專利名稱：梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物學和免疫學領域，涉及一種微生物檢測組合物及其方法，特別是涉及一種梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑及其制備方法。
背景技術：
引起梅毒病的病原體是梅毒螺旋體(Treponemal Pallidum)，是1905年Schandim和Hoffman首先發(fā)現(xiàn)的。梅毒螺旋體長約6～15微米，寬0.1～0.25微米，呈螺旋形，在未受外界因素影響時，螺旋是規(guī)則的。這種病原體通過粘膜或有破損的皮膚進入人體后，在人體內(nèi)可長期以橫斷分裂的方式，一分為二地進行繁殖。可經(jīng)淋巴系統(tǒng)及血液循環(huán)播散到全身，幾乎可以侵犯全身各臟器和組織。如果感染未在初期得到治療，則大部分的患者會發(fā)展成梅毒的慢性階段。到后期，細菌將損害心臟、眼睛、大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼、關節(jié)或身體的幾乎任何部位。可引起嚴重的心臟異常、失明、精神紊亂、其它神經(jīng)性問題等，甚至導致死亡。由于梅毒感染的后期具有如此嚴重的后果，因此對其早期進行診斷是十分必要的。然而，梅毒感染因其早期癥狀與很多其它疾病相似，所以，醫(yī)生通常不會依據(jù)梅毒的征兆和癥狀識別，而是進行梅毒細菌的顯微鑒定和血液檢驗。
梅毒螺旋體有吸附宿主蛋白的特性，此特性對于宿主-寄生物之間的相互作用是很重要的，特別是使螺旋體能持續(xù)存在于受感染的宿主中。在早期病人體內(nèi)各處如血液、內(nèi)臟以及病損處的分泌物，還有乳汁、唾液、尿和精液中均可找到它。但梅毒螺旋體因其透明不易染色，所以又稱蒼白螺旋體，采用一般染色方法不易見到，要用暗視野顯微鏡或經(jīng)嗜銀染色或熒光抗體法才可見到?？墒?，所述暗視野顯微鏡檢查等方法需要相當?shù)慕?jīng)驗和技巧并且容易產(chǎn)生錯誤判斷。鑒于上述原因，大部分梅毒病例采用血清學診斷。然而，目前一般性的血液檢驗主要是檢測梅毒抗體，不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染。即使檢測到抗體的存在也不能說明病人是否攜帶梅毒病原體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的檢測試劑，直接特異性的快速準確檢測人體液、分泌物、培養(yǎng)物中的梅毒螺旋體或其碎片，同時提供該試劑的具體制備方法和便于操作使用的試劑盒。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明是用膠體金免疫層析檢測技術，直接特異性的檢測人體液、分泌物、培養(yǎng)物中的梅毒螺旋體或其碎片。其中梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑，是由快速檢測試紙條所組成，快速檢測試紙條的結(jié)構包括載體板、硝酸纖維素膜、吸液(紙)條、膠體金標記物、對照線、梅毒螺旋體抗原檢測線、加樣墊。其中，載體板上粘貼硝酸纖維素膜，該膜的上部粘貼一個吸液(紙)條，下部粘貼預包被了抗梅螺旋體抗體的膠體金標記物。硝酸纖維素膜的中間段從上至下依次排列有對照線、梅毒螺旋體抗原檢測線。載體板的最下端粘貼加樣墊，加樣墊的前端粘貼在膠體金標記物上。其中梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑的配方為0.5-1.5％金酸溶液、15-25％BSA溶液、1.5-2.5％檸檬酸三鈉溶液、檢測線溶液、對照線溶液、金標記物凍干基礎液。
其制備方法包括1、用正辛酸法純化包被用梅毒螺旋體單克隆抗體；2、制備膠體金標記抗梅毒螺旋體單克隆抗體；3、采用方陣滴定法選擇最佳包被抗體的濃度、最佳金標記抗體的工作濃度；4、制備梅毒螺旋體抗原檢測線、對照線；5、粘貼；6、切條；7、質(zhì)控；8、包裝。
