專利名稱：重污染湖泊疏竣對底泥微生物生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能影響的評價方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及湖泊污染治理及水生生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)或重建，進(jìn)一步說是如何評價富營養(yǎng)化湖泊底泥生態(tài)疏浚的生態(tài)風(fēng)險，特別是一種重污染湖泊疏竣對底泥微生物生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能影響的評價方法。具體地說，是一種在湖泊進(jìn)行底泥疏竣前、疏浚期間和疏竣后，對由于疏竣工程給底泥微生物群落結(jié)構(gòu)與其功能帶來的影響進(jìn)行有效評價的檢測方法。
背景技術(shù)：
為了控制湖泊底泥污染，防止藍(lán)藻水華的發(fā)生，人們往往基于營養(yǎng)鹽是藍(lán)藻水花形成的重要因素的考慮，選用疏浚工程，作為去除底泥中積累的內(nèi)源營養(yǎng)鹽，減少藍(lán)藻水華的發(fā)生的方法之一。歐美和日本等國家的經(jīng)驗表明，環(huán)保疏浚不僅可以清除湖泊重污染水體中的污染底泥，同時也可為水生生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)或重建創(chuàng)造條件。但如果疏浚工藝不當(dāng)，將會出現(xiàn)嚴(yán)重的生態(tài)問題。環(huán)保疏浚的關(guān)鍵和難點在于如何科學(xué)確定疏浚過程給周邊湖泊環(huán)境帶來的生態(tài)風(fēng)險。目前我國幾乎沒有開展過此類的研究。
對湖泊進(jìn)行底泥疏浚，必須對不同疏浚工藝的實施在疏浚期間以及疏浚之后對周邊湖區(qū)環(huán)境將要產(chǎn)生的生態(tài)風(fēng)險進(jìn)行評估。但是由于在重污染湖區(qū)，長期的惡劣環(huán)境，導(dǎo)致生物群落受到很大沖擊，因此運用一般的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)方法進(jìn)行此類工程的生態(tài)風(fēng)險評估，很難采集到必要的樣品進(jìn)行分析，難以達(dá)到預(yù)期目的，需要針對重污染湖區(qū)狀況，探索具有針對性和可適用性的檢測和評價技術(shù)。
目前國內(nèi)外還沒有規(guī)范的評價富營養(yǎng)化湖泊的底泥疏浚所產(chǎn)生的潛在的生態(tài)風(fēng)險的評估檢測與實驗技術(shù)。人們?yōu)榱肆私馐杩９こ痰纳鷳B(tài)風(fēng)險，一般需要選用湖泊環(huán)境中的浮游生物、底棲動物以及底棲微生物群落的種群結(jié)構(gòu)變化來表征疏浚工程對水生生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和環(huán)境要素的改變。但是這種技術(shù)應(yīng)用在底泥疏浚的生態(tài)風(fēng)險的評價方面不是太適用。因為湖水水體本身是流動的，是一個開放的系統(tǒng)，而且本來浮游生物群落的結(jié)構(gòu)也存在季節(jié)和年度變化，因此在較短時間內(nèi)無法區(qū)分浮游生物群落結(jié)構(gòu)的變化是由于疏浚工程引起的還是其本身的季節(jié)或年度變化的結(jié)果；底棲動物的群落組成雖然相對比較穩(wěn)定，但是其在重污染湖區(qū)一般生物量都比較稀少，很小的樣本使得利用傳統(tǒng)的生態(tài)學(xué)方法所得到的評價結(jié)果的可信度下降；而微生物的群落組成的檢測，目前一般采用在野外采樣后室內(nèi)平板培養(yǎng)基的傳統(tǒng)技術(shù)，但是根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)，由于許多微生物無法在室內(nèi)的培養(yǎng)基上成活，至多只能得到原位環(huán)境中微生物種群的1％的信息。由于這些不確定的原因，導(dǎo)致了至今還沒有關(guān)于湖泊底泥疏浚的生態(tài)風(fēng)險評價的統(tǒng)一規(guī)范，因此也就無法對底泥疏浚在解決湖泊富營養(yǎng)化問題方面的效果和存在的風(fēng)險作出科學(xué)的評價?？