，HIV1+2抗體陽性人血清，HBS Ag陽性血清，EBV抗體陽性血清，梅毒抗體陽性血清，和陰性血清(HCV抗體、HIV1+2抗體、HBS Ag和梅毒抗體都為陰性的血清)。所有的樣品均經(jīng)使用經(jīng)典的ELISA方法在血清10倍稀釋反應(yīng)條件下預(yù)先檢測(cè)。
2).提供對(duì)照芯片用作對(duì)照的生物芯片的片基一樣、制備方法一樣(參考實(shí)施例3.1)。在本實(shí)施例中，對(duì)照芯片包括
(1).不含納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的生物芯片(I類對(duì)照芯片)這種芯片與用來研究的本發(fā)明的生物芯片的制備方法基本相似，只是這種芯片是直接使用探針分子、而不是探針分子/納米粒子混合物來制成的，其上的探針點(diǎn)均為非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)。
(2).基于未活化納米粒子制備的生物芯片(II類對(duì)照芯片)這種芯片與用來研究的本發(fā)明的生物芯片的制備方法基本相似，只是這種芯片使用上述4種未經(jīng)化學(xué)改性的商品納米粒子與相應(yīng)探針分子制備探針分子/納米粒子混合物來制成，而不象本發(fā)明的生物芯片使用本發(fā)明的活化納米粒子與相應(yīng)探針分子制備探針分子/活化納米粒子混合物來制成。用作對(duì)照的生物芯片的片基一樣、制備方法一樣(參考實(shí)施例3.1)。
(3)基于弱活化納米粒子制備的生物芯片(III類對(duì)照芯片)這種芯片與用來研究的本發(fā)明的生物芯片的制備方法基本相似，只是這種芯片使用弱活化納米粒子(參考實(shí)施例1)與相應(yīng)探針分子制備探針分子/弱活化納米粒子混合物來制成，而不象本發(fā)明的生物芯片使用本發(fā)明的活化納米粒子與相應(yīng)探針分子制備探針分子/活化納米粒子混合物來制成。用作對(duì)照的生物芯片的片基一樣、制備方法一樣(參考實(shí)施例3.1)。
(4)選自實(shí)施例3.1制備的生物芯片(IV類對(duì)照芯片)(5)選自實(shí)施例3.2和3.3制備的生物芯片(V類對(duì)照芯片)3).芯片測(cè)試本實(shí)施例中，芯片測(cè)試方法如下(1).非流動(dòng)芯片的測(cè)試實(shí)驗(yàn)時(shí)將50倍稀釋測(cè)試樣品分別加入所述芯片的反應(yīng)池中。加樣量為5μl，37℃反應(yīng)30分鐘后用洗滌液沖洗。標(biāo)記物(常規(guī)濃度)加入量為5μl，37℃反應(yīng)30分鐘后用洗滌液沖洗。干燥后進(jìn)行掃描。掃描儀為共聚焦激光掃描儀(Afymetrix公司GMS 418芯片掃描儀)，掃描激發(fā)光波長532nm，發(fā)射光波長570nm，激光強(qiáng)度35/50-55/70，讀取的信號(hào)經(jīng)處理軟件(JAGUAR II)處理，然后取平均值后得到結(jié)果。
(2)流動(dòng)芯片的測(cè)試實(shí)驗(yàn)時(shí)，將50倍稀釋樣品加熱至37℃，以流速10-50ul/min加入芯片反應(yīng)器。加樣時(shí)間60分鐘。加樣后流速50-100ul/min加入洗液。然后取下基片再洗滌。再在每個(gè)反應(yīng)器加入標(biāo)記物(常規(guī)濃度)溶液，加入量約為10ul，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間5分鐘。標(biāo)記反應(yīng)后洗滌反應(yīng)器。干燥后進(jìn)行掃描。掃描儀為共聚焦激光掃描儀(Afymetrix公司GMS 418芯片掃描儀)，掃描激發(fā)光波長532nm，發(fā)射光波長570nm，激光強(qiáng)度35/50-55/70，讀取的信號(hào)經(jīng)處理軟件(JAGUARII)處理，然后取平均值后得到結(jié)果。
實(shí)施例7.1不同類芯片的比較本實(shí)施例中，含有納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的芯片，分別為上述II-V類比較芯片。這些芯片在點(diǎn)樣時(shí)的探針分子/不同活化程度納米粒子混合物中的物質(zhì)濃度相同納米粒子濃度(w/v)為0.5％；探針分子濃度(w/v)為0.20mg/ml。上述I類比較芯片不含納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)，點(diǎn)樣時(shí)的探針分子溶液濃度(w/v)為0.20mg/ml。其它制備條件相同。
所獲得的芯片檢測(cè)結(jié)果是使用同一樣品，IV類比較芯片的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，是在III類對(duì)照芯片的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的350％以上；在III類對(duì)照芯片的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，是在II類對(duì)照芯片的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的150％以上；在II類對(duì)照芯片的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，比I類對(duì)照芯片的非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值高。此外，在活化納米粒子具有相同類型和相同數(shù)量的偶合基團(tuán)的條件下，IV類比較芯片與V類比較芯片比較，其納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值要高150％以上、甚至有時(shí)高200％以上。