本發(fā)明所述的試劑盒，是內(nèi)裝快速檢測試紙條的卡式試劑盒，在盒體上設置有加樣孔和觀察窗口。
本發(fā)明直接測定梅毒螺旋體，比起現(xiàn)在廣泛使用的間接測定梅毒螺旋體抗體的方法，更具臨床意義。而且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。


圖1為快速檢測試紙條結(jié)構示圖之一圖2為快速檢測試紙條結(jié)構示圖之二圖3為卡式試劑盒結(jié)構示圖其中1載體板(PVC底板) 2硝酸纖維素膜(NC膜) 3吸液(紙)條(吸收墊) 5對照線(C帶) 6梅毒抗原檢測線(T帶) 7膠體金標記物(膠體金墊) 8加樣墊(樣品吸收墊) 9觀察窗口 10加樣孔 11盒體具體實施方式
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細闡述。
快速診斷試紙條技術是20世紀九十年代以來在單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術。近年來該技術發(fā)展迅速，在生物醫(yī)學領域特別是醫(yī)學檢驗中對疾病的早期診斷和早期發(fā)現(xiàn)中的廣泛應用。本發(fā)明系采用純化抗梅毒螺旋體單克隆抗體包被的硝酸纖維素膜和凍干的金標記抗梅毒螺旋體單克隆抗體制成，應用膠體金免疫層析技術，以雙抗原夾心的方式特異性的檢測人體液、分泌物、培養(yǎng)物中的梅毒螺旋體或其碎片。
參照圖1、圖2，本發(fā)明的試劑是由快速檢測試紙條所組成，快速檢測試紙條的結(jié)構包括載體板1(又稱PVC底板)、硝酸纖維素膜2(又稱NC膜)、吸液(紙)條3(又稱吸收墊)、膠體金標記物7(又稱膠體金墊)、對照線5(又稱C帶)、梅毒螺旋體抗原檢測線6(又稱T帶)、加樣墊8(又稱樣品吸收墊)。其中，載體板1上粘貼硝酸纖維素膜2，該膜的上部粘貼一個吸液(紙)條3，下部粘貼預包被了抗梅螺旋體抗體的膠體金標記物7。硝酸纖維素膜2的中間段從上至下依次排列有對照線5、梅毒螺旋體抗原檢測線6。載體板1的最下端粘貼加樣墊8，加樣墊8的前端粘貼在膠體金標記物7上。載體板1通常由高分子(如聚氯乙烯，PVC)材料制成。硝酸纖維素膜2的上端的吸液(紙)條3，用于吸收反應液體。最下端的加樣墊8一般由玻璃纖維構成，玻璃纖維的作用是用于承載待測樣本。待測樣本溶解預先包埋在玻璃纖維前端的膠體金標記抗梅毒螺旋體單克隆抗體，待測樣本及溶解后的金標記抗梅毒螺旋體單克隆抗體，在毛細作用下，通過硝酸纖維素膜，到達吸液(紙)條，并在硝酸纖維素膜上完成反應。
其中梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑的配方為1％金酸溶液(1、氯酸1.0g 2、溶解于超純水中，定容至100ml)20％BSA溶液(1、BSA 20g 2、疊氮鈉0.02g 3、溶解于100ml超純水中)2％檸檬酸三鈉溶液(1、檸檬酸三鈉2g 2、溶解于100ml超純水中 3、疊氮鈉0.02g)檢測線溶液(1、1mg/ml抗梅毒螺旋體單克隆抗體 2、用10mM溶液pH8.0 Tris-HCl定容)對照線溶液(1、羊抗鼠抗體1mg/ml 2、用10mM pH8.0 Tris-HCl溶液定容)金標記物凍干基礎液(1、Trizma 1.21g 2、溶解于100ml超純水中 3、PVP 0.25g 4、氯化鈉0.45g 5、疊氮鈉0.02g 6、蔗糖2g 7、20％BSA 1ml)。
其制備方法包括1、辛酸法純化包被用梅毒螺旋體單克隆抗體。