梢?，在對重污染湖區(qū)的疏浚工程的生態(tài)風(fēng)險評估時，很有必要引入新的和更有效的檢測與分析方法，并進(jìn)行一系列的野外和室內(nèi)實驗?zāi)M研究，以預(yù)測和疏浚過程中可能出現(xiàn)的生態(tài)與環(huán)境問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種重污染湖泊疏竣對底泥微生物生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能影響的評價方法，其發(fā)明點在于借用公知的不飽和脂肪酸的生物標(biāo)志物分析和與營養(yǎng)鹽代謝有關(guān)的關(guān)鍵酶活性分析方法，以獲取更能真實反應(yīng)原位環(huán)境質(zhì)量信息，能在重污染湖區(qū)的富營養(yǎng)化湖泊的底泥疏竣前、疏竣期間和疏竣后，對由于疏竣工程給周邊湖區(qū)帶來的生態(tài)與環(huán)境變化的進(jìn)行明確和有效的評價，以指導(dǎo)疏浚工藝的選擇，并評價其可行性。
本發(fā)明的上述目的是這樣實現(xiàn)的重污染湖區(qū)富營養(yǎng)化湖泊疏竣對底泥微生物生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能影響的評價方法，其特征是選定不同疏浚工藝和深度的疏浚區(qū)，以及其臨近的未疏浚區(qū)，布設(shè)監(jiān)測點，采集底泥樣品，對疏浚區(qū)疏浚前后及其未疏浚湖區(qū)的底泥樣品進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)和底棲生態(tài)系統(tǒng)功能的變化檢測，分析疏浚前后底泥中不飽和脂肪酸和與營養(yǎng)鹽代謝有關(guān)的關(guān)鍵酶活性，以評價疏浚對湖泊底泥生態(tài)系統(tǒng)中主要營養(yǎng)元素循環(huán)的影響，確定底棲生態(tài)系統(tǒng)功能狀態(tài)。
步驟如下(1)利用脂肪酸分析法評價疏浚對底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響(a)樣品的采集疏浚前，至少進(jìn)行2次樣品的采集，作為湖水質(zhì)和沉積物的背景值；在疏浚過程中至少采樣2次，疏浚后至少每月采樣1次，整個采樣過程至少持續(xù)1年，采集表層1-5cm的沉積物樣品至少1kg，每點采集至少三個泥樣做平行處理，樣品密封冷藏運回室內(nèi)低溫保存，待分析；(b)脂肪酸的提取取相當(dāng)于1g干重的底泥于試管中，加入NaOH甲醇溶液后，熱提取至少30分鐘，然后冷卻至室溫；再加入HCl甲醇溶液，再次熱提取至少10分鐘后迅速冷卻至室溫；在上述試管中再加入1∶1的正己烷∶甲基叔丁醚溶劑1ml，充分?jǐn)噭踊旌?，靜止分層后取有機(jī)相；在試管中再加入2％NaOH水溶液對上述有機(jī)相提取物進(jìn)行堿洗，然后充分?jǐn)噭踊旌虾?，取出有機(jī)相于色譜采樣瓶中保存，待分析；(c)脂肪酸氣象色譜分析用氣相色譜儀、計算機(jī)及其相應(yīng)的應(yīng)用軟件，采用程序升溫的方法進(jìn)行，載氣為H2，N2，O2為助燃?xì)怏w；(d)結(jié)果確定用長鏈脂肪酸和相應(yīng)的甲脂標(biāo)準(zhǔn)品對照，得到疏浚前后底泥樣品中總脂肪酸含量的變化來表征湖泊底泥中微生物生物量變化；底泥樣品中脂肪酸種類的變化來表征湖泊底泥中微生物種群結(jié)構(gòu)的變化；(2)利用營養(yǎng)鹽代謝的關(guān)鍵酶活性評價疏浚湖泊底泥生態(tài)系統(tǒng)功能即物質(zhì)循環(huán)的影響(a)樣品的采集疏浚前，至少進(jìn)行2次樣品的采集，作為沉積物的背景值；在疏浚過程中至少采樣2次；疏浚后每月至少采樣1次，整個采樣過程至少持續(xù)1年，用底泥采樣器，采集表層1-5cm的沉積物樣品，每點至少采集三個泥樣做平行處理，樣品密封冷藏運回室內(nèi)低溫保存，待分析；(b)酶的提取取至少10g新鮮樣品于已滅菌的三角瓶加入無菌去離子水，用超聲波破碎器破碎，獲得1∶5底泥酶提取液；(c)酶活性的分析經(jīng)熒光素4-甲基傘形酮和7-氨基4-甲基香豆素染色標(biāo)記的底物化合物在水解酶的催化下分解，釋放出游離的熒光素MUF和AMC，用酶標(biāo)儀檢測底泥樣品中熒光素MUF和AMC生成速率，即可計算底泥樣品中相應(yīng)水解酶的代謝活性；(d)結(jié)果確定以單位時間內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化表示底泥樣品中水解酶活性；以水解酶活性的之間關(guān)系的變化表征底泥中微生物活性的大小及其種群的更替。