此結(jié)果說明，本發(fā)明的方法制備的生物芯片具有明顯提高的靈敏度，或以本發(fā)明的方法去制備生物芯片，可明顯降低探針分子的用量，這對(duì)生物芯片的制備，具有非?，F(xiàn)實(shí)的意義。
實(shí)施例7.2本發(fā)明的生物芯片間的比較在本發(fā)明的生物芯片中，有的僅含納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)，有的含兩種探針點(diǎn)(納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)和非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn))。
與實(shí)施例7.1中的結(jié)果一致，使用同一弱陽性樣品，在納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，是在非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的400％以上。但是，當(dāng)陽性樣品的陽性提高時(shí)，在納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)升值，不如在非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)升值明顯，尤其當(dāng)陽性樣品的陽性較高時(shí)更如此。
此結(jié)果說明，本發(fā)明的方法制備的含兩種探針點(diǎn)(納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)和非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn))的生物芯片，對(duì)于檢測(cè)不同的陽性值有特別的用處，尤其要進(jìn)行陽性比較時(shí)更如此。
在本發(fā)明的生物芯片中，還包括流動(dòng)芯片和非流動(dòng)芯片。在優(yōu)選條件下使用同一弱陽性樣品，在流動(dòng)芯片納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，可以是在非流動(dòng)芯片納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的300％以上?？赡苁窃诹鲃?dòng)芯片上的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)，比在非流動(dòng)芯片上的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)具有更加有利的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)條件。
實(shí)施例8本發(fā)明的生物芯片的比較研究及應(yīng)用(2)本實(shí)施例中，用來研究的本發(fā)明的生物芯片選自實(shí)施例3.2和3.3制備的生物芯片。比較研究的方法與實(shí)施例7中的方法相同。
本實(shí)施例中，所用對(duì)照芯片片基一樣、制備方法一樣(參考實(shí)施例3)。對(duì)照芯片包括(1).不含納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的生物芯片(I類對(duì)照芯片，參考實(shí)施例7)；(2).基于未活化納米粒子制備的生物芯片(II類對(duì)照芯片，參考實(shí)施例7)；(3)基于弱活化納米粒子制備的生物芯片(III類對(duì)照芯片，參考實(shí)施例7)，弱活化納米粒子中偶聯(lián)基團(tuán)的密度小于2.0umol/m2，(4)選自實(shí)施例3.2和3.3制備的生物芯片(IV類對(duì)照芯片)本實(shí)施例中，含有納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的芯片，分別為上述II-IV類比較芯片。這些芯片在點(diǎn)樣時(shí)的探針分子/納米粒子混合物中的物質(zhì)濃度相同納米粒子濃度(w/v)為0.5％；探針分子濃度(w/v)為0.20mg/ml。上述I類比較芯片不含納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)，點(diǎn)樣時(shí)的探針分子溶液濃度(w/v)為0.20mg/ml。其它制備條件相同。
