專利名稱：氨濃度的測定方法及氨診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域內(nèi)對氨濃度的檢測，尤其涉及利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法測定氨濃度的方法，以及由此制得的氨診斷試劑盒，屬于氨濃度分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨測定的方法有微量擴(kuò)散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應(yīng)用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。
擴(kuò)散法是標(biāo)本堿化后，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應(yīng)形成棕黃色碘化雙汞胺進(jìn)行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準(zhǔn)確性和精密度受到影響，目前已很少應(yīng)用；離子交換法比擴(kuò)散法更準(zhǔn)確，CV為8％～13％；離子選擇電極法是利用NH3擴(kuò)散到電極表面，引起電極的PH發(fā)生變化進(jìn)行測定，該方法的CV為3.5％～4.8％，回收率高。結(jié)合具體實際，應(yīng)以酶法測定為實用。
檢索中國專利，僅查出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測定氨濃度的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的氨診斷試劑盒。
本發(fā)明的原理是利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)來測定氨的濃度，其主要技術(shù)路線是采用谷氨酸脫氫酶(glutamatedehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作為作用酶，產(chǎn)生谷氨酸，谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)作為循環(huán)酶，功能為將谷氨酸再次變回氨及α-酮戊二酸，使氨不斷地被重復(fù)循環(huán)利用，并同時不斷地擴(kuò)增產(chǎn)生過氧化氫，過氧化物酶的作用是顯色酶，它將過氧化氫與還原型色原體組合作用，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400～700nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定染料吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)含量高低的光吸收大小，通過測量400～700nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升的程度，得出氨濃度大小測定結(jié)果。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，一種測定氨濃度的方法，采用以下步驟進(jìn)行首先，將待測樣品與含有α-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、還原型輔酶、還原型色原體組合和過氧化物酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)
然后，將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測400～700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收程度，測算得出樣品中氨濃度大小。
上述酶循環(huán)擴(kuò)增法測定氨濃度的方法中，所述還原型輔酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一種。
上述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任一個組合


實現(xiàn)本發(fā)明氨診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成緩沖液20～500mmol/L，穩(wěn)定劑/試劑總體積 1～50％，還原型輔酶0.1～0.35mmol/L，谷氨酸脫氫酶 2000～500000U/L，谷氨酸氧化酶 2000～500000U/L，α-酮戊二酸 2～20mmol/L，過氧化物酶500～500000U/L，還原型色原體組合 0.1～20mmol/L。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將以上單劑中的各種成分進(jìn)行組合配制成雙劑，比如 雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I的成分α-酮戊二酸、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、還原型色原體組合成分之一、過氧化物酶等，可以放在試劑II；試劑II中的谷氨酸氧化酶、還原型色原體組合成分之二也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將試劑配成如下三試劑

與雙劑類似，三劑的配方也不僅僅限于上述配方，其中試劑I中的α-酮戊二酸、還原型輔酶、還原型色原體組合成分之一、谷氨酸脫氫酶可以放在試劑II或試劑III中，試劑II中的過氧化物酶、還原型色原體組合成分之二可以放在試劑I或試劑III中，試劑III中的谷氨酸氧化酶也可以放到試劑I或者試劑II中，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II、三劑的試劑I/試劑II/試劑III當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑，濃度在1％～50％(V/W)范圍之內(nèi)。
用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一種。
研究表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的診斷試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案
緩沖液 100mmol/L，穩(wěn)定劑/試劑總體積 50％，還原型輔酶 0.25mmol/L，谷氨酸脫氫酶 100000U/L，谷氨酸氧化酶 8000U/L，α-酮戊二酸16mmol/L，過氧化物酶 30000U/L，還原型色原體組合 6mmol/L。
利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量通過酶聯(lián)反應(yīng)生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)，所導(dǎo)致在400～700nm波長處吸光度的上升，得以測定氨濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的氨診斷/檢測試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行氨濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實質(zhì)性特點和顯著的進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法測定氨濃度，測試結(jié)果準(zhǔn)確；(2)參與反應(yīng)的成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結(jié)果，而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進(jìn)行，不會污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用；