酶活性的分析具體方法是取一定體積的底泥酶提取液，加上相應(yīng)的底物溶液，再加pH＝7.0的Tris-HCl于熒光酶標(biāo)板微孔中，混勻后置于28±2℃溫度條件下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間依據(jù)所測定各微生物酶活性而定，至少2min，培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度變化速率，同時對每個底泥樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以計算熒光素MUF和AMC生成速率，以滅菌處理的底泥酶體液作空白對照，每個酶做三次重復(fù)，取三次重復(fù)的平均值。
本發(fā)明的優(yōu)點及效果本案選定不同疏浚工藝和深度的疏浚區(qū)，以及其臨近的未疏浚區(qū)，布設(shè)監(jiān)測點采集底泥樣品，對疏浚區(qū)疏浚前后及其未疏浚湖區(qū)的底泥樣品進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)和底棲生態(tài)系統(tǒng)功能的變化檢測。本案改變傳統(tǒng)的培養(yǎng)和形態(tài)鑒定方法，借用不飽和脂肪酸的生物標(biāo)志物分析方法，以解決目前一般野外采樣后在室內(nèi)平板培養(yǎng)技術(shù)無法得到所有微生物種群的問題；而通過檢測疏浚前后底泥中與營養(yǎng)鹽代謝有關(guān)的關(guān)鍵酶活性，以評價疏浚對湖泊底泥生態(tài)系統(tǒng)中主要營養(yǎng)元素循環(huán)的影響，來確定底棲生態(tài)系統(tǒng)功能狀態(tài)。本發(fā)明方法對重污染的富營養(yǎng)化湖泊疏浚工程所帶來的生態(tài)風(fēng)險進(jìn)行評估，在其他類似湖泊進(jìn)行疏浚前，可以利用該方法，進(jìn)行判斷與評估，以確定是否能疏浚，如何選擇疏浚工藝，并預(yù)測疏浚將帶來的生態(tài)風(fēng)險，可對于有關(guān)部門的決策提供重要依據(jù)。


圖1是本發(fā)明實施例疏浚前后底泥中中長鏈脂肪酸的組成表(峰面積百分比)；圖2是本發(fā)明實施例疏浚前后底泥中不同類型脂肪酸相對含量的變化；圖3是本發(fā)明實施例疏浚前后底泥中不同類型脂肪酸含量分布的主成分分析；圖4是本發(fā)明實施例底物試劑及其所測定的水解酶及其反應(yīng)底物表；圖5是本發(fā)明實施例底泥中關(guān)鍵性水解酶及其生態(tài)功能表；圖6是本發(fā)明實施例底泥疏浚前后碳水化合物水解酶活性變化；圖7是本發(fā)明實施例底泥疏浚前后酯類水解酶活性變化(酯酶活性未進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換)；圖8是本發(fā)明實施例底泥疏浚前后磷酸酶、蛋白酶和硫酸酶活性變化。
具體實施例方式
本發(fā)明在無錫五里湖進(jìn)行疏浚前后，通過取樣檢測底泥樣品中的脂肪酸種類，比較了底泥疏浚對五里湖底棲微生物群落構(gòu)成的影響。
(1)利用脂肪酸分析法評價疏浚對底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響疏浚前，需進(jìn)行2-3次樣品的采集，作為湖水質(zhì)和沉積物的背景值；在疏浚過程中采樣2-3次；疏浚后每月采樣一次，整個采樣過程持續(xù)1-2年。用柱狀底泥采樣器(直徑7cm)，采集表層(1-5cm)的沉積物樣品1kg。每點采集三個泥樣做平行處理。樣品裝入塑料袋中密封，保溫箱冷藏條件下運回室內(nèi)4℃下保存，待分析。取相當(dāng)于1g干重的底泥于帶teflon蓋的試管中(13×100mm)，然后進(jìn)行如下處理首先向試管中加入1ml的NaOH甲醇溶液(45gNaOH加150ml甲醇配制而成)，接著在100℃下水浴加熱30分鐘，然后將試管放在室溫的冷水中冷卻至室溫；在上述試管中加入2ml HCl甲醇溶液(6.0N HCl 325ml加275ml甲醇配制而成)，然后在80℃下水浴10分鐘，之后迅速冷卻至室溫。