所獲得的芯片檢測(cè)結(jié)果是使用同一樣品，IV類比較芯片的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，是在III類對(duì)照芯片的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的250％以上；在III類對(duì)照芯片的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，是在II類對(duì)照芯片的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的150％以上；在II類對(duì)照芯片的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，比I類對(duì)照芯片的非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值高。
此結(jié)果說明，本發(fā)明的方法制備的生物芯片具有明顯提高的靈敏度，或以本發(fā)明的方法去制備生物芯片，可明顯降低探針分子的用量，這對(duì)生物芯片的制備，具有非?，F(xiàn)實(shí)的意義。
此外，在優(yōu)選條件下使用同一弱陽性樣品，在流動(dòng)芯片納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，可以是在非流動(dòng)芯片納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的350％以上。
實(shí)施例9本發(fā)明的生物芯片的比較研究及應(yīng)用(3)本實(shí)施例中，用來研究的本發(fā)明的生物芯片選自實(shí)施例4制備的生物芯片。比較研究的方法與實(shí)施例7中的方法相同。
本實(shí)施例中，所用對(duì)照芯片片基一樣、制備方法一樣(參考實(shí)施例4)。對(duì)照芯片包括(1).基于未活化納米凸體制備的生物芯片(I類對(duì)照芯片，參考實(shí)施例4)，所用片基為實(shí)施例4中的納米結(jié)構(gòu)片基；(2)選自實(shí)施例4制備的含活化納米凸體的生物芯片(II類對(duì)照芯片)，所用片基為實(shí)施例4中的活化納米結(jié)構(gòu)片基。
本實(shí)施例中，芯片在點(diǎn)樣時(shí)的探針分子溶液濃度(w/v)，為0.20mg/ml。其它制備條件相同。
所獲得的芯片檢測(cè)結(jié)果是使用同一樣品，II類比較芯片的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，是在I類對(duì)照芯片的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的350％以上。此結(jié)果說明，本發(fā)明的方法制備的生物芯片具有明顯提高的靈敏度，或以本發(fā)明的方法去制備生物芯片，可明顯降低探針分子的用量，這對(duì)生物芯片的制備，具有非常現(xiàn)實(shí)的意義。
此外，在優(yōu)選條件下使用同一弱陽性樣品，在流動(dòng)芯片納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，可以是在非流動(dòng)芯片納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的250％以上。
實(shí)施例10本發(fā)明的生物芯片的比較研究及應(yīng)用(4)本實(shí)施例中，用來研究的本發(fā)明的生物芯片選自實(shí)施例5制備的生物芯片。比較研究的方法與實(shí)施例7中的方法相同。
本實(shí)施例中，所用對(duì)照芯片片基一樣、制備方法一樣(參考實(shí)施例5)。對(duì)照芯片包括(1).基于活化納米結(jié)構(gòu)片基和探針分子制備的生物芯片(I類對(duì)照芯片)，所用片基為實(shí)施例5中的活化納米結(jié)構(gòu)片基；(2)選自實(shí)施例5制備的生物芯片(II類對(duì)照芯片)，所用片基為實(shí)施例5中的活化納米結(jié)構(gòu)片基，且納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物。
本實(shí)施例中，芯片在點(diǎn)樣時(shí)的探針分子溶液濃度(w/v)為0.20mg/ml。其它制備條件相同。所獲得的芯片檢測(cè)結(jié)果是使用同一樣品，II類比較芯片的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，是在I類對(duì)照芯片的含納米結(jié)構(gòu)的探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的150％以上。此結(jié)果說明，本發(fā)明的方法制備的生物芯片具有明顯提高的靈敏度，或以本發(fā)明的方法去制備生物芯片，可明顯降低探針分子的用量，這對(duì)生物芯片的制備，具有非?，F(xiàn)實(shí)的意義。
此外，在優(yōu)選條件下使用同一弱陽性樣品，在流動(dòng)芯片納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值，可以是在非流動(dòng)芯片納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)上獲得的信號(hào)值的250％以上。
