專利名稱：同型半胱氨酸濃度的測定方法及同型半胱氨酸診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)對同型半胱氨酸濃度的檢測，尤其涉及利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法測定同型半胱氨酸濃度的方法，以及由此制得的同型半胱氨酸診斷試劑盒，屬于同型半胱氨酸濃度分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測定血漿中同型半胱氨酸濃度的方法有很多種，包括高效液相色譜法(HPLC)、氨基酸分析儀測定法、離子色譜法、酶聯(lián)免疫分析法(EIA)、毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜，熒光偏振免疫分析(FPIA)、電化學(xué)法及酶法等。
高效液相色譜法(HPLC)是經(jīng)典的參考方法，但其操作比較復(fù)雜，試驗(yàn)耗時(shí)比較長，試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異比較大，在臨床應(yīng)用方面逐漸被酶聯(lián)免疫分析法、熒光偏振分析法和酶法所取代。高效液相色譜法先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成還原形式，然后與熒光劑進(jìn)行衍生生成同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物，將衍生后的樣品進(jìn)行色譜分析。因色譜固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同，因此流動相將其洗脫下來的次序也不同，根據(jù)這一原理將樣品中的不同物質(zhì)分開，以熒光檢測器檢測洗脫下同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，將其與標(biāo)準(zhǔn)品/內(nèi)標(biāo)的比值進(jìn)行比較和計(jì)算，就可以測定血總同型半胱氨酸的水平。
酶聯(lián)免疫分析法(EIA)是臨床上測定同型半胱氨酸水平的常用方法，操作比較方便、快捷，重復(fù)性好，方法穩(wěn)定可靠。其缺點(diǎn)是大部分操作還是手工操作，比較耗時(shí)。酶聯(lián)免疫分析法基本分析原理先使用酶將血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成S-腺苷-L-同型半胱氨酸，然后加入酶標(biāo)的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的單克隆或多克隆抗體，采用競爭結(jié)合的原理，將不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合，然后以顯色試劑和終止試劑分別進(jìn)行顯色和終止，制作出同型半胱氨酸濃度與發(fā)色強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品也按相同步驟處理，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。
離子色譜法主要用于實(shí)驗(yàn)研究，臨床上較少使用。其基本分析原理是色譜分析的一種，主要是其固定相采用離子交換物質(zhì)，根據(jù)其對不同離子的吸附力不同可將同型半胱氨酸與其它物質(zhì)分開進(jìn)行測定。
毛細(xì)電泳法主要用于實(shí)驗(yàn)研究，有在臨床使用的報(bào)道。其特點(diǎn)與高效液相色譜方法相似，其操作比較復(fù)雜、試驗(yàn)耗時(shí)較長和試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異比較大的缺點(diǎn)?；痉治鲈硐仁褂眠€原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成還原形式，然后與熒光試劑進(jìn)行衍生生成同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物，將衍生后的樣品進(jìn)行毛細(xì)電泳分析。將樣品放置于10千伏左右的高壓電場中，因?yàn)楦鞣N物質(zhì)所帶電荷不同，其等電點(diǎn)也不相同，因此其在電場中的遷移速度也就不同，根據(jù)這一原理可將同型半胱氨酸與樣品中的其它物質(zhì)分開，再以熒光檢測器檢測同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，將其與標(biāo)準(zhǔn)品/內(nèi)標(biāo)的比值進(jìn)行比較和計(jì)算，就可以測定總同型半胱氨酸的水平。
熒光偏振法是臨床上測定同型半胱氨酸水平的比較好的方法，該方法完全自動化儀器分析，具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)點(diǎn)。其基本分析原理樣品中游離同型半胱氨酸和抗單克隆抗體相結(jié)合的同型半胱氨酸的熒光偏振強(qiáng)度不同，將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)抗體競爭結(jié)合，采用競爭結(jié)合的原理制作出同型半胱氨酸濃度與熒光偏振強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。
酶法因應(yīng)市場需求而新開發(fā)出來的測試方法，目前國內(nèi)有多項(xiàng)專利申請，CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶來測量樣品中同型半胱氨酸含量；CN200410016789.6利用同型半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(E.C.2.1.1.10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E.C.3.3.1.1)的循環(huán)擴(kuò)增作用，再加上腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶等，或腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶等顯色反應(yīng)測定同型半胱氨酸含量；CN200510053210.8利用L-蛋氨酸γ-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之產(chǎn)生硫化氫后再與瑩光化合物DMPD2HCl作用產(chǎn)生熒光，該方法使用全自動熒光分析儀測試，具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)點(diǎn)。其基本分析原理用基因重組酶將同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氫產(chǎn)物再與熒光顯色劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成可測量的熒光化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測定同型半胱氨酸濃度的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的同型半胱氨酸診斷試劑盒。