提取溶劑為1∶1正己烷∶methyl tert-butylether(甲基叔丁醚)(MTBE)，方法是在上述經(jīng)HCl處理的試管中加入1ml提取溶劑，充分?jǐn)噭踊旌?0分鐘，靜止分層后取有機(jī)相；堿洗在進(jìn)行色譜分析前，需要對上述有機(jī)相提取物進(jìn)行堿洗，方法是在試管中加入3ml 1.2％NaOH溶液(水)，然后充分?jǐn)噭踊旌?分鐘后，取出有機(jī)相于色譜采樣瓶中保存，待分析。
脂肪酸分析的儀器為HP-5890氣相色譜儀，計算機(jī)及其相應(yīng)的應(yīng)用軟件；色譜柱，HP-101毛細(xì)管色譜柱(25m×0.2mm)；FID檢測器。溫度條件采用程序升溫的方法，初始溫度為170℃，以5℃/min的速度升至250℃后，接著迅速升至310℃，在該溫度下保持2分鐘以免色譜柱被污染。氣體條件載氣為H2，N2，O2為助燃?xì)怏w，它們的流速依次為30，30，400ml/min。本方法所用的長鏈脂肪酸和相應(yīng)的甲脂為美國Sigma公司產(chǎn)品，做保留時間的對照。依據(jù)脂肪酸分析方法的原理來判定底泥疏浚對湖區(qū)底棲微生物群落的影響疏浚前后，用底泥樣品中總脂肪酸含量的變化來表征湖泊底泥中微生物生物量變化；底泥樣品中脂肪酸種類的變化來表征湖泊底泥中微生物種群結(jié)構(gòu)的變化。
疏浚前后底泥脂肪酸組成變化見圖1。由圖1可知，從疏浚前的兩個樣品中分別檢測出22，和21種脂肪酸，從疏浚后1，2，3和4個月樣品中分別檢測出12，12，15，17種脂肪酸；即疏浚后五里湖底泥中微生物脂肪酸的種類有所減少。由于脂肪酸對于不同生物在組成成分上可顯示出極大的差異，因此可推斷疏浚后五里湖底泥中微生物群落發(fā)生了變化(Zelleset al，1993；White et al，1979)。
疏浚前后，底泥樣品中各類脂肪酸含量如圖2所示。疏浚前，底泥樣品中羥基脂肪酸的百分含量為2.54±1.01，一元不飽和脂肪酸含量為7.44±0.92，直鏈脂肪酸含量為11.18±0.61，支鏈脂肪酸4.32±0.82，多元不飽和脂肪酸12.91±0.97；疏浚后，相應(yīng)各類脂肪酸含量分別為0.46±0.44、4.23±1.39、3.80±3.76、2.38±0.07、5.21±0.43。因此，疏浚后底泥中各類脂肪酸的含量均顯著降低。此外，疏浚前，底泥樣品中，多元不飽和脂肪酸的含量最高，其余依次為直鏈脂肪酸、一元不飽和脂肪酸、支鏈、羥基脂肪酸，其中羥基脂肪酸含量最低；疏浚后，各類脂肪酸的含量之間的關(guān)系也發(fā)生了相應(yīng)的變化。
由于一般情況下，不同微生物的細(xì)胞膜中所含脂肪酸化合物種類如下1細(xì)菌往往不含有多個不飽和鍵的脂肪酸，它含有的主要是鏈長為奇數(shù)的、帶支鏈的、主鏈上含有環(huán)丙基或羥基的脂肪酸；2真菌和氰化菌所合成的脂肪酸大多數(shù)含有多個不飽和鍵；3革蘭氏陽性菌含有較大比例的帶支鏈的脂肪酸；4革蘭氏陰性菌在其類酯多糖類A中含有較大比例的羥基脂肪酸；5還原菌可以合成縮醛酯類及鞘酯類化合物。
由此可知，疏浚前后，底泥中羥基不飽和脂肪酸、支鏈脂肪酸、多元不飽和脂肪酸等的含量變化，即表征者底泥中細(xì)菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌等微生物的生物量發(fā)生了變化。
為分析疏浚前后，底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，申請者采用主成分分析的方法對微生物在疏浚前后底泥樣品中的分布進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示。圖中，◇表示疏浚前底泥中包含的各種脂肪酸，▲表示疏浚后底泥中所包含的各種脂肪酸。可見，大部分脂肪酸與疏浚前底泥具有較高的相關(guān)性，即r≥0.5或r≤-0.5，主要包括羥基脂肪酸2-OH 10∶0、2-OH 16∶0、3-OH 14∶0，一元不飽和脂肪酸14∶1、16∶1、17∶1、18∶1和20∶1；直鏈飽和脂肪酸12∶0、15∶0、17∶0和18∶0；多元不飽和脂肪酸18∶2，20∶3，20∶4，20∶5。與疏浚后底泥具有良好相關(guān)性的脂肪酸相對較少，主要包括的羥基脂肪酸3-OH 14∶0，一元不飽和脂肪酸14∶1、15∶1、17∶1、18∶1，支鏈脂肪酸a15∶0和i16∶0，直鏈飽和脂肪酸12∶0、15∶0、17∶0、20∶0，多元不飽和脂肪酸18∶2，20∶2和20∶3。由此可見，疏浚前后底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了很大的變化。