實(shí)施例11本發(fā)明的生物芯片試劑盒的比較研究及應(yīng)用本實(shí)施例中，提供的樣品和芯片測(cè)試方法與實(shí)施例7相同。本實(shí)施例中，所用生物芯片試劑盒分別為本發(fā)明的生物芯片試劑盒(參考實(shí)施例9)。試劑盒不同之處在于所用標(biāo)記系統(tǒng)不同(即所提供物溶液標(biāo)記時(shí)標(biāo)記探針分子濃度分別為20、5、2、0.5ug/ml。
對(duì)大多數(shù)情況而言，使用5ug標(biāo)記探針分子/ml的標(biāo)記系統(tǒng)的試劑盒，與使用20ug標(biāo)記探針分子/ml的標(biāo)記系統(tǒng)的試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相同；對(duì)多數(shù)情況而言，使用2ug標(biāo)記探針分子/ml的標(biāo)記系統(tǒng)的試劑盒，與使用20ug標(biāo)記探針分子/ml的標(biāo)記系統(tǒng)的試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相同；對(duì)部份情況而言，即使使用0.5ug標(biāo)記探針分子/ml的標(biāo)記系統(tǒng)的試劑盒，也與使用20ug標(biāo)記探針分子/ml的標(biāo)記系統(tǒng)的試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相同。
此結(jié)果說明，本發(fā)明的含低濃度標(biāo)記探針分子的標(biāo)記系統(tǒng)的試劑盒，所用標(biāo)記探針分子更少。
權(quán)利要求
1.一種生物芯片，至少包括片基和在片基上的一個(gè)以上的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)，該納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)含有活化納米結(jié)構(gòu)，并在活化納米結(jié)構(gòu)上固定有探針分子，其特征在于a.在納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)中，所述活化納米結(jié)構(gòu)的分布密度大于1個(gè)活化納米結(jié)構(gòu)/μm2、優(yōu)選大于5個(gè)活化納米結(jié)構(gòu)/μm2；和b.所述活化納米結(jié)構(gòu)，含有納米結(jié)構(gòu)、共價(jià)鍵合在納米結(jié)構(gòu)上的偶聯(lián)基團(tuán)、共價(jià)鍵合在偶聯(lián)基團(tuán)上的活化基團(tuán)，且所述活化基團(tuán)選自a).-NH2；b).通式為-RNH2的基團(tuán)；和c).不含-NH2的有機(jī)基團(tuán)，其中(1).所述R為有機(jī)基團(tuán)；(2).所述活化納米結(jié)構(gòu)中當(dāng)所述活化基團(tuán)選自-NH2或/和不含-NH2的有機(jī)基團(tuán)時(shí)，所述偶聯(lián)基團(tuán)在其表面上的平均分布密度大于1.85μmol/m2，或/和所述活化基團(tuán)在其表面上的平均分布密度大于1.85μmol/m2。
2.按照權(quán)利要求1所述的生物芯片，其特征在于所述通式為-RNH2的基團(tuán)包括氨基肼基團(tuán)。
3.按照權(quán)利要求1所述的生物芯片，其特征在于所述通式為-RNH2的基團(tuán)包括氨基酸基團(tuán)。
4.按照權(quán)利要求2或3所述的生物芯片，其特征在于所述通式為-RNH2的基團(tuán)在活化納米結(jié)構(gòu)表面上的平均分布密度大于0.5μmol/m2。
5.按照權(quán)利要求1所述的生物芯片，其特征在于所述不含-NH2的有機(jī)基團(tuán)包括醛基。
6.按照權(quán)利要求1所述的生物芯片，其特征在于所述不含-NH2的有機(jī)基團(tuán)包括環(huán)氧基。
7.按照權(quán)利要求1-6之一所述的生物芯片，其特征在于a).所述片基包括納米結(jié)構(gòu)片基，其中所述納米結(jié)構(gòu)片基含有納米結(jié)構(gòu)區(qū)，并在該結(jié)構(gòu)區(qū)有納米凸體，并且納米凸體的分布密度大于1個(gè)納米凸體/μm2，優(yōu)選納米凸體的分布密度大于5個(gè)納米凸體/μm2；和b).所述活化納米結(jié)構(gòu)包括活化納米凸體，其中所述活化納米凸體含有所述納米凸體、共價(jià)鍵合在納米凸體上的所述偶聯(lián)基團(tuán)、共價(jià)鍵合在偶聯(lián)基團(tuán)上的所述活化基團(tuán)。
8.按照權(quán)利要求1-6之一所述的生物芯片，其特征在于a).所述片基包括非納米結(jié)構(gòu)片基；和b).所述活化納米結(jié)構(gòu)包括活化納米粒子，其中所述活化納米粒子含有納米粒子、共價(jià)鍵合在納米粒子上的所述偶聯(lián)基團(tuán)、共價(jià)鍵合在偶聯(lián)基團(tuán)上的所述活化基團(tuán)。