本發(fā)明的原理是利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)來測定同型半胱氨酸的濃度，其主要技術(shù)路線是采用同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶(EC 4.4.1.2)將同型半胱氨酸裂解產(chǎn)生硫化氫、氨及α-氧代丁酸(2-oxobutanoate)；胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)利用硫化氫再次合成同型半胱氨酸，這樣就使同型半胱氨酸能不斷地被重復(fù)循環(huán)利用，因此得以不斷地?cái)U(kuò)增其他兩個(gè)產(chǎn)物——氨及琥珀酸；再利用谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)或琥珀酸半醛脫氫酶(EC 1.2.4.16或EC 1.2.4.24)分別作用于氨或琥珀酸，使還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算同型半胱氨酸濃度的大小。谷氨酸脫氫酶及琥珀酸半醛脫氫酶可以單獨(dú)使用(消耗一個(gè)還原型輔酶)，也可以一齊使用(消耗二個(gè)還原型輔酶)，一齊合用可以增加測試的靈敏度一倍。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，一種酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法測定同型半胱氨酸濃度的方法，采用以下步驟進(jìn)行首先，將待測樣品與含有胱硫醚γ合酶、同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶、α-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀酸基-高絲氨酸和還原型輔酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)
然后，將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm的吸光度的下降速度，測算出同型半胱氨酸濃度大小。
上述酶循環(huán)擴(kuò)增法測定同型半胱氨酸濃度的方法中，所述還原型輔酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一種。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明同型半胱氨酸診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成緩沖液40～500mmol/L，穩(wěn)定劑/試劑總體積 1～50％，還原型輔酶0.1～0.35mmol/L，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶200～50000U/L，胱硫醚γ合酶 200～50000U/L，谷氨酸脫氫酶 2000～500000U/L，琥珀酸半醛脫氫酶 2000～500000U/L，琥珀酸基-高絲氨酸 2～60mmol/L，α-酮戊二酸 2～20mmol/L。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將以上單劑中的各種成分進(jìn)行組合配制成雙劑，比如 雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I的成分α-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、琥珀酸半醛脫氫酶，可以放在試劑II；試劑II中的琥珀酸基-高絲氨酸、同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶、胱硫醚γ合酶也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將試劑配成如下三試劑

與雙劑類似，三劑的配方也不僅僅限于上述配方，其中試劑I中的α-酮戊二酸可以放在試劑II或試劑III中，試劑II中的谷氨酸脫氫酶、琥珀酸半醛脫氫酶可以放在試劑I或試劑III中，試劑III中的琥珀酸基-高絲氨酸、同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶、胱硫醚γ合酶也可以放到試劑I或者試劑II中，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II、三劑的試劑I/試劑II/試劑III當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑，濃度在1％～50％(V/W)范圍之內(nèi)。
用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一種。
研究表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的診斷試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液100mmol/L，穩(wěn)定劑/試劑總體積 50％，還原型輔酶0.25mmol/L，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶2000U/L，胱硫醚γ合酶 2000U/L，谷氨酸脫氫酶 50000U/L，琥珀酸半醛脫氫酶 10000U/L，琥珀酸基-高絲氨酸 50mmol/L，α-酮戊二酸 16mmol/L。
利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定同型半胱氨酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的同型半胱氨酸診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行同型半胱氨酸濃度的測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法測定同型半胱氨酸濃度，測試結(jié)果準(zhǔn)確；(2)參與反應(yīng)的成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結(jié)果，而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進(jìn)行，不會污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用；(5)應(yīng)用本發(fā)明提供的測定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑等多種形式的試劑，用于測定各種樣品中同型半胱氨酸濃度的大??；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)同型半胱氨酸濃度診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，很好地保證了應(yīng)用測試效果。配成雙劑或者三劑以后，能夠進(jìn)一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測結(jié)果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長時(shí)間儲存。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明一種同型半胱氨酸濃度的測定方法及同型半胱氨酸診斷試劑盒，采用同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶與同型半胱氨酸裂解產(chǎn)生硫化氫、氨及α-氧代丁酸，由胱硫醚γ合酶與硫化氫再次合成同型半胱氨酸，使同型半胱氨酸能不斷地被重復(fù)循環(huán)利用，不斷地?cái)U(kuò)增氨及琥珀酸，再利用谷氨酸脫氫酶或琥珀酸半醛脫氫酶分別作用于氨或琥珀酸，使還原型輔酶氧化成為氧化型輔酶，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，進(jìn)而可以測算同型半胱氨酸濃度的大小。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不能理解為對本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。