如果對脂肪酸進(jìn)行氣相色譜分離分析的同時能夠借助微生物鑒定數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)(MIDI)，我們就可以將這些脂肪酸信息轉(zhuǎn)化為簡單的微生物種群信息，從而使研究結(jié)果得以簡單直觀的表達(dá)。目前，我們雖然未能利用底泥中脂肪酸的組成模式對其中微生物的組成簡單地加以定量、定性劃分，但是我們確實不僅可以利用其構(gòu)成模式作為指紋在橫向上評價底泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性；而且，我們也可以利用底泥中脂肪酸在時空上的差異來定性甚至半定量地評價其中微生物的動態(tài)變化。
結(jié)論由以上分析可知，疏浚不僅可減少五里湖底泥中微生物的的生物量，同時對其群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性具有較大的影響。鑒于底泥微生物群落在水體生態(tài)系統(tǒng)中的重要性，疏浚后底泥中微生物數(shù)量的減少或者群落的結(jié)構(gòu)的變更將會影響或改變底泥生態(tài)功能，從而對整個水體生態(tài)系統(tǒng)健全性和穩(wěn)定性產(chǎn)生潛在的風(fēng)險。
(2)利用營養(yǎng)鹽代謝的關(guān)鍵酶活性評價疏浚湖泊底泥生態(tài)系統(tǒng)功能即物質(zhì)循環(huán)的影響酶是生態(tài)過程的主要調(diào)節(jié)者，在物質(zhì)的降解，能量的轉(zhuǎn)化以及營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)中發(fā)揮重要作用。其中，水解酶被一致認(rèn)為在由大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物可利用小分子物質(zhì)過程中起重要的調(diào)控作用；因此，認(rèn)為其可以作為生態(tài)功能的生物標(biāo)記物。Kandeler et al(1996)和Dick(1994)等許多的研究者也相繼得出了類似的結(jié)論。
疏浚前，進(jìn)行了兩次樣品的采集，作為湖水質(zhì)和沉積物的背景值；在疏浚過程中采樣兩次；疏浚后每月采樣一次，整個采樣過程持續(xù)一年。用柱狀底泥采樣器(直徑7cm)，采集表層(1-5cm)的沉積物樣品1kg。每點采集三個泥樣做平行處理。樣品裝入塑料袋中密封，保溫箱冷藏條件下運回室內(nèi)4℃下保存，待分析。取10g新鮮樣品于已滅菌的250ml三角瓶(帶蓋子)加入50滅菌的去離子水用超聲波破碎器在50J·s-1功率下破碎120s，即為1∶5底泥酶提取液。供試試劑所用底物試劑及測定的水解酶如圖4所示。試驗原理是經(jīng)熒光素4-甲基傘形酮(MUF，4-Methylumbelliferyl)和7-氨基4-甲基香豆素(AMC，4-Methylumbelliferyl)染色標(biāo)記的底物化合物在水解酶的催化下分解，釋放出游離的熒光素MUF和AMC，用酶標(biāo)儀檢測底泥樣品中熒光素MUF和AMC生成速率，即可計算底泥樣品中相應(yīng)水解酶的代謝活性。方法是取100ul底泥酶提取液+20ul相應(yīng)的底物溶液(1mM)+80ul Tris-HCl(pH＝7.0)于熒光酶標(biāo)板微孔中(每個樣品4個平行)，混勻，然后置于28±2℃溫度條件下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間在2min-2hr，具體時間依據(jù)所測定各微生物酶活性而定，培養(yǎng)結(jié)束后，用Bio-Teck酶標(biāo)儀(USA)測定其熒光強(qiáng)度變化速率。同時對每個底泥樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以計算熒光素MUF和AMC生成速率，以滅菌處理的底泥酶體液作空白對照。每個酶做三次重，取三次重復(fù)的平均值。