是用PBS調(diào)單抗(SAS純)濃度、加入10mM醋酸、按比例加入正辛酸混勻，經(jīng)攪拌、放置、離心，上清液轉(zhuǎn)移到透析袋中，對10mMKPBS PH7.4透析，將透析物加入飽和硫酸銨，繼續(xù)經(jīng)攪拌、離心、沉淀，以少量10mMPBS復溶，對10mMPBS PH7.2透析，透析結(jié)束后測蛋白濃度。具體方法是用PBS將單抗(SAS純)濃度調(diào)至8～10mg/ml，置攪拌器上攪拌迅速加入兩倍體積的10mM醋酸。隨即按每ml加入0.025ml ml正辛酸的比例加入正辛酸，迅速混勻。中速攪拌，置室溫20分鐘，置4℃30分鐘。10000轉(zhuǎn)，0～4℃離心15分鐘。離心結(jié)束，上清迅速轉(zhuǎn)移到透析袋中。立即對10mMKPBS PH7.4透析。1小時后，將透析袋取出，用超純水沖洗燒杯和透析袋三次。10mMKPBSPH7.4透析過夜。10mMKPBS PH7.4透析2～4小時。將透析物小心取出，攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨至50％飽和度，繼續(xù)攪拌30分鐘以上，10000轉(zhuǎn)離心15分鐘，沉淀以少量10mMPBS復溶，對10mMPBS PH7.2透析，2～4小時換液一次(可過夜)，換液5～6次，透析結(jié)束后測蛋白濃度。
2、制備膠體金標記抗梅毒螺旋體單克隆抗體。
制備膠體金標記抗梅毒螺旋體單克隆抗體，包括膠體金顆粒的制備方法取HAuCl4溶液，加入到水中，加熱至沸，再加入檸檬酸三鈉，混合煮沸，冷卻后加入碳酸鉀溶液備用；取膠體金溶液，用K2CO3調(diào)pH值；用超純水稀釋純化的梅毒螺旋體單克隆抗體，加入膠體金溶液中并經(jīng)攪拌、靜置，加入牛血清白蛋白、PEG20000，攪拌、靜置、離心，吸去上清液，沉淀物溶于金標記物保護液，保存?zhèn)溆?；膠體金標記后的抗體加入金標記物凍干基礎液中，配制成適當濃度，加入適當保護劑噴涂于玻璃纖維表面，凍干后干燥條件下保存。具體方法可根據(jù)Frens于1973介紹的膠體金顆粒的制備方法取4ml 1％ HAuCl4溶液，加入到96ml水中，加熱至沸，再加入0.5～4ml 2％檸檬酸三鈉，混合煮沸15分鐘，直到顏色變?yōu)槌燃t。冷卻后加入1ml 1M碳酸鉀溶液備用。
量取膠體金溶液100ml，用0.2M K2CO3調(diào)至pH 8.2；用20ml超純水稀釋純化的梅毒螺旋體單克隆抗體4mg(事先用10mM pH 7.4 Tris-HCl充分透析)?？焖贁嚢柘录尤肽z體金溶液中并繼續(xù)攪拌30分鐘。靜置1小時。加入20％牛血清白蛋白2.5ml，20％PEG20000 1ml。攪拌30分鐘。靜置2小時。以9000r/min離心8分鐘。小心吸去上清液，沉淀物即為初步純化的金-梅毒抗體結(jié)合物。沉淀物溶于10ml金標記物保護液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 膠體金標記后的抗體加入金標記物凍干基礎液中，配制成適當濃度，加入適當保護劑噴涂于玻璃纖維表面，凍干后干燥條件下保存。
3、采用方陣滴定法選擇最佳包被抗體的濃度，最佳金標記抗體的工作濃度。固定浸泡時間，調(diào)整金標梅毒螺旋體單克隆抗體的濃度，將玻璃纖維紙浸入金標梅毒螺旋體單克隆抗體包被液中，浸泡均勻后，凍干，按正常生產(chǎn)工藝組裝試劑條，以陽性待測物加樣比較不同包被濃度的靈敏度高低。
金標梅毒螺旋體單克隆抗體稀釋度達到1∶20，陽性待測物質(zhì)的檢出時間即已符合設計要求。
4、制備梅毒螺旋體抗原檢測線、對照線。
用于包被和金標記的梅毒螺旋體單克隆抗體ELISA效價應不低于1∶10000倍稀釋。在確定包被抗體的濃度后，配制適當濃度的純化抗梅毒螺旋體單克隆抗體，在NC膜上制備檢測線，室溫干燥；配制適當濃度的羊抗鼠多克隆抗體，在NC膜上制備對照線。制備好的包被膜置室溫干燥保存。
5、粘貼--將各組分包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙按序粘貼在底板上。
6、切條--將底板切成一定寬度如3-4mm的試紙條。
7、質(zhì)控--用標準品和檢測儀測試試紙條的質(zhì)量。
8、包裝--將試紙條密封入鋁箔袋或裝入塑料外殼后再密封。