(5)應(yīng)用本發(fā)明提供的測定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑等多種形式的試劑，用于測定各種樣品中氨濃度的大??；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)氨診斷/檢測試劑盒，穩(wěn)定性好，很好地保證了應(yīng)用測試效果。配成雙劑或者三劑以后，能夠進(jìn)一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測結(jié)果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長時間儲存。
具體實施例方式
本發(fā)明一種氨濃度的測定方法及氨診斷試劑盒，利用谷氨酸脫氫酶與α-酮戊二酸、還原型輔酶生成谷氨酸，由谷氨酸氧化酶將谷氨酸變回氨及α-酮戊二酸，使氨不斷地被循環(huán)利用，并不斷地擴(kuò)增產(chǎn)生過氧化氫，再由過氧化物酶與過氧化氫及還原型色原體組合作用，將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而通過可見光分析儀器，在400～700nm波長處測定染料吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收大小，通過測量400～700nm處吸光度上升的程度，得出氨濃度的大小。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不能理解為對本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。
實施例一(單劑)按以下成分和用量配制氨診斷試劑盒三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，硫酸銨 50％(占試劑總體積)，NADH 0.25mmol/L，谷氨酸脫氫酶 150000U/L，谷氨酸氧化酶 8000U/L，α-酮戊二酸 16mmol/L，過氧化物酶 30000U/L，4-氨基抗砒 2mmol/L，石碳酸 10mmol/L；
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長505nm，測試副波長600nm，被測樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的程度，從而測算出氨的濃度大小。
實施例二(雙劑)按以下成分和用量配制氨診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，甘油 50％(占試劑I總體積)，NADPH0.25mmol/L，谷氨酸脫氫酶 120000U/L，α-酮戊二酸 16mmol/L，過氧化物酶 30000U/L，2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 0.2mmol/L；試劑II——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，甘油 50％(占試劑II總體積)，谷氨酸氧化酶 8000U/L，4-氨基抗砒 0.6mmol/L；試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長546nm，測試副波長600nm，被測樣品與試劑的體積比例為1∶20，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的程度，從而測算出氨的濃度大小。
實施例三(三劑)按以下成分和用量配制氨診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，丙二醇 50％(占試劑I總體積)，thio-NADH0.25mmol/L，谷氨酸脫氫酶 100000U/L，α-酮戊二酸 16mmol/L，3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L；試劑II——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，丙二醇 50％(占試劑II總體積)，過氧化物酶 40000U/L，雙甲基苯胺 2mmol/L；試劑III——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，丙二醇 50％(占試劑III總體積)，谷氨酸氧化酶 8000U/L；試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長578nm，測試副波長660nm，被測樣品與試劑的體積比例為1∶30，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的程度，從而測算出氨的濃度大小。
經(jīng)過驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不一一列舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)量污染。
權(quán)利要求
1.氨濃度的測定方法，包括以下步驟①將待測樣品與含有α-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、還原型輔酶、還原型色原體組合和過氧化物酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)， ②將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測400～700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收程度，測算得出樣品中氨濃度大小。
2.一種氨診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液 20～500mmol/L，穩(wěn)定劑/試劑總體積 1～50％，還原型輔酶 0.1～0.35mmol/L，谷氨酸脫氫酶 2000～500000U/L，谷氨酸氧化酶 2000～500000U/L，α-酮戊二酸2～20mmol/L，過氧化物酶 500～500000U/L，還原型色原體組合 0.1～20mmol/L，抗干擾劑 1～50mmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氨診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為硫酸銨、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氨診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氨診斷試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合為下列28個組合中的任一個組合
6.權(quán)利要求2～5中任意一種氨診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或者三劑。
7.權(quán)利要求2～5中任意一種氨診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒為干粉試劑盒或液體試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氨濃度的測定方法及氨診斷試劑盒，利用谷氨酸脫氫酶與α－酮戊二酸、還原型輔酶生成谷氨酸，由谷氨酸氧化酶將谷氨酸變回氨及α－酮戊二酸，使氨不斷地被循環(huán)利用，并不斷地擴(kuò)增產(chǎn)生過氧化氫，再由過氧化物酶與過氧化氫及還原型色原體組合作用，將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，利用可見光分析儀器，在400～700nm波長處測定染料吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收大小，通過測量400～700nm處吸光度上升的程度，得出氨濃度的大小。將診斷試劑盒制成雙劑或三劑可減少各成分的交叉影響。本發(fā)明可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果，精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號G01N21/25GK1912581SQ200610041358
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月17日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中