測定條件溫度28±2℃，熒光素MUF激發(fā)/發(fā)射波長，355nm/460nm；熒光素AMC激發(fā)/發(fā)射波長340/430。
酶活性的定義是單位時間內(nèi)每克鮮樣中熒光素MUF或AMC產(chǎn)生的數(shù)量，單位為μmol·g-1sediment·min-1。
Marx等研究表明該方法操作簡便，靈敏度高，即便是在低熒光強(qiáng)度下，也檢測到熒光強(qiáng)度的變化，因此，該方法對底物濃度要求較低；且所測定的酶活性與實際情況比較接近。
以單位時間內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化表示底泥樣品中水解酶活性；以水解酶活性的之間關(guān)系的變化表征底泥中微生物活性的大小及其種群的更替。
本實施例所選的9種微生物水解酶涉及多糖、纖維素、酯類以及氨肽類等有機(jī)化合物的水解，并涉及到碳、磷、氮、硫等生物營養(yǎng)元素的循環(huán)。因此，研究這9種微生物水解酶在疏浚前后的生物活性變化，不僅可以了解疏浚前后底泥中微生物對各種有機(jī)質(zhì)的降解、消除能力，同時也可以判定疏浚對底泥微生態(tài)功能的影響。所選微生物水解酶及其生態(tài)功能如圖5所示。采用熒光分析法，對五里湖底泥疏浚前后9種與碳、氮、磷和硫循環(huán)有關(guān)的水解酶活性變化進(jìn)行了原位分析測定。
酶活性的定義是單位時間內(nèi)每克鮮樣中熒光素MUF或AMC產(chǎn)生的數(shù)量，單位為μmol·g-1sediment·min-1。
Marx等(2001)研究表明該方法操作簡便，靈敏度高，即便是在低熒光強(qiáng)度下，也檢測到熒光強(qiáng)度的變化，因此，該方法對底物濃度要求較低；且所測定的酶活性與實際情況比較接近。
結(jié)果如圖6-8所示。本案例的研究結(jié)果表明，底泥疏浚可導(dǎo)致絕大多數(shù)水解酶活性降低。這是由于水解酶是異養(yǎng)生物分泌的胞外酶，其活性的高低與分布，除環(huán)境因素影響外，主要與環(huán)境中生物種群的豐富度和多樣性密切相關(guān)，而疏浚去除了積蓄有大量微生物及其分泌物(胞外酶)表層生物膜，使得底泥中微生物數(shù)量及其相應(yīng)的胞外酶含量下降，有機(jī)質(zhì)降解代謝能力降低。
由圖6可知，疏浚對五里湖底泥中碳水化合物水解酶活性影響較大，疏浚后，α，β-D-葡萄糖苷酶和β-D-木糖苷酶的活性顯著降低。疏浚前，α，β-D-葡萄糖苷酶和β-D-木糖苷酶活性分別為26.69±3.15、27.76±1.56、33.73±7.12μmol·g-1sediment·min-1；在疏浚后一個月內(nèi)，這個三種水解酶的活性降到最低值，分別為6.58±0.69、7.10±0.84、7.60±0.47μmol·g-1sediment·min-1。其中，β-D-木糖苷酶影響程度最大，與疏浚前相比，其活性降低了77.5％。之后持續(xù)到一年的時間內(nèi)，盡管其各自催化活性有所升高，但是與疏浚后一個月相比，均未有顯著升高，即仍低于疏浚前其各自活性水平。由此可知，疏浚對五里湖底泥中碳水化合物水解酶及其相應(yīng)的微生物種群影響較大，且這種并不可在短時間內(nèi)得以恢復(fù)，即便是經(jīng)歷了季節(jié)的更替和溫度的變化。這說明疏浚對底泥中該類微生物水解酶的生物活性影響較大，對底泥表層生物膜及其生態(tài)功能的破壞性較強(qiáng)。
圖7表示了疏浚前后，五里湖底泥中脂肪類化合物水解酶活性變化，其中，Vmax分別表示乙酰酯酶、丁酰酯酶的活性的對數(shù)值，但對脂酶表示的是其活性的實測值。由圖4可知，與疏浚前后底泥中碳水化合物水解酶活性相比，疏浚對底泥中酯酶活性影響更大。疏浚后，乙酰酯酶和丁酰酯酶的活性分別最高可降低17和18個數(shù)量級，即該類水解酶活性的降低了99％以上。同樣，底泥疏浚對脂酶活性影響也相對較大，疏浚前，其活性為13.05±2.25μmol·g-1sediment·min-1，疏浚后，降至為6.17±μmol·g-1sediment·min-1。此外，ANOVA法顯著性檢驗表明，在疏浚后1個月、3個月、5個月、7個月和一年的各底泥樣品中，乙酰酯酶、丁酰酯酶和脂酶的活性均存在顯著差異。這說明隨著季節(jié)的更替，底泥中該類水解酶活性可發(fā)生較大的變化。分析其原因是由于該類水解酶的活性與水體中浮游藻類、藻類細(xì)菌的生物量有關(guān)(Mudryk & Skórczewski，2004)。