本發(fā)明是基于已知的膠體金免疫層析技術而設計的。其主要特征是，在所說的膠體金表面上，預包被抗梅毒螺旋體抗體。金包被物在適當條件下干燥并附著在玻璃纖維上。硝酸纖維素膜上對照線處包被可特異性結(jié)合包被在膠體金表面上的抗體或抗原的蛋白質(zhì)(即所謂的捕獲蛋白)。梅毒螺旋體抗原檢測線處包被抗梅毒螺旋體單克隆抗體。
參照圖3，可將圖1、圖2所示的快速檢測試紙條置于一個盒體11內(nèi)，盒體11可用塑料材料制成，即構成(正面)外觀如圖3所示的卡式試劑盒。由圖3可以看出，盒體11上有加樣孔10和觀察窗口9。由觀察窗口9向內(nèi)可以看到自上至下依次排列的如圖1所示的對照線5和梅毒螺旋體抗原檢測線6。
這樣的盒式結(jié)構可以更便于攜帶和使用，并且可以更大限度地防止污染。本試劑盒可用于正常人的健康普查、可疑病人的臨床檢驗、疫區(qū)人群和獻血人員的篩選等，而且簡便快速--一步法操作，不需任何附加設備，3至15分鐘即可出結(jié)果。準確可靠--特異性強，靈敏度高。經(jīng)濟高效--低成本高效益，保存方便，適用于醫(yī)院、衛(wèi)生防疫、診所、家庭等。由于本試劑盒結(jié)構簡單并且使用方便，所以可大大的節(jié)省檢驗所投入的人力和物力，從而有利于梅毒的防治。本方法直接測定梅毒螺旋體，比起現(xiàn)在廣泛使用的間接測定梅毒螺旋體抗體的方法，更具臨床意義。
檢測機理當使用本試劑盒檢測梅毒螺旋體抗原陽性樣本時，取待測樣本，人體液、分泌物、培養(yǎng)物約60ul，通過加樣孔10滴加于加樣墊8，樣本浸濕到玻璃纖維前端包被有膠體金標記的抗梅毒螺旋體單抗，并使之發(fā)生溶解，樣本中的梅毒螺旋體抗原與膠體金標記的抗梅毒螺旋體單抗特異性結(jié)合，形成復合物。由于吸液紙條的虹吸作用，復合物沿著硝酸纖維素膜2向前(遠端)移動，一直到達硝酸纖維素膜2上部的吸液(紙)條3。當復合物沿硝酸纖維素膜2移動，途經(jīng)梅毒螺旋體抗原檢測線6時，即與檢測線6上預包被的抗梅毒螺旋體單克隆抗體結(jié)合形成“膠體金-抗梅毒螺旋體單克隆抗體-梅毒螺旋體抗原-抗梅毒螺旋體單克隆抗體-固相支持物NC膜”夾心結(jié)合物。由于膠體金微粒本身帶有顏色，且聚集在檢測線6處，使梅毒抗原檢測線6呈現(xiàn)清晰可辨的有色線條。未結(jié)合的膠體金-抗梅毒螺旋體單克隆抗體標記物與對照線5處包被的捕獲蛋白結(jié)合而富集在對照線處，使對照線5呈現(xiàn)清晰可辨的有色線條，被試的陰性樣品只在對照線5處顯色。
權利要求
1.一種梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑，是由快速檢測試紙條所組成，其特征在于，快速檢測試紙條的結(jié)構包括載體板(1)、硝酸纖維素膜(2)、吸液(紙)條(3)、膠體金標記物(7)、對照線(5)、梅毒螺旋體抗原檢測線(6)、加樣墊(8)，其中，載體板(1)上粘貼硝酸纖維素膜(2)，該膜的上部粘貼一個吸液(紙)條(3)，下部粘貼預包被了抗梅螺旋體抗體的膠體金標記物(7)，硝酸纖維素膜(2)的中間段從上至下依次排列有對照線(5)、梅毒螺旋體抗原檢測線(6)，載體板(1)的最下端粘貼加樣墊(8)，加樣墊(8)的前端粘貼在膠體金標記物(7)上。
2.根據(jù)權利要求1的梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑，其特征在于，包括如下試劑配方0.5-1.5％金酸溶液、15-25％BSA溶液、1.5-2.5％檸檬酸三鈉溶液、檢測線溶液、對照線溶液、金標記物凍干基礎液。
3.根據(jù)權利要求2的梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑，其特征在于，所述的試劑配方為1％金酸溶液、20％BSA溶液、2％檸檬酸三鈉溶液、檢測線溶液、對照線溶液、金標記物凍干基礎液。