實(shí)施例一(單劑)按以下成分和用量配制同型半胱氨酸診斷試劑盒三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，硫酸銨 50％(占試劑總體積)，NADH 0.25mmol/L，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶 2000U/L，胱硫醚γ合酶 2000U/L，谷氨酸脫氫酶 50000U/L，
琥珀酸半醛脫氫酶10000U/L，琥珀酸基-高絲氨酸 50mmol/L，α-酮戊二酸 16mmol/L。
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，檢測方法為速率法，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出同型半胱氨酸濃度的大小。
實(shí)施例二(雙劑)按以下成分和用量配制同型半胱氨酸診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，甘油 50％(占試劑I總體積)，NADPH0.25mmol/L，谷氨酸脫氫酶 40000U/L，琥珀酸半醛脫氫酶 15000U/L，α-酮戊二酸 12mmol/L；試劑II——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，甘油 50％(占試劑II總體積)，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶 2000U/L，胱硫醚γ合酶 2000U/L，
琥珀酸基-高絲氨酸 40mmol/L。
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑I、試劑II的體積比例為2∶20∶5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，檢測方法為速率法，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。
實(shí)施例三(三劑)按以下成分和用量配制同型半胱氨酸診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，丙二醇 50％(占試劑I總體積)，thio-NADH0.25mmol/L，α-酮戊二酸 10mmol/L；試劑II——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，丙二醇 50％(占試劑II總體積)，谷氨酸脫氫酶 60000U/L，琥珀酸半醛脫氫酶 20000U/L；試劑III——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，丙二醇 50％(占試劑III總體積)，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶 4000U/L，
胱硫醚γ合酶4000U/L，琥珀酸基-高絲氨酸 20mmol/L。
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定同型半胱氨酸濃度時(shí)，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑I、試劑II、試劑III的體積比例為4∶40∶5∶5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，檢測方法為速率法，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出同型半胱氨酸濃度的大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.同型半胱氨酸濃度的測定方法，包括以下步驟①將待測樣品與含有胱硫醚γ合酶、同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶、α-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀酸基-高絲氨酸和還原型輔酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)②將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm的吸光度的下降速度，測算出同型半胱氨酸濃度大小。
2.同型半胱氨酸診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液40～500mmol/L，穩(wěn)定劑/試劑總體積 1～50％，還原型輔酶0.1～0.35mmol/L，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶200～50000U/L，胱硫醚γ合酶 200～50000U/L，谷氨酸脫氫酶 2000～500000U/L，琥珀酸半醛脫氫酶 2000～500000U/L，琥珀酸基-高絲氨酸 2～60mmol/L，α-酮戊二酸 2～20mmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為硫酸銨、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一種。
5.權(quán)利要求2～4中任意一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或者三劑。
6.權(quán)利要求2～4中任意一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒為干粉試劑盒或液體試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及同型半胱氨酸濃度的測定方法及同型半胱氨酸診斷試劑盒，采用同型半胱氨酸－α，γ－裂解酶與同型半胱氨酸裂解產(chǎn)生硫化氫、氨及α－氧代丁酸，由胱硫醚γ合酶與硫化氫再次合成同型半胱氨酸，使同型半胱氨酸被重復(fù)循環(huán)利用，并不斷地?cái)U(kuò)增氨及琥珀酸，再利用谷氨酸脫氫酶或琥珀酸半醛脫氫酶分別作用于氨或琥珀酸，使還原型輔酶氧化成為氧化型輔酶，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，進(jìn)而可以測算同型半胱氨酸濃度的大小。本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀得出所需的測定結(jié)果，精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，其診斷試劑盒可以制成雙劑或三劑，以減少各成分的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性。
文檔編號G01N31/00GK1912582SQ200610041359
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月17日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中