由圖8所示，疏浚對底泥中磷酸酶、蛋白酶和硫酸酯酶活性也存在顯著的影響。疏浚后一個月，底泥中磷酸酶活性最高可降低近6個數(shù)量級；蛋白酶降低了78.8％；硫酸酯酶降低了44.7％，受影響相對較低。并且，在疏浚后各底泥樣品中，這三種水解酶活性均顯著低于疏浚前其相應(yīng)的活性水平；且除磷酸酶在最后一次采樣中具有顯著降低外，這三種涉及磷、氮和硫等營養(yǎng)元素循環(huán)的水解酶并未有顯著變化。這同樣說明，底泥疏浚對五里湖底泥中磷酸酶、蛋白酶和硫酸酯酶影響較大，且這種影響作用在短時間內(nèi)難以恢復(fù)。
比較底泥疏浚前后各水解酶活性變化可知，疏浚對底泥中乙酰乙酯水解酶和丁酰抑制水解酶兩種酯酶活性影響最大，其次為磷酸酶和蛋白酶，對碳水化合物水解酶類的影響相對較小。分析其原因可能與各微生物水解酶及其相應(yīng)微生物種群在底泥不同深度中的分布特征有關(guān)(Wittman et al，2000)。此外，疏浚前后，底泥中部分水解酶之間的關(guān)系也發(fā)生了一定的改變。如，疏浚前，疏浚前，α，β-葡萄糖苷酶＞β-木糖酶＞硫酸酯酶＞脂酶；疏浚后，硫酸酯酶＞脂酶＞α，β-葡萄糖苷酶＞β-木糖酶。鑒于同微生物種群與其相應(yīng)的水解酶之間具有相對專一性，因此，底泥疏浚后水解酶之間的關(guān)系的變化表征了底泥中微生物種群發(fā)生了相應(yīng)的變化。
由以上分析可知，底泥疏浚對五里湖底泥微生態(tài)系統(tǒng)的功能以及微生物群落均有顯著的影響。通過分析研究疏浚前后五里湖底泥中微生物水解酶的生物活性變化，并對其進(jìn)行長期監(jiān)測，不僅可分析和評價底泥疏浚對水體生態(tài)系統(tǒng)的影響，同時也可了解疏浚后底泥微生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)情況。湖泊底泥表層的微生物膜是經(jīng)過眾多微生物群落長年富集、更替累積的形成的微生態(tài)系統(tǒng)，是湖泊生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)過漫長的演化的結(jié)果，是湖泊生態(tài)系物質(zhì)微生物降解和轉(zhuǎn)化的集中營。鑒于其在湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要性，該生物膜的去除和破壞必然會對湖泊生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)帶來嚴(yán)重的負(fù)面影響。
權(quán)利要求
1.重污染湖泊疏竣對底泥微生物生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能影響的評價方法，其特征是選定不同疏浚工藝和深度的疏浚區(qū)，以及其臨近的未疏浚區(qū)，布設(shè)監(jiān)測點，采集底泥樣品，對疏浚區(qū)疏浚前后及其未疏浚湖區(qū)的底泥樣品進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)和底棲生態(tài)系統(tǒng)功能的變化檢測，分析疏浚前后底泥中不飽和脂肪酸和與營養(yǎng)鹽代謝有關(guān)的關(guān)鍵酶活性，以評價疏浚對湖泊底泥生態(tài)系統(tǒng)中主要營養(yǎng)元素循環(huán)的影響，確定底棲生態(tài)系統(tǒng)功能狀態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是步驟如下(1)利用脂肪酸分析法評價疏浚對底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響(a)樣品的采集疏浚前，至少進(jìn)行2次樣品的采集，作為湖水質(zhì)和沉積物的背景值；在疏浚過程中至少采樣2次，疏浚后至少每月采樣1次，整個采樣過程至少持續(xù)1年，采集表層1-5cm的沉積物樣品至少1kg，每點采集至少三個泥樣做平行處理，樣品密封冷藏運回室內(nèi)低溫保存，待分析；(b)脂肪酸的提取取相當(dāng)于1g干重的底泥于試管中，加入NaOH甲醇溶液后，熱提取至少30分鐘，然后冷卻至室溫；再加入HCl甲醇溶液，再次熱提取至少10分鐘后冷卻至室溫；在上述試管中再加入1∶1的正己烷∶甲基叔丁醚溶劑1ml，充分?jǐn)噭踊旌?