9.按照權(quán)利要求1-6之一所述的生物芯片，其特征在于a).所述片基包括納米結(jié)構(gòu)片基，其中所述納米結(jié)構(gòu)片基含有納米結(jié)構(gòu)區(qū)，并在該結(jié)構(gòu)區(qū)有納米凸體，并且納米凸體的分布密度大于1個(gè)納米凸體/μm2、優(yōu)選納米凸體的分布密度大于5個(gè)納米凸體/μm2；和b).所述活化納米結(jié)構(gòu)包括活化納米粒子，其中所述活化納米粒子含有納米粒子、共價(jià)鍵合在納米粒子上的所述偶聯(lián)基團(tuán)、共價(jià)鍵合在偶聯(lián)基團(tuán)上的所述活化基團(tuán)。
10.按照權(quán)利要求1-9之一所述的生物芯片，其特征在于所述生物芯片包括流動(dòng)式生物芯片。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10之一所述的生物芯片，其特征在于所述生物芯片還含有非納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)。
12.根據(jù)權(quán)利要求8-11之一所述的生物芯片，其特征在于其中所述納米粒子包括無機(jī)納米粒子。
13.根據(jù)權(quán)利要求8-12之一所述的生物芯片，其特征在于其中所述活化納米粒子與片基含有相同的所述活化基團(tuán)。
14.一種制備權(quán)利要求1-13所述生物芯片的方法，至少含以下步驟第一步，提供所述納米結(jié)構(gòu)、偶聯(lián)基團(tuán)和活化基團(tuán)，并制備所述活化納米結(jié)構(gòu)；第二步，提供所述探針分子和第一步制備出來的活化納米結(jié)構(gòu)，并制備所述納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)。
15.按照權(quán)利要求14所述的生物芯片的制備方法，其特征在于所述制備出的活化納米結(jié)構(gòu)，包括所述活化納米凸體。
16.接照權(quán)利要求14所述的生物芯片的制備方法，其特征在于所述制備出的活化納米結(jié)構(gòu)，包括活化納米粒子，并至少含有以下步驟第一步，提供所述探針分子和所制備出的活化納米粒子，并制備含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物；第二步，提供所述片基和第一步所制備出的含探針分子/活化納米粒子的制備物，并制備所述納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)。
17.按照權(quán)利要求16所述的生物芯片的制備方法，其特征在于其中在所述含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物中，未固定探針分子的含量小于探針分子總量的50％。
18.按照權(quán)利要求16或17所述的生物芯片的制備方法，其特征在于其中所述含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物中，非親和納米粒子的含量小于納米粒子總量的50％。
19.按照權(quán)利要求16-18之一所述的生物芯片的制備方法，其特征在于所述制備出的活化納米粒子，含有納米粒子、共價(jià)鍵合在納米粒子上的所述偶聯(lián)基團(tuán)、共價(jià)鍵合在偶聯(lián)基團(tuán)上的所述活化基團(tuán)。
20.按照權(quán)利要求16-18之一所述的生物芯片的制備方法，其特征在于所述制備出的含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物，其中未固定探針分子的含量小于探針分子總量的50％。
21.按照權(quán)利要求16-18之一所述的生物芯片的制備方法，其特征在于所述制備出的含探針分子/活化納米粒子復(fù)合物的制備物，其中非親和納米粒子的含量小于納米粒子總量的50％。
22.一種生物芯片試劑盒，其特征在于在該試劑盒內(nèi)包含有權(quán)利要求1-13之一所述的生物芯片。
23.按照權(quán)利要求22所述的生物芯片試劑盒，其特征在于在該試劑盒中還有標(biāo)記系統(tǒng)，且所述標(biāo)記系統(tǒng)如此配置使得在進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)時(shí)，其標(biāo)記物的標(biāo)記探針分子濃度小于5ug/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開含納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)的生物芯片，包括片基和其上的納米結(jié)構(gòu)探針點(diǎn)，該探針點(diǎn)含活化納米結(jié)構(gòu)及固定在該結(jié)構(gòu)上的探針分子，特征是在該探針點(diǎn)中活化納米結(jié)構(gòu)分布密度大于1個(gè)活化納米結(jié)構(gòu)/μm
文檔編號(hào)G01N35/00GK101046472SQ20061002063
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者鄒方霖, 王建霞, 陳春生 申請(qǐng)人:成都夸常醫(yī)學(xué)工業(yè)有限公司