4.一種梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑的制備方法，其特征在于，包括如下工藝流程(1)、用正辛酸法純化包被用梅毒螺旋體單克隆抗體；(2)、制備膠體金標記抗梅毒螺旋體單克隆抗體；(3)、采用方陣滴定法選擇最佳包被抗體的濃度，最佳金標記抗體的工作濃度；(4)、制備梅毒螺旋體抗原檢測線、對照線；(5)、粘貼；(6)、切條；(7)、質(zhì)控；(8)、包裝。
5.根據(jù)權利要求4的梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述的用正辛酸法純化包被用梅毒螺旋體單克隆抗體，是用PBS調(diào)單抗(SAS純)濃度、加入10mM醋酸、按比例加入正辛酸混勻，經(jīng)攪拌、放置、離心，上清液轉(zhuǎn)移到透析袋中，對10mMKPBS PH7.4透析，將透析物加入飽和硫酸銨，繼續(xù)經(jīng)攪拌、離心、沉淀以少量10mMPBS復溶，對10mMPBS PH7.2透析，透析結(jié)束后測蛋白濃度。
6.根據(jù)權利要求4的梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述的制備膠體金標記抗梅毒螺旋體單克隆抗體，包括膠體金顆粒的制備方法取HAuCl4溶液，加入到水中，加熱至沸，再加入檸檬酸三鈉，混合煮沸，冷卻后加入碳酸鉀溶液備用；取膠體金溶液，用K2CO3調(diào)pH值；用稀釋純化的梅毒螺旋體單克隆抗體，加入膠體金溶液中并經(jīng)攪拌、靜置，加入牛血清白蛋白、PEG20000，攪拌、靜置、離心，吸去上清液，沉淀物溶于金標記物保護液，保存?zhèn)溆茫荒z體金標記后的抗體加入金標記物凍干基礎液中，配制成適當濃度，加入適當保護劑噴涂于玻璃纖維表面，凍干后干燥條件下保存。
7.根據(jù)權利要求4的梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述的采用方陣滴定法選擇最佳包被抗體的濃度，最佳金標記抗體的工作濃度，是將玻璃纖維紙浸入金標梅毒螺旋體單克隆抗體包被液中，浸泡均勻后，凍干，組裝試劑條，以陽性待測物加樣比較不同包被濃度的靈敏度高低；金標梅毒螺旋體單克隆抗體稀釋度達到1∶20，陽性待測物質(zhì)的檢出時間。
8.根據(jù)權利要求4的梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述的制備梅毒螺旋體抗原檢測線、對照線，是在確定包被抗體的濃度后，配制適當濃度的純化抗梅毒螺旋體單克隆抗體，在NC膜上制備檢測線，室溫干燥；配制適當濃度的羊抗鼠多克隆抗體，在NC膜上制備對照線，制備好的包被膜置室溫干燥保存。
9.一種梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑的試劑盒，其特征在于，是一種內(nèi)裝有快速檢測試紙條的卡式試劑盒，在盒體(11)上具有加樣孔(10)和觀察窗口(9)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種梅毒螺旋體抗原快速檢測試劑及其制備方法，該檢測試劑包括快速檢測試紙條，系采用純化抗梅毒螺旋體單克隆抗體包被的硝酸纖維素膜和凍干的金標記抗梅毒螺旋體單克隆抗體制成，應用膠體金免疫層析技術，以雙抗原夾心的方式特異性的檢測人體液、分泌物、培養(yǎng)物中的梅毒螺旋體或其碎片?？捎糜谠缙谠\斷梅毒感染患者，以便得到及時治療。本發(fā)明直接測定梅毒螺旋體，比現(xiàn)在廣泛使用的問接測定梅毒螺旋體抗體的方法，更具臨床意義。且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。并設計有試劑盒，攜帶和使用十分方便。
文檔編號G01N33/577GK1866019SQ20061004022
公開日2006年11月22日 申請日期2006年4月29日 優(yōu)先權日2006年4月29日
發(fā)明者吳學記 申請人:吳學記