，靜止分層后取有機(jī)相；在試管中再加入2％NaOH水溶液對上述有機(jī)相提取物進(jìn)行堿洗，然后充分?jǐn)噭踊旌虾螅〕鲇袡C(jī)相于色譜采樣瓶中保存，待分析；(c)脂肪酸氣象色譜分析用氣相色譜儀、計算機(jī)及其相應(yīng)的應(yīng)用軟件，采用程序升溫的方法進(jìn)行，載氣為H2，N2，O2為助燃?xì)怏w；(d)結(jié)果確定用長鏈脂肪酸和相應(yīng)的甲脂標(biāo)準(zhǔn)品對照，得到疏浚前后底泥樣品中總脂肪酸含量的變化來表征湖泊底泥中微生物生物量變化；底泥樣品中脂肪酸種類的變化來表征湖泊底泥中微生物種群結(jié)構(gòu)的變化；(2)利用營養(yǎng)鹽代謝的關(guān)鍵酶活性評價疏浚湖泊底泥生態(tài)系統(tǒng)功能即物質(zhì)循環(huán)的影響(a)樣品的采集疏浚前，至少進(jìn)行2次樣品的采集，作為沉積物的背景值；在疏浚過程中至少采樣2次；疏浚后每月至少采樣1次，整個采樣過程至少持續(xù)1年，用底泥采樣器，采集表層1-5cm的沉積物樣品，每點至少采集三個泥樣做平行處理，樣品密封冷藏運回室內(nèi)低溫保存，待分析；(b)酶的提取取10g新鮮樣品于已滅菌的三角瓶加入無菌去離子水，用超聲波破碎器破碎，獲得1∶5底泥酶提取液；(c)酶活性的分析經(jīng)熒光素4-甲基傘形酮和7-氨基4-甲基香豆素染色標(biāo)記的底物化合物在水解酶的催化下分解，釋放出游離的熒光素MUF和AMC，用酶標(biāo)儀檢測底泥樣品中熒光素MUF和AMC生成速率，即可計算底泥樣品中相應(yīng)水解酶的代謝活性；(d)結(jié)果確定以單位時間內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化表示底泥樣品中水解酶活性；以水解酶活性的之間關(guān)系的變化表征底泥中微生物活性的大小及其種群的更替。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征是酶活性的分析具體方法是取一定體積的底泥酶提取液，加上相應(yīng)的底物溶液，再加pH＝7.0的Tris-HCl于熒光酶標(biāo)板微孔中，混勻后置于28±2℃溫度條件下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間依據(jù)所測定各微生物酶活性而定，至少2min，培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度變化速率，同時對每個底泥樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以計算熒光素MUF和AMC生成速率，以滅菌處理的底泥酶體液作空白對照，每個酶做三次重復(fù)，取三次重復(fù)的平均值。
全文摘要
重污染湖區(qū)富營養(yǎng)化湖泊疏竣對底泥微生物生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能影響的評價方法，其特征是選定不同疏浚工藝和深度的疏浚區(qū)，以及其臨近的未疏浚區(qū)，布設(shè)監(jiān)測點，采集底泥樣品，對疏浚區(qū)疏浚前后及其未疏浚湖區(qū)的底泥樣品進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)和底棲生態(tài)系統(tǒng)功能的變化檢測，分析疏浚前后底泥中不飽和脂肪酸和與營養(yǎng)鹽代謝有關(guān)的關(guān)鍵酶活性，以評價疏浚對湖泊底泥生態(tài)系統(tǒng)中主要營養(yǎng)元素循環(huán)的影響，確定底棲生態(tài)系統(tǒng)功能狀態(tài)。
文檔編號G01N21/64GK1865995SQ200610040288
公開日2006年11月22日 申請日期2006年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月12日
發(fā)明者孔繁翔, 范成新, 劉愛菊 申請人:中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所